“锚定点灯”式寡核苷酸芯片的检测技术 本发明是一种涉及基因组DNA寡核苷酸芯片的制作和检测技术，采用寡核苷酸探针末端连接DNA小沟结合物(MGB)，使MGB分子具有“锚定”靶DNA的作用，提高寡核苷酸探针与靶DNA的亲和力和解链温度(Tm)，因而可以实施高温杂交；同时采用“点灯”式的隐性荧光物质，只有在杂交形成时才显示信号。该技术可以大幅度提高杂交温度，减少溶液中靶DNA之间的复性，而且点灯荧光物质可以避免多次清洗，缩短检测时间，还可以应用于实时动态杂交检测与自动化设备的检测。该技术可用于单核苷酸多态性(SNP)和基因突变的检测分析。
发明所属领域：生物医学。
【发明背景】
人类基因组是一个十分稳定的体系，不同的民族、群体和个体都有46条染色体，有相同数目的基因和基因分布，也有基本相同的核苷酸序列，基因组结构的这种稳定性保证了人类作为一个物种的共同性和稳定性，然而人类基因组又是一个变异地体系。在长期进化的过程中，基因组的DNA序列不断地发生变异，这些变异可能是有害的、有益的或中性的，它们其中的一些被保存下来，导致了不同种族、群体和个体间基因组的差异或多态性。对基因组多态性的了解将有助于阐明基因表型、序列变异与疾病风险之问的关系。一种普遍的多态性是基因组中散在的单个碱基的不同，这种不同虽然也包括单个碱基的缺失和插入，但更多的是单个碱基的置换，即单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的这类多态性有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性、以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。
SNP是指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1％。由于SNP是二等位基因态(biallelic)的，易于自动化批量检测，因而被认为是新一代的遗传标记。作为DNA序列中单个碱基的置换，理论上任何用于检测单碱基突变或多态的技术都可用于SNPs的识别或检出，例如，RFLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异的PCR(ARMS)、DNA测序等都可分别用于已知或未知的SNPs的检测。这些方法大多需要电泳和荧光标记。无论为了大量发现新的SNPs，还是用已知SNPs作群体基因型分析，都需要同时检测大量的位点，而上述基于电泳和需标记DNA的方法则因其样本处理费时费力而效率有待提高。为此，近年来已发展了一些批量地、自动化地识别或检出SNPs的方法，如基因芯片技术，即在一块小硅片上进行微阵列分析，让目标DNA与密集的多重寡核苷酸阵列进行杂交以检出SNPs的有效方法。
基因芯片技术已经成为科学研究与临床诊断的重要手段。基因芯片技术是将互补的DNA片段中的一条链(已知序列)作为探针固定在芯片支撑物的表面，然后与被检测样本中的未知DNA杂交，样本中存在互补DNA序列，即在相应的探针位点产生阳性信号。在现阶段，用于基因突变或多态性检测DNA芯片是寡核苷酸芯片。寡核苷酸芯片是以寡核苷酸作为探针，固定于芯片表面，该寡核苷酸片段，多数为人工合成，用于检测基因突变的探针长度多在8～15个碱基左右。检测时，将相应的DNA片段用PCR进行扩增并标记，然后与芯片杂交，分析杂交位点的信号强度。
迄今为止，基因的点突变以及基因组的单核苷酸多态性的基因芯片检测，主要还是依靠一定长度的寡核苷酸探针对特定序列的识别，需要应用PCR将其特定基因片断扩增并标记，结果PCR扩增技术使被检测的突变位点或特定序列的数量大受限制。而且常规PCR技术将DNA的两条链一同扩增，其PCR产物是双螺旋结果的两条链的混合物，在杂交时由于长时间的杂交，PCR产物自身形成双螺旋结构，而影响了与芯片表面寡核苷酸探针的杂交效率。为了克服此种缺点，不少研究者采用的了不对称PCR技术，不对称性的将基因组DNA中一条链进行扩增，但同时也大大降低的PCR的扩增效率；也有人采用PCR引物标记和分离技术，将常规PCR扩增的产物，通过被标记引物的识别分离而去除互补链以增加杂交效率。这些均增加了操作的复杂性，并延长了检测时间。
因此，到目前为止，用于SNPs和已知基因点突变检测技术还不成熟，或者检测操作太复杂，影响了推广使用。
寡核苷酸芯片用于点突变和多态性的检测还存在以下问题：
1)目前所有基因组多态性的检测，还是基于引物/探针----合成----检测的模式，由于同体系中过多的引物或探针会相互干扰，因此体系中同时检测的引物或探针的数量受到很大的限制；
2)目前寡核苷酸芯片的寡核苷酸探针的Tm值相差很大，杂交温度难以优化调节，探针数量很大程度上受到限制；
3)现有方法检测基因突变的基因芯片方法中，大多需要PCR对基因进行扩增，有时还需要进行线性(不对称性)PCR扩增，主要是为了减少杂交体系中靶DNA产物双链之间的退火复性的干扰；
4)费时，由于涉及到PCR扩增、标记等操作，一般需要2天时间才能完成检测，不适合于一般的应用检测。
为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明采取增加固定探针杂交亲和力、高温杂交和杂交触发的荧光检测方法以达到本发明的目的，可提供一种检测程序较简单，能快速进行单核苷酸多态性(SNP)和基因突变的芯片检测的方法。本发明采用下列步骤实现寡核苷酸芯片快速检测：
1)探针标记DNA小沟结合物(MGB)分子，锚定靶DNA；
2)高温杂交，减少杂交体系中靶DNA自身的相互干扰；
3)采用杂交触发的荧光物质，进行检测。
本发明的具体原理如下：
1.探针标记MGB分子，杂交时锚定靶DNA
DNA小沟结合物(Minor Groove binders，MGB)是一类能结合到DNA双螺旋结构小沟的物质，多为天然类抗生素。这些MGB物质当初是作为治疗性药物开发的，但是由于毒性限制了应用。MGB分子多为长条扁平状，正好可以嵌入DNA双螺旋结构深而狭窄的小沟，与DNA骨架分子紧密接触，并形成氢键或疏水键，从而使DNA双螺旋结构更加稳定。在长条扁平型的MGB分子中，大多是由相同的单元和肽键链接在一起，如抗肿瘤抗生素CC-1065、纺锤菌素(Netropsin)、远端霉素(Distamycin)以及CC-1065的类似物CDPI3、Bizelesin(U-77,779)、Adozelesin(U-73,975，Cat#：123219-86-3，Upjohn)等，可以跨越多达4个碱基。
MGB稳定DNA双螺旋结构主要表现在解链温度TM值的升高，尤其是A/T碱基对。探针中的A/T碱基对含量越高，其TM值的抬升越明显，这可以使杂交时的杂交温度提升。杂交温度提升有不少好处，主要是杂交体系中的DNA物质能保持在单链状态，即使是杂交体系中含有配对的双链，同时由于杂交温度的提升，增加了体系中的分子的布郎运动，增加分子间碰撞的机会，提高杂交效率。由于MGB稳定DNA双螺旋结构的作用，可以缩短探针，进而增加完全配对与一个碱基错配之间的分辨率。比如带有MGB的12碱基的探针(图3)，完全配对的TM值20达到66℃，而中间有一个碱基错配19的TM值仅为46℃，相差20℃，使分辨率明显增加。
在这个系统中，MGB与DNA寡核苷酸探针22通过一个-(CH2)6-21相连接，探针的另一端通过另一个-(CH2)6-23与玻璃基片25相连接，在杂交时MGB分子24可以通过这个烷基链自由摆动或折返，当探针有配对的靶DNA结合时，MGB分子折返与DNA双螺旋结构结合，并锁定DNA双链，达到锚定的目的(图1)。完整的寡核苷酸探针与MGB和芯片支撑物的连接的结构如图4。
2.高温杂交，减少杂交体系中DNA的干扰
所谓高温杂交，是指杂交温度比正常杂交温度提升10℃以上，从而使杂交体系中靶DNA双链的杂交动力学和靶DNA与探针形成双链的比率发生显著的改变。
MGB修饰的DNA探针具有高亲和性的特点，即一旦杂交体形成以后就具有锁定靶DNA的功能，因而可以在高温下进行杂交，可以提高杂交温度(比正常高10～20℃左右)，这样可以避免DNA双螺旋结构复性对杂交的影响；同时因杂交温度的提高，增加了靶DNA分子的布郎运动，增加靶DNA与芯片表面探针碰撞的机会，增加杂交效率。
高温杂交，可避免被检测DNA双链之间的复性。为了避免杂交时靶DNA双螺旋复性以及靶DNA本身所形成的二级结构对靶DNA与探针DNA复性的影响，采用高温杂交技术，以保持靶DNA的变性状态和DNA二级结构的变性状态，同时又不影响靶DNA与探针的结合。带有MGB修饰的12个碱基的探针与靶DNA杂交的Tm值比天然DNA/DNA的Tm值平均高出20℃，因此可以保持靶DNA处于变性的温度范围，而又不影响探针与靶DNA的杂交体的形成。
3.采用杂交触发的荧光物质(点灯)
所谓“点灯”技术，是指由双链DNA形成本身触发而发生荧光的现象，即在单链状态下，荧光物质无荧光发生，当DNA双链形成时，荧光物质由于与DNA的结合发生构象变化，产生荧光。
点灯式荧光物质，具有隐性荧光的特点，它的物理特性可以通过与双链DNA的相互作用而发生改变，产生荧光光谱的变化，或者在特定波长的荧光质子的产生量显著增加，或者改变荧光分子的性质。荧光光谱的变化包括吸收光谱和发射光谱的改变。
这些荧光物质与双链DNA的结合主要有两种形式，即是碱基间的插入和股沟间的结合。这些结合反应都可以用来设计潜在荧光物质。荧光物质与双链DNA的结合可以降低荧光分子的旋转自由度，或者改变荧光分子的导电性质与环境。
具有这种特性的荧光物质，最典型的是非对称性的花青素甙类染料(Cyaninedyes)，如噻唑橙(Thiazole orange，TO)。噻唑橙分子的核心部分具有一个独特的特性，就是当它处于基态26(S0)状态下是不发荧光的，但是当染料与双链DNA结合27后，其次甲基键旋转30受到限制，当光线照射后便成为激发态28(S1)，激发态向基态转变时，便发生荧光发射29(参见图5)。SYBR Green I和PicoGreen(Molecular Probes，USA)也具有这样的核心部分，也具有被双链DNA触发的荧光发射的特性。
点灯荧光物质主要是非对称性的花青素甙染料噻唑橙(Thiazole orange，TO)为核心的染料，美国Molecular Probes公司推出的TO类似物SYBR Green I和PicoGreen，比TO具有更强荧光发射效率以及与双链DNA的亲和力，其中SYBRGreen I已成功地用于的实时定量PCR的检测。本发明直接把SYBR Green I 8加到杂交体系中(图1)，而不需要预先对靶DNA进行荧光标记，可以省去标记操作；同时由于是点灯式染料，只有在染料与双链DNA结合时才会发出荧光9，因此也可以用于芯片的实时杂交检测，在杂交过程中，采用从高温到低温的梯度降温，实时观察记录芯片探针位点的信号的情况。
在本发明中，除了花青素甙类染料外，一般的双链DNA插入染料如DAPI、柔红霉素以及Hoescht 33258等也可使用。只是要在杂交完成后需要增加清洗的过程，以去除游离荧光染料。
本发明与现有的检测技术相比，具有以下优点：
本发明针对现有寡核苷酸DNA芯片检测的不足，对DNA寡核苷酸探针进行MGB的连接修饰，使其对靶DNA的亲和力显著增加，可以在比正常杂交温度高10℃以上的温度下进行杂交，同时杂交可以触发荧光信号，使检测更为便利。
本发明的优点主要在于：
1.寡核苷酸探针与MGB分子相连接，提高了探针与靶DNA杂交的亲和力，因而可以提高杂交温度；
2.采用高温杂交，可以避免双股靶DNA之间的复性和DNA二级结构的形成以及对杂交所带来的影响，提高探针与靶DNA复性的效率；
3.本发明可以免去PCR的扩增、标记操作，使检测更简便快速、容易操作、成本更低；
4.去除了PCR对特定DNA片断扩增的制约，从而使芯片上探针的固定数目不受PCR操作的限制；
5.可以实时检测，由于采用了杂交触发的荧光检测技术，只有在杂交形成时才有信号，因而可以实行实时动态检测；
6.便于自动化，由于免去DNA扩增、标记、纯化等操作过程，因此易于进行自动化检测。
以下结合实例和附图详细解释本发明的实施。
图1.MGB-ODN的锚定点灯检测原理(图解)
1 固相支撑材料 6 折返的连接臂
2 连接臂 7 结合在DNA小沟的MGB分子
3 寡核苷酸探针 8 游离的无荧光染料
4 连接臂 9 与双链DNA结合的并发射荧光
的荧光染料
5 探针末端的MGB分子 10 被检测的靶DNA片段
图2.锚定与点灯方式检测靶DNA(图解)
11 固相支撑材料 15 结合在DNA小沟的MGB分子
12 连接臂 16 靶DNA片段
13 寡核苷酸探针 17 折返的MGB连接臂
14 游离的无荧光染料 18 结合在DNA小沟、被DNA双链
触发的发射荧光的荧光染料
图3.带有MGB分子的ODN杂交的不同杂交温度的荧光值的改变(图解)
19 一个碱基错配：探针GGCAATTCAAA-MGB
20 序列完全配对：探针GGCAATTTAAA-MGB
图4.MGB-连接臂-ODN-连接臂-固相界面连接物(图解)
21 探针与MGB之间的连接臂 24 MGB分子CDPI3
22 寡核苷酸探针 25 芯片支撑物
23 探针与芯片表面的连接臂
图5.双链DNA触发的荧光发射原理(图解)
26 基态荧光分子 29 激发态分子回到基态时发射的
27 荧光分子插入碱基之间 荧光
28 光线激发后的荧光分子激发 30 荧光分子的次甲基键旋转
态
图6.ODN末端的磷酸基团与芯片表面的氨基的连接反应
实施例 锚定点灯寡核苷酸芯片的制备与检测
1.基因突变位点的收集或SNP寡核苷酸(ODN)探针的设计
1)基因点突变探针的设计
检测基因突变的芯片产品，所固定的探针多选择突变位点上游6-8个碱基和下游6-8个碱基，探针长度一般多选择15个碱基左右，例如β-地中海贫血的珠蛋白基因的突变约有40个常见突变位点，加上野生性对应的突变位点，约有80个检测探针，加上阴性、阳性对照探针，用于β-地中海贫血的诊断芯片包含有100个检测寡核苷酸探针。
2)SNP探针的设计
SNP探针设计规则与基因点突变的检测探针设计相似，根据现有资料，收集相应研究领域的SNP探针资料，如高血压病相关的SNP资料，或与司法鉴定相关的SNP资料，探针的长度，一般也是以15个碱基为最佳，变异的碱基位于探针的中间位置，这样可提供最为敏感的分辨效果。
2.ODN-MGB的合成与连接
1)TFP-CDPI3合成
第一步合成TFP-CDPI。2，3，5，6-四氟苯三氟醋酸盐(TFP-TFA)2.6g(10mmol)逐滴加到溶解在15ml无水DMF中的1.4g(6.1mmol)CDPI(3-carbamoyl-1，2-dihydro-3H-pyrrolo[3，2-e]indole-7-carboxylic acid)和三乙胺(10mmol)溶液中，反应1小时，真空抽滤，残留物用2ml二氯甲烷溶解，再加50ml乙醚。0℃过夜，玻璃滤器过滤收集沉淀，10ml各50％的乙醚/二氯甲烷洗，再用乙醚洗，最后真空抽干。产物(TFP-CDPI)为黄色固体。TFP-CDPI2和TFP-CDPI3的合成，为TFP-CDPI合成过程的重复。最后的产物(黄绿色)为TFP-CDPI3，可以直接用于与ODN探针的连接。
2)带C6连接臂的ODN探针的合成
修饰过的寡核苷酸(ODN)探针的5′端带有氨基(-NH2)修饰和C6连接臂，3′端带有羧基(-COOH)修饰和C6连接臂，也可以是氨基基团与羧基基团位置对调，这些修饰和连接臂的合成均可通过DNA商用服务公司合成。探针的格式如下：
H2N-(CH2)6-ODN-(CH2)6-COOH或
H00C-(CH2)6-ODN-(CH2)6-NH2
另一种连接方法是，在寡核苷酸探针的5′或3′端增加数个(5-20)多聚dT作为连接臂，并在多聚dT的末′端进行磷酸化修饰(p)，以便用于与氨基玻片的共价连接。探针的形式如下：
H2N-(CH2)6-ODN-(dT)n.p或
p(dT)n-ODN-(CH2)6-NH2
3)TFP-CDPI3与ODN的连接
四氟苯酯基团(TFP)可以在pH7-9的水溶液中与一级氨基和次级氨基基团反应，形成共价连接。在标记前，将20μl新鲜配置、溶解在DMSO的1mg/ml的TFP-CDPI3加到1ml(1mg/ml)的H2N-(CH2)6-ODN-(CH2)6-COOH中去，室温反应1小时，凝胶(如Sephadex G-25)过滤去除游离的TFP-CDPI3，收集洗脱液，浓缩待用。分子连接形式为：
MGB-(CH2)6-ODN-(CH2)6-COOH或
MGB-(CH2)6-ODN-(dT)n.p
MGB包括CDPI3、抗肿瘤抗生素CC-1065、纺锤菌素(Netropsin)、远端霉素(Distamycin)、Bizelesin、Adozelesin等DNA小沟结合物。
3.寡核苷酸探针阵列的制作
MGB-(CH2)6-ODN-(CH2)6-COOH(MGB-ODN探针)的羧基可以在EDC的存在下与氨基修饰的玻片形成共价连接。应用芯片制作三维机器人控制系统，将MGB-ODN探针传递到芯片表面指定的位置。所使用的探针数量可依照芯片的需要而定，从几个到几千个探针不等，每个芯片均设一定数量的阳性、阴性和空白对照系统，主要选用各种看家(House keeping)基因作为阳性对照，选择随机序列探针或植物DNA序列探针作为阴性对照系统。每个探针的点样量可根据所采用的点样机械而定，一般10pl到0.1μl不等，例如点样于膜，所需样本量由于点较大的缘故可以多一些。
这里把DNA探针通过三维机器人送到芯片指定的位置的过程称为点样，点样时，将末端羧基修饰的MGB-ODN探针1μl(100μM)与1μl 0.1M的水溶性碳二亚胺EDC(1-ethyl-3，3′-dimethylaminopropyl carbodiimide)、1μl 0.1M的NHS(N-hydroxysuccinimide)溶液，混合，进行点样，点样量的多少取决于点样机械，点样所用玻片为氨基修饰的玻片(silanated slides，SIGMA)，点样完成后，将玻片置于室温下过夜(＞12小时)，0.01M PBS(pH7.4)洗片，将含有探针的芯片置于干燥器内，4℃保存。
MGB-(CH2)6-ODN-(dT)n.p或p(dT)n-ODN-(CH2)6-MGB寡核苷酸探针，其末端带有磷酸基团，用EDC和NHS处理，可生成活性的中间体，然后与氨基玻片表面的氨基基团反应生成类肽键，形成共价连接。原理如图6。
4.基因组DNA的常规分离、纯化
采用QIAGEN公司的DNeasy Tissue system从组织、细胞、细菌、酵母等中分离基因组DNA。该方法采用一种硅胶膜技术高效地结合基因组DNA，不需酚、氯仿或者乙醇沉淀操作，甚至连机械匀浆也不需要，采用蛋白酶K消化代替。样本用蛋白酶K消化后加到Dneasy离心柱，DNA被吸附，而其他物质被去除，残留杂质可以通过洗柱2次给以充分去除，纯DNA用低盐缓冲液洗脱。对于直接用基因组DNA进行检测的情况，基因组DNA的量不应少于100μg。
5.DNA分子酶学破碎
DNA杂交前要进行相应的限制性内切酶消化。一般可采用四核苷酸的限制性内切酶消化基因组DNA，使DNA的长度不大于100bp；选用四核苷酶切位点的限制性内切酶，如Alu1、NlaIII、HaeIII的不同组合等，一般反应步骤为：调整抽提的DNA盐浓度为1～3mol/L，加入所用内切酶，37℃反应1小时，终止反应。酶切主要将DNA片断的长度控制在50～150bp之间。
DNA酶I消化也可产生50～150bp长度的DNA片断。消化时，将100μg基因组DNA(10μl的10mM TE缓冲液溶解)加2.5μl 10×DNA酶I反应缓冲液、3μl的2ng/μl DNA酶I母液和9.5μl无核酸酶的水，37℃反应30分钟(时间根据经验而定)，冰浴停止反应。
6.采用点灯荧光物质
点灯荧光物质主要是非对称性的花青素甙类染料，如噻唑橙(Thiazoleorange，TO)、以及美国Molecular Probes公司的SYBR Green I和PicoGreen，其中SYBR Green I已成功地用于的实时定量PCR的检测。本发明直接把SYBRGreen I加到杂交体系中，而不需要预先进行靶DNA荧光标记，可以省去标记操作；同时由于是点灯式染料，只有在染料与双链DNA结合时才会发出荧光，因此也可以用于芯片的实时杂交检测，在杂交过程中，采用从高温到低温的梯度降温，实时观察记录芯片探针位点的信号的情况。
7.芯片杂交过程
寡核苷酸探针上连接的MGB分子，可选择性的与A:T对结合，并使杂交体稳定性升高，Tm值随之增高，使A:T对的解链温度趋同于G:C对，达到寡核苷酸探针的Tm值只与探针长度有关而其碱基组成无关。
带有MGB的寡核苷酸芯片的杂交温度为70-75℃，使系统中的靶DNA双链基本上处于变性状态。杂交时，50μl靶DNA溶液(3-6×SSC加0-2％SDS)加入1μl 200倍稀释的SYBR Green I(Molecular Probes，USA)溶液，滴于芯片上的杂交区域，蔽光将芯片封好浸于适宜的温度的水中孵育2～14小时。然后将玻片在含有0.2％SDS的1×SSC室温洗5分钟去除未杂交的DNA，然后再在含有0.2％SDS的0.1×SSC溶液中洗5分钟，最后用0.1×SSC溶液洗去残余的SDS。玻片干燥后进行激光扫描检测。
8.杂交后处理
显色和分析测定方法主要为荧光法，主要的检测手段是芯片专用扫描仪或激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础。芯片扫描，可采用Scanarray 5000激光芯片扫描仪，488nm激光扫描，采集扫描信号。
9.图象分析
由于正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子的部分位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。