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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410724953.2 (22)申请日 2014.12.03 A61K 31/7048(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) A61P 9/06(2006.01) A61K 31/352(2006.01) (71)申请人 南京睿鹰润泽生物医药科技有限公 司 地址 211198 江苏省南京市江宁区芝兰路 18 号江宁科学园 (72)发明人 尚靖 于东升 田友清 吴华丽 丁琳 柳军 (74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102 代理人 孙立冰 (54) 发明名称。
2、 一种抗心肌缺血再灌注损伤的香青兰活性成 分组合物 (57) 摘要 本发明涉及天然药物领域， 具体涉及抗心肌 缺血再灌注损伤的香青兰活性成分组合物。其特 征是本发明的复方药物组合物， 由活性成分及药 学上可接受的载体组成， 活性成分含木犀草素、 山 奈酚和木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷。药效学试验证 明， 三个成分组合在一起可以协同治疗心肌缺血 再灌注损伤。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104490910 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104490910。
3、 A 1/1 页 2 1.一种治疗心肌缺血再灌注损伤的复方药物组合物， 由活性成分及药学上可接受的载 体组成， 其特征是 ： 活性成分含木犀草素、 山奈酚和木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷。 2.权利要求 1 的复方药物组合物， 其中木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷三 个组分的摩尔比为 0.4-2.8:1.5-4.7:0.2-3.1。 3.权利要求 2 的复方药物组合物， 其中木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷三 个组分的摩尔比为 0.7-2.2:2.1-4.1:0.6-2.4。 4.权利要求 3 的复方药物组合物， 其中木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7。
4、-O- 葡萄糖苷三 个组分的摩尔比为 1.1-1.6:2.8-3.5:1.0-1.7。 5.权利要求1至4中任一项的复方药物组合物用于制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药 物的用途。 权 利 要 求 书 CN 104490910 A 2 1/9 页 3 一种抗心肌缺血再灌注损伤的香青兰活性成分组合物 技术领域 0001 本发明涉及天然药物领域， 具体涉及由香青兰活性成分木犀草素、 山奈酚和木犀 草素 -7-O- 葡萄糖苷配伍的组合物。 背景技术 0002 心血管病是全球范围造成死亡的最主要原因， 其致死、 致残率高居各类疾病之首。 心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia-repe。
5、rfusion injury,MIRI)是心肌缺血后在 一定时间内恢复供血时发生的心律失常、 心肌收缩功能障碍和再灌注性心肌不可逆损伤等 严重的毒性反应， 严重影响了疾病的治疗。 近年来， 冠脉搭桥术等临床治疗手段的广泛应用 使再灌注损伤越来越多的受到重视。因此， 开发防治 MIRI 的药物是临床急需解决的重大问 题。 0003 再灌注损伤的机制目前有多种假说， 主要有氧自由基大量产生、 钙离子超载、 内皮 细胞和中性粒细胞激活的炎症反应以及以细胞凋亡为主的心肌不可逆损伤等， 临床常用治 疗心肌缺血再灌注损伤的药物主要是针对单一致病因素， 如自由基清除剂和抗氧化剂谷胱 甘肽和维生素 E， 减轻。
6、钙超载药物， 如钙通道阻滞剂硝苯地平、 降钙素基因相关肽 CGRP、 腺 苷等 ； 保护血管内皮药物， 如血管紧张素转换酶抑制剂ACEI、 内皮源性NO等 ； 抑制炎症介质 释放的药物， 如乌司他丁 ； 以及中药的应用， 包括人参皂苷、 葛根素等。但治疗 MIRI 更加安 全有效的药物仍待深入探索。 0004 中医药历经几千年的发展， 形成了独特的理论体系， 是中药现代研究开发的宝贵 素材。 但由于传统中药复方成分较为复杂， 质量难以控制， 从而限制了降脂中药在更广范围 内的推广使用。如何从复杂的中药中剔除无效成分、 毒性成分， 提取针对病症的有效组分， 并优化其比例， 最大程度地发挥其药效是。
7、当今研究的热点。 0005 中药香青兰为唇形科青兰属植物香青兰 Dracocephalum moldavica L. 地上全草 入药， 具有清肺解表， 凉肝止血的功效， 其已知分离得到的成分有 ： 黄酮类、 三萜类、 甾体类、 苯丙素类、 环烯醚萜类和挥发油类等成分。前期研究结果显示， 木犀草素、 山奈酚及木犀草 素-7-O-葡萄糖苷的在保护MIRI方面的作用特点不尽相同 ： 木犀草素可以升高线粒体膜电 位， 改善心肌收缩功能 ； 山奈酚可以降低线粒体钙离子， 抑制 SHP-2、 PTEN 活力， 保护心率 ； 木犀草素 -7-O 葡萄糖苷可以降低细胞质钙离子， 抗氧自由基损伤。结构式如下 ：。
8、 0006 说 明 书 CN 104490910 A 3 2/9 页 4 0007 目前， 利用木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷进行配伍， 用于治疗心肌 缺血再灌注损伤方面的药物， 尚未见报道。 发明内容 0008 本发明公开了一种复方药物组合物， 其药物活性成分由木犀草素、 山奈酚、 木犀草 素 -7-O- 葡萄糖苷组成， 药效学试验证明， 三个成分组合在一起可以协同治疗心肌缺血再 灌注损伤。 0009 试验结果表明， 木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷的配伍组合物 当其摩尔浓度比例为 0.4-2.8:1.5-4.7:0.2-3.1 时， 能够明显减少大。
9、鼠原代心肌细 胞缺氧 / 复氧损伤凋亡率， 其心肌保护作用平均达到 70以上。三者的摩尔比优选 0.7-2.2:2.1-4.1:0.6-2.4， 在此范围内其心肌保护作用平均可达到80以上。 三者的摩尔 比更优选 1.1-1.6:2.8-3.5:1.0-1.7， 在此范围内其心肌保护作用平均可达到 90以上。 0010 本发明的复方药物组合物可以制备成多种药学领域的制剂， 如片剂、 颗粒剂、 注射 剂、 滴丸、 胶囊、 气雾剂、 栓剂、 膏药等， 经口服或者经静脉、 肌肉、 皮下或以其他的注射方式 注射， 经口腔、 直肠、 阴道、 皮肤吸收或者经鼻腔吸入， 以含有活性成分的药物制剂形式， 以 。
10、药学上可接受的制剂形式给予施用。 在本发明组合物中， 除了药物活性成分， 药学上可接受 的载体可以添加一种或多种药学上常规使用的药物制剂辅料如赋形剂， 稀释剂， 粘合剂， 稳 定剂等， 以及一些化学添加剂如色素， 防腐剂， 增味剂等。 0011 下面是本发明的部分药效学试验及结果 ： 0012 药学部分受试药物配伍组合物溶液的配制方法 ： 木犀草素、 山奈酚、 木犀草 素-7-O-葡萄糖苷以二甲基亚砜为溶剂， 其中二甲基亚砜的终浓度小于0.1。 不同组别组 合物的三个组分的配比如表 1。 0013 表 1 不同配伍组合物的构成 ( 摩尔浓度比 ) 0014 0015 说 明 书 CN 1044。
11、90910 A 4 3/9 页 5 0016 注 ： 对于每一个配伍组合物， 由木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷构成， 其总摩尔浓度均为 30M， 表 1 所示为其中所含的摩尔浓度比例。 0017 一、 药物对大鼠 H9c2 心肌细胞活力的影响 0018 取对数生长期 H9c2 大鼠心肌细胞， 消化后， 用 DMEM 培养基 ( 含 10 FBS) 重悬， 接种于96孔板， 置37、 5CO2培养箱中正常培养， 待细胞进入对数生长期， 按下述分组进 行实验 ： 正常培养组(Control组) ： 实验期间， 采用正常培养基于37、 5CO2培养箱中 正常培养 ； N2H/R。
12、 模型组 (Model 组 ) ： 将进入对数生长期用于实验的细胞用预先经 95 N2+5 CO2混合气饱和 1h 的无糖 Earle s 液置换正常培养液， 后放入通有 95 N 2+5 CO2 的 37恒温培养箱， 做缺氧培养 6h， 再将缺氧后的心肌细胞换用预先用 95空气 +5 CO2 饱和的 DMEM 高糖培养基 ( 含 10 FBS， 在正常培养条件下复氧 5h。木犀草素、 山奈酚及 木樨草 7-O- 葡萄糖苷配伍预处理组 ： H9c2 细胞经木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O 葡萄糖 苷不同比例配伍预孵育 12h， 再以 95 N2+5 CO2混合气饱和 1h 的无糖 Ea。
13、rle s 液置换正 常培养液， N2缺氧罐进行缺氧 6h 处理后， 置换正常培养液正常培养环境下复氧 5h， 同时给 予各配伍药物孵育。各实验组细胞经处理后， 加入 20g/ml MTT 孵育 4h， 用 150l DMSO 溶解 MTT。用酶联免疫检测仪在波长为 490nm 处测定每孔的 OD。并计算细胞活性。结果见 表 2.。 0019 表 2 不同配伍组合物对大鼠 H9c2 心肌细胞缺氧 / 复氧损伤后凋亡的影响 0020 0021 说 明 书 CN 104490910 A 5 4/9 页 6 0022 表 2 中 1-11 组是由木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷组。
14、合而成 ； 12-14 组分别是单体木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷。从与单体化合物 12-14 组相比 结果看， 复方配伍组的细胞保护作用更优。同时， 各配伍组在保护缺氧 / 复氧损伤心肌细胞 方面差异显著， 其中以配伍组 1、 4、 5、 7、 9 的保护效果更为明显。 0023 二、 三个单体化合物配伍协同作用分析 0024 表 3 香青兰活性成分配伍协同作用分析 0025 0026 表中 A 代表木犀草素， B 代表山奈酚， C 代表木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷。对表 3 的 交互作用估计系数进行分析， 系数值越大表明化合物间交互作用越强， 可以看出， 在保护细 。
15、胞缺氧复氧损伤细胞活力方面， 木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷三药间的交互 作用最强， 强于两两药物间的作用以及单体药物的作用。 0027 三、 响应面分析法计算配伍比例的 3D 图与等高线图 0028 采用混料实验设计中的 D- 最优实验设计方法， 运用响应面分析法并选择 Design 说 明 书 CN 104490910 A 6 5/9 页 7 expert8.05b软件进行计算。 选择Mixture选项中的D-optimal,输入配伍组的配伍比例与 表 2 下的试验结果进行分析， 选择结果中调整 R 方和预测 R 方值最大的模型对试验结果拟 合， 并利用拟合得到的模型。
16、对不同木犀草素、 山奈酚、 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷比例的情况 下的降脂滴含量效果进行预测， 可得到的 3D- 响应面图和对应的等高线图。见图 1。 0029 从图 1 的 3D 图中的圆点表示试验真实值， 曲面由木犀草素、 山奈酚、 木犀草 素 -7-O- 葡萄糖苷不同比例下的预测值组成。对图中的响应结果进行分析， F 值为 4.56， 多元相关系数 R2为 0.7673， 说明模型对实际情况拟合较好 ； 信噪比 (Adeq Precision) 为 5.727， 表明可信度高， 可以用来进行响应值预测。 0030 从 3D 图结果分析可以得到， 当木犀草素、 山奈酚和木犀草素 -7-。
17、O- 葡萄糖苷的摩 尔浓度比例为 (1.1-1.6):(2.8-3.5):(1.0-1.7) 时， 细胞活力保护率达到 90以上 ； 在摩 尔浓度比例为 (0.7-2.2):(2.1-4.1):(0.6-2.4) 时， 细胞活力保护率达到 80以上。 0031 随后在 3D 图中选取代表细胞活力保护性由好及差好的三个配伍比例 1、 3、 11， 并 将这三个点的配伍比例用原代心肌细胞进行验证。 0032 四、 配伍组合物对缺氧 / 复氧损伤原代大鼠心肌细胞活力的影响 0033 无菌状态下取出生 2d 的 Wistar 乳鼠心室肌 , 以混合消化酶 (0.06胰蛋白酶 和 0.1型胶原酶均量混合。
18、液 ) 反复进行短时间多次消化， 用差速贴壁法纯化心肌细 胞。细胞计数得到活细胞数以及细胞存活率， 以 1.0106cell/mL 培养基点板。细胞培养 24h 后， 弃上清， 用 PBS 洗三遍， 将细胞分为对照组、 缺氧 / 复氧损伤组、 缺氧 / 复氧损伤模 型 + 配伍组 1(30M)、 缺氧 / 复氧损伤模型 + 配伍组 3(30M)、 缺氧 / 复氧损伤模型 + 配 伍组 11(30M)、 缺氧 / 复氧损伤模型 + 木犀草素 (30M)、 缺氧 / 复氧损伤模型 + 山奈酚 (30M)、 缺氧 / 复氧损伤模型 + 木犀草素 -7-O- 葡萄糖苷 (30M)。其中所有缺氧 / 复。
19、氧 损伤模型组预给药 24h 后置于预先经 95 N2+5 CO2混合气饱和 1h 的无糖 Earle s， 后放 入通有 95 N2+5 CO2的 37恒温培养箱， 做缺氧培养 6h， 再将缺氧后的心肌细胞换用预 先用95空气+5CO2饱和的DMEM高糖培养基(含10FBS)， 在正常培养条件下复氧5h， 同时给予各配伍药物孵育。各实验组细胞经处理后， 加入 20g/ml MTT 孵育 4h， 用 150l DMSO 溶解 MTT。用酶联免疫检测仪在波长为 490nm 处测定每孔的 OD。并计算细胞活力。结 果见表 4。 0034 表 4 配伍组合物对氮气缺氧 / 复氧损伤大鼠原代心肌细胞活。
20、力的影响 0035 0036 说 明 书 CN 104490910 A 7 6/9 页 8 0037 注 ： 与对照组相比， #P0.001 ； 与模型组相比，*P0.05，*P0.001。 0038 分析 ： 与空白对照组相比， 模型组细胞活力显著降低， 说明大鼠原代心肌细胞缺氧 /复氧损伤模型建立成功。 与模型组相比， 配伍组1、 配伍组3、 配伍组11能在不同程度上保 护细胞活力， 且保护作用优于 3 个化合物单独作用的效果。 0039 五、 配伍组化合物对氮气缺氧 / 复氧损伤大鼠原代心肌细胞 LDH 漏出的影响 0040 实验方法 ： 无菌状态下取出生 2d 的 Wistar 乳鼠心。
21、室肌， 以混合消化酶 (0.06胰 蛋白酶和 0.1型胶原酶均量混合液 ) 反复进行短时间多次消化， 用差速贴壁法纯化心 肌细胞。 细胞计数得到活细胞数以及细胞存活率， 以1.0106cell/mL培养基点板。 细胞培 养 24h 后， 弃上清， 用 PBS 洗三遍， 将细胞分为对照组、 缺氧 / 复氧损伤组、 缺氧 / 复氧损伤 模型 + 配伍组。其中所有缺氧 / 复氧损伤模型组预给药 24h 后置于预先经 95 N2+5 CO2 混合气饱和 1h 的无糖 Earle s， 后放入通有 95 N2+5 CO2的 37恒温培养箱， 做缺氧培 养 6h， 再将缺氧后的心肌细胞换用预先用 95空气。
22、 +5 CO2饱和的 DMEM 高糖培养基 ( 含 10 FBS)， 在正常培养条件下复氧 5h， 同时给予各配伍药物孵育。各实验组细胞经处理后， 取上清， 按照 LDH 试剂盒步骤检测培养基上清中 LDH 漏出的含量。结果见表 5. 0041 表 5 配伍组合物对氮气缺氧 / 复氧损伤大鼠原代心肌细胞 LDH 漏出的影响 0042 0043 注 ： 与对照组相比， #P0.001 ； 与模型组相比，*P0.05，*P0.01，*P0.001。 0044 分析 ： 与空白对照组相比， 模型组细胞活力显著降低， 说明大鼠原代心肌细胞缺氧 /复氧损伤模型建立成功。 与模型组相比， 配伍组1、 配伍。
23、组3、 配伍组11能在不同程度上减 说 明 书 CN 104490910 A 8 7/9 页 9 轻细胞 LDH 的释放， 且保护作用优于 3 个化合物单独作用的效果。 0045 六、 配伍组化合物对氮气缺氧 / 复氧损伤大鼠原代心肌细胞上清液 pH 的影响 0046 实验方法 ： 无菌状态下取出生 2d 的 Wistar 乳鼠心室肌， 以混合消化酶 (0.06胰 蛋白酶和 0.1型胶原酶均量混合液 ) 反复进行短时间多次消化， 用差速贴壁法纯化心 肌细胞。 细胞计数得到活细胞数以及细胞存活率， 以1.0106cell/mL培养基点板。 细胞培 养 24h 后， 弃上清， 用 PBS 洗三遍，。
24、 将细胞分为对照组、 缺氧 / 复氧损伤组、 缺氧 / 复氧损伤 模型 + 配伍组。其中所有缺氧 / 复氧损伤模型组预给药 24h 后置于预先经 95 N2+5 CO2 混合气饱和 1h 的无糖 Earle s， 后放入通有 95 N2+5 CO2的 37恒温培养箱， 做缺氧培 养 6h， 再将缺氧后的心肌细胞换用预先用 95空气 +5 CO2饱和的 DMEM 高糖培养基 ( 含 10 FBS)， 在正常培养条件下复氧 5h， 同时给予各配伍药物孵育。各实验组细胞经处理后， 取上清， 用 pH 计直接测定上清培养基的 pH 值。结果见表 6。 0047 表 6 配伍组合物对氮气缺氧 / 复氧损。
25、伤大鼠原代心肌细胞 LDH 漏出的影响 0048 0049 注 ： 与对照组相比， #P0.001 ； 与模型组相比，*P0.05，*P0.01，*P0.001。 0050 分析 ： 与空白对照组相比， 模型组细胞培养液上清 pH 值显著降低， 说明大鼠原代 心肌细胞缺氧 / 复氧损伤过程中缺氧心肌进行无糖酵解， 大量生成乳酸， 造成培养基上清 液 pH 值降低。与模型组相比， 配伍组 1、 配伍组 3、 配伍组 11 能在不同程度上减轻细胞培养 基上清液 pH 值， 表明药物能够改善细胞无糖酵解， 改善细胞能量代谢障碍， 且保护作用优 于 3 个化合物单独作用的效果。 0051 七、 配伍组。
26、化合物对氮气缺氧 / 复氧损伤大鼠原代心肌细胞 ATP、 ADP、 AMP 的影响 0052 实验方法 ： 无菌状态下取出生 2d 的 Wistar 乳鼠心室肌， 以混合消化酶 (0.06胰 蛋白酶和 0.1型胶原酶均量混合液 ) 反复进行短时间多次消化， 用差速贴壁法纯化心 肌细胞。 细胞计数得到活细胞数以及细胞存活率， 以1.0106cell/mL培养基点板。 细胞培 养 24h 后， 弃上清， 用 PBS 洗三遍， 将细胞分为对照组、 缺氧 / 复氧损伤组、 缺氧 / 复氧损伤 模型 + 配伍组。其中所有缺氧 / 复氧损伤模型组预给药 24h 后置于预先经 95 N2+5 CO2 混合气。
27、饱和 1h 的无糖 Earle s， 后放入通有 95 N2+5 CO2的 37恒温培养箱， 做缺氧培 养 6h， 再将缺氧后的心肌细胞换用预先用 95空气 +5 CO2饱和的 DMEM 高糖培养基 ( 含 10 FBS)， 在正常培养条件下复氧 5h， 同时给予各配伍药物孵育。各实验组细胞经处理后， 说 明 书 CN 104490910 A 9 8/9 页 10 吸弃培养液， 用预冷的PBS润洗细胞一次， 每孔加入预冷的50高氯酸溶液500l， 在冰上 裂解细胞 5min， 刮取细胞， 加入 2.5mol/L Na2CO3溶液 600l， 调节 pH 至 6.5， 收集混合裂 解液于离心管中。
28、， 4离心， 取上清于 HPLC 检测。 0053 分别精密称定ATP、 ADP、 AMP各0.5mg， 用磷酸盐缓冲液溶解并稀释成0.625、 1.25、 2.5、 5、 10、 20、 40g/mL 的浓度梯度。 0054 采用高效液相色谱法测定。仪器为 LC-2010C 四元泵高效液相色谱仪， 分析柱为 Diamonsil C18 柱 (250mm4.6mm,5m)， 检测波长 ： 260nm， 流动相为 0.05M 磷酸盐缓冲液 (pH6.5)， 检测器为紫外可见检测器。柱速 0.8mL/min， 进样量 20L， 分析时间 12min， 数据 处理用 LCsolution 色谱工作站。
29、 ( 日本岛津 )。结果见表 7。 0055 表7配伍组合物对氮气缺氧/复氧损伤后大鼠原代心肌细胞高能磷酸物含量的影 响 0056 0057 注 ： 与对照组相比， #P0.001 ； 与模型组相比，*P0.05，*P0.01，*P0.001。 0058 分析 ： 与空白对照组相比， 模型组 ATP 含量显著降低， ADP、 AMP 含量显著升高。与 模型组相比， 配伍组 1、 配伍组 3、 配伍组 11 能在不同程度上升高 ATP 含量， 降低 ADP、 AMP 含 量， 表明药物能够改善细胞能量代谢障碍， 且保护作用优于 3 个化合物单独作用的效果。 附图说明 0059 图 1 是木犀草素。
30、、 山奈酚、 木犀草素 -7-O 葡萄糖苷配伍对 H9c2 细胞缺氧 / 复氧损 伤细胞活力保护作用效果拟合分析 3D 响应面图和等高线分析图。 0060 图 2 是大鼠原代心肌细胞缺氧 / 复氧损伤后细胞活力的变化情况。 具体实施方式 0061 实施例 1 0062 片剂 ( 每片含量 ) 0063 说 明 书 CN 104490910 A 10 9/9 页 11 0064 将上表配方的粉末混合， 通过压片机压片， 制成每片 500mg 的片剂。该片剂可以根 据需要进行薄膜包衣或包糖衣。 0065 实施例 2 0066 片剂 ( 每片含量 ) 0067 0068 0069 将上表配方的粉末混合， 通过压片机压片， 制成每片 500mg 的片剂。该片剂可以根 据需要进行薄膜包衣或包糖衣。 说 明 书 CN 104490910 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104490910 A 12 。