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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710062632.4 (22)申请日 2017.01.23 (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院放 射与辐射医学研究所 地址 100039 北京市海淀区太平路27号二 所 (72)发明人 高月 杨颖 汤响林 王莉莉 王宇光 马增春 谭洪玲 肖成荣 郝斐然 梁乾德 (74)专利代理机构 北京太兆天元知识产权代理 有限责任公司 11108 代理人 马灵洁 (51)Int.Cl. A61K 36/487(2006.01) A61K 31/352(2006.01) A61。
2、P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种显著激发内质网应激和氧化应激的单 体化合物及其用途 (57)摘要 本发明公开一种可以显著激发人肝癌细胞 (HepG2)内质网应激和氧化应激的单体化合物补 骨脂二氢黄酮， 该化合物通过激活线粒体通路和 内质网应激通路使HepG2细胞凋亡， 可为临床安 全合理应用补骨脂二氢黄酮及其原药材补骨脂 提供依据并提供新的抗肿瘤药物。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 106619801 A 2017.05.10 CN 106619801 A 1.一种抗肝癌的药物， 该药物含有1-99的补骨脂二氢黄酮。 2.一种抗肝癌的药物， 该药物含有中药。
3、材补骨脂10-40重量份或相当其生药材量的提 取物。 3.补骨脂二氢黄酮在制备治疗肝癌的药物中的应用。 4.补骨脂或相当其生药材量的提取物在制备治疗肝癌的药物中的应用。 5.如权利要求4所述的应用， 其中所述药物含有中药材补骨脂10-40重量份或相当其生 药材量的提取物。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 106619801 A 2 一种显著激发内质网应激和氧化应激的单体化合物及其用途 发明领域 0001 本发明涉及一种单体化合物， 特别涉及一种可以显著激发人肝癌细胞(HepG2)内 质网应激和氧化应激的中药补骨脂中获得的单体化合物补骨脂二氢黄酮。 背景技术 0002 在真核细胞中， 。
4、内质网是蛋白质折叠、 转运及分泌的重要场所,高质量的蛋白质折 叠是保证细胞功能和细胞生存的基本前提。 在内质网中存在各种控制机制来确保蛋白的正 确折叠、 修饰使其正确表达， 当外界因素的刺激或内环境紊乱会导致细胞中的蛋白质发生 错误折叠， 这些错误折叠或未折叠的蛋白质的大量累积即称为内质网应激(ER stress)， 并 同时激活未折叠蛋白反应(UPR)来使细胞恢复稳态。 短暂的内质网应激能增强蛋白质折叠 和修饰的能力， 而持续的内质网应激则会激活凋亡程序使细胞走向死亡。 因此， 内质网应激 和未折叠蛋白反应的激活决定着细胞的命运和功能， 并且是人类许多疾病如代谢性疾病、 癌症、 肝脏疾病等重。
5、要的病源因素。 除此之外， 氧化应激也是导致脏器损伤的重要因素， 主 要机理为线粒体膜电位消失、 形态变化、 功能失常以及线粒体膜通透性转换孔(mPTP)的开 放， 并导致线粒体产生大量活性氧ROS， 进而激活一系列毒性反应从而启动凋亡信号通路。 内质网应激和氧化应激是机体重要的毒性通路， 本发明的目的在于公开一种可以显著激发 内质网应激和氧化应激的中药单体化合物。 0003 补骨脂(PsoraleaeFructus)是豆科植物补骨脂Psoraleacorylifolia L.的干燥 成熟果实， 具有温肾助阳， 纳气平喘， 温脾止泻的作用， 外用消风祛斑。 用于肾阳不足， 阳痿 遗精， 遗尿尿。
6、频等。 随着对补骨脂的临床应用和对中药安全性研究日渐深入， 国内外关于补 骨脂导致肝损伤的报道逐年增多， 表现为肝细胞损伤、 胆汁淤积， 严重者可导致感染性休 克、 脑水肿、 消化道出血以及肝肾综合征等。 有临床调查显示， 在595例中药导致肝损伤的患 者中， 补骨脂占40例。 另有研究报道， 补骨脂水提物可引起大鼠肝损害， 表现为肝脏增大、 肝 脏系数显著增高。 此外补骨脂中所含的补骨脂乙素、 补骨脂素均可诱导HepG2细胞凋亡。 研 究补骨脂中发挥毒性作用的单体成分及其毒性作用机制对于临床安全合理应用补骨脂中 药材以及含有补骨脂的中成药具有重要的指导意义。 0004 补骨脂中药材主要包括三。
7、大类化合物， 香豆素、 萜酚和黄酮类。 通过对补骨脂中所 含的主要单体成分进行毒性筛选发现补骨脂黄酮类化合物中的补骨脂二氢黄酮(又称补骨 脂甲素， Bavachin)可显著激发肝细胞内质网应激反应和氧化应激反应， 短暂的应激可使细 胞存活， 若持续存在便使细胞走向凋亡， 从而导致肝脏脏器的损伤。 补骨脂二氢黄酮是补骨 脂中黄酮类化合物的主要有效成分， 含量占补骨脂中药材的0.03410.248(1.159 0.029mg/g)， 目前还未见关于补骨脂二氢黄酮可产生细胞毒性反应的报道。 发明内容 0005 本发明的目的在于公开一种可显著激发人肝癌细胞内质网应激和氧化应激的中 药单体化合物补骨脂二。
8、氢黄酮及其抗肝癌新用途。 说 明 书 1/5 页 3 CN 106619801 A 3 0006 本发明是通过如下技术方案实现的： 0007 一种抗肝癌的药物， 该药物含有1-99的补骨脂二氢黄酮或该药物含有中药材补 骨脂10-40重量份或相当该生药材量的提取物； 补骨脂二氢黄酮在制备治疗肝癌的药物中 的应用； 补骨脂或相当其生药材量的提取物在制备治疗肝癌的药物中的应用。 附图说明： 0008 图1： 补骨脂二氢黄酮对HepG2细胞存活率的影响 0009 图2： 补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子ATF4的影响 0010 图3-1： 高内涵分析补骨脂二氢黄酮处理后线粒体中ROS的产生 0011。
9、 图3-2： 流式细胞术检测补骨脂二氢黄酮处理后全细胞中ROS的产生 0012 图3-3： 补骨脂二氢黄酮处理后对线粒体形态及功能的影响 0013 图4： 补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子mRNA水平的影响 0014 图5： 补骨脂二氢黄酮对内质网应激标志分子蛋白水平的影响 具体实施方式： 0015 1.材料与方法 0016 1.1细胞培养与细胞系 0017 人肝癌细胞HepG2， 购自北京协和细胞库， 培养于含10胎牛血清、 1双抗的DMEM 培养基中， 置37、 5CO2的孵箱中进行培养。 0018 1.2仪器 0019 细胞培养箱(Thermo Forma， 美国)； 超净工作台(北京。
10、长城空气净化设备公司， SW- CJ-1F型)； 倒置显微镜(日本Nikon120型)； IN CELL ANALYZER 2000HCA分析仪(GE， 美国)； 精密电子天平(德国Sartorius， BS110S)； 酶标仪(美国Perkin Elmer， PE Victor X5型)； PCR仪(Gene Amp 2400)； StepOnePlusTM Real Time PCR(美国Applied Biosystems， StepOnePlusTM272006169) 0020 1.3试剂 0021 补骨脂二氢黄酮Bavachin购自上海一飞生物科技有限公司(批号： E031951)。
11、； DMEM 培养基、 PBS(Gibco美国)； 血清(FBS四季青)； 胰酶(Sigma)； MTS试剂盒(Promega)； BSA (Sigma)； 荧光染料Hoechst33342， MitoTrackerRedCMXRos、 MitoSOX red以及荧光二抗Aexa Fluor 488donkey anti-mouse IgG抗体和Aexa Fluor 488donkey anti-rabbit IgG抗体 (Life technology)； ATF4兔单克隆抗体、 CHOP鼠单克隆抗体、 BIP兔单克隆抗体、 GAPDH兔单 克隆抗体(Cell Signaling美国)； R。
12、IPA lysis buffer裂解液、 蛋白酶抑制剂、 TBST(10) (北京康为世纪公司) 0022 1.4MTS法检测HepG2细胞活力 0023 取对数生长期的HepG2细胞以2104接种于96孔板， 设置无细胞孔为空白对照， 37 、 5CO2培养24h后对细胞进行给药处理， 设置空白组、 正常对照组及给药组(浓度依次为 0,2.5,5,10,20,40,80,160,200 M)， 每组设置4个复孔， 分别培养24h和48h后， 将含药培养 基弃去， 每孔加入100 l基础培养基， 再分别加入20 l/孔MTS溶液， 置于37培养箱中继续 孵育1h， 用酶标仪测定在490nm处的。
13、吸光度值(OD)， 按以下公式计算细胞存活率。 并用 说 明 书 2/5 页 4 CN 106619801 A 4 Graphpad软件拟合IC50值 0024 细胞存活率(IC)(实验组OD值-空白组OD值)/(正常对照组OD值-空白组OD值) 100 0025 1.5高内涵筛选(HCA)补骨脂二氢黄酮的内质网应激和氧化应激 0026 1.5.1分组与处理 0027 在预铺细胞粘附剂或胶原的黑色底透的96孔板(Corning， 美国)上， 以1104个/ 孔/100 l种板， 培养24h后， 进行给药处理， 根据MTS筛选出的Bavachin的IC50值并在其附近 设置低、 中、 高三个浓度。
14、， 同时设立正常对照组和阳性对照组衣霉素(Tunicamycin)， 各给药 组均设置4个复孔以保证结果的准确性。 以上给药组的DMSO含量均小于0.1。 0028 1.5.2内质网应激检测实验方法 0029 根据前期工作， 选取12h为给药时间节点， 药物处理后， 加50 l/孔的活细胞染料溶 液， 包括核染料Hochest33342和线粒体膜电位染料MitoTrackerRedCMXRos， 37孵育 30min。 弃液， 加入100 l/孔预温到37的固定液， 室温避光放置20min。 100 l/孔的PBS洗1 次， 再加入100 l/孔的透膜缓冲液， 室温避光放置10min。 100。
15、 l/孔的PBS洗2次， 加100 l/孔 的BSA封闭液， 37孵育30min。 弃液， 加40 l/孔的一抗ATF4/CHOP， 室温避光孵育2h， 100 l/ 孔封闭液洗3次， 加上50 l/孔二抗， 室温避光孵育1h， 200 l/孔的PBS洗3次加入200 l/孔 PBS上机检测。 检测指标为线粒体膜电位(MMP)， ATF4、 CHOP。 0030 1.5.3氧化应激实验方法 0031 在给药处理12h后， 用预热至37的1Hank s balance sodium solution(HBSS) 配置含有细胞核染料Hoechst33342和线粒体活性氧染料MitoSOX red的。
16、混合活细胞染料， 各染料的终浓度分别为1、 100和5 M。 将96孔板中的含药培养基弃去， 用200 l/孔含钙的 HBSS小心洗涤细胞一次， 加入50 l/孔混合细胞染料， 于37避光染色40min， 染色后将染料 弃去， 用200 l/孔HBSS小心洗涤细胞一次， 加入200 l/孔HBSS上机检测线粒体ROS的释放情 况。 0032 1.6利用RT-PCR方法对高内涵筛选结果进行验证 0033 在对HepG2细胞给药处理12h后， 用预冷的Trizol裂解液将其裂解， 提取mRNA后使 用超微量分光光度计检测其浓度及纯度， 所得A260/A280值均在1.8-2.0之间， 表明纯度合 。
17、格。 将提取的mRNA尽快反转录成cDNA， 之后进行RT-qPCR反应。 检测指标为ATF4、 ATF6、 XBP1s、 CHOP。 0034 1.7利用WesternBlot方法对高内涵筛选结果进行验证。 0035 在对HepG2细胞给药处理12h后提取蛋白， 使用SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制备的 8的分离胶和5的浓缩胶进行电泳分析， 约1.5h后使用0.45 m的硝酸纤维素膜进行转膜 1h， 之后用5的脱脂奶粉室温封闭3h。 用抗体稀释液按1:1000稀释兔抗人单克隆抗体 GRP78(BIP)和ATF4兔抗人单克隆抗体室温孵育2h后4过夜， 用TBST洗膜三次后用抗体稀 释液稀释山羊。
18、抗兔二抗， 室温孵育1h。 按1:1配置发光液， 滴加到膜上后放入凝胶成像系统 中进行拍照。 实验数据使用SPSS 20.0软件进行统计处理， 采用单因素方差分析， P0.05为 具有统计学差异。 0036 2.实验结果 0037 2.1Bavachin对HepG2细胞活力的影响 说 明 书 3/5 页 5 CN 106619801 A 5 0038 采用MTS法检测了不同浓度的Bavachin处理细胞24h和48h对HepG2细胞增殖的抑 制活性， 如图1所示， Bavachin在1-200 M的范围内， 呈剂量依赖的抑制HepG2细胞活力， 其 IC50值在24h和48h分别为24.44 。
19、M和11.9 M。 0039 2.2高内涵筛选Bavachin的内质网应激反应(Endoplasmic Reticulum Stress， ERS) 0040 如图2所示Bavachin作用于HepG2细胞12h， 10 M、 20 M和40 M的Bavachin可激发 ATF4蛋白的核转位， 并在细胞核中高表达， 这是内质网应激反应的标志， 同时可使线粒体膜 电位MMP显著降低， 正常的线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、 产生ATP的前提， 是 维持线粒体功能所必需， 而凋亡过程中一个重要的变化即是线粒体膜电位的崩溃。 表明在 Bavachin处理12h可显著激发HepG2内质网应激反。
20、应和线粒体应激反应。 0041 2.3高内涵筛选Bavachin的氧化应激反应(Oxidative Stress)。 0042 如图3-1和图3-2所示， 在Bavachin给药处理12h和24h可使线粒体释放大量活性氧 ROS， 导致线粒体和全细胞中ROS的升高， ROS的大量释放直接造成线粒体严重损伤， 一方面 可导致线粒体膜电位降低甚至消失， 另一方面使线粒体形态出现明显皱缩， 如图3-3所示。 表明Bavachin可激发HepG2细胞显著的氧化应激反应。 0043 2.4RT-PCR对HCA筛选结果验证 0044 从mRNA水平检验Bavachin对内质网应激标志分子ATF4、 ATF。
21、6、 XBP1s、 CHOP的影响。 结果如图4所示。 在给药12h后， 细胞中内质网应激的三条通路的标志分子ATF4、 ATF6、 XBP1s 表达均明显升高， 与空白对照组相比均有显著性差异， 内质网应激的持续激发会启动凋亡 信号通路CHOP的高表达， 进而对细胞造成损伤。 0045 2.5WesternBlot方法对HCA筛选结果验证。 0046 为了进一步确证本发明数据的可靠性， 采用WesternBlot技术对Bavachin对HepG2 细胞给药处理后对内质网应激标志蛋白ATF4和GRP78(BIP)的表达进行检测。 结果如图5所 示， 在给药12h时， ATF4和BIP的表达呈现。
22、浓度依赖性增加， 与高内涵筛选结果一致。 0047 实施例1 0048 一种抗肝癌的胶囊， 该药物含有70-80补骨脂二氢黄酮。 0049 实施例2 0050 一种抗肝癌的胶囊， 该药物含有补骨脂20g或相当该生药材量的提取物。 0051 实施例3 0052 一种抗肝癌的片剂， 该药物含有20-40补骨脂二氢黄酮。 0053 实施例4 0054 一种抗肝癌的片剂， 该药物含有补骨脂30g或相当该生药材量的提取物。 0055 实施例5 0056 一种抗肝癌的颗粒剂， 该药物含有50-60补骨脂二氢黄酮。 0057 实施例4 0058 一种抗肝癌的颗粒剂， 该药物含有补骨脂10g或相当该生药材量的。
23、提取物。 0059 实施例6 0060 一种抗肝癌的胶囊， 该药物含有骨脂二氢黄酮0.0496g。 0061 实施例7 说 明 书 4/5 页 6 CN 106619801 A 6 0062 一种抗肝癌的胶囊， 该药物含有补骨脂15g或相当该生药材量的提取物。 0063 实施例3 0064 一种抗肝癌的片剂， 该药物含有补骨脂二氢黄酮0.0744g。 0065 实施例4 0066 一种抗肝癌的片剂， 该药物含有补骨脂30g或相当该生药材量的提取物。 实施例3 0067 一种抗肝癌的颗粒剂， 该药物含有补骨脂二氢黄酮0.0248g。 说 明 书 5/5 页 7 CN 106619801 A 7 图1 图2 说 明 书 附 图 1/4 页 8 CN 106619801 A 8 图3-1 图3-2 说 明 书 附 图 2/4 页 9 CN 106619801 A 9 图3-3 图4 说 明 书 附 图 3/4 页 10 CN 106619801 A 10 图5 说 明 书 附 图 4/4 页 11 CN 106619801 A 11 。