本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年6月8日，申请 号为201080036063.2(PCT/US2010/037779)，发明名称为“用于增加 产热脂肪细胞的方法”。
相关申请的交叉引用
本申请要求以下美国临时申请序列号的权益：2009年6月8号 申请的61/268,128、2009年9月10日申请的61/276,422和2009年 11月3日申请的61/280,545。所有上述引用的申请的教导通过引用 结合到本文中。
发明背景
哺乳动物脂肪细胞传统上分类为储存能量的白色脂肪细胞或消 耗能量的棕色脂肪细胞。棕色脂肪细胞表达解偶联蛋白-1(UCP1)， 其通过使ATP产生与线粒体质子梯度解偶联而将生物化学能量转换 为热量(Cannon等，2004，Physiol Rev 84：277-359)。这样的产热用来 在冷的环境条件下维持体温，或者在面对过量热量摄入时促进能量 平衡。为了强调棕色脂肪的代谢重要性，在小鼠中使其遗传缺损导 致胰岛素抵抗、高血糖、高脂血症和高胆固醇血症伴随的重度肥胖 症。(Lowell等，1993，Nature 366：740-742；Hamann等，1995，Diabetes 44：1266-1273；Hamann等，1996，Endocrinology 137：21-29)。鉴于UCP- 1作为重要解偶联蛋白的作用，表达UCP-1的脂肪细胞将具有产热 活性。
在人类中，棕色脂肪组织在婴儿中起着重要的产热作用，但在 出生后发育期间收缩，并且历史上认为在成人中稀少和在临床上不 重要。然而，最近的发现已颠覆该想法，并对成年期间棕色脂肪组 织的作用产生了相当大的兴趣。具体地，将正电子成像术和计算层 析X射线照相术(PET-CT)联合用于监测肿瘤转移导致偶然检测到在 显著百分比的成人中高度活性、推定的棕色脂肪库(Nedergaard等， 2007，Am J Physiol Endocrinol Metab 293：E444-E452)。随后的研究已 在健康成人中证实，这些库确实为表达UCP1的功能棕色脂肪 (Virtanen等，2009，N Engl J Med 360：1518-1525)，在超过90％的研究 的年轻男性中，冷暴露期间观察到棕色脂肪组织活性，但热中性条 件期间则未观察到(van Marken Lichtenbelt等，2009，N Engl J Med 360： 1500-1508)。此外，由于不同诊断原因而进行的近两千PET-CT扫描 的回顾性分析表明活性棕色脂肪的量与体重指数(一种广泛使用的整 体肥胖的度量)逆相关，引起棕色脂肪在成人代谢中重要有益作用的 可能性(Cypess等，2009，N Engl J Med 360：1509-1517)。不太清楚的是 散布在白色脂肪组织中的产热脂肪细胞(例如，棕色脂肪细胞或其他 表达UCP-1的脂肪细胞)的作用。
鉴于产热脂肪细胞的重要代谢活性，存在体内增加(例如通过形 成和/或增加的活性)产热脂肪细胞的物质的需要。
发明概述
在一些方面，本说明书提供用于通过使用ActRIIB信号转导途 径的拮抗剂增加患者中产热脂肪细胞的方法。这样的拮抗剂可为， 例如可溶性ActRIIB蛋白(例如ActRIIB-Fc融合蛋白)、与ActRIIB结 合或抑制ActRIIB表达的拮抗剂，和与通过ActRIIB进行信号转导的 配体结合或抑制其表达并参与产热脂肪细胞的调节的拮抗剂。这样 的配体包括肌肉抑制素(myostatin，即GDF8)、GDF3、激活蛋白(例 如激活蛋白A、B、C或E)、GDF11和Nodal。
在一些方面，本说明书提供用于通过给予有需要的患者有效量 的ActRIIB相关多肽来增加产热脂肪细胞的方法。ActRIIB相关多肽 可为与ActRIIB配体例如GDF3、GDF8、GDF11、激活蛋白或Nodal 结合的ActRIIB多肽(例如ActRIIB胞外结构域或其部分)。任选地， ActRIIB多肽与ActRIIB配体结合的Kd小于10微摩尔浓度，或小于 1微摩尔浓度，100、10或1纳摩尔浓度。多种合适的ActRIIB多肽 已在下述公开PCT专利申请中描述，所有公开PCT专利申请通过引 用结合到本文中：WO 00/43781、WO 04/039948、WO 06/012627、 WO 07/053775、WO 08/097541和WO 08/109167。任选地，ActRIIB 多肽抑制ActRIIB信号转导，例如由ActRIIB配体引发的细胞内信号 转导事件。在这种制剂中使用的可溶性ActRIIB多肽可为本文公开的 任何多肽，例如具有选自SEQ ID NO：1、2、5、6、12、14和17的 氨基酸序列的多肽，或具有与选自SEQ ID NO：1、2、5、6、12、14 和17的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同 一性的氨基酸序列的多肽。可溶性ActRIIB多肽可包括天然ActRIIB 多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NO：1、2、5、6、12、14和 17的序列的至少10、20或30个氨基酸的多肽，或包含SEQ ID NO： 1的序列(缺失C末端1、2、3、4、5或10-15个氨基酸和在N末端 缺失1、2、3、4或5个氨基酸)的多肽。任选地，多肽将包含相对于 SEQ ID NO：1在N末端2-5个氨基酸和在C末端不超过3个氨基酸 的截短。另一多肽示为SEQ ID NO：12。可溶性ActRIIB多肽可在氨 基酸序列中(例如在配体结合结构域中)包含相对于天然存在的 ActRIIB多肽的一、二、三、四、五或更多个改变。相对于天然存在 的ActRIIB多肽，氨基酸序列中的改变可例如在哺乳动物、昆虫或其 他真核细胞中产生时改变多肽的糖基化，或者改变多肽的蛋白酶剪 切。可溶性ActRIIB多肽可为融合蛋白，其具有作为一个结构域的 ActRIIB多肽(例如ActRIIB或其变体的配体结合结构域)和提供所需 性质(例如改进的药代动力学、较容易的纯化、靶向特定组织等)的一 个或多个额外的结构域。例如，融合蛋白的结构域可增强一种或多 种如下性质：体内稳定性、体内半寿期、摄入/给药、组织定位或分 布、蛋白复合体的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化。可溶性 ActRIIB融合蛋白可包含免疫球蛋白恒定结构域，例如Fc结构域(野 生型或突变体)或血清白蛋白。在特定实施方案中，ActRIIB-Fc融合 蛋白包含位于Fc结构域和胞外ActRIIB结构域之间的相对非结构化 的接头。该非结构化接头可对应于ActRIIB的胞外结构域C末端的 约15个氨基酸的非结构化区域(“尾”)，或者它可为相对不含二级结 构的具有5-15、20、30、50或更多个氨基酸的人工序列。接头可富 含甘氨酸和脯氨酸残基，并可例如包含苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重 复序列，例如TG4重复(SEQ ID NO：18)或SG4重复(SEQ ID NO： 19)。融合蛋白可包括纯化子序列(subsequence)，例如表位标签、 FLAG标签、多组氨酸序列和GST融合体。任选地，可溶性ActRIIB 多肽包含一个或多个选自以下的修饰氨基酸残基：糖基化氨基酸、 PEG化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基 酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂(derivatizing agent)缀合 的氨基酸。通常优选在以下哺乳动物细胞系中表达ActRIIB蛋白：其 适当介导ActRIIB蛋白的天然糖基化以便减少患者中不利免疫反应的 可能性。已成功应用人和CHO细胞系，并预期其他常见的哺乳动物 表达载体是有用的。
在一些方面，本文公开的化合物可配制成药物制剂。药物制剂 亦可包含一种或多种另外的化合物，例如用于治疗ActRIIB相关疾病 的化合物。优选地，药物制剂基本上不含致热原。
在一些方面，本说明书提供编码可溶性ActRIIB多肽的核酸， 其不编码完整的ActRIIB多肽。分离的多核苷酸可包含例如上文所述 的可溶性ActRIIB多肽的编码序列。例如，分离的核酸可包含编码 ActRIIB的胞外结构域(例如配体结合结构域)的序列，和编码 ActRIIB的部分或全部的跨膜结构域和/或胞质结构域，但不编码位 于跨膜结构域或胞质结构域内或者位于胞外结构域和跨膜结构域或 胞质结构域之间的终止密码子的序列。例如，分离的多核苷酸可包 含全长ActRIIB多核苷酸序列例如SEQ ID NO：4，或者部分截短形 式，所述分离的多核苷酸还包含3’端至少600个核苷酸前的转录终 止密码子，或者位于其它位置使得多核苷酸的翻译产生任选与全长 ActRIIB的截短部分融合的胞外结构域的转录终止密码子。本文公开 的核酸可与用于表达的启动子有效连接，并且本说明书提供用这样 的重组多核苷酸转化的细胞。优选细胞为哺乳动物细胞，例如CHO 细胞。
在一些方面，本说明书提供用于制备可溶性ActRIIB多肽的方 法。这样的方法可包括在合适细胞例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表 达本文公开的任何核酸(例如SEQ ID NO：3)。这样的方法可包括：a) 在适合可溶性ActRIIB多肽表达的条件下培养细胞，其中所述细胞用 可溶性ActRIIB表达构建体转化；和b)回收如此表达的可溶性 ActRIIB多肽。可使用从细胞培养物获得蛋白的任何公知技术，将可 溶性ActRIIB多肽回收为粗的、部分纯化的或高度纯化的部分。
在一些方面，使用本文所述的化合物增加产热脂肪细胞可用于 控制其中控制代谢活性是有益的多种疾病。实例包括控制肥胖、减 少身体脂肪含量或降低身体脂肪含量增加速率，和治疗疾病例如肥 胖症、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、2型糖尿病、心血管疾病、 癌症、高血压、中风、呼吸疾病(respiratory problem)、血脂异常、脂 肪代谢障碍、糖皮质激素给药后遗症和胆囊疾病。
在一些方面，本文公开的可溶性ActRIIB多肽可在用于治疗患 有肌肉损失或肌肉生长不足相关疾病的受试者的方法中使用，其中 这样的疾病亦与代谢疾病相关，例如肥胖症、脂肪代谢障碍、糖尿 病(例如II型糖尿病)、恶病质或其他上述疾病。这样的疾病包括肌肉 营养不良、肌肉衰减综合征(sarcopenia)和HIV(其可与肌肉萎缩 (muscle wasting)和脂肪代谢障碍两者相关)。
在一些方面，本说明书提供用于拮抗细胞中ActRIIB多肽或 ActRIIB配体(例如GDF8、GDF11、激活蛋白、GDF3和Nodal)的活 性的方法。该方法包括将细胞与可溶性ActRIIB多肽接触。任选地， ActRIIB多肽或ActRIIB配体的活性由ActRIIB/ActRIIB配体复合体 介导的信号转导监测，例如通过监测细胞增殖或UCP-1表达水平。 该方法的细胞包括成骨细胞、软骨细胞、肌原细胞、脂肪细胞和肌 细胞。
在一些方面，本说明书提供可溶性ActRIIB多肽在制备用于治 疗本文所述的疾病或病症的药物中的用途。
在一些方面，本说明书提供用于增加有需要的患者中产热脂肪 细胞的方法，这样的方法可包括给予有效量的选自以下的化合物： 包含与SEQ ID NO：2的氨基酸29-109的序列有至少90％同一性的氨 基酸序列的多肽和由在严格杂交条件下与SEQ ID NO：3的核酸杂交 的核酸编码的多肽。多肽可为包含异源部分的融合蛋白。多肽可为 二聚体。多肽可与免疫球蛋白的恒定结构域融合。多肽可与免疫球 蛋白例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc部分融合。多肽可包含与 SEQ ID NO：2的氨基酸29-109、29-128、29-131、29-134、25-109、 25-128、25-131、25-134或20-134的序列有至少80％、90％、93％、 95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。多肽可包含与 SEQ ID NO：5、6、12、14或17的氨基酸的序列有至少80％、 90％、93％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。 用这样的化合物治疗的患者可为患有本文所述疾病的患者，所述疾 病包括例如代谢疾病(例如肥胖症、糖尿病、代谢综合征、血脂异常 或脂肪代谢障碍)或与代谢疾病相关的肌肉疾病(例如肌肉衰减综合征 的一些情况)。化合物的给药可促进治疗患者的脂肪细胞中(任选在白 色脂肪组织中)的UCP-1表达。
在一些方面，本说明书提供用于增加有需要的患者中产热脂肪 细胞的方法，该方法包括给予有效量的化合物，该化合物通过靶向 ActRIIB或靶向通过ActRIIB进行信号转导的配体来抑制ActRIIB信 号转导途径。这样的化合物的实例包括ActRIIB的拮抗剂、肌肉抑制 素(即GDF-8)的拮抗剂、激活蛋白(例如激活蛋白A、激活蛋白B、 激活蛋白C或激活蛋白E)的拮抗剂、GDF-11的拮抗剂、Nodal的拮 抗剂和GDF3的拮抗剂。各上述拮抗剂可为与这样的靶标特异性结 合并抑制所述靶标的抗体或其他蛋白(例如抗体(例如单克隆抗体)或 前肽(就肌肉抑制素和GDF3而言))。上述的拮抗剂亦可为抑制 ActRIIB或配体的表达的化合物，例如基于核酸的化合物(例如反义 核酸或RNAi核酸)。用这样的化合物治疗的患者为患有本文所述疾 病的患者，所述疾病包括例如代谢疾病(例如肥胖症、糖尿病、代谢 综合征、血脂异常或脂肪代谢障碍)或与代谢疾病相关的肌肉疾病(例 如肌肉衰减综合征的一些情况)。化合物的给药可促进治疗患者的脂 肪细胞中(任选在白色脂肪组织中)的UCP-1表达。
附图简述
图1显示ActRIIB(20-134)-hFc治疗60天对高脂肪饮食喂养的雄 性小鼠的附睾脂肪垫中解偶联蛋白-1(UCP-1)mRNA水平的影响。 RT-PCR数据(相对单位，RU)为平均值±SEM；*，与载体相比p＜ 0.05。ActRIIB(20-134)-hFc引起编码棕色脂肪的该选择性标记的 mRNA近9倍的增加，因此表明广泛分布在该白色脂肪库内的棕色 脂肪细胞产热能力的上调。
图2显示通过ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天在高脂肪饮食喂养 的小鼠中的附睾白色脂肪组织内诱导的产热组织学改变。所有的显 微镜图片在相同的放大倍数下显示。苏木精和伊红(H&E)染色表明 ActRIIB(25-131)-hFc减少棕色脂肪的脂滴大小和诱导棕色脂肪的多 泡脂肪细胞(箭头)聚簇特性的能力。非-相邻切片的免疫染色揭示在 多泡脂肪细胞和单泡脂肪细胞两者中UCP1(绿色荧光)的广泛的胞质 诱导。
图3显示ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天对高脂肪饮食喂养的小 鼠的附睾白色脂肪中UCP1 mRNA水平的影响。RT-PCR数据(相对单 位，RU)为平均值±SEM；n＝6-7/组；*，p＜0.05。ActRIIB(25-131)- hFc引起编码棕色脂肪的该选择性标记的mRNA 60倍的增加，因此 表明该白色脂肪库内产热能力的上调。
图4显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠附睾白色脂肪中编码sirtuin家族成员SIRT-1(沉默信息调节剂2， 同系物1)的mRNA的水平。RT-PCR数据(相对单位，RU)为平均值 ±SEM；n＝7/组；*，p＜0.05，NS＝不显著。在高脂肪饮食喂养的小 鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc增加的SIRT-1 mRNA水平超过70％，将 它们恢复至与标准饮食喂养的小鼠没有显著不同的水平。
图5显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠附睾白色脂肪中编码PGC-1α(过氧化物增殖物激活受体γ辅激活 物-1α)的mRNA的水平。RT-PCR数据(相对单位，RU)为平均值 ±SEM；n＝6-7/组；***，p＜0.001。在高脂肪饮食喂养的小鼠中， ActRIIB(25-131)-hFc增加的PGC-1α mRNA水平超过250％，将它们 恢复至与标准饮食喂养的小鼠没有显著不同的水平。
图6显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠附睾白色脂肪中编码Foxo-1(包含分叉头(forkhead)框的蛋白O亚 家族-1)的mRNA的水平。RT-PCR数据(相对单位，RU)为平均值 ±SEM；n＝7/组；**，p＜0.01。在高脂肪饮食喂养的小鼠中， ActRIIB(25-131)-hFc增加的Foxo-1 mRNA水平超过90％，将它们恢 复至与标准饮食喂养的小鼠没有显著不同的水平。
图7显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠附睾白色脂肪中脂连蛋白mRNA的水平。RT-PCR数据(相对单 位，RU)为平均值±SEM；n＝7/组；*，p＜0.05。在高脂肪饮食喂养 的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc增加的脂连蛋白mRNA水平超过 60％，因此有助于这些小鼠中循环脂连蛋白的浓度升高。
图8显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠中脂连蛋白的血清水平。ELISA测量检测所有主要寡聚体同种型 (总脂连蛋白)，和数据为平均值±SEM；n＝7-8/组；**，p＜0.01； ***，p＜0.001。在高脂肪饮食喂养的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc 增加的循环脂连蛋白浓度超过75％，明显超过标准饮食对照中的浓 度。
图9显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-hFc治疗60天的函数的小 鼠中胰岛素的血清浓度。数据为平均值±SEM；n＝7-8/组；**，p＜ 0.01。在高脂肪饮食喂养的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc使胰岛素浓 度正常化为在标准饮食对照中观察到的水平。
图10显示作为饮食和ActRIIB(25-131)-mFc治疗60天的函数的 左右对的肩胛间棕色脂肪库的照片。高脂肪饮食增加库的大小并使 其颜色明亮，而ActRIIB(25-131)-mFc很大程度上逆转这些变化。
图11描述ActRIIB(25-131)-mFc治疗60天对高脂肪饮食喂养的 小鼠中肩胛间棕色脂肪的质量的影响。数据为组合的左右库的平均 值±SEM；***，p＜0.001。ActRIIB(25-131)-mFc逆转高脂肪饮食对 该棕色脂肪库质量的影响。
图12描述ActRIIB(25-131)-mFc治疗60天对高脂肪饮食喂养的 小鼠中肩胛间棕色脂肪的密度的影响，如由显微计算层析X射线照 相术(microCT)测定。数据(平均值±SEM)以基于骨盐羟基磷灰石(HA) 的正值和水的零值的标准化单位表示；因此脂肪值为负，白色脂肪 的值通常接近于-120。**，p＜0.01。ActRIIB(25-131)-mFc彻底逆转 高脂肪饮食对该棕色脂肪库的密度的影响。
图13显示ActRIIB(25-131)-hFc(SEQ ID NO：14)的全部氨基酸 序列。TPA前导序列(残基1-22)和截短的ActRIIB胞外结构域(天然 残基25-131)各有下划线。突出显示的是通过测序揭示为成熟融合蛋 白的N末端氨基酸的谷氨酸。
图14显示编码ActRIIB(25-131)-hFc(编码链SEQ ID NO：15示 于顶部，而互补链SEQ ID NO：16以3′-5′示于底部)的核苷酸序列。 编码TPA前导序列(核苷酸1-66)和ActRIIB胞外结构域(核苷酸73- 396)的序列有下划线。亦示出ActRIIB(25-131)对应的氨基酸序列。
详述
1.综述
哺乳动物脂肪细胞可分类为储存能量的白色脂肪细胞或消耗能 量的棕色脂肪细胞。解偶联蛋白-1(UCP1)通过使ATP产生与线粒体 质子梯度解偶联而将生物化学能量转换为热量，被广泛认为是棕色 脂肪细胞的明确功能标记。表达UCP-1的脂肪细胞本文中称为“产 热脂肪细胞”。小鼠中棕色脂肪组织的遗传缺损导致极度肥胖症 (Lowell等，1993，Nature 366：740-742)，而UCP1的选择性缺损在小 鼠中防止对β3-肾上腺素能刺激的产热和抗-肥胖症响应(Inokuma等， 2006，Am J Physiol Endocrinol Metab 290：E1014-E1021)，这证实 UCP1在能量消耗和肥胖的调节中为关键性分子(Kozak等，2008，Int J Obes 32：S32-S38)。
在从啮齿动物到人的哺乳动物中，棕色脂肪细胞以新生地最显 著的棕色脂肪组织的分散库形式存在，这符合在该年龄生存的热挑 战。最近的发现表明这些棕色脂肪库在人类成年期保留产热能力 (Nedergaard等，2007，Am J Physiol Endocrinol Metab 293：E444-E452； van Marken Lichtenbelt等，2009，N Engl J Med 360：1500-1508；Cypess 等，2009，N Engl J Med 360：1509-1517)，产生这样的组织可被外源激 活用于治疗益处的可能性。引人关注地，相当数量的棕色脂肪细胞 在出生后早期发育期间亦短暂地存在于一些“白色”脂肪库内(Xue 等，2007，J Lipid Res 48：41-51)，并在成年期在特定条件下可在白色脂 肪库中重现(Cousin等，1992，J Cell Sci 103：931-942)。甚至在人类中， 有限的证据表明棕色脂肪细胞在成年期在白色脂肪库中是可诱导的 (Lean等，1986，Int J Obes 10：219-227)。因此，也存在的可能性是， “分散的”产热脂肪细胞可在传统白色脂肪库中被诱导用于治疗益 处。传统白色脂肪组织库事实上显示细胞重建程度或表型可塑性， 其未在分散的棕色脂肪库中观察到(Prunet-Marcassus等，2006，Exp Cell Res 312：727-736)。
如在实施例中所述，ActRIIB-Fc融合蛋白可用于增加高脂肪饮 食喂养的小鼠的脂肪库中的UCP-1信号转导。因此，抑制ActRIIB 信号转导的ActRIIB衍生物质和其他化合物可用于增加产热脂肪细胞 的数量和/或活性。与涉及产热脂肪细胞的调节的ActRIIB结合的配 体包括激活蛋白(例如激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活 蛋白E)、肌肉抑制素(即GDF-8)、GDF-3、GDF-11和Nodal。在一 些方面，本发明涉及ActRIIB多肽。如本文所用，术语“ActRIIB” 指得自任何物种的激活蛋白受体IIB型(ActRIIB)蛋白和ActRIIB相关 蛋白的家族。ActRIIB家族的成员通常全部为跨膜蛋白，由带富半胱 氨酸区的配体结合胞外结构域、跨膜结构域和带预测的丝氨酸/苏氨 酸激酶特异性的胞质结构域组成。人ActRIIB前体具有下列氨基酸序 列，其中信号肽带下划线，胞外结构域以粗体表示，和潜在的N-连 接糖基化位点加框(SEQ ID NO：2)(NM_001106，512个氨基酸)。
MTAPWVALALLWGSLWPG LLTVLAYSLLPIGGLSLIVLLAFWMYRHRKPPYGHVDIHEDPG PPPPSPLVGLKPLQLLEIKARGRFGCVWKAQLMNDFVAVKIFPLQDKQSWQSEREIFST PGMKHENLLQFIAAEKRGSNLEVELWLITAFHDKGSLTDYLKGNIITWNELCHVAETMS RGLSYLHEDVPWCRGEGHKPSIAHRDFKSKNVLLKSDLTAVLADFGLAVRFEPGKPPGD THGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDMYAMGLVLWELVSRCKAADGPVDEYMLP FEEEIGQHPSLEELQEVVVHKKMRPTIKDHWLKHPGLAQLCVTIEECWDHDAEARLSAG CVEERVSLIRRSVNGTTSDCLVSLVTSVTNVDLPPKESSI
上述包含天然前导序列的野生型序列贯穿本说明书使用，作为 用于对ActRIIB的任何不同截短、成熟形式和变体的氨基酸编号的基 本序列。术语“ActRIIB多肽”用于指包括ActRIIB家族成员的任何 天然存在的多肽及其保留有用活性的任何变体(包括突变体、片段、 融合体和肽模拟物形式)的多肽。例如，ActRIIB多肽包括衍生自任 何已知ActRIIB的序列的多肽，所述已知ActRIIB具有与ActRIIB多 肽的序列有至少约80％同一性且优选有至少85％、90％、95％、 97％、99％或更高同一性的序列。
在特定的实施方案中，本发明涉及可溶性ActRIIB多肽。如本 文所述，术语“可溶性ActRIIB多肽”通常指包含ActRIIB蛋白的胞 外结构域的多肽。本文所用的术语“可溶性ActRIIB多肽”包括 ActRIIB蛋白的任何天然存在的胞外结构域及其保留有用活性的任何 变体(包括突变体、片段和肽模拟物形式)。例如，ActRIIB蛋白的胞 外结构域与配体结合并通常为可溶性的。以下为可溶性ActRIIB多肽 的实例(SEQ ID NO：1)(116个氨基酸)。
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGC WLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPT
可溶性ActRIIB多肽的其他实例除了ActRIIB蛋白的胞外结构 域外还包含信号序列(参见实施例1)。信号序列可为ActRIIB的天然 信号序列或来自另一蛋白的信号序列，例如组织纤溶酶原激活物 (TPA)信号序列或蜜蜂蜂毒肽(honey bee mellitin，HBM)信号序列。
两种相关的II型受体(ActRIIA和ActRIIB)已经被鉴定为激活蛋 白(Mathews和Vale，1991，Cell 65：973-982；Attisano等，1992，Cell 68： 97-108)和许多其他BMP和GDF的II型受体。除了激活蛋白外， ActRIIA和ActRIIB可与若干其他TGF-β家族蛋白(包括BMP7、 Nodal、GDF8和GDF11)进行生物化学相互作用(Yamashita等，1995， J.Cell Biol.130：217-226；Lee和McPherron，2001，Proc.Natl.Acad.Sci. 98：9306-9311；Yeo和Whitman，2001，Mol.Cell 7：949-957；Oh等， 2002，Genes Dev.16：2749-54)。在特定实施方案中，本发明涉及用主 题ActRIIB多肽(例如可溶性ActRIIB多肽)拮抗ActRIIB受体的配体 (亦称作ActRIIB配体)。因此，本发明的组合物和方法可用于治疗与 ActRIIB受体的一种或多种配体的异常活性相关的疾病。ActRIIB受 体的例示性配体包括一些TGF-β家族成员，例如激活蛋白(例如激活 蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、GDF3、Nodal、 GDF8和GDF11。
激活蛋白为二聚体多肽生长因子并属于TGF-β超家族。存在三 种激活蛋白(A、B和AB)，其为两种密切相关的β亚基的同型二聚体 /异二聚体(βAβA、βBβB和βAβB)。在TGF-β超家族中，激活蛋白是独 特的和多功能的因子，其可在卵巢和胎盘细胞中刺激激素产生、支 持神经元细胞存活、视细胞类型积极或消极地影响细胞周期进展和 至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化(DePaolo等，1991，Proc SocEp Biol Med.198：500-512；Dyson等，1997，Curr Biol.7：81-84；Woodruff， 1998，Biochem Pharmacol.55：953-963)。此外，人们发现从刺激的人 单核白血病细胞中分离的红细胞分化因子(EDF)与激活蛋白A相同 (Murata等，1988，PNAS，85：2434)。这表明激活蛋白A作为红细胞生 成的天然调节物在骨髓中起作用。在若干组织中，激活蛋白信号转 导由其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在促卵泡激素(FSH)从垂 体释放期间，激活蛋白促进FSH分泌和合成，而抑制素防止FSH分 泌和合成。可调节激活蛋白生物活性和/或与激活蛋白结合的其他蛋 白包括下面所述的促滤泡素抑制素(FS)、促滤泡素抑制素相关蛋白 (FSRP)、α2-巨球蛋白、Cerberus和内皮糖蛋白。
骨形态发生蛋白7(BMP7)，亦称为生骨蛋白(oseogenic protein)- 1(OP-1)，众所周知其诱导软骨和骨形成。另外，BMP7调节大量的 生理过程。特别地，BMP最近被鉴定为棕色脂肪细胞分化的关键促 进因子(Tseng等，2008，Nature 454：1000-1004)。在该研究中，BMP7 的遗传缺损导致鼠胚胎中棕色脂肪的缺乏和UCP1的几乎完全不存 在。此外，通过腺病毒给药上调小鼠中BMP7表达增加棕色脂肪质 量和能量消耗。因此，文献表明，预期BMP7的拮抗剂例如ActRIIB 多肽或抗-ActRIIB抗体不促进UCP1表达、棕色脂肪细胞形成和/或 棕色脂肪细胞活性。与激活蛋白类似，BMP7与II型受体ActRIIA 和ActRIIB结合。然而，BMP7和激活蛋白募集不同的I型受体为异 聚体受体复合体。观察到的主要BMP7I型受体为ALK2，而激活蛋 白排它地与ALK4(ActRIIB)结合。BMP7和激活蛋白引起不同的生 物学反应和激活不同Smad途径(Macias-Silva等，1998，J Biol Chem. 273：25628-36)。
生长和分化因子-3(GDF3)，亦被称为Vg1-相关的2，在胚胎发 育中起着重要的作用且还参与成年期间脂肪生成。简言之，GDF3在 白色脂肪组织中的表达与体重或肥胖症相关(Weisberg等，2003，J Clin Invest 112：1796-1808)，且腺病毒介导的GDF3的过量表达使在高脂 肪饮食条件下的野生型小鼠中观察到的肥胖增加过多(Wang等，2004， Biochem Biophys Res Commun 321：1024-1031)。重要地，带GDF3遗 传缺损的小鼠在维持标准饮食是健康的和基本正常的，但在维持高 脂肪饮食时免于肥胖症和显示增加的基础代谢率(Shen等，2009，Mol Endocrinol 23：113-123)。总之，这些发现在饮食诱导的肥胖症和更普 遍在肥胖的调节中明确涉及GDF3。
Nodal蛋白在中胚层和内胚层的诱导和形成以及随后的早期胚胎 发生中轴结构(例如心脏和胃)的机体形成中起作用。已证明正在发育 的脊椎动物胚胎中的背组织主要促进脊索和脊索前板的轴结构，同 时它募集周围细胞形成非轴胚胎结构。Nodal似乎通过I型和II型受 体和被称为Smad蛋白的胞内效应物进行信号转导。最近的研究支持 ActRIIA和ActRIIB作为Nodal的II型受体的观点(Sakuma等，Genes Cells.2002，7：401-12)。其表明Nodal配体与其辅因子(例如cripto)相 互作用以激活磷酸化Smad2的激活蛋白I型和II型受体。Nodal蛋 白参与对早期脊椎动物胚胎重要的许多事件，包括中胚层形成、前 图式发育(anterior pattening)和左右轴特化。实验的证据已证明Nodal 信号转导激活pAR3-Lux，一种先前显示特异性反应于激活蛋白和 TGF-β的荧光素酶报道分子。然而，Nodal不能诱导pTlx2-Lux，一 种特异性反应于骨形态发生蛋白的报道分子。最近的结果提供的直 接生化证据是，Nodal信号转导由激活蛋白-TGF-β途径Smad、 Smad2和Smad3介导。更多的证据显示Nodal信号转导需要细胞外 cripto蛋白，使得它与激活蛋白信号转导或TGF-β信号转导不同。
生长和分化因子-8(GDF8)亦称为肌肉抑制素。GDF8为骨骼肌 质量的负调节剂。GDF8在正在发育的骨骼肌和成人骨骼肌中高表 达。转基因小鼠中GDF8无效突变通过骨骼肌的明显的肥大和增生 表征(McPherron等，Nature，1997，387：83-90)。在牛中(Ashmore等， 1974，Growth，38：501-507；Swatland和Kieffer，J.Anim.ScL，1994， 38：752-757；McPherron和Lee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997， 94：12457-12461；和Kambadur等，Genome Res.，1997，7：910-915)和引 人注目地在人中(Schuelke等，N Engl J Med 2004；350：2682-8)，骨骼肌 质量的类似增加在天然存在的GDF8突变中是明显的。研究亦显示 人的与HIV感染相关的肌肉萎缩伴随有GDF8蛋白表达的增加 (Gonzalez-Cadavid等，PNAS，1998，95：14938-43)。另外，GDF8可调 节肌肉特异性酶(例如肌酸激酶)的产生和调节成肌细胞的细胞增殖 (WO 00/43781)。GDF8前肽可与成熟GDF8结构域二聚体非共价结 合，灭活其生物学活性(Miyazono等(1988)J.Biol.Chem.，263：6407- 6415；Wakefield等(1988)J.Biol.Chem.，263；7646-7654；和Brown 等(1990)Growth Factors，3：35-43)。与GDF8或结构上相关的蛋白结 合并抑制其生物学活性的其他蛋白包括促滤泡素抑制素和可能包括 促滤泡素抑制素相关蛋白(Gamer等(1999)Dev.Biol.，208：222- 232)。
生长和分化因子-11(GDF11)，亦称为BMP11，是一种分泌蛋白 (McPherron等，1999，Nat.Genet.22：260-264)。在小鼠发育期间， GDF11在尾芽、肢芽、上颌弓和下颌弓以及背根神经节中表达 (Nakashima等，1999，Mech.Dev.80：185-189)。GDF11在中胚层和神 经组织两者的图式发育中起着独特的作用(Gamer等，1999，Dev Biol.， 208：222-32)。显示GDF11在发育中的小鸡肢体中为软骨发生和肌发 生的负调节剂(Gamer等，2001，Dev Biol.229：407-20)。GDF11在肌肉 中的表达亦显示其在以类似于GDF8的方式调节肌肉生长中的作 用。另外，GDF11在脑中的表达显示GDF11亦可能具有与神经系统 的功能相关的活性。引人关注地，发现GDF11在嗅上皮细胞中抑制 神经发生(Wu等，2003，Neuron.37：197-207)。因此，GDF11可具有 在治疗疾病例如肌肉疾病和神经退行性疾病(例如肌萎缩性侧索硬化 症)的体外和体内应用。
在一些方面，本发明涉及特定ActRIIB多肽(例如可溶性 ActRIIB多肽)通常拮抗与ActRIIB活性相关的任何过程中的ActRIIB 配体信号转导的用途。任选地，本发明的ActRIIB多肽可拮抗 ActRIIB受体的一种或多种配体，例如激活蛋白(例如激活蛋白A、 激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、GDF3、Nodal、GDF8和 GDF11，并可因此用于其他疾病的治疗。
因此，本说明书预期使用ActRIIB多肽以及ActRIIB或ActRIIB 配体的拮抗剂治疗或预防与产热脂肪细胞活性相关的疾病或病症。 ActRIIB或ActRIIB配体参与许多关键生物学过程的调节。这样的代 谢疾病或病况的实例包括但不限于代谢综合征(亦称为综合征X)、糖 尿病、葡萄糖耐量减低、空腹血糖减低(impaired fasting flucose)、升 高的血浆胰岛素浓度和胰岛素抵抗、血脂异常、高脂血症、暴食和 贪食症、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌和肾癌、骨关节 炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、胆石病、胆结石、高血压、心脏病、心 率异常和心律不齐、心肌梗死、充血性心力衰竭、冠心病、冠状动 脉疾病、心绞痛、猝死、多囊性卵巢病、颅咽管瘤、Prader-Willi综 合征、Frohlich氏综合征、GH缺乏受试者、正常变异身材矮小、特 纳综合征和以总的无脂肪质量的百分比显示降低的代谢活性或减少 的静息能量消耗的其他病理学病况，例如患急性成淋巴细胞性白血 病的儿童。更多实例有性和生殖功能障碍(例如不育)、男性性腺功能 减退和女性多毛症、胃肠运动疾病(例如肥胖症相关的胃食道回流)、 呼吸疾病(例如肥胖症-通气不足综合征或Pickwickian综合征)、心血 管疾病、脑梗死、脑血栓形成、短暂性缺血发作、炎症(例如脉管结 构的全身性炎症)、动脉硬化、高胆固醇血症、高尿酸血症、脂肪 肝、痛风、胆囊疾病、整形外科疾病和腰背痛(lower back pain)。这 些疾病和病症在下面“例示性治疗用途”中讨论。
在本发明上下文中和在各术语使用的特定语境中，该说明书中 使用的术语一般具有其在本领域中的普通含义。在说明书的下文或 其他地方讨论一些术语，以便在描述本发明的组合物和方法以及如 何制造和使用它们方面给从业者提供额外的指导。根据使用术语的 特定语境，该术语的任何使用的范围或含义将显而易见。
鉴于测量的性质或精确度，“约”和“近似”通常指所测量的 量的可接受误差程度。例示性误差程度通常为给定值或值的范围的 20％内，优选10％内，和更优选5％内。
备选地，且特别地在生物学系统中，术语“约”和“近似”可 指值在给定值的数量级内，优选5倍内和更优选2倍内。除非另外 说明，本文给定的数值量为近似的，意味着当没有明确说明时可暗 示术语“约”和“近似”。
本发明的方法可包括序列间相互比较的步骤，包括野生型序列 与一个或多个突变体(序列变体)的比较。这样的比较通常包括多聚体 序列的比对，例如使用本领域熟知的序列比对程序和/或算法(例如 BLAST、FLAST和MEGALIGN，仅举几个实例)。熟练的技术人员 可容易认识到，在突变包含残基插入或缺失的这样的比对中，序列 比对将在不包含插入或缺失残基的多聚体序列中引入“空位(gap)” (通常由短线或“A”表示)。
本文所用术语“糖尿病”指非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM，亦 称为II型糖尿病)。I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)是胰岛 素绝对缺乏的结果，胰岛素为调节葡萄糖利用的激素。II型糖尿病或 胰岛素依赖性糖尿病(即非胰岛素依赖性糖尿病)通常在面对正常或甚 至升高的胰岛素水平时发生，并似乎是适当响应胰岛素的组织失能 的结果。大多数II型糖尿病亦肥胖。
在所有其语法形式和拼写变化中，“同源的”指具有“共同进 化起源”的两个蛋白间的关系，蛋白包括来自生物体的相同物种的 超家族的蛋白和来自生物体的不同物种的同源蛋白。这样的蛋白(及 其编码核酸)具有序列同源性，如通过它们的序列相似性反映，不管 按照百分比同一性还是通过特定残基或模体和保守位置的存在。
“肥胖症”是一种存在过量身体脂肪的病况。肥胖症的操作性 定义基于体重指数(BMI)，计算为体重/平方米身高(kg/m2)计算。“肥 胖症”指由医生诊断为肥胖的病况。一种标准分级系统如下所述通 常用于欧洲人、非洲人、美洲土著人或印第安人后裔，和一种备选 的系统通常用于亚洲患者。根据该系统，肥胖症定义为具有大于或 等于30kg/m2 BMI的其他方面健康的受试者，或具有至少一种同病 的受试者具有大于或等于27kg/m2 BMI的病况。
在所有其语法形式中，术语“序列相似性”指可能或可能不共 享共同进化起源的核酸序列或氨基酸序列间的同一性或一致性程 度。
然而，在通常的使用和本申请中，当以副词例如“高度”修饰 时，术语“同源的”可指序列相似性并可能或可能不涉及共同进化 起源。
2.ActRIIB多肽
在一些方面，本发明涉及ActRIIB变体多肽(例如可溶性 ActRIIB多肽)。任选地，片段、功能变体和修饰形式具有其相应野 生型ActRIIB多肽的相似或相同生物学活性。例如，本发明的 ActRIIB变体可与ActRIIB配体(例如激活蛋白A、激活蛋白AB、激 活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白E、GDF3、Nodal、GDF8或 GDF11)结合并抑制其功能。任选地，ActRIIB多肽调节例如脂肪、 肌肉、骨或软骨等组织的生长。ActRIIB多肽的实例包括人ActRIIB 前体多肽(SEQ ID NO：2)和可溶性人ActRIIB多肽(例如SEQ ID NO： 1、5、6、12、14和17)。
本说明书鉴定ActRIIB的功能活性部分和变体。申请人已经发 现，具有由Hilden等(Blood.1994年4月15日；83(8)：2163-70)公开的 序列的Fc融合蛋白在对应于SEQ ID NO：2的氨基酸64的位置上具 有丙氨酸(A64)，其对激活蛋白和GDF-11具有相对低的亲和力。与 之相反，在位置64带有精氨酸(R64)的相同Fc融合蛋白对激活蛋白 和GDF-11的亲和力在低纳摩尔浓度至高皮摩尔浓度范围内。因此在 本说明书中将带R64的序列用作人ActRIIB的野生型参考序列。
Attisano等(Cell.1992年1月10日；68(1)：97-108)显示，在 ActRIIB胞外结构域C末端脯氨酸结的缺失降低受体对激活蛋白的亲 和力。相对于包含脯氨酸结区和完整近膜结构域的ActRIIB(20-134)- Fc，包含SEQ ID NO：2的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白 “ActRIIB(20-119)-Fc”具有与GDF-11和激活蛋白降低的结合。然 而，即使脯氨酸结区是被破坏，ActRIIB(20-129)-Fc蛋白相对于野生 型仍保留相似但稍微降低的活性。因此，预期终止于氨基酸134、 133、132、131、130和129的ActRIIB胞外结构域都有活性，但终 止于134或133的构建体可能最有活性。类似地，预期在残基129- 134中任一个上的突变不因大的边缘(margin)改变配体结合亲和力。 P129和P130的突变实质上不减少配体结合，支持了该观点。因此 ActRIIB-Fc融合蛋白可最早终止于氨基酸109(最后的半胱氨酸)，然 而，预期终止于109和119或109和119之间的形式具有降低的配 体结合。氨基酸119保守性差，所以容易被改变或截去。终止于128 以后的形式保留配体结合活性。终止于119和127或119和127之 间的形式将具有中间结合能力。这些形式中的任一个可合意地使 用，这取决于临床环境或实验环境。
在ActRIIB的N末端，预期起始于氨基酸29以前的蛋白将保留 配体结合活性。氨基酸29代表首个半胱氨酸。位置24的丙氨酸突 变为天冬酰胺引入N-连接的糖基化序列，但实质上不影响配体结 合。这证明，在信号切割肽和半胱氨酸交联区之间的区(对应于氨基 酸20-29)中的突变被良好耐受。特别地，起始于位置20、21、22、 23和24的构建体将保留活性，并预期起始于位置25、26、27、28 和29的构建体亦保留活性。
总之，ActRIIB的活性部分包含SEQ ID NO：2的氨基酸29- 109，构建体可例如起始于对应氨基酸20-29的残基并终止于对应氨 基酸109-134的位置。其他实例包括起始于20-29或21-29的位置并 终止于119-134、119-133或129-134、129-133的位置的构建体。其 他实例包括起始于20-24(或21-24，或22-25)的位置并终止于109- 134(或109-133)、119-134(或119-113)或129-134(或129-133)的位置 的构建体。亦预期这些范围内的变体，尤其与SEQ ID NO：2的相应 部分具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的变体。
本说明书包括合成ActRIIB结构的分析的结果，其证明配体结 合口袋由残基Y31、N33、N35、L38-T41、E47、E50、Q53-K55、 L57、H58、Y60、S62、K74、W78-N83、Y85、R87、A92和E94- F101限定。在这些位置上，虽然K74A突变被良好耐受，但预期保 守突变将被耐受，如R40A、K55A、F82A和L79位置的突变。R40 在爪蟾中为K，表明在该位置碱性氨基酸将被耐受。Q53在牛 ActRIIB中为R且在爪蟾ActRIIB中为K，因此包括R、K、Q、N 和H在内的氨基酸在该位置将被耐受。因此，活性ActRIIB变体蛋 白的通式为这样的蛋白，其包含氨基酸29-109，但任选起始于20-24 或22-25的位置并终止于129-134的位置，且在配体结合口袋中包含 不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸改变，且在配体结合口袋中 的位置40、53、55、74、79和/或82上包含零、一或多个非保守性 改变。这样的蛋白可与SEQ ID NO：2的氨基酸29-109的序列保留超 过80％、90％、95％或99％的序列同一性。变异性可尤其被良好耐受 的结合口袋外位点包括胞外结构域(如上所述)的氨基和羧基末端和位 置42-46以及65-73。在位置65上天冬酰胺改变为丙氨酸(N65A)在 A64背景下实际上改进配体结合，并因此预期在R64背景下对配体 结合不具有不利的影响。该改变在A64背景下可能排除N65上的糖 基化，因此证明在该区的显著改变倾向于被耐受。虽然对R64A改变 耐受性差，但是R64K被良好耐受，并因此另外的碱性残基例如H 在位置64上可被耐受。
ActRIIB在几乎所有脊椎动物中保守性好，其中胞外结构域的许 多段序列完全保守。与ActRIIB结合的许多配体亦高度保守。因此， 来自不同脊椎动物生物体ActRIIB序列的比较提供对可被改变的残基 的了解。因此，活性的人ActRIIB变体可包含来自另一种脊椎动物 ActRIIB序列相应位置上的一个或多个氨基酸，或可包含与人或其他 脊椎动物序列中的残基相似的残基。以下实例阐明该方法以限定活 性ActRIIB变体。L46在爪蟾ActRIIB中为缬氨酸，所以该位置可被 改变，并任选可被改变为另一疏水残基例如V、I或F，或非极性残 基例如A。E52在爪蟾中为K，表明该位点可耐受大量的改变，包括 极性残基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能的A。T93 在爪蟾中为K，表明在该位置上耐受广泛的结构变异，偏好极性残 基例如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。F108在爪蟾中为Y， 因此Y或其他疏水基团例如I、V或L应被耐受。E111在爪蟾中为 K，表明带电残基在该位置上将被耐受，包括D、R、K和H，以及 Q和N。R112在爪蟾中为K，表明碱性残基在该位置上被耐受，包 括R和H。位置119的A相对保守性差，且在啮齿动物中表现为P 和在爪蟾中表现为V，因此基本上任何氨基酸在该位置上均应被耐 受。
本说明书证明，加入另外的N-连接的糖基化位点(N-X-S/T)相对 于ActRIIB(R64)-Fc形式增加ActRIIB-Fc融合蛋白的血清半寿期。通 过在位置24上引入天冬酰胺(A24N构建体)，产生赋予较长半寿期的 NXT序列。在42-44(NQS)和65-67(NSS)上发现其他NX(T/S)序列， 但是用位置64上的R可能无法将后者有效糖基化。可通常在配体结 合口袋外的位置上引入N-X-S/T序列。用于引入非内源N-X-S/T序 列的特别合适的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、 120-134或129-134。亦可将N-X-S/T序列引入到ActRIIB序列和Fc 或其他融合部分间的接头中。可通过将N引入相对于已有的S或T 的正确位置或在与已有的N相应的位置上引入S或T，以最小的努 力引入这样的位点。因此，可产生N-连接的糖基化位点的合意的改 变为：A24N、R64N、S67N(可能与N65A改变组合)、E106N、 R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T。由于 通过糖基化提供的保护，无需产生免疫原性位点即可将预测为糖基 化的任何S改变为T。同样地，预测为糖基化的任何T可改变为S。 因此预期改变S67T和S44T。同样地，在A24N变体中、可使用 S26T改变。因此ActRIIB变体可包含一个或多个额外的非内源N-连 接的糖基化共有序列。
可将位置L79改变为赋予改变的激活蛋白-肌肉抑制素(GDF-11) 结合特性。L79A或L79P降低GDF-11结合比降低激活蛋白结合的 程度高。L79E或L79D保留GDF-11结合。显著地，L79E和L79D 变体具有大大降低的激活蛋白结合。体内实验表明这些非激活蛋白 受体保留显著的能力以增加肌肉质量，但显示对其他组织的作用降 低。这些数据表明获得对激活蛋白作用降低的多肽的合意性和可行 性。
所述的变异可以不同方式组合。此外，本文所述的诱变程序的 结果表明，在ActRIIb中存在通常有益于保守的氨基酸位置。这些包 括位置64(碱性氨基酸)、位置80(酸性或疏水氨基酸)、位置78(疏 水的，并特别为色氨酸)、位置37(酸性的，并特别为天冬氨酸或谷 氨酸)、位置56(碱性氨基酸)、位置60(疏水氨基酸，特别为苯丙氨 酸或酪氨酸)。因此在本文公开的每个变体中，本说明书提供可能保 守的氨基酸框架。可能需要保守的其他位置如下所述：位置52(酸性 氨基酸)、位置55(碱性氨基酸)、位置81(酸性)、98(极性或带电荷 的，特别为E、D、R或K)。
在特定实施方案中，ActRIIB多肽的分离的片段可通过筛选重组 产生自编码ActRIIB多肽的核酸(例如SEQ ID NO：3和4)的相应片段 重组产生的多肽而获得。另外，可使用本领域已知的技术例如常规 的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成片段。可产生(重组 或通过化学合成)和测试片段，以鉴定可例如作为ActRIIB蛋白或 ActRIIB配体的拮抗剂(抑制剂)或激动剂(激活剂)起作用的那些肽基 片段。
在特定实施方案中，ActRIIB多肽的功能变体具有与选自SEQ ID NO：1、2、5、6、12、14和17的氨基酸序列有至少75％同一性 的氨基酸序列。在特定实例中，功能变体具有与选自SEQ ID NO： 1、2、5、6、12、14和17的氨基酸序列有至少80％、85％、90％、 95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在特定实施方案中，本发明预期通过修饰ActRIIB多肽的结构 制造功能变体，用于例如增强治疗功效或稳定性(例如先体外后体内 的保存期限和体内蛋白酶降解抗性)等目的。亦可产生修饰的 ActRIIB多肽，例如通过氨基酸置换、缺失或添加。例如，合理预期 单独用异亮氨酸或缬氨酸置换亮氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸、丝氨 酸置换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似置换(例如保 守突变)将不会对所产生的分子的生物学活性具有主要的影响。保守 置换为在其侧链相关的氨基酸的家族内发生的置换。在ActRIIB多肽 的氨基酸序列中的改变是否导致功能同源物，可通过评估变体 ActRIIB多肽在细胞中以类似于野生型ActRIIB多肽的方式产生反应 的能力或以类似于野生型的方式与一种或多种配体例如激活蛋白(激 活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白C和激活蛋白E)、Nodal、 GDF3、GDF11或肌肉抑制素结合的能力而容易地测定。
在特定的实施方案中，本发明预期ActRIIB多肽的特定突变以 便改变多肽的糖基化。在ActRIIB多肽中的例示性糖基化位点在 SEQ ID NO：2中阐明。可选择这样的突变以便引入或消除一个或多 个糖基化位点，例如O-连接或N-连接糖基化位点。天冬酰胺连接的 糖基化识别位点通常包含由合适的细胞糖基化酶特异性识别的三肽 序列，天冬酰胺-X-苏氨酸(其中“X”为任何氨基酸)。亦可通过向野 生型ActRIIB多肽的序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基 而作出改变(用于O-连接糖基化位点)。在糖基化识别位点的第一个 或第三个氨基酸位置之一或两者上的不同氨基酸置换或缺失(和/或在 第二个位置上的氨基酸缺失)导致在修饰的三肽序列上非糖基化。在 ActRIIB多肽上增加碳水化合物部分的数量的另一个方法为通过将糖 苷与ActRIIB多肽化学或酶促偶联。取决于使用的偶联模式，糖可连 接于(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸 的巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基；(e) 芳香族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基；或(f) 谷氨酰胺的酰胺基。这些方法在1987年9月11日公开的WO 87/05330和在Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，第 259-306页中有述，它们通过引用结合到本文中。除去存在于 ActRIIB多肽上的一个或多个碳水化合物部分可以化学方法和/或酶 方法完成。化学去糖基化可包括例如使ActRIIB多肽暴露于化合物三 氟甲磺酸或等效化合物。虽然剩下完整的氨基酸序列，但是该处理 导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所 有糖的切割。化学去糖基化由Hakimuddin等(1987)Arch.Biochem. Biophys.259：52和Edge等(1981)Anal.Biochem.118：131进一步描 述。ActRIIB多肽上的碳水化合物部分的酶切割可通过使用由 Thotakura等(1987)Meth.Enzymol.138：350所述的各种内切糖苷酶和 外切糖苷酶而完成。取决于所使用的表达系统类型可酌情调整 ActRIIB多肽的序列，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可引 入不同的糖基化图式，这些图式可受该肽的氨基酸序列影响。通 常，用于在人类中使用的ActRIIB蛋白将在提供合适糖基化的哺乳动 物细胞系例如HEK293或CHO细胞系中表达，但是预期其他哺乳动 物表达细胞系也是有用的。
本说明书还预期产生变体的方法，变体尤其是ActRIIB多肽的 组合变体的集合，任选包括截短变体；组合突变体池尤其可用于鉴 定功能变体序列。筛选这样的组合文库的目的可以是产生例如具有 改变的特性(例如改变的药代动力学或改变的配体结合)的ActRIIB多 肽变体。下面提供各种筛选测定，并且这种测定可用于评估变体。 例如可针对与ActRIIB多肽结合以防止ActRIIB配体与ActRIIB多肽 结合的能力筛选ActRIIB多肽变体。
ActRIIB多肽或其变体的活性亦可在基于细胞的测定或体内测定 中测试。例如可评估ActRIIB多肽变体对参与脂肪细胞分化或功能的 基因的表达的影响(例如UCP-1)。这可视需要在一种或多种重组 ActRIIB配体蛋白(例如GDF8)的存在下进行，并可转柒细胞以产生 ActRIIB多肽和/或其变体和任选产生ActRIIB配体。同样地，可将 ActRIIB多肽给予小鼠或其他动物，并可评估脂肪细胞的一种或多种 特性，例如棕色脂肪细胞产热。相似地，可在脂肪细胞、肌细胞、 骨细胞和神经细胞中测试ActRIIB多肽或其变体的活性对这些细胞的 生长的任何影响，例如通过下述测定。这种测定在本领域是公知的 和常规的。可在这样的细胞系中使用SMAD反应性报告基因监测对 下游信号转导的影响。
可产生具有与天然存在的ActRIIB多肽相关的选择性效能的组 合衍生变体。当从重组DNA构建体中表达时，这样的变体蛋白可在 基因治疗方案中使用。同样地，诱变可产生具有与相应的野生型 ActRIIB多肽显著不同的胞内半寿期的变体。例如，可使改变的蛋白 对蛋白酶降解或导致天然ActRIIB多肽的破坏或以其它方式失活的其 他过程更稳定或更不稳定。这种变体和编码它们的基因可用于通过 调节ActRIIB多肽的半寿期改变ActRIIB多肽水平。例如，短的半寿 期可导致更短暂的生物学作用，且当部分的可诱导表达系统时，可 允许更紧密控制细胞内的重组ActRIIB多肽水平。
在特定实施方案中，本发明的ActRIIB多肽除了天然存在于 ActRIIB多肽中的任何修饰外，还可包含翻译后修饰。这种修饰包括 但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，修 饰的ActRIIB多肽可包含非氨基酸成分，例如聚乙二醇、脂质、多糖 或单糖和磷酸酯。这种非氨基酸成分对ActRIIB多肽的功能的影响可 如本文所述地针对其他ActRIIB多肽变体测试。当ActRIIB多肽在细 胞中通过切割ActRIIB多肽的初生形式产生时，翻译后加工亦对蛋白 的正确折叠和/或功能重要。不同细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、 293、WI38、NIH-3T3或HEK293)对于这种翻译后活性具有特定的细 胞系统和特有的机制，并可选择不同细胞以确保ActRIIB多肽的正确 修饰和加工。
在一些方面，ActRIIB多肽的功能变体或修饰形式包括具有至少 部分的ActRIIB多肽和一个或多个融合结构域的融合蛋白。这种融合 结构域的公知实例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽-S-转 移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区 (例如Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可选择融合结构 域以赋予所需的特性。例如，一些融合结构域特别可用于通过亲和 层析分离融合蛋白。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析的相 关基质，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多这种 基质以“试剂盒”形式可得，例如Pharmacia GST纯化系统和与 (HIS6)融合伴侣一起使用的QIAexpressTM系统(Qiagen)。作为另一个 实例，可选择融合结构域以有助于ActRIIB多肽的检测。这种检测结 构域的实例包括各种荧光蛋白(例如GFP)和“表位标签”，“表位标 签”通常为有特异性抗体可用的短肽序列。可容易获得特异性单克 隆抗体的公知表位标签包括FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和 c-myc标签。在一些情况中，融合结构域具有蛋白酶切割位点，例如 Xa因子或凝血酶，其使相关的蛋白酶能够部分消化融合蛋白并因此 从中释放重组蛋白。可接着通过随后的层析分离将释放的蛋白与融 合结构域分离。在特定优选实施方案中，ActRIIB多肽与使ActRIIB 多肽在体内稳定的结构域(“稳定化”结构域)融合。“稳定化”指增 加血清半寿期的任何情况，不管这是由于减少的破坏、降低的肾清 除率或其他药代动力学作用。与免疫球蛋白的Fc部分的融合已知对 许多蛋白赋予所需的药代动力学特性。同样地，与人血清白蛋白的 融合可赋予所需的特性。可选择的其他融合结构域类型包括多聚化 (例如二聚化、四聚化)结构域和功能结构域(赋予额外的生物学功 能，例如进一步刺激肌肉生长)。
作为特定的实例，本发明提供作为GDF8拮抗剂的融合蛋白， 其包含与Fc结构域融合的胞外(例如GDF8结合)结构域(例如SEQ ID NO：13)。
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPV PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSL SLSPGK
任选地，Fc结构域在残基例如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434 上具有一个或多个突变。在特定情况下，具有一个或多个这些突变 (例如Asp-265突变)的突变体Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有 降低的与Fcγ受体结合的能力。在其他情况中，具有一个或多个这些 突变(例如Asn-434突变)的突变体Fc结构域相对于野生型Fc结构域 具有增加的与MHC I类相关Fc受体(FcRN)结合的能力。
应当理解，融合蛋白的不同成分可按与所需功能一致的任何方 式排列。例如，可排列ActRIIB多肽使C-末端对着异源结构域，或 备选地，可排列异源结构域使C-末端对着ActRIIB多肽。ActRIIB多 肽结构域和异源结构域在融合蛋白中不需要相邻，且可包含额外的 结构域或氨基酸序列使C-末端或N-末端对着任一结构域或将额外的 结构域或氨基酸序列包含在结构域之间。
在特定实施方案中，本发明的ActRIIB多肽包含能够使ActRIIB 多肽稳定的一个或多个修饰。例如，这种修饰增加ActRIIB多肽的体 外半寿期、增加ActRIIB多肽的循环半寿期或降低ActRIIB多肽的蛋 白酶降解。这种稳定化修饰包括但不限于融合蛋白(包括例如包含 ActRIIB多肽和稳定化结构域的融合蛋白)、糖基化位点的修饰(包括 例如将糖基化位点加入ActRIIB多肽)和碳水化合物部分的修饰(包括 例如从ActRIIB多肽上除去碳水化合物部分)。就融合蛋白而言， ActRIIB多肽与稳定化结构域例如IgG分子(例如Fc结构域)融合。如 本文所用，术语“稳定化结构域”不仅指如就融合蛋白而言的融合 结构域(例如Fc)，而且包括非蛋白修饰(例如碳水化合物部分)或非蛋 白聚合物(例如聚乙二醇)。
在特定实施方案中，本发明使ActRIIB多肽的分离形式和/或纯 化形式可得，其与其他蛋白分离，或者基本上不含其他蛋白。
在特定实施方案中，本发明的ActRIIB多肽(未修饰的或修饰的) 可通过许多本领域已知的技术产生。例如，这种ActRIIB多肽可使用 标准蛋白质化学技术合成，例如使用Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Vetlag，Berlin(1993)和Grant G.A.(主编)， Synthetic Peptides：A User′s Guide，W.H.Freeman和Company，New York(1992)中所述的技术。另外，自动化肽合成器有市售(例如 Advanced ChemTech Model 396；Milligen/Biosearch 9600)。备选地， 可使用本领域公知(也参见下文)的各种表达系统(例如，大肠杆菌、 中国仓鼠卵巢细胞、COS细胞、杆状病毒)重组产生ActRIIB多肽、 其片段或变体。在另一个实施方案中，可通过使用例如蛋白酶(例如 胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶)或成对碱性氨基酸 转化酶(PACE)消化天然存在的或重组产生的全长ActRIIB多肽，产 生修饰的或未修饰的ActRIIB多肽。计算机分析(使用市售软件，例 如MacVector，Omega，PCGene，Molecular Simulation，Inc.)可用于鉴定 蛋白酶切割位点。备选地，这种ActRIIB多肽可产生自天然存在或重 组产生的全长ActRIIB多肽，例如通过本领域已知的标准技术，例如 化学切割(例如溴化氰、羟胺)。
3.编码ActRIIB多肽的核酸
在一些方面，本发明提供编码任何ActRIIB多肽(例如可溶性 ActRIIB多肽)(包括任何本文公开的变体)的分离的和/或重组核酸。 例如，以下序列编码天然存在的人ActRIIB前体多肽(SEQ ID NO：4) (NM_001106的核苷酸5-1543，1539bp)：
atgacggcgccctgggtggccctcgccctcctctggggatcgctgtggcccggctct gggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggagctg gagcgcaccaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctg cactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggc tgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggag aacccccaggtgtacttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttcact catttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagccccc accctgctcacggtgctggcctactcactgctgcccatcgggggcctttccctcatc gtcctgctggccttttggatgtaccggcatcgcaagcccccctacggtcatgtggac atccatgaggaccctgggcctccaccaccatcccctctggtgggcctgaagccactg cagctgctggagatcaaggctcgggggcgctttggctgtgtctggaaggcccagctc atgaatgactttgtagctgtcaagatcttcccactccaggacaagcagtcgtggcag agtgaacgggagatcttcagcacacctggcatgaagcacgagaacctgctacagttc attgctgccgagaagcgaggctccaacctcgaagtagagctgtggctcatcacggcc ttccatgacaagggctccctcacggattacctcaaggggaacatcatcacatggaac gaactgtgtcatgtagcagagacgatgtcacgaggcctctcatacctgcatgaggat gtgccctggtgccgtggcgagggccacaagccgtctattgcccacagggactttaaa agtaagaatgtattgctgaagagcgacctcacagccgtgctggctgactttggcttg gctgttcgatttgagccagggaaacctccaggggacacccacggacaggtaggcacg agacggtacatggctcctgaggtgctcgagggagccatcaacttccagagagatgcc ttcctgcgcattgacatgtatgccatggggttggtgctgtgggagcttgtgtctcgc tgcaaggctgcagacggacccgtggatgagtacatgctgccctttgaggaagagatt ggccagcacccttcgttggaggagctgcaggaggtggtggtgcacaagaagatgagg cccaccattaaagatcactggttgaaacacccgggcctggcccagctttgtgtgacc atcgaggagtgctgggaccatgatgcagaggctcgcttgtccgcgggctgtgtggag gagcgggtgtccctgattcggaggtcggtcaacggcactacctcggactgtctcgtt tccctggtgacctctgtcaccaatgtggacctgccccctaaagagtcaagcatctaa
以下序列编码人可溶性(胞外)ActRIIB多肽(SEQ ID NO：3)(348 bp)。
tctgggcgtggggaggctgagacacgggagtgcatctactacaacgccaactgggag ctggagcgcaccaaccagagcggcctggagcgctgcgaaggcgagcaggacaagcgg ctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaag ggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgag gagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgaaggcaacttctgcaacgagcgcttc actcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgacagcc cccacc
主题核酸可为单链的或双链的。这种核酸可为DNA或RNA分 子。这些核酸可例如在用于制备ActRIIB多肽的方法中使用，或作为 直接治疗物质(例如在基因治疗方法中)使用。
在一些方面，编码ActRIIB多肽的主题核酸还理解为包括为 SEQ ID NO：3变体的核酸。变体核苷酸序列包括相差一个或多个核 苷酸置换、添加或缺失的序列，例如等位变体；和将因此包括与 SEQ ID NO：4所示编码序列的核苷酸序列不同的编码序列。
在特定实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO：3具有至少 80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的分离的 或重组核酸序列。本领域的普通技术人员将认识到，与SEQ ID NO： 3互补的核酸序列和SEQ ID NO：3的变体亦在本发明的范围内。在 另外的实施方案中，本发明的核酸序列可为分离的、重组的和/或与 异源核苷酸序列融合，或在DNA文库中。例如，本发明提供与SEQ ID NO：10或15具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、 99％或100％同一性的分离的或重组核酸序列。
在其他实施方案中，本发明的核酸亦包括在高度严格条件下与 SEQ ID NO：3所示核苷酸序列、SEQ ID NO：3的互补序列或其片段 杂交的核苷酸序列。如上文所述，本领域的普通技术人员将容易理 解促进DNA杂交的合适严格条件可变化。本领域的普通技术人员将 容易理解促进DNA杂交的合适严格条件可变化。例如，可在约45℃ 在6.0x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)下进行杂交，接着在50℃进行2.0x SSC的洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从50℃约2.0x SSC的低 严格性至50℃约0.2x SSC的高严格性中选择。另外，洗涤步骤中的 温度可从室温(约22℃)低严格条件增加至约65℃高严格条件。温度 和盐两者都可变化，或者温度或盐浓度可保持不变，而改变另一个 变量。在一个实施方案中，本发明提供在室温6x SSC的低严格条件 下杂交接着在室温2x SSC下洗涤的核酸。
由于遗传密码的简并性而与SEQ ID NO：3所示核酸不同的分离 的核酸亦在本发明的范围内。例如，许多氨基酸由超过一个三联体 指定。指定相同氨基酸的密码子或同义密码子(例如CAU和CAC为 组氨酸的同义密码子)可导致不影响蛋白的氨基酸序列的“沉默”突 变。然而，预期的确导致主题蛋白质的氨基酸序列改变的DNA序列 多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域的技术人员将认识到，编 码特定蛋白的核酸的一个或多个核苷酸(可达约3-5％的核苷酸)中的 这些变异由于天然等位变异可存在于给定物种的个体中。任何和所 有这种核苷酸变异以及所产生的氨基酸多态性在本发明的范围内。
在特定实施方案中，本发明的重组核酸可与表达构建体中的一 种或多种调节核苷酸序列有效连接。调节核苷酸序列将通常适合于 用于表达的宿主细胞。用于不同宿主细胞的许多类型的适当表达载 体和合适的调节序列是本领域已知的。通常，所述一种或多种调节 核苷酸序列可包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核 糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增 强子序列或激活子(activator)序列。本领域所知的组成型启动子或诱 导型启动子为本发明所预期。启动子可为天然存在的启动子或组合 超过一个启动子的元件的杂合启动子。表达构建体可存在于细胞内 的附加体(例如质粒)上，或者表达构建体可插入染色体中。在一个优 选的实施方案中，表达载体包含选择性标记基因以允许选择转化的 宿主细胞。选择性标记基因是本领域公知的，并将随所使用的宿主 细胞而变化。
在本发明的一些方面，主题核酸在包含编码ActRIIB多肽并与 至少一种调节序列有效连接的核苷酸序列的表达载体中提供。调节 序列是本领域已知的并被选择用于指导ActRIIB多肽的表达。因此， 术语调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。例示性的 调节序列见述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)。例如，当与其有 效连接时控制DNA序列表达的多种表达控制序列中的任一种可在这 些载体中使用，以表达编码ActRIIB多肽的DNA序列。这种有用的 表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺 病毒或巨细胞病毒即时早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系 统、TAC或TRC系统、由T7 RNA聚合酶指导表达的T7启动子、λ 噬菌体的主要操纵基因和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘 油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如 Pho5)、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子和 已知控制原核细胞或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列，以 及其不同组合。应该理解，表达载体的设计可取决于例如待转化宿 主细胞的选择和/或需要表达的蛋白类型等因素。此外，也应该考虑 载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白(例 如抗生素标记)的表达。
本发明的重组核酸可通过将克隆的基因或其部分连接到适合于 在原核细胞、真核细胞(酵母、禽类、昆虫或哺乳动物)或两者中表达 的载体中产生。用于产生重组ActRIIB多肽的表达载体包括质粒和其 他载体。例如，合适的载体包括以下类型的质粒：pBR322衍生的质 粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和 pUC衍生的质粒，用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达。
一些哺乳动物表达载体包含促进载体在细菌中增殖的原核序列 和一个或多个在真核细胞中表达的真核转录单位两者。 pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2- dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生的载 体为适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。这些载体中 的一些用来自细菌质粒(例如pBR322)的序列修饰，以便有助于在原 核细胞和真核细胞两者中的复制和药物抗性选择。备选地，病毒例 如牛乳头状瘤病毒(BPV-1)或EB病毒(pHEBo、pREP衍生的和p205) 的衍生物可用于真核细胞中蛋白的瞬时表达。其他病毒(包括逆转录 病毒)表达系统的实例可在下文基因治疗递送系统的描述中找到。在 质粒的制备中和宿主生物的转化中使用的各种方法是本领域公知 的。关于原核细胞和真核细胞两者的其他合适表达载体以及一般重 组方法，参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，主编 Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)第16和17章。在一些情况中，通过使用杆状病毒表达系统表 达重组多肽是合意的。这种杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生 的载体(例如pVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUW衍生的载体 (例如pAcUW1)和pBlueBac衍生的载体(例如包含β-gal的pBlueBac III)。
在一个优选的实施方案中，将载体设计用于在CHO细胞中产生 主题ActRIIB多肽，例如Pcmv-Script载体(Stratagene、La Jolla、 Calif)、pcDNA4载体(Invitrogen、Carlsbad、Calif)和PCI-neo载体 (Promega，Madison，Wisc.)。主题基因构建体可用于引起主题ActRIIB 多肽在培养物中增殖的细胞中表达将是明显的，例如产生用于纯化 的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白。
本发明亦涉及用重组基因转染的宿主细胞，该重组基因包含一 种或多种主题ActRIIB多肽的编码序列(例如SEQ ID NO：3、4、10 或15)。宿主细胞可为任何原核细胞或真核细胞。例如，本发明的 ActRIIB多肽可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如使用杆状 病毒表达系统)、酵母或哺乳动物细胞中表达。其他合适的宿主细胞 为本领域的技术人员所知。
因此，本发明还涉及产生主题ActRIIB多肽的方法。例如，可 在合适条件下培养用编码ActRIIB多肽的表达载体转染的宿主细胞， 以允许ActRIIB多肽的表达发生。ActRIIB多肽可从细胞混合物和包 含ActRIIB多肽的培养基中分泌和分离。备选地，ActRIIB多肽可保 留在胞质中或膜组分中和收集的裂解细胞中以及分离的蛋白中。细 胞培养物包含宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合 适培养基是本领域公知的。主题ActRIIB多肽可使用本领域已知用于 纯化蛋白的技术(包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳和 使用对ActRIIB多肽的特定表位特异的抗体的免疫亲和纯化)从细胞 培养基、宿主细胞或两者中分离。在一个优选的实施方案中， ActRIIB多肽为包含促进其纯化的结构域的融合蛋白。
在另一实施方案中，编码纯化前导序列(例如重组ActRIIB多肽 的所需部分的N-末端的多-(His)/肠激酶切割位点序列)的融合基因， 可使表达的融合蛋白能够通过使用Ni2+金属树脂的亲和层析纯化。然 后，纯化前导序列可随后通过肠激酶处理而除去，以提供纯化的 ActRIIB多肽(例如参见Hochuli等，(1987)J.Chromatography 411：177 和Janknecht等，PNAS USA 88：8972)。
用于制备融合基因的技术是公知的。本质上，编码不同多肽序 列的各种DNA片段的连接依照常规技术进行，使用平头末端或交错 末端用于连接，限制酶消化以提供合适的末端，视情况补平黏性末 端，碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接、和酶促连接。在另一实 施方案中，可通过常规技术(包括自动化DNA合成器)合成融合基 因。备选地，可使用引起两个连续基因片段之间的互补突出端的锚 定引物进行基因片段的PCR扩增，互补突出端随后可被退火以产生 嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，主编 Ausubel等，John Wiley & Sons：1992)。
4.抗体和其他拮抗剂
本发明的另一方面涉及抗体和其他拮抗剂，包括与本文公开的 靶标结合的蛋白和抑制本文公开的靶标表达的核酸。与ActRIIB多肽 (例如可溶性ActRIIB多肽)特异反应并与ActRIIB多肽竞争结合的抗 体可作为ActRIIB多肽活性的拮抗剂使用。例如，通过使用来源于 ActRIIB多肽的免疫原，可通过标准方案制备抗-蛋白/抗-肽抗血清或 单克隆抗体(参见例如由Harlow和Lane主编的Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press：1988))。可用ActRIIB多 肽或配体、能够引起抗体反应的抗原片段或融合蛋白的免疫原形式 免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔。用于赋予蛋白或肽免疫原性 的技术包括与载体缀合或本领域公知的其他技术。可在佐剂存在下 给予ActRIIB多肽或配体的免疫原部分。可通过检测血浆或血清中的 抗体滴度监测免疫进程。以免疫原作为抗原，可使用标准ELISA或 其他免疫测定来评估抗体的水平。
在用ActRIIB多肽或配体的抗原制剂免疫动物后，可获得抗血 清，且视需要可从血清中分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体， 可从免疫的动物中收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)，并通过标准体细 胞融合程序与无限增殖化细胞例如骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细 胞。这种技术在本领域中是公知的，并且包括例如杂交瘤技术(最初 由Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-497开发)、人B细胞杂 交瘤技术(Kozbar等，1983，Immunology Today，4：72)和产生人单克隆 抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.第77-96页)。可免疫化学筛选杂交 瘤细胞用于产生与ActRIIB多肽特异性反应的抗体和分离自包含这种 杂交瘤细胞的培养物的单克隆抗体。
本文所用术语“抗体”旨在包括亦与主题ActRIIB多肽或配体 特异性反应的其片段。可使用常规技术将抗体片段化，并以与上文 所述用于完整抗体的相同的方法筛选片段的效用。例如，可通过用 胃蛋白酶处理抗体产生F(ab)2片段。可处理产生的F(ab)2片段以还原 二硫桥而产生Fab片段。本发明的抗体还旨在包括具有由抗体的至 少一个CDR区赋予的对ActRIIB多肽的亲和力的双特异性、单链和 嵌合以及人源化分子。在优选的实施方案中，抗体还包含与其连接 的标记并能够被检测(例如，标记可为放射性同位素、荧光化合物、 酶或酶辅因子)。
在特定优选实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体，和在特 定实施方案中，本发明使用于产生新抗体的方法可得。例如，用于 产生与ActRIIB多肽或配体特异性结合的单克隆抗体的方法可包括： 给予小鼠一定量的包含ActRIIB多肽或配体的免疫原性组合物以有效 刺激可检测的免疫反应，从小鼠中获得产生抗体的细胞(例如脾细胞) 并将产生抗体的细胞与杂交瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤， 和测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生与ActRIIB多肽或配体特异性结 合的单克隆抗体的杂交瘤。一旦获得，杂交瘤可在细胞培养物中增 殖，任选在杂交瘤衍生的细胞产生与ActRIIB多肽或配体特异性结合 的单克隆抗体的培养条件下。可从细胞培养物中纯化单克隆抗体。
在用于抗体时，形容词“与...特异性反应”旨在指与本领域通 常理解的一样，抗体在目标抗原(例如ActRIIB多肽)和其他非目标抗 原间有充分的选择性，使得抗体在最低限度可用于检测特定类型的 生物学样品中目标抗原的存在情况。在使用抗体的特定方法中，例 如治疗应用，较高程度的结合特异性可为所需的。单克隆抗体一般 具有较大的倾向(与多克隆抗体相比较)以有效区分所需的抗原和交联 反应的多肽。影响抗体：抗原相互作用的特异性的一个特征是抗体对 抗原的亲和力。虽然所需的特异性可以不同亲和力范围实现，但是 通常优选的抗体将具有约10-6、10-7、10-8、10-9或更低的亲和力(解离 常数)。
另外，用于筛选抗体以鉴定所需抗体的技术可影响所获得的抗 体的性质。例如，如果抗体用于在溶液中结合抗原，那么测试溶液 结合可是合意的。用于测试抗体和抗原间相互作用以鉴定特别合意 的抗体的许多不同技术是可得的。这种技术包括ELISA、表面等离 振子共振结合测定(例如Biacore结合测定，Bia-core AB，Uppsala， Sweden)、夹心测定(例如IGEN International，Inc.，Gaithersburg， Maryland的顺磁珠系统)、蛋白质印迹、免疫沉淀测定和免疫组织化 学。
在一些方面，本说明书提供与可溶性ActRIIB多肽或配体结合 的抗体。可基本上如上文所述地产生这样的抗体，使用可溶性 ActRIIB多肽或配体或其片段作为抗原。该类型的抗体可用于例如检 测生物学样品中的ActRIIB多肽和/或监测个体中的可溶性ActRIIB 多肽水平。在特定情况下，与可溶性ActRIIB多肽或配体特异性结合 的抗体可用于调节ActRIIB多肽和/或ActRIIB配体的活性，从而增 加产热脂肪细胞。
可通过使用包含各自前肽的结合部分的多肽或其变体，抑制特 定配体例如肌肉抑制素和GDF3。这种前肽可制备为融合蛋白，包括 Fc融合蛋白。合适前肽的实例在公开专利申请WO 02/085306和WO 06/002387中公开。
此外，可使用其他结合蛋白，例如所谓的“诱捕器(trap)”(例如 促滤泡素抑制素、FLRG、FSTL、Cerberus和Coco)、可溶性I型受 体，例如ALK-7。这种多肽的实例可见于公开专利申请WO 05/115439、WO 08/109779、WO 08/067480、WO 07/109686、WO 05/100563和WO 05/025601。
可使用核酸，例如反义或RNAi探针(其可包含天然存在的核苷 酸和非天然存在的核苷酸两者)，以抑制ActRIIB或本文讨论的任何 配体的表达。
5.筛选测定
在一些方面，本发明涉及主题ActRIIB多肽(例如可溶性 ActRIIB多肽)鉴定是ActRIIB多肽的激动剂或拮抗剂的化合物(物质) 的用途。通过该筛选鉴定的化合物可在例如脂肪、肌肉、骨、软骨 和/或神经元等组织中测试，以评估其体外调节组织生长的能力。任 选地，这些化合物可进一步在动物模型中测试以评估其体内调节组 织生长的能力。
存在许多方法用于筛选通过靶向ActRIIB多肽来调节组织生长 的治疗物质。在特定实施方案中，可进行化合物的高通量筛选，以 鉴定干扰ActRIIB介导的对脂肪、肌肉、骨、软骨和/或神经元的生 长的作用的物质。在特定实施方案中，进行测定以筛选和鉴定特异 性抑制或减少ActRIIB多肽与其结合配偶体例如ActRIIB配体(例如 激活蛋白、GDF3、Nodal、GDF8或GDF11)的结合的化合物。备选 地，测定可用于鉴定增强ActRIIB多肽与其结合蛋白(例如ActRIIB 配体)结合的化合物。在另一个实施方案中，可通过其与ActRIIB多 肽相互作用的能力鉴定化合物。
各种测定形式将足够，但是根据本说明书，未在文中清楚描述 的测定形式将被本领域的普通技术人员理解。如本文所述，本发明 的测试化合物(物质)可通过任何组合化学方法产生。备选地，主题化 合物可为体内或体外合成的天然存在的生物分子。测试其作为组织 生长调节剂的能力的化合物(物质)可例如通过细菌、酵母、植物或其 他生物产生(例如天然产物)、以化学方法产生(例如小分子，包括肽 模拟物)或以重组方法产生。本发明预期的测试化合物包括非肽基有 机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖、激素和核酸分子。在一个特定 实施方案中，测试物质为具有小于约2,000道尔顿的分子量的有机小 分子。
本发明的测试化合物可作为单独的离散实体提供，或在更复杂 的文库中提供，例如通过组合化学制备。这些文库可包括例如醇、 卤代烷、胺、酰胺、酯、醛、醚和其他类有机化合物。将测试化合 物呈现给测试系统可以以分离的形式或作为化合物的混合物，尤其 在最初的筛选步骤中。任选地，化合物可任选用其他化合物衍生， 并且具有促进化合物分离的衍生化基团。衍生化基团的非限制性实 例包括生物素、荧光素、digoxygenin、绿色荧光蛋白、同位素、多 组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶(GST)、可光活化的交联剂或其任 何组合。
在许多测试化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，为了 在给定时间期间内使研究的化合物的数量最大化，高通量测定是合 意的。在无细胞系统中进行的测定(例如使用纯化或半纯化的蛋白得 到的)通常优选为“主要”筛选，因为可产生它们以允许由测试化合 物介导的分子靶标中的改变的快速开发和相对容易的检测。此外， 测试化合物对细胞毒性或生物利用度的影响在体外系统中一般可被 忽视，反而测定主要集中于药物对分子靶标的影响，如在ActRIIB多 肽和其结合蛋白(例如ActRIIB配体)间结合亲和力的改变所显示的。
仅为了说明，在本发明的一个例示性筛选测定中，将目标化合 物与分离且纯化的ActRIIB多肽相接触，该多肽通常能够与ActRIIB 配体结合，视情况用于测定的目的。接着将包含ActRIIB配体的组合 物加入化合物和ActRIIB多肽的混合物中。ActRIIB/ActRIIB配体复 合体的检测和定量提供用于测定化合物抑制(或加强)ActRIIB多肽和 其结合蛋白间的复合体形成的功效的方法。化合物的功效可通过从 使用不同浓度的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线来评估。 此外，亦可进行对照测定以提供比较基线。例如，在对照测定中， 将分离且纯化的ActRIIB配体加入到包含ActRIIB多肽的组合物中， 并在测试化合物不存在时定量ActRIIB/ActRIIB配体复合物的形成。 通常可以理解，反应物可能的混合次序可不同，并可同时混合。此 外，细胞提取物和裂解物可代替纯化的蛋白使用以提供合适的无细 胞测定系统。
可通过多种技术检测ActRIIB多肽和其结合蛋白间的复合体形 成。例如，可通过免疫测定或通过层析检测，使用例如可检测标记 的蛋白例如放射性标记的(例如32P、35S、14C或3H)、荧光标记的(例 如FITC)或酶标记的ActRIIB多肽或其结合蛋白定量复合体形成的调 节。
在特定实施方案中，本发明预期使用荧光偏振测定和荧光共振 能量转移(FRET)测定直接或间接测量ActRIIB多肽和其结合蛋白间 相互作用的程度。另外，其他检测方式，例如基于光波导的检测方 式(PCT公开说明书WO 96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等 离振子共振(SPR)、表面电荷传感器、表面力传感器与本发明的许多 实施方案适合。
此外，本发明预期使用相互作用诱捕测定(亦称为“双杂交测 定”)鉴定破坏或加强ActRIIB多肽和其结合蛋白间相互作用的物 质。例如参见美国专利号5,283,317；Zervos等，1993，Cell 72：223- 232；Madura等，1993，J Biol Chem 268：12046-12054；Bartel等，1993， Biotechniques 14：920-924；和Iwabuchi等，1993，Oncogene 8：1693- 1696)。在一个特定实施方案中，本发明预期使用反向双杂交系统鉴 定解离ActRIIB多肽和其结合蛋白间相互作用的化合物(例如小分子 或肽)。例如参见Vidal和Legrain，1999，Nucleic Acids Res 27：919- 29；Vidal和Legrain，1999，Trends Biotechnol 17：374-81；和以及美国 专利号5,525,490、5,955,280和5,965,368。
在特定实施方案中，主题化合物通过其与本发明的ActRIIB多 肽相互作用的能力鉴定。化合物与ActRIIB多肽间的相互作用可为共 价的或非共价的。例如，这种相互作用可在蛋白水平上使用体外生 化方法(包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析)鉴定(Jakoby WB等，1974，Methods in Enzymology 46：1)。在特定情况下，可在基 于机制的测定(例如检测与ActRIIB多肽结合的化合物的测定)中筛选 化合物。这可包括固相结合事件或流体相结合事件。备选地，可周 报道系统(例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白)将编码 ActRIIB多肽的基因转染到细胞中，并优选通过高通量筛选针对文库 筛选或使用文库的单个成员筛选。可使用其他基于机制的结合测 定，例如检测自由能改变的结合测定。可使用固定于孔、珠或芯片 或由固定化抗体捕获或通过毛细管电泳解析的靶标进行结合测定。 通常可使用比色或荧光或表面等离振子共振检测结合化合物。
在一些方面，本发明提供用于控制体重增加和肥胖症的方法和 物质。在分子水平上，脂肪细胞增殖和分化在肥胖症的发展中是关 键性的，其导致额外脂肪细胞(脂肪细胞)的产生。因此，可在完整细 胞或组织中体外或体内的测试任何鉴定的化合物，以通过测量脂肪 细胞增殖或分化来证实其调节脂肪生成的能力。本领域已知的各种 方法可用于该目的。例如，ActRIIB多肽(例如可溶性ActRIIB多肽) 或测试化合物对脂肪生成的作用可通过在基于细胞的测定中(例如， 通过观察Oil Red O染色小泡中三酰甘油的积累和通过观察特定脂肪 细胞标记例如FABP(aP2/422)和PPARγ2的出现)测量3T3-L1前脂肪 细胞至成熟脂肪细胞的分化而测定。参见例如Reusch等，2000，Mol Cell Biol.20：1008-20；Deng等，2000，Endocrinology.141：2370-6；Bell 等，2000，Obes Res.8：249-54。基于细胞的测定的另一实例包括例如通 过监测溴脱氧尿苷(BrdU)阳性细胞来分析ActRIIB多肽和测试化合物 在脂肪细胞或脂肪细胞前体细胞(例如3T3-L1细胞)增殖中的作用。 参见例如Pico等，1998，Mol Cell Biochem.189：1-7；Masuno等，2003， Toxicol Sci.75：314-20。
应当理解，本发明的筛选测定不仅适用于主题ActRIIB多肽和 ActRIIB多肽的变体，而且适用于包括ActRIIB多肽或ActRIIB信号 转导的激动剂和拮抗剂在内的任何测试化合物。另外，这些筛选测 定可用于药物靶标确认和质量控制目的。
6例示性治疗用途
在特定实施方案中，本发明的组合物(例如ActRIIB多肽)可用于 治疗或预防与ActRIIB多肽和/或ActRIIB配体(例如激活蛋白或 GDF8)的异常活性相关的疾病或病况。在特定实施方案中，本发明提 供通过给予将治疗有效量的上文所述ActRIIB多肽有需要的个体来治 疗或预防个体的方法。这些方法尤其针对动物和更尤其人的治疗性 和预防性治疗。
如本文所用，“预防”疾病或病症的治疗剂指这样的化合物， 其在统计学样品中，相对于未治疗的对照样品，降低治疗的样品中 疾病或病况的发生率，或相对于未治疗的对照样品，延缓疾病或病 况的一种或多种症状的发作或者降低其严重程度。本文所用术语 “治疗”包括指定病况的预防或已发生病况的改善或消除。
如本文所表明，ActRIIB-Fc促进介导线粒体中解偶联的蛋白 UCP1的表达，导致新陈代谢活跃的或产热脂肪组织。因此，本文公 开的组合物可用于治疗多种疾病，例如棕色脂肪组织或棕色脂肪细 胞缺乏、代谢综合征(亦称为综合征X)、糖尿病、高脂血症、高胆固 醇血症、暴食症和贪食症、高血压、动脉硬化(冠状动脉疾病或冠心 病)、心肌梗死、充血性心力衰竭、脑梗死、脑血栓形成、呼吸疾病 (例如Pickwickian综合征)、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜 癌和肾癌、生长激素缺乏受试者、正常变异身材矮小、特纳综合 征，和以总的无脂肪质量的百分比显示降低的代谢活性或减少的静 息能量消耗的其他病理学病况，例如患有急性成淋巴细胞性白血病 的儿童。
在特定实施方案中，本发明的组合物(例如可溶性ActRIIB多肽) 用于促进产热脂肪细胞的形成和/或活性。如上文所述，产热离散棕 色脂肪组织和白色脂肪组织内的棕色脂肪细胞包含大量表达解偶联 蛋白-1(UCP)的线粒体。具有高热量摄入且缺乏棕色脂肪细胞的个体 不能将过剩的热量摄入转化为热，并因此被迫储存未使用的生物化 学能量，通常作为肥大的白色脂肪组织。体内阻断或拮抗一种或多 种ActRIIB配体(例如GDF8)的功能可有效增加分布于白色脂肪组织 内的离散棕色脂肪细胞库中棕色脂肪细胞的产热活性。该方法由本 文所示的数据证实和支持，其中显示ActRIIB-Fc蛋白诱导白色脂肪 中UCP1表达、增加整体身体组成并改善高脂肪饮食的小鼠中的代谢 状态。
在特定实施方案中，本发明的组合物(例如可溶性ActRIIB多肽) 用作代谢综合征(亦称为综合征X和胰岛素抵抗综合征)的部分治疗， 代谢综合征为增加发展心血管疾病和II型糖尿病的风险的疾病和风 险因素的组合。大多数患者为年长的、肥胖的、久坐的并具有一定 程度的胰岛素抵抗。中部(腹部或内脏)肥胖为该综合征的显著特征。
在相关的实施方案中，本发明的可溶性ActRIIB多肽和其他组 合物可用作II型糖尿病(亦称为非胰岛素依赖性糖尿病或成年型糖尿 病)的部分治疗，II型糖尿病的特征为在胰岛素抵抗和相对胰岛素不 足的情况下的高血糖。在糖尿病中复杂和多因子的代谢改变通常导 致许多器官(最重要为心血管系统)的损坏和功能损伤。II型糖尿病通 常与肥胖症(腹部或内脏肥胖)、高血压、高胆固醇和代谢综合征相 关。II型糖尿病的重要风险因素包括变老、高脂肪饮食和久坐的生活 方式。
在其他相关的实施方案中，本发明的可溶性ActRIIB多肽和其 他组合物可用作动脉粥样硬化的部分治疗，动脉粥样硬化是慢性炎 性病况，其中动脉壁由于脂肪库(通常被称为斑块)的积累而变厚。动 脉粥样硬化的风险因素包括变老、糖尿病、血脂蛋白异常、肥胖症 (腹部或内脏肥胖)和久坐的生活方式。
可溶性ActRIIB多肽亦可用于脂肪代谢障碍疾病，其往往与代 谢综合征相关。严重胰岛素抵抗可起因于遗传形式和获得形式的脂 肪代谢障碍，在后者情况中包括用抗逆转录病毒疗法治疗的患者中 人免疫缺陷病毒(HIV)相关的脂肪代谢障碍。
主题ActRIIB多肽还可作为用作减缓或预防肥胖症发展的治疗 物质。该方法由本文所示的数据证实和支持，其中显示ActRIIB-Fc 蛋白改善高脂肪饮食的小鼠中的代谢状态。
在其他实施方案中，本发明提供用于调节动物中身体脂肪含量 和用于治疗或预防与此相关的病况和尤其与此相关的危害健康的病 况的组合物和方法。根据本发明，调节(控制)体重可指降低或增加体 重、降低或增加体重增加的速率或增加或降低体重减轻的速率，亦 可包括积极地维持或不显著改变体重(例如针对不然可增加或降低体 重的外部或内部影响)。本发明的一个实施方案涉及通过给予有需要 的动物(例如人)ActRIIB多肽来调节体重。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及用于减少动物中体重和/ 或减少动物中体重增加的方法和化合物，更具体而言，涉及用于治 疗或改善处于肥胖症风险中或患肥胖症的患者中肥胖症的方法和化 合物。在另一具体实施方案中，本发明涉及用于治疗不能增加或保 留体重的动物(例如患衰竭综合征的动物)的方法和化合物。这样的方 法对增加体重有效，或者对降低体重和损失有效，或者对改善与不 合意的低(例如不健康)体重相关或由其引起的疾病有效。
如在WO 2006/012627和WO 2008/097541中所表明，本文公开 的化合物刺激肌肉生长。因此，这些化合物在伴随重叠肌肉和代谢 功能异常的疾病或病症中可尤其有用。
在特定实施方案中，本发明的组合物(例如可溶性ActRIIB多肽) 用作肌肉营养不良的部分治疗。术语“肌肉营养不良”指由骨骼肌 和有时心肌及呼吸肌的逐渐减弱和衰退表征的一组退行性肌肉疾 病。肌肉营养不良是通过从肌肉中的微小变化开始的进行性肌肉萎 缩和肌无力表征的遗传疾病。随着肌肉随时间推移的退化，人的肌 肉强度下降。此外，下降的肌肉质量和减少的体力活动促进摄入热 量摄入和能量消耗间的不平衡，导致过剩能量不健康地储存为白色 脂肪组织。可用包括主题ActRIIB多肽的方案治疗的例示性肌肉营养 不良包括：杜兴肌营养不良(DMD)、贝克尔肌营养不良(BMD)、埃- 德肌营养不良(EDMD)、肢带肌营养不良(LGMD)、面肩肱肌营养不 良(FSH或FSHD)(亦称为兰代肌营养不良)、强直性肌营养不良 (MMD)(亦称为Steinert氏疾病)、眼咽肌营养不良(OPMD)、远端肌 营养不良(DD)、先天性肌营养不良(CMD)。
杜兴肌营养不良(DMD)由法国神经病学家Guillaume Benjamin Amand Duchenne在十九世纪六十年代首次描述。贝克尔肌营养不良 (BMD)以于二十世纪五十年代首次描述DMD的该变体的德国医生 Peter Emil Becker命名。DMD是最常见的男性遗传疾病中的一种， 其影响1/3,500的男孩。当位于x染色体的短臂上的肌养蛋白基因损 坏时，DMD发生。因为男性仅携带一个X染色体拷贝，所以他们仅 具有一个肌养蛋白基因拷贝。在缺乏肌养蛋白时，肌肉在收缩和舒 张的循环期间容易受损。虽然在疾病早期肌肉可通过再生补偿，但 是以后肌肉祖细胞赶不上正在进行的损伤，健康肌肉由非功能纤维 脂肪组织代替。
BMD由肌养蛋白基因中的不同突变造成。BMD患者具有一些 肌养蛋白，但是其要么数量上不充足，要么质量差。具有一些肌养 蛋白保护患BMD的患者的肌肉免受像患DMD人群的肌肉一样严重 或迅速的退化。
例如，最近的研究表明体内阻断或消除GDF8(一种ActRIIB配 体)的功能可有效治疗DMD和BMD患者中的至少某些症状。因此， 主题ActRIIB多肽可作为GDF8抑制剂(拮抗剂)起作用，并构成体内 阻断DMD和BMD患者GDF8和/或ActRIIB的功能的备选方法。该 方法由本文所示的数据证实和支持，其中显示ActRIIB-Fc蛋白增加 肌肉营养不良小鼠模型中的肌肉质量。
同样地，主题ActRIIB多肽提供增加需要肌肉生长的其他疾病 中肌肉质量的有效方法。例如ALS亦称为路格里克(Lou Gehrig)氏病 (运动神经元病)，是一种慢性、不能治愈和无法停止的CNS疾病， 其攻击运动神经元、攻击连接大脑和骨骼肌的CNS成分。在ALS 中，运动神经元恶化并最终死亡，并且虽然人的大脑通常仍是完全 功能的和灵敏的，但是运动的命令从未到达肌肉。患有ALS的大多 数人为40-70岁之间。第一批减弱的运动神经元为通向手臂或腿的运 动神经元。患ALS的人具有行走问题，他们可能掉东西、摔倒、说 话含糊不清和不受控制地笑或哭。最后肢中的肌肉由于不用而开始 萎缩。该肌肉无力将变得使人虚弱，人将需要轮椅或变得不能离开 床活动。大多数ALS患者死于呼吸衰竭或呼吸机辅助并发症(如肺 炎)，从疾病发生开始3-5年。该方法由本文所示的数据证实和支 持，其中显示ActRIIB-Fc蛋白改善ALS的小鼠模型的外观、肌肉质 量和寿命。
ActRIIB多肽诱导的增加的肌肉质量亦可对患有肌肉萎缩疾病的 患者有益。Gonzalez-Cadavid等(同上)报道，GDF8表达在人中与无 脂肪质量逆相关，且GDF8基因增加的表达与患AIDS衰竭综合征的 男性的体重减轻有关。通过抑制AIDS患者中GDF8的功能，即使没 有完全消除，也可减轻AIDS的至少某些症状，因此显著改善AIDS 患者的生活质量。
肌肉衰减综合征，随着变老的肌肉损失亦通常与代谢综合征、 糖尿病、动脉硬化、血脂异常和其他年龄相关的代谢病况相关。 ActRIIB多肽诱导的肌肉质量亦可对患有肌肉衰减综合征的患者有 益。
7药物组合物
在特定实施方案中，将本发明的化合物(例如ActRIIB多肽)与药 学上可接受的载体配制。例如，ActRIIB多肽可单独给予或作为药物 制剂(治疗组合物)的成分给予。可将主题化合物配制用于以用于人或 兽医学的任何合宜方式给予。
在特定实施方案中，本发明的治疗方法包括局部、全身或作为 植入或装置局部地给予组合物。当给药时，在本发明中使用的治疗 组合物当然是不含致热源、生理上可接受的形式。另外，可将组合 物合意地包封或以粘性形式注射用于递送至靶组织位点(例如骨、软 骨、肌肉、脂肪或神经元)，例如具有组织损伤的位点。局部给药可 适合于创伤愈合和组织修复。非ActRIIB多肽的治疗上有用的物质亦 可任选地包含在上文所述的组合物内，在本发明的方法中可备选地 或另外地与主题化合物(例如ActRIIB多肽)同时或序贯给予。
在特定实施方案中，本发明的组合物可包含能够将一种或多种 治疗化合物(例如ActRIIB多肽)递送至靶组织位点、为发育中组织提 供结构并任选能够被身体再吸收的基质。例如，基质可提供ActRIIB 多肽的缓释。这样的基质可由目前用于其他植入医药应用的材料形 成。
基质材料的选择基于生物适合性、生物降解性、机械性能、表 面外观(cosmetic appearance)和界面性质。主题组合物的具体用途将限 定适合的制剂。组合物的潜在基质可为生物可降解的且化学上限定 硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其他潜在材料是 生物可降解的和生物学上明确定义的，例如骨或真皮胶原。其他基 质由纯蛋白或胞外基质成分组成。其他潜在基质为生物不可降解的 且化学上限定的，例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶 瓷。基质可由任何上述提及类型的材料的组合组成，例如聚乳酸和 羟磷灰石或者胶原和磷酸三钙。可在组合物中改变生物陶瓷，例如 在磷铝酸钙(calcium-aluminate-phosphate)中改变并加工以改变孔径、 粒度、颗粒形状和生物降解性。
在特定实施方案中，本发明的方法可口服给予，例如以胶囊 剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味的基质，通常为蔗糖和阿 拉伯胶或西黄蓍胶)、散剂、颗粒剂的形式，或者为水性液体或非水 液体中的溶液剂或混悬剂，或者为水包油或油包水液体乳剂，或者 为酏剂或糖浆剂，或者为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油， 或蔗糖和阿拉伯胶)和/或为漱口剂等，各包含预定量的物质作为活性 成分。亦可以大丸剂、药糖剂或糊剂给予药剂。
在用于口服给药的固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、散 剂、颗粒剂等)中，可将本发明的一种或多种治疗化合物与一种或多 种药学上可接受的载体混合，该载体例如为柠檬酸钠或磷酸氢钙和/ 或任何下列载体：(1)填充剂或补充剂(extender)，例如淀粉、乳糖、 蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、 藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂， 例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海 藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂，例如石蜡；(6)吸收促 进剂，例如季铵化合物；(7)例如润湿剂，例如十六醇和单硬脂酸甘 油酯；(8)吸收剂，例如白陶土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、 硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合 物；和(10)着色剂。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，药物组合物亦可包 含缓冲剂。相似类型的固体组合物亦可在软胶囊剂和硬填充胶囊剂 中用作填充剂，所使用的赋形剂例如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar) 以及高分子量聚乙二醇等。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、 溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分，液体剂型还可包 含本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和 乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲 酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其为棉籽油、花生油、玉米油、 胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和 山梨坦的脂肪酸酯及其混合物。除了惰性溶剂外，口服组合物亦可 包含佐剂，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色 剂、芳香剂和防腐剂。
除了活性化合物外，混悬剂还可包含助悬剂，例如乙氧基化异 十八醇、聚氧化乙烯山梨醇和山梨坦酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝 (aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶及其混合物。
本说明书公开的一些组合物可局部给予皮肤或黏膜。局部制剂 还可包含已知作为皮肤或角质层渗透促进剂有效的多种物质中的一 种或多种。这些的实例为2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基 乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲亚砜和氮 酮。还可包含另外的物质使得制剂外观上可接受。这些的实例为脂 肪、蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。亦可 包含角质层分离剂例如本领域所知的那些。实例为水杨酸和硫磺。
用于局部或透皮给药的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊 剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可在无菌条件 下将活性化合物与药学上可接受的载体、以及与可能需要的任何防 腐剂、缓冲剂或推进剂混合。除了本发明的主题化合物(例如 ActRIIB多肽)，软膏剂、糊剂、霜剂和凝胶剂还可包含赋形剂，例 如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生 物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合 物。
除了主题化合物，散剂和喷雾剂还可包含赋形剂，例如乳糖、 滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉或这些物质的混合 物。喷雾剂可另外包含常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性的未取代 的烃，例如丁烷和丙烷。
在特定实施方案中，适合胃肠外给药的药物组合物可包含一种 或多种ActRIIB多肽与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非 水溶液、分散体、混悬剂或乳剂或临用前可复溶为无菌注射溶液或 分散体的无菌粉剂的组合，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、 使制剂与预期受体的血液等渗的溶质或助悬剂或增稠剂。可在本发 明的药物组合物中使用的合适的水性和非水载体的实例包括水、乙 醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植 物油(例如橄榄油)和注射用有机酯(例如油酸乙酯)。可维持合适的流 动性，例如通过使用包被材料(例如卵磷脂)、在分散体情况下通过维 持所需的粒度，和通过使用表面活性剂。
本发明的组合物亦可包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂 和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如尼泊金酯、氯丁 醇、苯酚山梨酸等)，可保证预防微生物作用。将等渗剂例如糖、氯 化钠等包含在组合物中亦可能是合意的。另外，可通过包含延缓吸 收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，引起注射用药物形式的延长吸 收。
应当理解，剂量方案将由主治医生考虑改变本发明主题化合物 (例如ActRIIB多肽)的作用的多种因素决定。多种因素将取决于待治 疗的疾病。
在特定实施方案中，本发明亦提供用于体内产生本文公开的 ActRIIB多肽或其他化合物的基因治疗。这样的治疗通过将ActRIIB 多核苷酸序列引入具有如上文所列举的疾病的细胞或组织中来实现 其治疗效果。可使用重组表达载体(例如嵌合病毒)或胶体分散系统， 完成ActRIIB多核苷酸序列的递送。用于ActRIIB多核苷酸序列的治 疗递送优选使用靶向脂质体。
可用于本文所教导的基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、疱 疹病毒、痘苗病毒或优选RNA病毒(例如逆转录病毒)。优选地，逆 转录病毒载体为鼠或禽逆转录病毒的衍生物。可插入单个外源基因 的逆转录病毒载体的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒 (MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV) 和劳斯肉瘤病毒(RSV)。许多另外的逆转录病毒载体可掺入多个基 因。所有这些载体可转移或掺入选择性标记的基因，使得可鉴定和 产生转导的细胞。可通过连接例如糖、糖脂或蛋白质，使逆转录病 毒载体有靶标特异性。优选的靶向通过使用抗体实现。本领域的技 术人员将认识到，特异性多核苷酸序列可被插入到逆转录病毒基因 组中或与病毒被膜连接，以允许包含ActRIIB多核苷酸的逆转录病毒 载体的靶特异性递送。在一个优选的实施方案中，载体靶向骨、软 骨、肌肉或神经元细胞/组织。
备选地，可通过常规的磷酸钙转染，使用编码逆转录病毒结构 基因gag、pol和env的质粒直接转染组织培养细胞。接着用包含目 标基因的载体质粒转染这些细胞。所得细胞将逆转录病毒载体释放 到培养基中。
ActRIIB多核苷酸的另一靶向递送系统为胶体分散系统。胶体分 散系统包括大分子复合体、纳米囊、微球体、珠和基于脂质的系统 (包括水包油乳剂、胶束、混合的胶束和脂质体)。本发明优选的胶体 系统为脂质体。脂质体为人工膜囊泡，其可用作体外和体内递送载 体。可将RNA、DNA和完整的病毒体包封在水性内部并以生物学活 性形式递送至细胞(参见例如Fraley等，Trends Biochem.Sci.，6：77， 1981)。使用脂质体载体用于有效基因转移的方法是本领域已知的， 参见例如Mannino等，Biotechniques，6：682，1988。脂质体的组合物通 常是磷脂的组合，通常与类固醇(特别是胆固醇)组合。亦可使用其他 磷脂或其他脂质。脂质体的物理性质取决于pH、离子强度和二价阳 离子的存在情况。
在脂质体的生产中有用的脂质的实例包括磷脂酰基化合物，例 磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、 脑苷脂和神经节苷脂。例证的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰基 磷脂酰胆碱和二硬脂酰基磷脂酰胆碱。脂质体的靶向亦可基于例如 器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，且是本领域已知的。
例证
现在已一般性描述本发明，参考以下实施例将更容易地理解本 发明，所包括的实施例仅用于本发明的特定实施方案和实施方案的 例证的目的，并不旨在限制本发明。
实施例1.ActRIIB-Fc融合蛋白的产生
申请人构建可溶性ActRIIB融合蛋白，该融合蛋白具有与人或 小鼠Fc结构域融合的人ActRIIB的胞外结构域以及它们之间的最小 的接头(三个甘氨酸氨基酸)。构建体分别称为ActRIIB(20-134)-hFc和 ActRIIB(20-134)-mFc。
纯化自CHO细胞系的ActRIIB-hFc如下所示(SEQ ID NO：5)
GRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTI ELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGG PEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPFLLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在CHO细胞系中表达ActRIIB(20-134)-hFc和ActRIIB(20-134)- mFc蛋白。考虑三种不同的前导序列：
(i)蜜蜂蜂毒肽(HBML)：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA(SEQ ID NO：7)
(ii)组织纤溶酶原激活物(TPA)：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO：8)
(iii)天然的：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA(SEQ ID NO：9)
所选形式使用TPA前导序列并具有下列未加工的氨基酸序列：
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGASGRGEAETRECIYYNANWELERTNQS GLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTIELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEE NPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGGPEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEO ID NO：17)
该多肽由下列核酸序列编码(SEQ ID NO：10)：
CHO细胞产生的物质的N-末端测序揭示主要序列-GRGEAE (SEQ ID NO：11)。值得注意地，文献中报道的其他构建体以-SGR... 序列起始。
可通过一系列的柱层析步骤完成纯化，例如包括三种或更多的 任意次序的下述柱层析：蛋白A层析、Q琼脂糖凝胶层析、苯基琼 脂糖凝胶层析、大小排阻层析和阳离子交换层析。可用病毒过滤和 缓冲剂交换完成纯化。
亦可在HEK293细胞和COS细胞中表达ActRIIB-Fc融合蛋白。 虽然来自所有细胞系的材料和合理的培养条件给蛋白提供体内肌肉 构建活性，但是观察到效能差异，可能与细胞系选择和/或培养条件 有关。
实施例2：ActRIIB-Fc突变体的产生
申请人在ActRIIB的胞外结构域中产生了一系列的突变，并将 这些突变体蛋白产生为细胞外ActRIIB和Fc结构域之间的可溶性融 合蛋白。背景ActRIIB-Fc融合蛋白具有以下序列(Fc部分有下划线) (SEQ ID NO：12)：
SGRGEAETRECIYYNANWELERTNQSGLERCEGEQDKRLHCYASWRNSSGTI ELVKKGCWLDDFNCYDRQECVATEENPQVYFCCCEGNFCNERFTHLPEAGG PEVTYEPPPTAPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
将不同突变(包括N末端和C末端截短)引入背景ActRIIB-Fc蛋 白中。基于实施例1中示出的数据，预期如果用TPA前导序列表 达，这些构建体将缺失N末端丝氨酸。通过PCR诱变在ActRIIB胞 外结构域中产生突变。在PCR后，通过Qiagen柱纯化片段，用SfoI 和AgeI消化并凝胶纯化。将这些片段连接到表达载体pAID4中(参 见WO2006/012627)，使得在连接后产生与人IgG1的融合嵌合体。 在转化到大肠杆菌DH5α中后，挑选菌落并分离DNA。对于鼠构建 体(mFc)，用鼠IgG2a置换人IgG1。核实所有突变体的序列。
通过瞬时转染在HEK293T细胞中产生所有的突变体。总的来 说，在500ml旋转器中，将HEK293T细胞以6×105细胞/ml在250ml 体积的Freestyle(Invitrogen)培养基中建立并培养过夜。第二天，用 0.5ug/ml终DNA浓度的DNA∶PEI(1∶1)复合体处理这些细胞。在4 小时后，加入250ml培养基并将细胞培养7天。通过旋下细胞和浓 缩收获条件培养基。
使用多种技术(包括例如蛋白A柱)纯化突变体，并用低pH(3.0) 甘氨酸缓冲液洗脱。在中和后，针对PBS透析突变体。
亦可通过相似的方法在CHO细胞中产生突变体。
在结合测定和/或生物测定中测试突变体。在一些实例中，用条 件培养基而不是纯化的蛋白进行测定。变体描述于例如公开的专利 申请WO 06/012627和WO 08/097541。这样的变体可在本文所述的 方法中使用。
实施例3：ActRIIB(20-134)-hFc在高脂肪饮食喂养的小鼠中对白色 脂肪组织产热性质的影响
申请人研究了在高脂肪饮食喂养的雄性小鼠中ActRIIB-Fc对棕 色脂肪细胞和其他代谢终产物(metabolic endpoint)的影响。10周龄 C57BL/6小鼠是体重匹配的，并用ActRIIB(20-134)-hFc(n＝10)或Tris 缓冲盐水(TBS)载体(n＝7)以10mg/kg每周两次皮下治疗，持续60 天。在此期间，小鼠无限制地享用包含58％脂肪的饮食代替包含 4.5％脂肪的标准食物。在研究结束时，收集附睾脂肪垫，并使用定 量RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)测量编码解偶联蛋白-1(UCP1)的 mRNA的水平，UCP1为文献充分证明的棕色脂肪细胞中产热能力的 标记，棕色脂肪细胞分散地分布在白色脂肪库内(Cousin等，1992，J Cell Sci 103：931-942)。
ActRIIB(20-134)-hFc治疗引起了一群值得注意的代谢影响。在 高脂肪饮食的小鼠中，ActRIIB(20-134)-hFc相比于载体使附睾脂肪 中UCP1mRNA水平增加接近9倍(图1；P＜0.05)，考虑到C57BL/6 小鼠相比于其他小鼠种系显示关键白色脂肪库内的UCP1和棕色脂肪 细胞的严重减弱的诱导，该增加为一种特别令人印象深刻的作用 (Guerra等，1998，J Clin Invest 102：412-420；Xue等，2007，J Lipid Res 48：41-51)。ActRIIB(20-134)-hFc亦产生有益的血清游离脂肪酸浓度 的30％降低(P＜0.001)。重要地，UCP1的上调伴随ActRIIB(20-134)- hFc对身体组成的有益影响，如通过核磁共振(NMR)在基线和第48 天测定的。在高脂肪饮食条件下，总脂肪质量在载体治疗的对照中 在这48天期间增至3倍，而ActRIIB(20-134)-hFc治疗将该增加减少 了40％。到第48天为止，总脂肪质量在ActRIIB(20-134)-hFc治疗的 小鼠中为26％的体重，相比之下对照小鼠中为39％，而无脂肪组织 质量在ActRIIB-Fc治疗的小鼠中为64％的体重，相比之下对照小鼠 中为55％。因此，在高脂肪饮食的条件下，净结果为较健康的身体 组成。
实施例4：截短的变体ActRIIB(25-131)-hFc在高脂肪饮食喂养的小 鼠中对白色脂肪组织的产热性质的影响
在上文所述的研究中(实施例3)，申请人亦研究了截短的变体 ActRIIB(25-131)-hFc在高脂肪饮食条件下对白色脂肪组织和其他代 谢终产物的产热性质的影响。
申请人使用如上文关于ActRIIB(20-134)-hFc所述的相同前导序 列和方法产生了截短的融合蛋白ActRIIB(25-131)-hFc(图13-14)。在 CHO细胞中表达后纯化的成熟蛋白具有下示序列(SEQ ID NO：6)：
用ActRIIB(25-131)-hFc或Tris缓冲盐水(TBS)载体以10mg/kg 每周两次皮下治疗10周龄C57BL/6小鼠，持续60天。在此期间， 小鼠无限制地享用包含58％脂肪的饮食代替包含4.5％脂肪的标准食 物。维持标准食物饮食的另一组小鼠亦用TBS载体治疗并作为饮食 对照。
在高脂肪饮食条件下，ActRIIB(25-131)-hFc治疗引发与产热能 力一致的白色脂肪组织中的组织学改变和基因表达图式。如在图2 中所示，附睾白色脂肪的组织学检查表明，ActRIIB(25-131)-hFc降 低脂滴大小并引起是棕色脂肪的标志的多泡脂肪细胞簇的形成。此 外，该组织的免疫组织化学分析揭示，由于ActRIIB(25-131)-hFc治 疗，在多泡脂肪细胞和单泡脂肪细胞两者中广泛存在UCP1的胞质诱 导(图2)。
伴随这些组织学改变的是在附睾白色脂肪中关键产热和代谢调 节基因的表达中的显著改变，如通过定量RT-PCR测定。在高脂肪 饮食的小鼠中，ActRIIB(25-131)-hFc相比于载体使UCP1 mRNA水平 增加超过60倍(图3)，这是一种特别令人印象深刻的改变，因为如上 文所述，该小鼠种系相比于其他小鼠种系显示关键白色脂肪库内的 UCP1和棕色脂肪细胞的严重减弱的诱导。另外，ActRIIB(25-131)- hFc治疗增加编码sirtuin SIRT-1(沉默信息调节剂2，同系物1)的 mRNA的水平(图4)，SIRT-1为防御由高脂肪饮食诱导的代谢损伤的 能量敏感主导调节剂(去乙酰酶)(Pfluger等，2008，Proc Natl Acad Sci USA 105：9793-9798)并表明为脂肪酸转移的重要控制(Rodgers等， 2008，FEBS Lett 582：46-53)。显著地，ActRIIB(25-131)-hFc治疗亦增 加编码PGC-1α(过氧化物增殖物激活受体γ辅激活物-1α)的mRNA 的水平(图5)，PGC-1α为文献充分证明的SIRT-1的靶标，其继而控 制棕色脂肪组织中线粒体生物发生和产热能力所必需的许多基因的 表达(Uldry等，2006，Cell Metab，3：333-341)。值得注意地，已显示 PGC-1α在白色脂肪细胞中的强制表达诱导包括UCP1在内的基因表 达的产热程序，与在棕色脂肪细胞中极为相似(Hansen等，2006， Biochem J 398：153-168)。在本研究中，ActRIIB(25-131)-hFc使在高 脂肪饮食条件下的白色脂肪组织中的PGC-1α基因表达恢复至与标准 饮食喂养的小鼠不可区别的水平(图5)。
与治疗相关的另外改变构成白色脂肪组织中改变的表达模式和 有益的激素和代谢效果间的显著的关联。因此，在附睾白色脂肪 中，ActRIIB(25-131)-hFc增加编码Foxo-1(包含分叉头框，蛋白O亚 家族-1)的mRNA的水平(图6)，Foxo-1为转录因子，是SIRT-1的靶 标和脂连蛋白表达的关键诱导剂(Qiao等，2006，J Biol Chem 281：39915-39924)。脂连蛋白，一种脂肪衍生的激素，其浓度变化与 脂肪质量/肥胖症相反，在靶组织中发挥重要的胰岛素增敏作用 (Yamauchi等，2001，Nat Med 7：941-946；Maeda等，2002，Nat Med 8：731-737；Kadowaki等，2005，Endocr Rev 26：439-451)。与Foxo-1 mRNA诱导一致，ActRIIB(25-131)-hFc治疗增加附睾白色脂肪中脂 连蛋白mRNA的水平(图7)以及增加脂连蛋白的循环浓度(图8)。重 要地，这些改变在ActRIIB(25-131)-hFc治疗的小鼠中伴随循环胰岛 素(图9)、甘油三酯、游离脂肪酸、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂 蛋白(LDL)的稳健减少，导致几乎所有这些参数的正常化。最后，上 述影响伴随身体组成中的有益改变，如通过核磁共振(NMR)在基线和 第48天测定。具体地，在高脂肪饮食条件下的载体治疗的对照中总 脂肪质量在这48天期间增至3倍，而ActRIIB(25-131)-hFc治疗使该 增加减少了差不多40％。总之，在高脂肪饮食条件下的ActRIIB(25- 131)-hFc治疗导致：1)与产热能力一致的白色脂肪组织中的组织学改 变和基因表达模式，2)大范围的激素和代谢参数中的有益改变，和3) 改善的身体组成。
实施例5：ActRIIB(25-131)-mFc在高脂肪饮食喂养的小鼠中对棕色 脂肪库的影响
在另一研究中，申请人研究了在高脂肪饮食条件下截短的变体 ActRIIB(25-131)-mFc对肩胛内棕色脂肪库性质的影响。9周龄 C57BL/6小鼠用ActRIIB(25-131)-mFc(n＝20)或Tris缓冲盐水(TBS)载 体(n＝10)以10mg/kg每周两次皮下治疗，持续60天。给予开始前的 开始7天，小鼠无限制地享用包含58％脂肪的饮食代替包含4.5％脂 肪的标准食物。维持标准食物饮食的另一组小鼠(n＝10)亦用TBS载 体治疗并作为饮食对照。
与标准饮食相比，高脂肪饮食在棕色脂肪组织的肩胛间库中产 生若干显著的改变，而ActRIIB(25-131)-mFc治疗完全或者很大程度 上逆转这些变化的每个。具体地，高脂肪饮食引起肩胛间库的显著 扩大和从红至粉红明亮其颜色(图10)。该饮食诱导的扩大反映质量的 加倍(图11)和棕色脂肪库的密度的降低(图12)。一亚组小鼠(n＝4/组) 的库密度由显微-计算层析X射线照相术(microCT)测定，所述小鼠的 总的身体脂肪百分比，如通过核磁共振(NMR)测定，最接近于组平均 值(所有小鼠通过NMR扫描。在任何情况下，ActRIIB(25-131)-mFc 治疗完全逆转饮食诱导的棕色脂肪质量(图11)和密度(图12)的改变， 同时很大程度上逆转饮食诱导的库的大小和颜色的改变(图10)。这些 结果表明，在高脂肪饮食条件下，ActRIIB(25-131)-mFc很大程度上 或完全恢复可能与健康棕色脂肪功能相关的性质，并因此随着其降 低棕色脂肪库的总大小改善棕色脂肪的品质。
总之，这些数据表明可溶性ActRIIB-Fc融合蛋白可用作通过 TGF-家族配体信号转导的拮抗剂，以增加产热棕色脂肪细胞的形成 和/或活性，并因此治疗因高热量摄入加重的代谢病况和潜在也治疗 其他病况。
通过引用并入
本文提及的所有公开出版物和专利通过全文引用的方式并入， 正如表明将各个别公开出版物或专利具体且个别地通过引用并入。
虽然已经讨论主题的特定实施方案，但是上述说明书为例示性 的而不是限制性的。根据该说明书和下述权利要求的回顾，许多变 化对本领域的技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应参考 权利要求(连同其等价物的全部范围)和说明书(连同这样的变化)决 定。