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1、(10)申请公布号 CN 104027810 A (43)申请公布日 2014.09.10 CN 104027810 A (21)申请号 201410303382.5 (22)申请日 2014.06.30 A61K 45/00(2006.01) A61K 9/08(2006.01) (71)申请人 王涛 地址 710032 陕西省西安市新城区长乐西路 169 号 (72)发明人 王涛 汤礼军 罗皓 许川 汪涛 闫洪涛 梁鸿寅 黄竹 马利红 (74)专利代理机构 成都顶峰专利事务所 ( 普通 合伙 ) 51224 代理人 杨俊华 (54) 发明名称 一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动 物模型。
2、的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种构建先天性肝内胆管发育 不良综合征动物模型的方法， 解决现有技术较为 复杂、 费用高、 效率低的问题。本发明包括以下 步骤 ：（1） 配制 - 分泌酶抑制剂玉米油溶液和 - 分泌酶抑制剂磷酸盐缓冲液溶液 ；（2） 将成年 雌雄大鼠合笼， 从雌鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠 胚胎 14 天时， 向每个羊膜腔注射溶液甲 ； 同时， 向 孕鼠尾静脉注射溶液乙 ；（3） 常规饲养孕鼠至其 生产， 胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征 动物模型。本发明有利于进行先天性肝内胆管发 育不良综合征的研究， 尤其是病理生理机制研究 以及药物的研发。 (51)Int.Cl. 。
3、权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104027810 A CN 104027810 A 1/1 页 2 1. 一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法， 其特征在于， 包括以下 步骤 ： （1） 将 - 分泌酶抑制剂溶解于玉米油中， 配制成浓度为 10mg/ml 的溶液甲 ； 将 - 分 泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中， 再用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为 5mg/ml 的溶液乙 ； （2） 将成年雌雄大鼠合笼， 从雌鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠胚胎 1。
4、4 天时， 向每个羊膜 腔注射溶液甲 ； 同时， 向孕鼠尾静脉注射溶液乙 ； （3） 常规饲养孕鼠至其生产， 胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。 2. 根据权利要求 1 所述的一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法， 其特征在于， 溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定， 溶液甲是按照 5mg/kg 的剂量注射到每个羊膜腔内， 溶液乙是按照 1mg/kg 的剂量注射到孕鼠尾静脉内。 3. 根据权利要求 2 所述的一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 具体的方法为 ： 将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠怀孕， 再从 雌。
5、鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠胚胎 14 天时， 在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔， 向每个羊膜 腔内注射溶液甲 ； 同时， 在超声引导下穿刺孕鼠尾静脉， 注射溶液乙。 权 利 要 求 书 CN 104027810 A 2 1/4 页 3 一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种疾病的动物模型构建方法， 具体来说， 是一种构建先天性肝内胆 管发育不良综合征动物模型的方法。 背景技术 0002 先天性疾病就是一出生就有的病。 母亲在怀孕期间接触环境有害因素， 如农药、 有 机溶剂、 重金属等化学品， 或过量暴露在各种射线下， 或服用某些药物， 或染上某些病菌。
6、， 甚 至一些习惯爱好， 如桑拿 （蒸气浴） 和饮食癖好， 都可能引起胎儿先天异常， 但不属于遗传疾 病。 先天性胆管发育不良综合征涉及的脏器包括肝脏、 心脏、 骨骼、 眼睛和颜面等， 国外报道 该病在新生儿的发病率约为 1/70000， 因此其病理生理机制的研究尤为重要， 成功建立该病 的动物模型可以为该病的预防和治疗提供研究基础。 基因敲除动物是目前广泛被采纳的方 法。 但是在目前大多数实验室中， 很难有条件建立这种动物模型， 另外这种方法也因为其技 术复杂、 费用高、 效率低， 因此并不是建立这种动物模型的最好方法。此外若使用其他方法 诱导， 会因为很多药物无法通过血管胎盘屏障而使药物作。
7、用降低， 使诱导效率下降。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方 法， 解决现有技术较为复杂、 费用高、 效率低的问题。 0004 本发明通过下述技术方案实现 ： 一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法， 包括以下步骤 ： （1） 将 - 分泌酶抑制剂溶解于玉米油中， 配制成浓度为 10mg/ml 的溶液甲 （也就是指 - 分泌酶抑制剂在溶液甲中的浓度是 10mg/ml ； 例如 ： 1ml 的溶液甲中含有 10mg- 分泌 酶抑制剂） ； 将 - 分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中， 再用磷酸盐缓冲液 （磷酸盐缓冲液 采用浓度为 0。
8、.01M 的磷酸盐缓冲液， 具体浓度则是 0.01mol/L） 稀释成浓度为 5mg/ml 的溶 液乙 （也就是指 - 分泌酶抑制剂在溶液乙中的浓度为 5mg/ml ； 例如 1ml 的溶液乙中含有 5mg- 分泌酶抑制剂） ； （2） 将成年雌雄大鼠合笼， 从雌鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠胚胎 14 天时， 向每个羊膜 腔注射溶液甲 ； 同时， 向孕鼠尾静脉注射溶液乙 ； （3） 常规饲养孕鼠至其生产， 胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。 0005 进一步地， 溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定， 溶液甲是按照 5mg/kg的剂量注射到每个羊膜腔内， 溶液乙是按照1m。
9、g/kg的剂量注射到孕鼠尾静脉内。 其 中 “5mg/kg” 是指孕鼠体重假如是 1kg， 那么需要注射 5mg 的 - 分泌酶抑制剂， 那个溶液甲 实际量则为 0.5ml， 故而 “5mg/kg” 中的 5mg 量是指的 - 分泌酶抑制剂的量， 而不是溶液甲 的量 ；“1mg/kg” 是指孕鼠体重假如是 1kg， 那么需要注射 1mg 的 - 分泌酶抑制剂， 那么溶 液乙实际量则为 0.2ml， 故而 “1mg/kg” 中的 1mg 量是指 - 分泌酶抑制剂的量， 而不是溶液 乙的量。 说 明 书 CN 104027810 A 3 2/4 页 4 0006 再进一步地， 所述步骤 （2） 具。
10、体的方法为 ： 将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠 怀孕， 再从雌鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠胚胎 14 天时， 在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔， 向 每个羊膜腔内注射溶液甲 ； 同时， 在超声引导下穿刺孕鼠尾静脉， 注射溶液乙。 0007 另 外，本 发 明 的 - 分 泌 酶 抑 制 剂 为 DAPT、 LY-450139、 MK-0752、 E2012、 BMS-708163、 PF-3084014、 GSI-953 中的一种。 0008 本发明具有以下优点及有益效果 ： 本发明有利于进行先天性肝内胆管发育不良综合征的研究， 尤其是病理生理机制研究 以及药物的研发 ； 且本发明相对现有技术来说。
11、， 易于操作， 费用低、 效率高， 适合推广应用。 附图说明 0009 图 1 为 Jagged1 免疫组化染色结果比较图。 0010 图 2 为胎鼠血清胆红素浓度结果比较图。 0011 图 3 为肺动脉根部内径比较图。 具体实施方式 0012 下面结合实施例对本发明作进一步的说明， 但本发明的实施方式并不限于此。 实施例 0013 一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法， 包括以下步骤 ： （1） 将 - 分泌酶抑制剂溶解于玉米油中， 配制成浓度为 10mg/ml 的溶液甲 ； 将 - 分 泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中， 再用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为 5mg/ml 的溶液乙 ； 。
12、（2） 将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠怀孕， 再从雌鼠怀孕开始计时， 在雌性孕鼠胚 胎 14 天时， 在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔， 向每个羊膜腔内注射溶液甲 ； 同时， 在超声引导 下穿刺孕鼠尾静脉， 注射溶液乙 ； （3） 术后常规饲养孕鼠至其生产， 胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。 0014 其中， 溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定， 溶液甲是按照 5mg/ kg 的剂量注射到每个羊膜腔内， 溶液乙是按照 1mg/kg 的剂量注射到孕鼠尾静脉内。 0015 本发明之所以将 - 分泌酶抑制剂溶于玉米油中， 是为了增加脂溶性， 有利于药 物在体内的吸收、 运转。 。
13、本发明利用超声引导能精确定位到每个羊膜腔进行准确注射， 减少 药物在体内代谢所导致的降解 ； 此外， 同时辅以尾静脉小剂量给药， 在控制孕鼠体内 - 分 泌酶抑制剂的浓度， 减少孕鼠的死亡率的同时， 不减弱对胎鼠先天性肝内胆管发育不良模 型建立的效果。另外， 由于胚胎 14 天为肝干细胞向胆管上皮细胞分化的开始阶段， 在此阶 段阻断 Notch 信号通路才能有效的抑制胆管上皮细胞的生成， 最终导致胎鼠发生先天性肝 内胆管发育不良综合征， 故而本发明选择在胚胎 14 天进行药物注射。 0016 对本发明构建的动物模型 （胎鼠） 的肝脏、 心脏、 血清等组织标本处理方法如下 ： 1、 免疫组织化学。
14、方法检测 Jagged1 的表达 （检测结果如图 1） ： （1） 使用蜡块包埋机常规包埋肝组织， 包埋完成后使用石蜡切片机对蜡块组织进行切 片， 石蜡切片厚度为 1m。 0017 （2）脱蜡 / 脱水 ： A. 将石蜡切片放入二甲苯中 5min， 取出后也能够蒸馏水漂洗 说 明 书 CN 104027810 A 4 3/4 页 5 （5min， 2 次） ， 上述操作共反复进行 3 次 ； B. 将二甲苯处理过的组织切片放入无水乙醇中 10min， 取出后用蒸馏水漂洗 （5min， 2 次） ， 上述操作共反复进行 2 次 ； C. 将无水乙醇处理过 的组织切片放入 95% 乙醇中 10mi。
15、n， 取出后用蒸馏水漂洗 （5min， 2 次） ， 上述操作反复进行 2 次。 0018 （3） 抗原修复 ： 将完成脱蜡 / 脱水的组织切片放入煮沸的柠檬酸抗原修复液中， 保 持抗原修复液处于达到沸点的临界状态 （不使液体沸腾） 10min， 取出组织切片在室温下冷 却 30min。 0019 （4） 用 PBS（磷酸盐缓冲液） 漂洗抗原修复后的组织切片 （5min， 3 次） ， 将组织切片 浸入 3%H2O2中 10min。 0020 （5） 用 PBS（磷酸盐缓冲液） 漂洗组织切片 （5min， 3 次） ， 将组织切片使用封闭液在 室温下封闭 1h。 0021 （6）弃去封闭液， 。
16、用抗体稀释液按照小鼠抗 Jagged1 抗体 （1:50， 博奥森， 北京） 的比例稀释一抗， 将稀释后的一抗添加到组织切片上， 将组织切片放入湿盒， 4孵育过夜 （20 24h） 。 0022 （7） 弃去组织切片上孵育的一抗， 用 PBS（磷酸盐缓冲液） 漂洗组织切片 （5min， 3 次） ， 分别加入免疫组化试剂盒 （中杉， 北京） 中的与一抗来源种属相对应的二抗， 室温孵育 30min。 0023 （8） 弃去组织切片上孵育的二抗， 用 PBS（磷酸盐缓冲液） 漂洗组织切片 （5min， 3 次） ， 加入免疫组化试剂盒的三抗， 室温孵育 15min。 0024 （9） 弃去组织切片。
17、上孵育的三抗， 使用 DAB 显色试剂盒 （中衫， 中国） 进行 DAB 显色 （2 4min） ， 显色完成后用蒸馏水漂洗组织切片。 0025 （10） 使用苏木素对组织切片进行衬染， 衬染完成后用蒸馏水漂洗组织切片 （5min， 3 次） 。 0026 （11）脱水 ： A. 将组织切片放入 95% 乙醇中 10min， 取出后用蒸馏水漂洗 （10s， 2 次） ， 上述操作反复进行2次 ； B.将95%乙醇处理过的组织切片放入无水乙醇中 10min， 取出 后用蒸馏水漂洗 （10s， 2次） ， 上述操作共反复进行2次 ； C.将无水乙醇处理过的组织切片放 入二甲苯中 5min， 取出后。
18、用蒸馏水漂洗 （10s， 2 次） ， 上述操作共反复进行 2 次。 0027 （12） 将完成脱水的组织切片用中性树脂进行封片， 封片后室温晾干 24h 后置于显 微镜下进行观察和拍照。 0028 从图 1 中可看出， 模型组肝内胆道系统明显多于对照组 （本申请中的所有对照组 均是指给孕鼠羊膜注射等体积不含有 - 分泌酶抑制剂的玉米油， 同时在尾静脉内注射等 体积不含有 - 分泌酶抑制剂的磷酸盐缓冲液， 从而获得的胎鼠） ， 同时 Jagged1 缺失会导 致先天性肝内胆管发育不良， 对 Jagged1 进行免疫组织化学染色， 结果显示模型组的细胞 膜上的 Jagged1 表达 （棕色颗粒）。
19、 显著低于对照组， 病理符合肝内胆管发育不良。其中棕色 是免疫组织化学染出来的。 0029 2、 两组胎鼠血清胆红素浓度结果比较 （检测结果如图 2） ： （1） 胎鼠乙醚常规麻醉后。固定于手术台， 碘酊消毒腹部皮肤， 75% 脱碘后， 保持无菌 条件下一次打开胎鼠腹腔， 在留取肝脏、 心脏标本前， 先用头皮针穿刺腹主动脉， 抽取全血 5ml ； 说 明 书 CN 104027810 A 5 4/4 页 6 （2） 将全血在 4、 4000 转 / 分下离心 10min， 分层后吸取上层血清， 全自动生化分析仪 （COBAs400， 罗氏公司， 德国） 检测血清中总胆红素、 直接胆红素、 间接。
20、胆红素。 0030 从图 2 中可看出， 本发明构建的模型组胎鼠出生后即有胆汁淤积症状， 符合肝内 胆管发育不良的临床表现。 0031 3、 游标卡尺测量肺动脉内径 （检测结果如图 3） ： 游标卡尺测量肺动脉与心脏连接 处 （即肺动脉根部） 内径。 0032 从图 3 中可看出， 本发明构建的模型组胎鼠肺动脉根部内径显著小于对照组， 模 型组肺动脉根部显著缩窄， 符合先天性肝内胆管发育不良的心血管表现。 0033 按照上述实施例， 便可很好地实现本发明。值得说明的是， 基于上述设计的前提 下， 为解决同样的技术问题， 即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色， 所采用的 技术方案的实质仍然与本发明一样， 故其也应当在本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 104027810 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104027810 A 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 104027810 A 8 。