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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710497169.6 (22)申请日 2017.06.26 (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大 道639号 (72)发明人 李萍 杨华 梁金秀 黄艳飞 何瑞 (74)专利代理机构 南京汇盛专利商标事务所 (普通合伙) 32238 代理人 赵超 (51)Int.Cl. A61K 31/575(2006.01) A61K 31/366(2006.01) A61K 31/47(2006.01) A61P 39/02(2006.01) A6。
2、1P 21/00(2006.01) A61P 15/00(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/10(2006.01) (54)发明名称 甾醇在降低他汀类药物肌肉和胚胎毒性方 面的应用 (57)摘要 本发明公开了甾醇在降低他汀类药物肌肉 和胚胎毒性方面的应用， 具体地， 本发明提供了 一种化学结构特定的甾醇在降低他汀类药物肌 肉和胚胎毒性方面的应用， 该甾醇的22、 23位碳 原子之间为双键连接， 22、 23位碳原子之间为单 键的甾醇对他汀类药物肌肉和胚胎毒性无减毒 作用； 而且， 该甾醇的7、 8位碳原子之间若也为双 键连接， 其对他汀类药物肌肉和胚胎毒性的。
3、减毒 作用进一步提高。 本发明提供的甾醇可以从实质 意义上降低他汀类药物的肌肉毒性以及申请人 前期实验发现的胚胎毒性。 权利要求书1页 说明书15页 附图2页 CN 107184588 A 2017.09.22 CN 107184588 A 1.如下结构的甾醇或其醇酯在制备降低他汀类药物肌肉和/或胚胎毒性的药物中的应 用， 其中， R为-CH3或-CH2CH3； C22-C23之间为双键， C7-C8之间或为双键。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述甾醇为麦角甾醇、 豆甾醇或菜籽甾醇， 或其醇酯。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于： 所述他汀类药物为洛伐他汀、 辛伐他。
4、汀、 普 伐他汀、 氟伐他汀、 阿伐他汀或西伐他汀。 4.一种用于降低他汀类药物肌肉和/或胚胎毒性的辅助用药， 其特征在于： 含有权利要 求1或2所述的甾醇或其醇酯。 5.一种降血脂的他汀类药物组合物， 含有他汀类成分， 其特征在于： 还含有权利要求1 或2所述的甾醇或其醇酯。 6.一种降血脂的药物制剂， 其特征在于： 包括权利要求5所述的药物组合物， 还包括药 学上可以接受的载体或赋形剂， 制成药学上可以接受的剂型。 7.根据权利要求6所述的治疗急性心肌梗死的药物制剂， 其特征在于： 所述药学上可以 接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、 半固体或液体辅料。 8.根据权利要求6所述的治疗急性。
5、心肌梗死的药物制剂， 其特征在于： 所述药学上可以 接受的剂型包括片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 注射剂、 丸剂、 糖浆剂、 散剂、 膏剂、 液体制剂。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107184588 A 2 甾醇在降低他汀类药物肌肉和胚胎毒性方面的应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 涉及已知药物的新用途， 具体涉及甾醇在降低他汀类药物 肌肉和胚胎毒性方面的应用。 背景技术 0002 他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂， 此类药物通过竞争性 抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶， 阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径， 使细胞内 胆固醇合成减。
6、少， 从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein， LDL)受体数量和活性增加、 使血清胆固醇清除增加、 水平降低。 他汀类药物已 成为降低LDL胆固醇的标准治疗剂。 0003 他汀类药物最常见的副作用包括消化不良、 腹痛和胃气胀， 最严重的不良反应是 血清转氨酶水平升高和引起肌炎。 肌毒性是所有的他汀类药物在高剂量时常见的作用 (Preclinical safety evaluation of cerivastatin,a novel HMG-CoA reductase inhibitor； Am J Cardiol.1998 Aug。
7、27； 82)， 机理似乎是对于线粒体的氧化损伤。 他汀类药 物引起乳酸盐/丙酮酸盐水平下降。 乳酸盐/丙酮酸盐比例是线粒体功能障碍和氧化状态的 一项灵敏指标。 临床研究表明他汀类药物消耗了能量产生所需的必要辅因子辅酶Q。 辅酶Q 的消耗具有剂量依赖性。 辅酶Q是线粒体电子转移过程中的必要部分， 其提供了氧化过程所 产生的能量。 他汀类药物通过在HMG CoA还原酶催化步骤中阻断胆固醇合成而发挥作用。 HMG CoA经还原产生甲羟戊酸。 甲羟戊酸经过一系列酶步骤用于合成胆固醇。 甲羟戊酸也是 辅酶Q的前体。 胆固醇合成抑制作用因此也抑制了辅酶Q的合成。 对能量有高需求的肌细胞 对于他汀类药物引。
8、起的损伤最为敏感。 当肌细胞内含物释放入体循环中时， 会产生最严重 的肌损伤形式(横纹肌溶解症)。 主要的并发症包括急性肾衰竭和心脏异常。 心脏毒性可能 是他汀类药物对于心肌辅酶Q水平的直接作用结果。 当他汀类药物和其他抑制细胞色素 p450系统的药物如唑类抗真菌剂、 西咪替丁和氨甲喋呤联合使用时， 发生这些不良反应的 几率更大。 使用吉非贝齐、 烟酸或大环内酯类药物的患者发生他汀类相关性肌炎的危险性 会有所增加。 即便没有药物相互作用的可能性， 他汀类药物对于肌肉的主要副作用也大大 地阻碍了患者继续使用这些药物。 任何安全性高、 不影响他汀类药物的疗效且可以有效降 低其肌肉毒性的药物都让人极。
9、为期待。 0004 CN200480022866.7公开了一种包含甾醇和/或甾烷醇及胆固醇生物合成抑制剂 (他汀类药物)的药物组合物， 该专利申请公开了甾醇和/或甾烷醇具有降血脂的作用， 与他 汀类药物合用后可以降低他汀类药物的给药剂量， 而由于他汀类药物的肌肉毒性是剂量依 赖性的， 所以该组合物可以在发挥降脂作用的同时克服他汀类药物的肌肉毒性。 0005 但是， 这种组合物并没有从实质上克服他汀类药物的肌肉毒性， 只是用其他降脂 药物替代了部分他汀类药物， 降低了他汀类药物的服用剂量， 使得肌肉毒性不明显而已。 而 他汀类药物对肌肉仍然是有损伤的， 这个问题不容忽视。 说 明 书 1/15 。
10、页 3 CN 107184588 A 3 发明内容 0006 本发明的目的在于从实质意义上降低他汀类药物的肌肉毒性以及申请人前期实 验发现的胚胎毒性， 目的是在不降低他汀类药物给药剂量的前提下降低他汀类药物造成的 肌肉毒性和胚胎毒性， 这就显然可以提高他汀类药物的服用安全性。 0007 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 0008 如下结构的甾醇或其醇酯在制备降低他汀类药物肌肉和/或胚胎毒性的药物中的 应用， 0009 0010 其中， R为-CH3或-CH2CH3； C22-C23之间为双键， C7-C8之间或为双键。 0011 优选地， 所述甾醇为麦角甾醇、 豆甾醇或菜籽甾醇。
11、， 或其醇酯。 0012 麦角甾醇、 豆甾醇或菜籽甾醇的化学结构式如下： 0013 0014 所述他汀类药物为洛伐他汀、 辛伐他汀、 普伐他汀、 氟伐他汀、 阿伐他汀或西伐他 汀。 0015 一种用于降低他汀类药物肌肉和/或胚胎毒性的辅助用药， 含有上述甾醇或其醇 酯。 0016 一种降血脂的他汀类药物组合物， 含有他汀类成分， 还含有上述甾醇或其醇酯。 0017 一种降血脂的药物制剂， 包括上述药物组合物， 还包括药学上可以接受的载体或 赋形剂， 制成药学上可以接受的剂型。 0018 优选地， 所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、 半固体或液 体辅料。 说 明 书 2/15 。
12、页 4 CN 107184588 A 4 0019 优选地， 所述药学上可以接受的剂型包括片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 注射剂、 丸剂、 糖 浆剂、 散剂、 膏剂、 液体制剂。 0020 本发明的优点： 0021 本发明提供了一种化学结构特定的甾醇在降低他汀类药物肌肉和胚胎毒性方面 的应用， 该甾醇的22、 23位碳原子之间为双键连接， 22、 23位碳原子之间为单键的甾醇对他 汀类药物肌肉和胚胎毒性无减毒作用； 而且， 该甾醇的7、 8位碳原子之间若也为双键连接， 其对他汀类药物肌肉和胚胎毒性的减毒作用进一步提高。 本发明提供的甾醇可以从实质意 义上降低他汀类药物的肌肉毒性以及申请人前期实验发。
13、现的胚胎毒性。 附图说明 0022 图1为对照组斑马鱼正常心包与他汀干预组斑马鱼水肿心包对比； 0023 图2为对照组斑马鱼与他汀干预组斑马鱼的脊柱和肌肉发育对比。 具体实施方式 0024 下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容， 但并不以此限定本发明的保护范 围。 实验中未详述的试验操作均为本领域技术人员所熟知的常规试验操作。 0025 下述实施例中以菜油甾醇和 -谷甾醇作为对比， 这两个甾醇的化学结构式如下： 0026 0027 从上述结构可见， 菜籽甾醇比菜油甾醇多C22-C23双键， 豆甾醇比 -谷甾醇多C22-C23 双键， 麦角甾醇比菜籽甾醇多C7-C8双键。 0028 实施例1。
14、 麦角甾醇、 菜籽甾醇和菜油甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀的减毒作用 0029 一、 实验材料 0030 实验动物： 0031 野生型AB品系繁殖用斑马鱼(Danio rerio)， 购自国家斑马鱼资源中心(中国科学 院水生生物研究所， 武汉)。 0032 仪器和试剂： 说 明 书 3/15 页 5 CN 107184588 A 5 0033 0034 0035 试剂配制： 0036 养鱼水： 以约0.06g海盐加入1L的蒸馏水中(终浓度约60 g/ml)， 充分溶解。 0037 麻醉剂： 称取0.016Tricaine， 加入100mL的纯水中， 超声溶解。 0038 他汀和甾醇用乙醇溶解后加入到。
15、养鱼水中， 使斑马鱼在他汀和甾醇中暴露养殖。 0039 二、 实验方法 0040 1、 斑马鱼的培养 0041 野生型AB品系繁殖用斑马鱼， 参照Westerfield的养殖方法， 在28条件下， 维持 14小时光照/10小时黑暗饲养于斑马鱼循环养殖系统(北京爱生科技发展有限公司， 北京) 中， 系统自动调节： pH 7.0-7.4； 电导率500-550 S/cm。 斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配 的方式进行， 胚胎用含有亚甲基蓝的养鱼水， 培养于智能光照培养箱中， 控制温度28.5。 说 明 书 4/15 页 6 CN 107184588 A 6 0042 2、 实验分组 0043 洛伐他。
16、汀组： 向养鱼水中投入洛伐他汀的乙醇溶液， 洛伐他汀终浓度为1.0 M； 0044 洛伐他汀+麦角甾醇组： 向养鱼水中投入洛伐他汀和麦角甾醇的乙醇溶液， 洛伐他 汀终浓度为1.0 M， 麦角甾醇终浓度为1.0 M； 0045 洛伐他汀+菜籽甾醇组： 向养鱼水中投入洛伐他汀和菜籽甾醇的乙醇溶液， 洛伐他 汀终浓度为1.0 M， 菜籽甾醇终浓度为1.0 M； 0046 洛伐他汀+菜油甾醇组： 向养鱼水中投入洛伐他汀和菜油甾醇的乙醇溶液， 洛伐他 汀终浓度为1.0 M， 菜油甾醇终浓度为1.0 M； 0047 辛伐他汀组： 向养鱼水中投入辛伐他汀的乙醇溶液， 辛伐他汀终浓度为1.0 M； 0048 。
17、辛伐他汀+麦角甾醇组： 向养鱼水中投入辛伐他汀和麦角甾醇的乙醇溶液， 辛伐他 汀终浓度为1.0 M， 麦角甾醇终浓度为1.0 M； 0049 辛伐他汀+菜籽甾醇组： 向养鱼水中投入辛伐他汀和菜籽甾醇的乙醇溶液， 辛伐他 汀终浓度为1.0 M， 菜籽甾醇终浓度为1.0 M； 0050 辛伐他汀+菜油甾醇组： 向养鱼水中投入辛伐他汀和菜油甾醇的乙醇溶液， 辛伐他 汀终浓度为1.0 M， 菜油甾醇终浓度为1.0 M； 0051 空白对照组： 仅加入等体积乙醇溶剂； 0052 每组4个平行， 每个平行50尾斑马鱼。 0053 给药处理： 取正常发育至48小时(48hpf)胚胎应用于本实验， 按照上述分。
18、组方法添 加药物， 使斑马鱼暴露在药物中培养， 观察胚胎发育状态。 每天观察统计斑马鱼死亡率、 胚 胎出膜率、 畸形率， 观察幼鱼发育状态。 在实验结束阶段(72hpf)， 每组收集50条斑马鱼幼鱼 用高浓度5*Tricain溶液进行深度麻醉处死， 10分钟后收集斑马鱼置于1.5ml管中， 加入100 l裂解液(冰上操作)， 组织研磨仪破碎组织后， 高速离心取上清， 按照肌酸激酶(CK)测定试 剂盒说明书测定上清液中CK浓度。 0054 三、 实验结果 0055 1、 麦角甾醇、 菜籽甾醇和菜油甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀胚胎毒性的干预作用 0056 从表1和表2可见， 48hpf胚胎药物干预24。
19、h后， 与空白对照组比， 洛伐他汀组和辛伐 他汀组斑马鱼死亡率显著升高(P0.05)， 出膜孵化率显著降低(P0.05)， 可以观察到有 些斑马鱼在出膜前就已经死亡， 有些斑马鱼出膜后死亡。 这表明， 洛伐他汀和辛伐他汀严重 干扰斑马鱼胚胎孵化， 具有明显的胚胎毒性。 当与麦角甾醇、 菜籽甾醇和菜油甾醇联合给药 时， 与洛伐他汀组相比， 洛伐他汀+麦角甾醇组、 洛伐他汀+菜籽甾醇组斑马鱼死亡率显著降 低(P0.05)， 出膜孵化率显著升高(P0.05)， 洛伐他汀+菜油甾醇组斑马鱼死亡率和出膜 孵化率无显著变化(P0.05)； 与辛伐他汀组相比， 辛伐他汀+麦角甾醇组、 辛伐他汀+菜籽 甾醇组。
20、斑马鱼死亡率显著降低(P0.05)， 出膜孵化率显著升高(P0.05)， 辛伐他汀+菜油 甾醇组斑马鱼死亡率和出膜孵化率无显著变化(P0.05)。 这表明， 麦角甾醇和菜籽甾醇可 以显著降低洛伐他汀和辛伐他汀对斑马鱼的胚胎毒性， 而菜油甾醇对这两种他汀的胚胎毒 性无明显缓解作用。 死亡的斑马鱼中有一部分是因为出现心包水肿导致心脏破裂死亡(正 常心包与水肿心包对比如图1所示， 各组心包水肿发生率如表3所示)。 0057 表1 药物干预对斑马鱼72小时胚胎死亡率的影响 说 明 书 5/15 页 7 CN 107184588 A 7 0058 0059 表2 药物干预对斑马鱼72小时胚胎孵化率的影响。
21、 0060 0061 表3 药物干预对斑马鱼心包水肿发生率的影响 说 明 书 6/15 页 8 CN 107184588 A 8 0062 0063 2、 麦角甾醇、 菜籽甾醇和菜油甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀肌肉毒性的干预作用 0064 患者服用他汀类药物后出现的肌病不良反应主要表现为肌痛、 乏力、 肌无力并伴 随着血液中与肌肉有关的酶如肌酸激酶(CK)含量的升高， 严重者肌肉纤维坏死其内容物肌 红蛋白大量释放到血中， 引起横纹肌溶解症。 因此， 研究者在动物模型上研究他汀类药物的 肌肉毒性时， CK含量是一个重要指标。 从表4可见， 48hpf胚胎药物干预24h后， 与空白对照组 比， 洛伐他。
22、汀组和辛伐他汀组斑马鱼组织中的CK含量显著升高(P0.05)， 培养过程中可见 洛伐他汀和辛伐他汀可导致斑马鱼脊柱弯曲、 肌肉萎缩， 脊柱和肌肉与空白对照组的比较 如图2所示， 这表明洛伐他汀和辛伐他汀可导致明显的肌肉毒性。 当与麦角甾醇、 菜籽甾醇 和菜油甾醇联合给药时， 与洛伐他汀组相比， 洛伐他汀+麦角甾醇组、 洛伐他汀+菜籽甾醇组 斑马鱼组织中的CK含量显著降低(P0.05)， 洛伐他汀+菜油甾醇组斑马鱼组织中的CK含量 无显著变化(P0.05)； 与辛伐他汀组相比， 辛伐他汀+麦角甾醇组、 辛伐他汀+菜籽甾醇组 斑马鱼组织中的CK含量显著降低(P0.05)， 辛伐他汀+菜油甾醇组斑马。
23、鱼组织中的CK含量 无显著变化(P0.05)。 这表明， 麦角甾醇和菜籽甾醇可以显著降低洛伐他汀和辛伐他汀对 斑马鱼的肌肉， 而菜油甾醇对这两种他汀的肌肉毒性无明显缓解作用。 0065 表4 药物干预对斑马鱼CK值的影响 0066 说 明 书 7/15 页 9 CN 107184588 A 9 0067 0068 实施例2 豆甾醇和 -谷甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀的减毒作用 0069 一、 实验材料 0070 实验动物： 0071 野生型AB品系繁殖用斑马鱼(Danio rerio)， 购自国家斑马鱼资源中心(中国科学 院水生生物研究所， 武汉)。 0072 仪器和试剂： 0073 0074 说。
24、 明 书 8/15 页 10 CN 107184588 A 10 0075 0076 试剂配制： 0077 养鱼水： 以约0.06g海盐加入1L的蒸馏水中(终浓度约60 g/ml)， 充分溶解。 0078 麻醉剂： 称取0.016Tricaine， 加入100mL的纯水中， 超声溶解。 0079 他汀和甾醇用乙醇溶解后加入到养鱼水中， 使斑马鱼在他汀和甾醇中暴露养殖。 0080 二、 实验方法 0081 1、 斑马鱼的培养 0082 野生型AB品系繁殖用斑马鱼， 参照Westerfield的养殖方法， 在28条件下， 维持 14小时光照/10小时黑暗饲养于斑马鱼循环养殖系统(北京爱生科技发展有。
25、限公司， 北京) 中， 系统自动调节： pH 7.0-7.4； 电导率500-550 S/cm。 斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配 的方式进行， 胚胎用含有亚甲基蓝的养鱼水， 培养于智能光照培养箱中， 控制温度28.5。 0083 2、 实验分组 0084 洛伐他汀组： 向养鱼水中投入洛伐他汀的乙醇溶液， 洛伐他汀终浓度为1.0 M； 0085 洛伐他汀+豆甾醇组： 向养鱼水中投入洛伐他汀和豆甾醇的乙醇溶液， 洛伐他汀终 浓度为1.0 M， 豆甾醇终浓度为1.0 M； 0086 洛伐他汀+ -谷甾醇组： 向养鱼水中投入洛伐他汀和 -谷甾醇的乙醇溶液， 洛伐他 汀终浓度为1.0 M， -谷甾醇终浓。
26、度为1.0 M； 0087 辛伐他汀组： 向养鱼水中投入辛伐他汀的乙醇溶液， 辛伐他汀终浓度为1.0 M； 0088 辛伐他汀+豆甾醇组： 向养鱼水中投入辛伐他汀和豆甾醇的乙醇溶液， 辛伐他汀终 浓度为1.0 M， 豆甾醇终浓度为1.0 M； 0089 辛伐他汀+ -谷甾醇组： 向养鱼水中投入辛伐他汀和 -谷甾醇的乙醇溶液， 辛伐他 汀终浓度为1.0 M， -谷甾醇终浓度为1.0 M； 0090 空白对照组： 仅加入等体积乙醇溶剂； 0091 每组4个平行， 每个平行50尾斑马鱼。 0092 给药处理： 取正常发育至48小时(48hpf)胚胎应用于本实验， 按照上述分组方法添 加药物， 使斑马。
27、鱼暴露在药物中培养， 观察胚胎发育状态。 每天观察统计斑马鱼死亡率、 胚 胎出膜率、 畸形率， 观察幼鱼发育状态。 在实验结束阶段(72hpf)， 每组收集50条斑马鱼幼鱼 用高浓度5*Tricain溶液进行深度麻醉处死， 10分钟后收集斑马鱼置于1.5ml管中， 加入100 l裂解液(冰上操作)， 组织研磨仪破碎组织后， 高速离心取上清， 按照肌酸激酶(CK)测定试 剂盒说明书测定上清液中CK浓度。 0093 三、 实验结果 0094 1、 豆甾醇和 -谷甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀胚胎毒性的干预作用 0095 从表5和表6可见， 48hpf胚胎药物干预24h后， 与空白对照组比， 洛伐他汀组和。
28、辛伐 他汀组斑马鱼死亡率显著升高(P0.05)， 出膜孵化率显著降低(P0.05)， 可以观察到有 些斑马鱼在出膜前就已经死亡， 有些斑马鱼出膜后死亡。 这表明， 洛伐他汀和辛伐他汀严重 说 明 书 9/15 页 11 CN 107184588 A 11 干扰斑马鱼胚胎孵化， 具有明显的胚胎毒性。 当与豆甾醇联合给药时， 与洛伐他汀组相比， 洛伐他汀+豆甾醇组斑马鱼死亡率显著降低(P0.05)， 出膜孵化率显著升高(P0.05)， 洛 伐他汀+ -谷甾醇组斑马鱼死亡率和出膜孵化率无显著变化(P0.05)； 与辛伐他汀组相 比， 辛伐他汀+豆甾醇组斑马鱼死亡率显著降低(P0.05)， 出膜孵化率。
29、显著升高(P 0.05)， 辛伐他汀+ -谷甾醇组斑马鱼死亡率和出膜孵化率无显著变化(P0.05)。 这表明， 豆甾醇可以显著降低洛伐他汀和辛伐他汀对斑马鱼的胚胎毒性， 而 -谷甾醇对这两种他汀 的胚胎毒性无明显缓解作用。 死亡的斑马鱼中有一部分是因为出现心包水肿导致心脏破裂 死亡， 各组心包水肿发生率如表7所示。 0096 表5 药物干预对斑马鱼72小时胚胎死亡率的影响 0097 0098 表6 药物干预对斑马鱼72小时胚胎孵化率的影响 0099 0100 0101 表7 药物干预对斑马鱼心脏发育的影响 说 明 书 10/15 页 12 CN 107184588 A 12 0102 0103。
30、 2、 豆甾醇和 -谷甾醇对洛伐他汀和辛伐他汀肌肉毒性的干预作用 0104 患者服用他汀类药物后出现的肌病不良反应主要表现为肌痛、 乏力、 肌无力并伴 随着血液中与肌肉有关的酶如肌酸激酶(CK)含量的升高。 因此， 研究者在动物模型上研究 他汀类药物的肌肉毒性时， CK含量是一个重要指标。 从表8可见， 48hpf胚胎药物干预24h后， 与空白对照组比， 洛伐他汀组和辛伐他汀组斑马鱼组织中的CK含量显著升高(P0.05)， 培 养过程中可见洛伐他汀和辛伐他汀可导致斑马鱼脊柱弯曲、 肌肉萎缩， 这表明洛伐他汀和 辛伐他汀可导致明显的肌肉毒性。 当与豆甾醇联合给药时， 与洛伐他汀组相比， 洛伐他汀。
31、+ 豆甾醇组斑马鱼组织中的CK含量显著降低(P0.05)， 洛伐他汀+ -谷甾醇组斑马鱼组织中 的CK含量无显著变化(P0.05)； 与辛伐他汀组相比， 辛伐他汀+豆甾醇组斑马鱼组织中的 CK含量显著降低(P0.05)， 辛伐他汀+ -谷甾醇组斑马鱼组织中的CK含量无显著变化(P 0.05)。 这表明， 豆甾醇可以显著降低洛伐他汀和辛伐他汀对斑马鱼的肌肉， 而 -谷甾醇对 这两种他汀的肌肉毒性无明显缓解作用。 0105 表8 药物干预对斑马鱼CK值的影响 0106 0107 实施例3 麦角甾醇、 豆甾醇、 菜籽甾醇与洛伐他汀联合降脂 0108 一、 实验材料 0109 实验动物： 野生型AB品。
32、系繁殖用斑马鱼(Danio rerio)， 购自国家斑马鱼资源中心 (中国科学院水生生物研究所， 武汉)。 0110 仪器和试剂： 说 明 书 11/15 页 13 CN 107184588 A 13 0111 0112 0113 试剂配制： 0114 养鱼水： 以约0.06g海盐加入1L的蒸馏水中(终浓度约60 g/ml)， 充分溶解。 0115 麻醉剂： 称取0.016Tricaine， 加入100mL的纯水中， 超声溶解。 0116 高胆固醇饲料： 取0.4克胆固醇， 乙醚溶解后， 与10克普通饲料一起搅拌均匀， 烘干 至乙醚完全挥发， 充分研磨。 0117 药物配制： 将药物和胆固醇一。
33、起加入乙醚中溶解， 配制方法同高胆固醇饲料配方。 0118 二、 实验方法 0119 1、 斑马鱼的培养 说 明 书 12/15 页 14 CN 107184588 A 14 0120 野生型AB品系繁殖用斑马鱼， 参照Westerfield的养殖方法， 在28条件下， 维持 14小时光照/10小时黑暗饲养于斑马鱼循环养殖系统(北京爱生科技发展有限公司， 北京) 中， 系统自动调节： pH 7.0-7.4； 电导率500-550 S/cm。 斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配 的方式进行， 胚胎用含有亚甲基蓝的养鱼水， 培养于智能光照培养箱中， 控制温度28.5。 0121 2、 实验分组 012。
34、2 对照组、 高胆固醇组(模型组)、 洛伐他汀组、 洛伐他汀+麦角甾醇组、 洛伐他汀+菜 籽甾醇组、 洛伐他汀+豆甾醇组， 每组4个平行， 每个平行100尾斑马鱼。 0123 给药处理： 野生型AB品系斑马鱼孵化至4dpf时， 转移至2L烧杯中。 将发育正常、 具 备游动能力的幼鱼按完全随机的方法分为六组， 分别为： 对照组、 高胆固醇组、 洛伐他汀组、 洛伐他汀+麦角甾醇组、 洛伐他汀+菜籽甾醇、 洛伐他汀+豆甾醇。 从斑马鱼发育至5dpf时， 对 照组给予标准饲料AP100， 高胆固醇组给与不含药的高胆固醇饲料， 各给药组给予含药的高 胆固醇饲料， 每天喂食两次， 喂食后幼鱼自由进食， 及。
35、时清理食物残渣。 给药14天后， 每组收 集30条斑马鱼幼鱼用高浓度5*Tricain溶液进行深度麻醉处死， 10分钟后收集斑马鱼置于 1.5ml管中， 加入100 l裂解液(冰上操作)， 组织研磨仪破碎组织后， 高速离心取上清， 用于 生化指标测定。 0124 三、 实验结果 0125 从表9-11可见， 与空白组相比， 高胆固醇组斑马鱼体内总胆固醇(TC)、 甘油三酯 (TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平明显升高(P0.05)； 与高胆固醇组相比， 洛伐他汀组、 洛 伐他汀+麦角甾醇组、 洛伐他汀+菜籽甾醇组、 洛伐他汀+豆甾醇组斑马鱼体内总胆固醇 (TC)、 甘油三酯(TG)和低密度。
36、脂蛋白(LDL-C)水平明显降低(P0.05)， 且含有甾醇的洛伐 他汀组降低更为明显。 这些结果表明， 麦角甾醇、 豆甾醇、 菜籽甾醇可以增强洛伐他汀的降 脂作用， 与洛伐他汀存在协同降脂作用。 0126 表9 药物干预对斑马鱼幼鱼总胆固醇(TC)水平的影响 0127 0128 表10 药物干预对斑马鱼幼鱼甘油三酯(TG)水平的影响 说 明 书 13/15 页 15 CN 107184588 A 15 0129 0130 表11 药物干预对斑马鱼幼鱼低密度脂蛋白(LDL-C)水平的影响 0131 0132 麦角甾醇、 豆甾醇、 菜籽甾醇也可以增强辛伐他汀等他汀药物的降脂作用， 这已被 现有技。
37、术报道， 具体药理数据就不一一赘述。 0133 甾醇醇酯由甾醇醇羟基成酯而成， 甾醇醇酯进入机体后会水解成甾醇发挥作用， 这已被现有技术报道， 因此， 本领域技术人员可以预料到本发明提供的甾醇的醇酯也具有 上述减毒和协同降脂作用， 因此也属于本发明要求保护的范围。 0134 实施例4 甾醇及其醇酯用于制备降低他汀肌肉和胚胎毒性的辅助用药 0135 肌毒性是所有的他汀类药物在高剂量时常见的作用。 他汀类药物引起乳酸盐/丙 酮酸盐水平下降。 乳酸盐/丙酮酸盐比例是线粒体功能障碍和氧化状态的一项灵敏指标。 临 床研究表明他汀类药物消耗了能量产生所需的必要辅因子辅酶Q。 辅酶Q的消耗具有剂量依 赖性。。
38、 辅酶Q是线粒体电子转移过程中的必要部分， 其提供了氧化过程所产生的能量。 他汀 类药物通过在HMG CoA还原酶催化步骤中阻断胆固醇合成而发挥作用。 HMG CoA经还原产生 甲羟戊酸。 甲羟戊酸经过一系列酶步骤用于合成胆固醇。 甲羟戊酸也是辅酶Q的前体。 胆固 醇合成抑制作用因此也抑制了辅酶Q的合成。 对能量有高需求的肌细胞对于他汀类药物引 起的损伤最为敏感。 当肌细胞内含物释放入体循环中时， 会产生最严重的肌损伤形式(横纹 肌溶解症)。 主要的并发症包括急性肾衰竭和心脏异常。 心脏毒性可能是他汀类药物对于心 肌辅酶Q水平的直接作用结果。 当他汀类药物和其他抑制细胞色素p450系统的药物如。
39、唑类 抗真菌剂、 西咪替丁和氨甲喋呤联合使用时， 发生这些不良反应的几率更大。 使用吉非贝 齐、 烟酸或大环内酯类药物的患者发生他汀类相关性肌炎的危险性会有所增加。 即便没有 药物相互作用的可能性， 他汀类药物对于肌肉的主要副作用也大大地阻碍了患者继续使用 说 明 书 14/15 页 16 CN 107184588 A 16 这些药物。 0136 从实施例1-3可见， 本发明提供的甾醇及其醇酯可以明显降低他汀类药物的肌肉 和胚胎毒性， 因此， 可以将本发明提供的甾醇及其醇酯制成降低他汀肌肉和胚胎毒性的辅 助用药， 以减少他汀对那些必须服用高剂量他汀的患者或必须使用他汀与吉非贝齐、 烟酸、 大环。
40、内酯类药物联用的患者或对他汀毒性耐受性低的患者的肌肉毒性， 并减少他汀对孕妇 患者的胚胎毒性。 其对他汀的减毒作用并不以牺牲他汀药物的用量和使用方式为代价。 0137 已知甾醇的水溶性和油溶性均很差， 现有技术中， 为了改善其溶解性， 一般用物理 和化学方法对其进行改性。 物理改性主要是改善其分散性， 利用包合、 微乳、 喷雾干燥等技 术； 化学改性就是在植物甾醇分子上接上亲油/亲水基团(即制备成醇酯)以改善其溶解性。 但这两种方式均增加了工艺复杂性和成本。 发明人在一个具体实验中发现， 当麦角甾醇与 一定比例的麦芽糖醇(麦芽糖醇质量为麦角甾醇质量的15-25)混合后， 其水溶性和油溶 性均显。
41、著提高， 在水和大豆油中的溶解性均由几乎不溶或不溶变为略溶(溶解性参考2015 版中国药典)。 这可以大大降低麦角甾醇的制药工艺， 可以方便地制成用于降低他汀肌肉和 胚胎毒性的水性或油性辅助用药， 与他汀类药物配合使用。 0138 实施例5 制备他汀与甾醇或其醇酯的药物组合物、 药物制剂 0139 从实施例1-3可见， 本发明提供的甾醇及其醇酯可以明显降低他汀类药物的肌肉 和胚胎毒性， 因此， 可以将本发明提供的甾醇及其醇酯与他汀类药物制成药物组合物、 药物 制剂， 比他汀的降脂作用更优， 且肌肉毒性和胚胎毒性显著降低。 服用这种药物组合物、 药 物制剂时， 不需要降低他汀类药物的剂量。 因此。
42、， 可以制备一种降血脂的药物制剂， 含有他 汀和上述甾醇或其醇酯， 还包括药学上可以接受的载体或赋形剂， 制成药学上可以接受的 剂型。 药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、 半固体或液体辅料。 药学上可 以接受的剂型包括片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 注射剂、 丸剂、 糖浆剂、 散剂、 膏剂、 液体制剂。 这对 于本领域技术人员而言是容易实现的。 0140 综上， 本发明提供了一种化学结构特定的甾醇在降低他汀类药物肌肉和胚胎毒性 方面的应用， 该甾醇的22、 23位碳原子之间为双键连接， 22、 23位碳原子之间为单键的甾醇 对他汀类药物肌肉和胚胎毒性无减毒作用； 而且， 该甾醇的7、 8位碳原子之间若也为双键连 接， 其对他汀类药物肌肉和胚胎毒性的减毒作用进一步提高。 本发明提供的甾醇可以从实 质意义上降低他汀类药物的肌肉毒性以及申请人前期实验发现的胚胎毒性。 说 明 书 15/15 页 17 CN 107184588 A 17 图1 说 明 书 附 图 1/2 页 18 CN 107184588 A 18 图2 说 明 书 附 图 2/2 页 19 CN 107184588 A 19 。