一段人型乳头瘤病毒-6DNA序列(5)特异性的确定及其应用 技术领域：
本发明涉及一段人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6DNA序列(5)特异性的确定及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6是一种泌尿系统经常感染的病毒。准确的诊断是进行即时而可靠的治疗的依据，目前只能根据临床指征进行诊断。PCR和基因芯片诊断是一种快速而准确的检测方法。而这一类的诊断方法依赖于获得特异的核酸序列。
发明内容：
本发明在于通过生物信息学和分子生物学技术，确定了一段人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6特异核苷酸序列及其PCR引物。该序列和相应的PCR引物可用于建立基因芯片和PCR方法进行人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6的诊断。
本发明的技术方案为：本发明利用现有的方法确定了长度为214bp的一段人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6特异DNA序列(5)及其PCR引物，用引物进行PCR扩增，其序列如下：
caaaagggaa tggatttgga aatgtaaatg ttgttactct agtatgtaaa tacttatatt 60
tatcttcttt agtaatatct atgttggacg ttactagcag aggtggacat ttaattaatg 120
tcaatgcttt atgctttctg tcaatactca taggattacc atctaacaaa tttctcatat 180
atgtatccat atatatccaa catggctgtg ttgc 214
引物序列为：
1.5’-gcaacacagccatgttggat-3’
2.5’-caaaagggaatggatttgga-3’
上述人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6地特异DNA序列(5)用于诊断人型乳头瘤病毒-6的基因芯片的探针序列，并通过上述的引物序列进行PCR扩增，标记后进行杂交检测或直接用于PCR诊断。
用本发明建立的临床检测技术所使用的方法具有快速、准确、操作简便、成本低等优点。
附图说明：
图1为临床标本的PCR扩增图谱。
图2、图2续是测序图。其中图2是测定的序列、图2续是原始测序图谱。
图3是用Blast软件对PCR扩增产物的测序结果与预计序列的比较分析。
图4、图4续(1)、图4续(2)、图4续(3)是基因数据库中Blast搜索结果。
图5为基因芯片杂交结果。
具体实施方式：
首先以人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6为关键词，在基因数据库中搜索人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6的核苷酸序列。共获得数条关系较密切的核苷酸序列，将这些核苷酸序列用NCBI网上的Blast在线使用软件比对基因数据库中的核苷酸序列(nr)，排出非特异性的核苷酸序列，获得了6Kb特异性的核苷酸序列。以这段序列设计了20余对PCR引物，以临床标本提取DNA，进行PCR扩增，筛选到一对适合进行PCR扩增的序列及引物，PCR扩增获得的产物与预计大小一致(见图1，图中序号1为标准分子量DNA，，分子量大小从上至下分别为：622，527，404，309，242/238，217，201，190，180，160+160，147+147，123；2、4、5为临床阴性标本，没有扩增产物；3为临床阳性标本，扩增产物很纯，大小在210左右，与预计大小一致。图谱结果显示用本发明中的引物能特异的扩增临床样品)，然后用T-vector进行克隆，并测序(测序报告见图2、图2续，图中从58位开始，到271位，共214bp为克隆序列，其余序列为克隆载体序列)，序列为214通过Blast软件比对预计序列，显示与预计的序列一致(见图3，图中除第62位由a改变成c，第71位由a改变成g，第89位由c改变成t外，其余均与预计序列一致)，表明该序列可以被特异性的扩增，可用于人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6PCR检测。序列用NCBI网站的Blast搜索基因数据库的DNA(包含cDNA)序列，该序列只与人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6的序列一致，而与其它的物种序列没有同源性【见图4、图4续(1)、图4续(2)、图4续(3)，图中搜寻结果表明，只有人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6的质粒DNA序列与本序列同源，并且是完全配对。而其它的序列，由于没有引物与之配对，故在检测中不会被检测到】。用这一序列标记后作为探针与含有9种泌尿生殖道感染病原物的45个基因位点的基因芯片杂交，只有本发明序列与此有杂交信号，而其它所有序列与此无杂交信号(见图5，图中是4个重复，每个重复含9种泌尿生殖道感染性疾病病原物共45个不同的位点和4个对照位点。杂交结果表明只有本序列有特异信号，而其它均无杂交信号)，表明该序列为人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6的特异序列。
本发明可用于PCR方法或基因芯片方法进行人型乳头瘤病毒(humanpapillomavirua)-6的临床检测。用本发明提供的序列进行PCR扩增，根据PCR方法获得产物是否出现和大小判断是否为人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6感染。也可用本序列为探针，作为基因芯片中的一个检测位点，然后用本发明中的PCR引物序列扩增临床标本，并标记后进行杂交检测。
说明书序列表
<110>昆明寰基生物芯片开发有限公司
<120>一段人型乳头瘤病毒-6DNA序列(5)特异性的确定
<140>
<141>
<160>1
<210>1
<211>214
<212>DNA
<213>人型乳头瘤病毒(human papillomavirua)-6
<220>
<221>gene
<222>(1)…(214)
<400>1
caaaagggaa tggatttgga aatgtaaatg ttgttactct agtatgtaaa tacttatatt 60
tatcttcttt agtaatatct atgttggacg ttactagcag aggtggacat ttaattaatg 120
tcaatgcttt atgctttctg tcaatactca taggattacc atctaacaaa tttctcatat 180
atgtatccat atatatccaa catggctgtg ttgc 214