技术领域
本发明涉及鼠麹草提取物、鼠麹草有效物质富集物，制备方法与应用。
背景技术
尿酸是人类嘌呤化合物的最终代谢产物，嘌呤代谢紊乱会导致高尿酸血症。高尿酸血症(HUA)是指在正常嘌呤饮食状态下，非同日两次空腹血尿酸水平男性高于420μmol/L，女性高于360μmol/L。高尿酸血症是由于体内尿酸生成增加或排出减少引起。高尿酸血症是痛风的发病基础，当尿酸浓度过饱和形成结晶，沉积在关节滑膜，软组织，软骨和肾脏等处就会引发"痛风"，从而触发机体固有免疫反应，导致关节及其周围组织炎症反应和肾功能损害。高尿酸血症患者，体内糖和脂肪的代谢功能会明显降低，容易引发各种严重的疾病，主要有糖尿病，高血压、高血脂、冠心病、心肌梗塞，动脉粥样硬化等，严重威胁人体健康。
随着人们生活水平的提高，饮食结构的改变，在我国高尿酸血症人群已呈现逐年上升趋势。临床降尿酸药物需求量将逐年增大。
西医中，降尿酸治疗主要通过抑制尿酸生成，增加尿酸排泄或分解等方式控制尿酸水平。目前，临床上用于降尿酸的化学药或生物制剂主要包括以下几类：
(1)抑制尿酸生成-黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制剂：别嘌呤醇，非布索坦等。
(2)促进尿酸排泄-尿酸盐阴离子转运蛋白(URAT1)抑制剂：苯溴马隆，苯磺唑酮，苯磺舒等。
(3)促进尿酸分解-尿酸酶类：拉布立酶(Rasburicase)，聚乙二醇化重组尿酸氧化酶(PEG-uricase)。
有临床病例表明，长期服用XOD抑制剂类药物，痛风复发率依然较高。 而长期服用促尿酸排泄药物会引起严重肝毒性以及急性肾损伤，在用药期间特别需要专业医师指导。2014年底CFDA已经公布苯溴马隆不良反应通报，提醒医生和患者知晓用药风险。因此，毒性较小的天然药用动植物资源成为药物开发的重要原料来源。
鼠麴草，(Gnaphalium affine，又称鼠曲草、佛耳草、白艾)，为菊科鼠麹草属植物，味微甘、性平，有祛风化痰泻浊之效。《名医别录》明确记载“主痹寒，寒热”；《药典》1977版记载“祛风湿，用于风湿痹痛”。清明节前后，我国多地各民族民间有采其嫩茎叶食用的习惯。
文献Lin W,Xie J,Wu X,Yang L,Wang H.Inhibition of Xanthine Oxidase Activity by Gnaphalium Affine Extract.Chinese Medical Sciences Journal,2014.29(4):225-230公开了一种鼠麹草乙醇提取物(95％的乙醇提取)，并证明其有体外抑制黄嘌呤氧化酶作用，即对尿酸的生成有抑制作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的促尿酸排泄类药物存在不良反应较大，且现有的抑制尿酸生成的鼠麹草提取物并非理想药物提取物的缺陷，而提供了鼠麹草提取物、鼠麹草有效物质富集物，制备方法与应用。本发明制备得到的鼠麹草提取物和鼠麹草有效物质富集物可以促进尿酸排泄且药效稳定，进一步地，鼠麹草有效物质富集物还可以降低尿素氮水平，对尿酸造成的急性肾损伤具有一定保护作用；且鼠麹草野生资源丰富、药材成本低廉，开发潜力巨大。
现有技术中鼠麹草95％乙醇提取物有一定的体外抑制黄嘌呤氧化酶作用，即对尿酸的生成有抑制作用，然而长期服用黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物，痛风复发率依然较高。从病症缓解机理角度来说抑制尿酸的生成并不能很好地从根源上将体内尿酸总量有效降低，尤其是尿酸总量已经处于较高水平时，抑制尿酸生成药物并非理想解决方式，因而寻找一种理想促进尿酸排泄的天然药物提取物是亟待解决的问题，最终，本发明通过下述技术方案解决上述 技术问题。
本发明提供了鼠麹草提取物的制备方法，其包括以下步骤：将鼠麹草与乙醇水溶液混合，提取得提取液，即可；其中，所述的乙醇水溶液为体积百分含量为50％～80％的乙醇水溶液。
所述的鼠麹草提取物的制备方法中，所述的乙醇水溶液优选为体积百分含量为60％的乙醇水溶液。所述的鼠麹草与所述的乙醇水溶液的重量体积比可为常规植化提取中的原料与溶剂的用量比，优选1:10～1:20kg/L，更优选1:10～1:15kg/L。所述的鼠麹草优选为阴干后的鼠麹草。本领域中，所述的阴干一般指即将药材放置于室内、室外或大棚的阴凉处、利用流动的空气，吹去水分而达到干燥的目的，本发明中所述的“阴干后的鼠麹草”一般指水分的质量含量约为4％的鼠麹草。
所述的提取的温度可以为50～100℃，更优选70～80℃。所述提取的次数可以参照本领域的常规选择，本发明优选2～4次，更优选3次。所述的提取中单次提取的时间可根据本领域常规进行选择，本发明优选1～2h。
本发明所述的鼠麹草提取物的制备方法，还可包括浓缩所述的提取液得浓缩液或浓缩物的步骤。
其中，所述的浓缩的条件可以参照本领域常规进行选择，本法优选减压浓缩；所述的减压浓缩的温度优选50～70℃。所述的“浓缩所述的提取液得浓缩液”中，所述的鼠麹草与所述的浓缩液的质量体积比优选1:0.5～1:2kg/L，更优选1:0.5～1:1kg/L。所述的“浓缩所述的提取液得浓缩物”中，优选浓缩所述的提取液至干，得到所述的浓缩物。
本发明还提供了鼠麹草有效物质富集物的制备方法，其包括以下步骤：用石油醚萃取上述的浓缩液得到水相一；乙酸乙酯萃取所述的水相一得到水相二；水饱和正丁醇萃取所述的水相二，收集水饱和正丁醇相，即可。
所述的鼠麹草有效物质富集物的制备方法中，所述的浓缩液一般为所述的鼠麹草提取物的制备方法制备得到的所述的浓缩液，也可以通过所述的鼠麹草提取物的制备方法制备得到的所述的浓缩物与水混合后得到。
所述的鼠麹草有效物质富集物的制备方法中，所述的石油醚的用量可以参照本领域的常规进行选择，本发明中，所述的浓缩液与所述的石油醚的体积比优选1:1～1:2；所述的石油醚萃取的次数可以参照本领域常规进行选择，本发明优选2～4次，更优选3次。
所述的乙酸乙酯的用量可以参照本领域的常规进行选择，本发明中，所述的水相一与所述的乙酸乙酯的体积比优选1:1～1:2；所述的乙酸乙酯萃取的次数可以参照本领域常规进行选择，本发明优选2～4次，更优选3次。
所述的水饱和正丁醇可为本领域常规使用的水饱和正丁醇，配置方法一般为室温下(0～40度)将正丁醇和蒸馏水混合(混合体积比为1:1)，振摇，混匀，放置过夜，得到的混合液分层，上层为水饱和的正丁醇溶液。所述的水饱和正丁醇的用量可以参照本领域的常规进行选择，本发明中，所述的水相二与所述的水饱和正丁醇的体积比优选1:1～1:2；所述的水饱和正丁醇萃取的次数可以参照本领域常规进行选择，本发明优选2～4次，更优选3次。
所述的鼠麹草有效物质富集物的制备方法中，还可进一步包括浓缩、干燥所述的水饱和正丁醇相的步骤；其中，所述的浓缩优选减压浓缩。所述的浓缩优选浓缩所述的水饱和正丁醇相至干，即可。
本发明还提供一种由上述鼠麹草提取物的制备方法制备得到的鼠麹草提取物。
本发明还提供一种由上述鼠麹草有效物质富集物的制备方法制备得到的鼠麹草有效物质富集物。
本发明还提供一种上述的鼠麹草提取物和/或鼠麹草有效物质富集物在制备促进尿酸排泄药物中的应用。
本发明还提供了一种上述的鼠麹草提取物和/或鼠麹草有效物质富集物在制备用于治疗和/或预防由尿酸水平高引起的相关病症药物中的应用，或在制备用于调节尿酸水平功能食品中的应用。
本发明所述的“由尿酸水平高引起的相关病症”可为高尿酸血症和/或痛风。所述的调节尿酸水平功能食品一般指降低尿酸水平的功能食品。
本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述的鼠麹草提取物和/或上述的鼠麹草有效物质富集物，以及药学上可接受的赋形剂。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：1、相比于同类化学药物，本发明产品来源于鼠麹草，毒副作用较小，且鼠麹草野生资源丰富，药材成本低廉，开发潜力巨大；2、本发明中的鼠麹草50～80％乙醇提取物相比于鼠麹草95％乙醇提取物促尿酸排泄药效更强；且在较大的剂量范围之内(250～1000mg/kg小鼠)也基本能够保持很好的药效，因此药效的稳定性好；3、所述的鼠麹草有效物质富集物在剂量降低4-8倍，仍可以保持显著的药效；还可进一步降低尿素氮水平，对尿酸造成的急性肾损伤具有一定保护作用。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1
阴干后鼠麹草切段，称取1kg，与60％(v/v)乙醇水溶液15L(1：15，kg/L)比例混合，加热回流提取2次，每次1h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)，干燥，得鼠麹草提取物166.4g。
实施例2
阴干后鼠麹草切段，称取5kg，与50％(v/v)乙醇水溶液50L(1：10，kg/L，比例混合，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(70℃)，干燥，得鼠麹草提取物982.2g。
实施例3
阴干后鼠麹草切段，称取2kg，与80％(v/v)乙醇水溶液40L(1：20， kg/L)比例混合，加热回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(50℃)，干燥，得鼠麹草提取物311.6g。
实施例4
阴干后鼠麹草切段，称取5kg，与60％(v/v)乙醇水溶液75L(1：15，kg/L)比例混合，加热回流提取4次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(60℃)至5L(药材：浓缩液体积为1:1kg/L)，得提取浓缩液。
提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取3次，每次浓缩液与石油醚体积比1：1(v/v)，弃掉石油醚相，得水相一。水相一加入乙酸乙酯，萃取3次，每次水相一与乙酸乙酯体积比1：1(v/v)，萃取之后得水相二。水相二加入水饱和正丁醇，萃取3次，每次水相二与水饱和正丁醇体积比1：1(v/v)，合并水饱和正丁醇相，减压至干，得鼠麹草有效物质富集物129.6g。
实施例5
阴干后鼠麹草切段，称取0.6kg，与50％(v/v)乙醇水溶液6L(1：10，kg/L)比例混合，加热回流提取3次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(70℃)至1.2L(药材：浓缩液体积为1:2kg/L)，得提取浓缩液。
提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取2次，每次浓缩液与石油醚体积比1：2(v/v)，弃掉石油醚相，得水相一。水相一加入乙酸乙酯，萃取2次，每次水相一与乙酸乙酯体积比1：2(v/v)，萃取之后得水相二。水相二加入水饱和正丁醇，萃取2次，每次水相二与水饱和正丁醇体积比1：2(v/v)，合并水饱和正丁醇相，减压至干，得鼠麹草有效物质富集物16.8g。
实施例6
阴干后鼠麹草切段，称取2kg，与80％(v/v)乙醇水溶液40L(1：20，kg/L)比例混合，加热回流提取2次，每次2h，合并提取液。提取液减压浓缩(50℃)至1L(药材：浓缩液体积为1:0.5kg/L)，得提取浓缩液。
提取浓缩液加入60～90℃石油醚萃取4次，每次浓缩液与石油醚体积比1：1(v/v)，弃掉石油醚相，得水相一。水相一加入乙酸乙酯，萃取4次，每次水相一与乙酸乙酯体积比1：1(v/v)，萃取之后得水相二。水相二加入水 饱和正丁醇，萃取4次，每次水相二与水饱和正丁醇体积比1：1(v/v)，合并水饱和正丁醇相，减压至干，得鼠麹草有效物质富集物49.6g。
对比实施例1将乙醇水溶液的浓度由60％(v/v)换做95％(v/v)，其余条件和步骤同实施例1。
对比实施例2、按照现有文献《白艾提取液对高尿酸血症大鼠的实验研究》，林伟青，谢建祥，王海东，中华风湿病学杂志，2005，9(8)，509-510，第1.2.2部分，制备得到的鼠麹草水提物。
效果实施例1
本发明效果实施例1均采用直接补充尿酸致小鼠高尿酸血症模型，供试物制备、给药方式、造模、血样采集等方法如下：
单次给药方式：
鼠种：ICR小鼠；方法：正常组和模型组小鼠灌胃给予0.5％羧甲基纤维素钠水溶液(CMC-Na，g/mL)，0.2mL/10g体重；给药组小鼠灌胃给予不同浓度阳性药或供试物(鼠麹草提取物或鼠麹草有效物质富集物)的CMC-Na水悬浊液，0.2mL/10g体重。一小时后，正常组小鼠腹腔注射1％的CMC-Na水溶液(g/mL)，模型组与给药组腹腔注射尿酸混悬液(溶剂为1％的CMC-Na水溶液，g/mL)，0.2mL/只，注射剂量250mg尿酸/kg小鼠体重。
注射尿酸一小时后眼底静脉丛插管取血0.5mL，冰浴保存，离心，血清在一小时内通过全自动生化仪(日本日立，型号：7080)以及尿酸(尿酸酶法)、尿素氮(尿素酶-谷氨酸脱氢酶法)检测试剂盒检测尿酸和尿素氮含量。
其中给药的规格如下：
别嘌醇组为别嘌醇片(购自上海信谊)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)，以100mg别嘌醇/kg小鼠体重给药，给药体积0.2mL/10g小鼠体重；
苯溴马隆组为苯溴马隆片(购自德国赫曼大药厂)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)，以50mg苯溴马隆/kg小鼠体重给 药，给药体积0.2mL/10g小鼠体重；
尿酸混悬液为将尿酸(购自Sigma)混悬于1％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)中，注射体积为0.2mL/只，注射剂量为250mg尿酸/kg小鼠体重。
供试物(实施例1～6和对比实施例1～3)配制：将供试物(实施例1～6和对比实施例1～3制得的产物)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)中，给药体积为0.2mL/10g小鼠体重，具体给药剂量见表1～8。
多次给药方式：
鼠种：ICR小鼠；方法：正常组和模型组小鼠灌胃给予0.5％羧甲基纤维素钠水溶液(CMC-Na，g/mL)，每只0.2mL/10g体重，连续灌胃5天；给药组小鼠灌胃给予阳性药或不同浓度供试物(鼠麹草提取物或有效物质富集物)的CMC-Na水悬浊液，连续灌胃5天。最后一天灌胃后一小时，正常组小鼠腹腔注射1％的CMC-Na水溶液(g/mL)，模型组与给药组腹腔注射尿酸混悬液(溶剂为1％的CMC-Na水溶液，g/mL)0.2mL/只，注射剂量为250mg尿酸/kg小鼠体重。
注射尿酸一小时后眼底静脉丛插管取血0.5mL，冰浴保存，离心，血清在一小时内通过全自动生化仪(日本日立，型号：7080)以及尿酸(尿酸酶法)、尿素氮(尿素酶-谷氨酸脱氢酶法)检测试剂盒检测尿酸和尿素氮含量。
其中给药的规格如下：
别嘌醇组为别嘌醇片(购自上海信谊)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)，以100mg别嘌醇/kg小鼠体重给药，给药体积0.2mL/10g小鼠体重；
苯溴马隆组为苯溴马隆片(购自德国赫曼大药厂)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)，以50mg苯溴马隆/kg小鼠体重给药，给药体积0.2mL/10g小鼠体重；
尿酸混悬液为将尿酸(购自Sigma)混悬于1％的羧甲基纤维素钠水溶 液中(CMC-Na，g/mL)中，注射体积为0.2mL/只，注射剂量为250mg尿酸/kg小鼠体重。
供试物(实施例1～6和对比实施例1～3)配制：将供试物(实施例1～6和对比实施例1～3制得的产物)混悬于0.5％的羧甲基纤维素钠水溶液中(CMC-Na，g/mL)中，给药体积为0.2mL/10g小鼠体重，具体给药剂量见表1～8。
具体实验数据如表1～8所示：
表1.实施例1制得的鼠麹草提取物单次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
表1的实验结果表明，实施例1制得的鼠麹草提取物在500mg/kg剂量，经单次给药，与模型组比较具有显著的促尿酸排泄作用。对比实施例1和对比实施例2制得的鼠麹草提取物(500mg/kg)单次给药后，与模型组相比，血尿酸水平无显著性差异，即无明显促尿酸排泄作用。
表2.实施例1制得的鼠麹草提取物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表2实验结果表明，实施例1鼠麹草提取物在250、500和1000mg/kg剂量，经多次给药与模型组比较，均具有显著的促尿酸排泄作用。对比实施例1和对比实施例2制得的鼠麹草水提物(500mg/kg)经多次给药后，与模型组相比，P<0.05，呈现出一定的促尿酸排泄作用，但仍弱于实施例1制得的鼠麹草提取物。
表3.实施例2制得的鼠麹草提取物单次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较**P<0.01
表3实验结果表明，实施例2制得的鼠麹草提取物在500和1000mg/kg剂量，经单次给药，与模型组比较均具有显著的促尿酸排泄作用。对比实施例2制得的鼠麹草水提物(500mg/kg)经单次给药后，与模型组相比，差异不显著，促尿酸排泄作用不明显。
表4.实施例2制得的鼠麹草提取物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表4实验结果表明，实施例2鼠麹草提取物在250、500、1000mg/kg剂量，经多次给药，与模型组比较均具有显著的促尿酸排泄作用。对比实施例2制得的鼠麹草水提物(500mg/kg)经多次给药后，与模型组比较P<0.05，呈现出一定的促尿酸排泄作用，但活性弱于实施例2鼠麹草提取物。
表5 实施例3制得的鼠麹草提取物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
表5实验结果表明，实施例3制得的鼠麹草提取物在250、500、1000mg/kg剂量，经多次给药，与模型组比较均具有显著的促尿酸排泄作用。对比实施例2制得的鼠麹草水提物(500mg/kg)经多次给药后，与模型组比较，呈现出一定的促尿酸排泄作用，但活性弱于实施例3制得的鼠麹草提取物。
表6 实施例4制得的鼠麹草有效物质富集物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001
表6实验结果表明，实施例4制得的鼠麹草有效物质富集物在62.5、125、250mg/kg剂量，经多次给药，与模型组比较均具有显著的促尿酸排泄作用；且在62.5、125mg/kg剂量水平能够显著降低尿素氮水平，活性高于苯溴马隆组，对尿酸造成的急性肾损伤具有一定保护作用。
表7 实施例5制得的鼠麹草有效物质富集物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
表7实验结果表明，实施例5制得的鼠麹草有效物质富集物在62.5、125、250mg/kg剂量，经多次给药，与模型组比较均具有显著的促尿酸排泄作用；且在62.5、125mg/kg剂量水平能显著降低尿素氮水平，活性明显高于苯溴马隆组，对尿酸造成的急性肾损伤具有一定保护作用。
表8 实施例6制得的鼠麹草有效物质富集物多次给药促尿酸排泄活性
与正常组比较：##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
表8实验结果表明，实施例6制得的鼠麹草有效物质富集物在62.5、125、250mg/kg剂量，经多次给药，与模型组比较，均具有显著的促尿酸排泄作 用；且在62.5、125、250mg/kg剂量水平下尿素氮水平与模型组有显著差异，能够显著降低尿素氮水平，活性明显高于苯溴马隆组，对尿酸造成的急性肾损伤具有一定保护作用。