技术领域
本发明涉及Ruxolitinib在制备治疗M2型急性髓系白血病药物中的应用，尤其是涉及Ruxolitinib在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病药物中的应用。
背景技术
白血病是一类造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，因白血病细胞自我更新增强、增殖失控、分化障碍和凋亡受阻，而停泄在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中，白血病细胞大量增生累积，使正常造血受抑制并浸润其他器官和组织，临床表现为肝脾淋巴结肿大或局部肿块伴有不同程度的贫血、出血、感染以及骨骼疼痛。白血病是一种常见的疾病，发病率在肿瘤疾病中居第六位，是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。有资料显示，全球每年新增的白血病患者30万人，而死于白血病者亦达22.2万人。我国每年新增白血病患者4万余人，发病率约为3~4/万人。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，可将白血病分为急性和慢性两大类。急性和慢性白血病又可根据白血病细胞系列归属各自分为急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性粒细胞性白血病（CML）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）。白血病耐药性是目前白血病治疗失败的主要原因之一。
M2b型急性髓系白血病(acute myeloid leukemia M2b，AML-M2b)具有特征性的非随机性染色体易位t(8;21)(q22;q22)，该易位产生的AML1-ETO融合基因及其编码蛋白与AML-M2b发病密切相关。M2型急性髓系白血病（AML M2）发病率较高，占所有AML的25%。目前临床上主要采用细胞毒类化疗药物（蒽环类药物、阿糖胞苷等）治疗AML-M2b，尽管大多数患者经标准诱导缓解方案化疗后可获得完全缓解，但仍有大约50%患者在缓解后短期内复发并对常规化疗药物产生耐药。因而AML-M2b白血病的治疗还有待进一步改进。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是TNF超家族成员之一，是一种II型膜蛋白，通过与其特异性死亡受体（DR4和DR5）结合而激活凋亡信号转导途径，从而诱导肿瘤细胞凋亡。
TRAIL可诱导肿瘤细胞发生快速、高效的凋亡反应，而对正常细胞无明显毒性，这一特点使其成为近年来肿瘤治疗的研究热点，然而体外实验也观察到肿瘤细胞对TRAIL产生耐药的现象。近来有研究表明，TRAIL与一些药物合用，可以增强其诱导凋亡的能力。TRAIL与多种药物联合应用具有协同效应，但其中确切的相互作用机制尚不清楚。
中国专利文献CN 200510102194.7，公开了一种化合物PSI在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病的药物中的应用。中国专利文献CN200510102193.2，公开了一种化合物MG-132在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病的药物中的应用。但是关于Ruxolitinib作为药物治疗白血病，特别是治疗M2型急性髓系白血病目前还未见报道。
Ruxolitinib是一种选择性Janus激酶（JAK）1/2酪氨酸蛋白激酶抑制剂，其通过阻断JAK信号转导及转录因子（STAT）通路而发挥作用，该通路在许多与细胞增生、生长和造血有关的细胞因子和生长因子的信号转导中起关键作用。Ruxolitinib是FDA批准的首个治疗骨髓纤维化的药物，其分子结构如下图所示。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Ruxolitinib在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病药物中的应用。
本发明的再一目的是，提供Ruxolitinib在制备具有抑制白血病细胞Kasumi-1生长和诱导其凋亡作用的药物中的应用。
本发明的另一的目的是，提供一种治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病的联合用药物。
本发明的第四个目的是，提供所述的联合用药物在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病药物中的应用。
本发明的第五个目的是，提供Ruxolitinib在制备上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3、抑制NF-κB蛋白活性的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
Ruxolitinib在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病药物中的应用。
所述的药物是通过上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3、抑制NF-κB蛋白活性来治疗白血病的。
所述的Ruxolitinib浓度为1×10-6~1×10-5M。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
Ruxolitinib在制备具有抑制白血病细胞Kasumi-1生长和诱导其凋亡作用的药物中的应用。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病的联合用药物，它包括Ruxolitinib和rsTRAIL。
所述的Ruxolitinib和rsTRAIL比例为5mM：1~10ng/ml。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
所述的联合用药物在制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病药物中的应用。
所述的联合用药物是通过上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3、抑制NF-κB蛋白活性来治疗白血病的。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
Ruxolitinib在制备上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3、抑制NF-κB蛋白活性的药物中的应用。
Kasumi－1是培养自人t（8；21）急性髓系白血病患者的细胞系，是体外研究该类型白血病的良好模型。本发明通过Ruxolitinib和/或rsTRAIL对Kasumi-1细胞的体外作用，用细胞毒性CCK-8试验测定不同浓度Ruxolitinib对Kasumi-1细胞生存率的影响；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测其对细胞凋亡凋亡的影响。结果表明不同浓度的Ruxolitinib对Kasumi-1细胞均有生长抑制作用，而Ruxolitinib联合rsTRAIL作用24h后，对Kasumi-1细胞的生长抑制作用更为显著；DAPI染色后显微镜下观察细胞形态，发现Ruxolitinib单药和联合rsTRAIL用药组的Kasumi-1细胞形态均出现胞体缩小和胞核固缩等显著变化，而联合用药组上述改变更为显著；rsTRAIL联合Ruxolitinib作用于Kasumi-1细胞48小时，与相同质量浓度rsTRAIL和相同浓度的Ruxolitinib分别单独作用于Kasumi-1细胞相比，能明显增加细胞凋亡率。通过对Ruxolitinib体外增强rsTRAIL对Kasumi-1细胞诱导凋亡机制的研究，发现Ruxolitinib可以上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、激活凋亡蛋白caspase-3、上调凋亡蛋白Bax的表达和抑制NF-κB蛋白活性。以上结果表明Ruxolitinib不仅能单独用于治疗白血病，而且将其与rsTRAIL联合用药后治疗效果更佳明显。
本发明提供了Ruxolitinib在临床医学上可作为治疗白血病药物的用途。Ruxolitinib是应用于制备治疗具有t（8；21）染色体易位的M2型急性髓系白血病的药物中，药物Ruxolitinib不仅本身对白血病细胞Kasumi－1具有抑制生长和诱导凋亡作用，而且其通过上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3和抑制NF-κB蛋白活性从而增强了白血病细胞Kasumi－1对药物rsTRAIL的敏感性。本发明中药物Ruxolitinib在治疗具有t(8;21)染色体易位的M2型急性髓系白血病白血病中的应用，不仅为此类白血病的治疗提供了新的治疗药物，而且为克服白血病细胞的TRAIL耐药性提供了新途径。
附图说明
附图1是不同终浓度的rsTRAIL（0、1、5、10、100ng/ml）作用于Kasumi-1细胞24h、48h、72h后细胞生存率。
附图2是不同终浓度的Ruxolitinib（0、1、100nM，1、5、10uM）作用于Kasumi-1细胞24h、48h、72h后细胞生存率。
附图3是5uM浓度的Ruxolitinib联合rsTRAIL（1、5、10ng/ml）作用Kasumi-1细胞24h后生存率。
附图4是rsTRAIL、Ruxolitinib单药及其联合用药对Kasumi-1细胞凋亡作用的DAPI染色细胞核观察。其中，A为Control(对照组)；B为rsTRAIL（10ng/ml）单独作用24h后；C为Ruxolitinib（10uM）单独作用24h后；D为rsTRAIL（10ng/ml）+Ruxolitinib（10uM）联合作用24h后。
附图5是流式细胞术测定rsTRAIL、Ruxolitinib单药和联合用药对Kasumi-1细胞AnnexinV/PI表达的作用。其中，A为Control(对照组)；B为10ng/ml rsTRAIL单独作用48小时；C为10uM Ruxolitinib单独作用48小时；D为rsTRAIL(10ng/ml)联合Ruxolitinib(10uM)作用48小时。
附图6是流式细胞术测定rsTRAIL、Ruxolitinib单药和联合用药对Kasumi-1细胞AnnexinV/PI表达的作用。其中E为图5中B+D代表对照组中加入与稀释药物同等浓度的BSA和DMSO，R代表Ruxolitinib， T代表rsTRAIL， R+T代表Ruxolitinib+rsTRAIL。
附图7是Ruxolitinib（10uM）作用于Kasumi-1细胞，分别于6、12、24、48h后荧光PCR检测JAK1、JAK2、CD45、TRAIL及TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2 mRNA水平变化。与正常未加药对照组细胞比较，以β-actin作为内参。
附图8是Ruxolitinib（0、1、5、10uM）单独用于Kasumi-1细胞48h后JAK1、JAK2、p-STAT3蛋白变化水平。
附图9是Ruxolitinib（10uM）和rsTRAIL(10ng/ml)联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察TRAIL及死亡受体（DR4、DR5），诱骗受体（DcR1、DcR2）的蛋白水平变化。
附图10是Ruxolitinib（0、1、5、10uM）单独用于Kasumi-1细胞48h后DR4蛋白变化水平。
附图11是Ruxolitinib（10uM）和rsTRAIL(10ng/ml)联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察DR4蛋白水平变化。
附图12是Ruxolitinib（10uM）单独及联合rsTRAIL（10ng/ml）应用于Kasumi-1细胞48h，观察凋亡蛋白Caspase8和9水平变化。
附图13是Ruxolitinib（10uM）单独及联合rsTRAIL（10ng/ml）应用于Kasumi-1细胞48h，观察Caspase3和促凋亡蛋白Bax水平变化。
附图14是Kasumi-1细胞经siRNA干扰JAK2，STAT3后对DR4蛋白水平影响。其中，siJAK2、siSTAT3的效率，以mRNA水平表达测定，干扰效率分别达（87.91%±2.67%）（90.12%±2.53%）(P<0.05)。
附图15是Kasumi-1细胞经siRNA干扰JAK2后TRAIL受体DR4的蛋白水平变化。
附图16是Kasumi-1细胞经siRNA干扰STAT3后，TRAIL受体DR4的蛋白水平变化。
附图17是Ruxolitinib单独及联合rsTRAIL作用于Kasumi-1细胞，NF-κB蛋白水平变化。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 Ruxolitinib和/或rsTRAIL对Kasumi-1细胞的体外作用
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1细胞系
Kasumi-1细胞:由上海瑞金医院血研所诸江教授馈赠，用含10%FBS+RPMI1640培养液在37℃、5%CO2、饱和湿度下的培养箱中培养，取对数期的细胞进行实验。
1.1.2主要试剂
表1
1.1.3主要仪器
表2
1.2方法
1.2.1 细胞培养
细胞培养条件: Kasumi-1细胞在无菌操作条件下接种于含10%FBS的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。
细胞传代：细胞低速离心后，弃上清，3-5ml培养基重悬细胞，转移至培养瓶中继续培养。
细胞冻存：细胞低速离心后，用冻存液（1640:FBS:DMSO=7:2:1）重悬，置于冻存管中，存于冻存盒，放入-80℃过夜，长期保存置于液氮罐内。
DAPI染色
将Kasumi-1细胞2×105/ml的浓度接种于24孔板，实验分为4组:
加入不同浓度rsTRAIL组，使其浓度分别为1、5、10、20、100ng/ml；
加入不同浓度Ruxolitinib组，使其终浓度分别为1、100nM，1、5、10uM；
联合用药组，在加入不同浓度rsTRAIL的同时分别加入不同浓度的Ruxolitinib；
④ 空白对照组（不加任何药物）。各组细胞分别培养24h，取不同药物处理组的细胞，甩片甲醛固定后用滴管滴加DAPI染液，吸球轻轻吹打，使之混匀，显微镜下观察细胞核变化。
1.2.3 CCK-8实验
将Kasumi-1细胞2×105/ml浓度分别接种到96孔板，实验分为5组:
加入不同质量浓度rsTRAIL，使其终浓度分别为1、5、10、100ng/ml，分别作用24h、48h、72h；
加入不同浓度Ruxolitinib组，使其终浓度分别为1、100nM，1、5、10uM，分别作用24h、48h、72h；
联合用药组，在加入不同浓度rsTRAIL的同时分别加入Ruxolitinib，作用48h；
空白组，不加细胞和药物，仅加入100ul含10%的FBS的RPMI1640液；
对照组，不加药物，只加90ul细胞和10ul含10%FBS的RPMI1640培养液。
每孔共加100ul，每组均做复孔。在每个药物作用时间点，每孔均加入CCK-8试剂10ul，温箱中继续孵育2h，在450nm和630nm波长下用酶标仪测定各孔的吸光度值。以各组复孔的平均值作为该组的A值，并计算细胞生存率，细胞生存率%=[(A实验组-A空白组)]/(A对照组-A空白组)] ×100%，实验重复3次。
两药协同作用判断标准：采用国内金（正均）氏公式判断Ruxolitinib和rsTRAIL的联合作用是否具有协同性。公式为：Q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)。EA为A药单独处理24h的细胞抑制率，EB为B药单独处理24h的细胞抑制率，EA+EB为两药联合处理24h的细胞抑制率。Q值介于0.85-1.15为单纯相加，介于1.15-2.0为增强，大于2.0为明显增强，介于0.85-0.55为拮抗，小于0.55为明显拮抗。
1.2.4 Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率
将Kasumi-1细胞2×105/ml浓度接种于6孔板，实验分为4组：
加入DMSO和BSA，使其终浓度分别为1‰、10ng/ml。
加入终浓度为10ng/ml的TRAIL组。
加入终浓度为10uM的Ruxolitinib组。
联合用药组：加入终浓度为10ng/ml的TRAIL联合10uM的Ruxolitinib组。
每孔共加样2ml，于37℃、含5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养48h。
取上述各组细胞，1000rpm离心5min，弃上清后收集细胞，行Annexin V-FITC/PI流式检测凋亡，具体流程如下：
将收集的细胞用冷PBS洗涤2次，1000rpm离心5分钟，去上清，取总数约为1×106个细胞待检测。
用250ul1×结合缓冲液重悬细胞使其浓度为（2-5）×105cells/ml。
取195ul的细胞悬液加入5ulAnnexin V-FITC，轻轻混匀后间隔3min，轻轻混匀后间隔3min，再加入10ul浓度为20ug/ml的碘化丙啶（PI）溶液。
混匀后于室温下避光孵育10min。
孵育后加入300ul 1×结合缓冲液，轻轻混匀，上流式细胞仪进行检测分析。
流失细胞仪光源为488nm氩离子激光器，FITC激发后发绿色荧光，PI激发后发红色荧光。流式细胞仪分析后所获得的四个象限组成的细胞直方图分别代表不同的细胞:左下格为AnnexinV(-)/PI(+)，代表死亡细胞，右下格为AnnexinV(+)/PI(-)，代表膜完整的凋亡细胞数；右上格为Annexin V(+)/PI(+)，代表晚期凋亡细胞数和坏死细胞数。
1.2.5 统计学处理
（1）计量资料数据均采用“均数±标准差（x±s）”表示，各种统计图采用SPSS20.0for windows及Microsoft Excel 统计软件获得，均以P<0.05为差异显著。
（2）不同浓度rsTRAIL、不同浓度Ruxolitinib单药及联合作用于Kasumi-1细胞及耐药株经不同作用时间后细胞生长抑制率的比较采用重复测量数据的方差分析。
（3）Annexin V-FITL/PI双染检测细胞凋亡率的比较用单因素方差分析。（one-way ANOVA）。
2 实验结果
2.1 CCK-8比色法检测细胞生长抑制率。
如图1，2，3所示，不同浓度的rsTRAIL及不同浓度Ruxolitinib对Kasumi-1细胞均有生长抑制作用，抑制细胞生长成明显的剂量和时间依赖性（P<0.05），rsTRAIL对细胞的生长抑制也呈时间及剂量依赖性（P<0.05）。而5uM联合不同浓度rsTRAIL作用24h后，对细胞的生长抑制作用更为显著。
用金（正均）公式分析显示：分别联合不同浓度rsTRAIL作用24h后，Kasumi-1细胞Q值介于单纯相加值增强，由此可以证实，Ruxolitinib可以协同增强rsTRAIL对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用。Ruxolitinib联合不同浓度的rsTRAIL对Kasumi-1细胞有生长抑制作用，抑制细胞生长成明显的剂量和时间依赖性（P<0.05）。
2.2 DAPI染色后显微镜下形态。
如图4所示，rsTRAIL、Ruxolitinib单药及其联合用药对Kasumi-1细胞凋亡作用的DAPI染色细胞核观察。
A: 对照组细胞核大小基本一致，形态规整。
B: rsTRAIL单独作用24h后，细胞均出现胞核固缩。
C: Ruxolitinib单独作用24h后，细胞也出现胞核固缩，但无rsTRAIL用药组明显。
D: 两种药物联合作用24h后，细胞核固缩、碎裂。
普通光学显微镜下观察不同药物处理后细胞形态学改变。rsTRAIL（10ng/ml）单药、Ruxolitinib单药和rsTRAIL与联合用药组，作用24h后观察发现，单药和联合用药组细胞形态均出现胞体缩小和胞核固缩等显著变化，而联合用药组上述改变更为显著。
2.3 流式细胞术（AnnexinV/PI双染色）检测细胞凋亡率。
收集rsTRAIL、Ruxolitinib单独及其联合用药作用48小时后的Kasumi-1细胞，用AnnexinV FITC/PI双标记检测细胞凋亡率。结果发现，rsTRAIL联合Ruxolitinib作用于Kasumi-1细胞48小时，与相同质量浓度rsTRAIL和相同浓度的Ruxolitinib分别单独作用于Kasumi-1细胞相比，能明显增加细胞凋亡率，前者AnnexinV-FITC阳性率为（56.66%±4.23%），后两者分别为（30.62%±3.34%）和（33.99%±3.67%），差异显著（P<0.05）。
3、结论
（1）rsTRAIL和Ruxolitinib在体外单独作用和联合用药均可抑制Kasumi-1细胞的生长，且呈时间和剂量依赖性。
（2）rsTRAIL和Ruxolitinib在体外均有诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。
（3）Ruxolitnib在体外具有增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。
实施例2 Ruxolitinib体外增强rsTRAIL对Kasumi-1细胞诱导凋亡机制的研究
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 引物
根据NCBI数据库提供的人TRAIL、DR4、DR5、DcR1、DcR2、JAK1、JAK2、mRNA序列，以β-actin作为内参照，用软件Primer5.0设计引物，并由上海生工生物有限公司合成：
DR4引物序列：
Forward Primer:5’aaatgggtacaacaaaactggac3’
Reverse Primer:5’gagcctgtgccatcttctaagt3’
DR5引物序列：
Forward Primer:5’agacttggtgccctttgactc3’
Reverse Primer:5’cggttttgttgacccactttat3’
DcR1引物序列：
Forward Primer:5’attacaccaacgcttccaaca3’
Reverse Primer:5’catctctggggagttttcattc3’
DcR2引物序列：
Forward Primer:5’gtgtgtcagtgtgaaaaaggaag3’
Reverse Primer:5’aggtagtgatagggagaggcaag3’
TRAIL引物序列：
Forward Primer:5’gtgtgtcagtgtgaaaaaggaag3’
Reverse Primer:5’aggtagtgatagggagaggcaag3’
JAK1引物序列：
Forward Primer:5’ccactaccggatgaggttcta 3’
Reverse Primer:5’gggtctcgaataggagccag 3’
JAK2引物序列：
Forward Primer:5’agcctatcggcatggaatatct 3’
Reverse Primer: 5’taacactgccatcccaagaca 3’
β-actin 引物序列：
Forward Primer:5’ccacggaaactaccttcaactcc3’
Reverse primer:5’tcatactcctgctgcttgctgatcc3’
1.1.2 抗体：
表3
1.1.3 主要仪器
表4
1.1.4 主要试剂配制
磷酸盐缓冲液(PBS 1000ml)
表5
1.2实验方法
1．2.1 细胞培养
1.2.2 凋亡相关基因mRNA水平检测
（1）细胞总RNA的提取:取对数生长期的Kasumi-1细胞，按2×105/ml接种于6孔培养板，培养48h。
a.取1×107/ml细胞，加入1ml Trizol，用匀浆器打碎，在室温下孵育5min，使核酸蛋白复合体充分裂解。
b.按5:1（Trizol:氯仿）的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃几秒钟，室温下孵育2-3min。
c.于12000g 4℃条件下离心15min，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚-氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入Trizol体积的60%。
d.将水相移入干净的离心管，每1mlTrizol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，15-30℃静置10min。
e.于12000g 4℃条件下离心15min，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。
f.RNA洗涤，倒掉上清液，1mlTrizol加入1ml的比例加入75%乙醇，震荡混匀。于7500g 4℃条件下离心5min，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5-10min，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。
g.用DEPC处理过的水重新溶解RNA。
h.用紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。
（2）逆转录
a. 去除RNA中的基因组DNA。
依照下表将相关试剂加入于薄壁PCR管内，DNaseI反应体系：
b.37℃孵育30min。
c.加入1ul 25mM EDTA于65℃孵育10min。
依照下表将相关试剂加入薄壁PCR管内：
d.65℃孵育5min，随后于冰上冷却，并依次加入下列试剂：
e.轻轻混匀，离心机轻甩后，42℃，孵育60min。
f.70℃孵育5min，终止反应，反应产物-20℃保存。
Real-Time PCR
使用7500 Real-Time PCR System，按下列组份配制PCR反应液：
进行Real-Time PCR反应。采用两步法PCR反应程序：
Stage1:预变性，95℃30s；
Stage2:PCR反应，95℃5s，60℃34s，40个循环。
1.2.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）
（1）细胞总蛋白提取
a.取对数生长的细胞，按2×105浓度接种于6孔板培养板中，分别加入所需终浓度的药物。
b.1000rpm离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗两次，彻底弃净上清。
c.大约每1×106个细胞加入0.3ml裂解液，（每1ml裂解液在使用前加入10ul蛋白酶抑制剂），用枪反复抽吸混匀混合物。
d.在冰上轻轻摇动混合物，裂解大约15min。
e.14000g 4℃离心15min，收集上清，即为总蛋白。
（2）BCA法测定蛋白质浓度
本方法是将双缩脲反应和显色反应结合在一起：前者为在碱性中介，蛋白质可将CU2+还原成CU+的反应，后者为使用含有二喹啉甲酸（BCA）的独特试剂，利用比色法检测CU+，具有高灵敏度和高选择性的特点。此法中产生的紫色显色物质是由两分子BCA和一分子的亚铜离子螯合而成。该水溶性复合物在562nm处有很强的光吸收值，在很宽的蛋白质范围内（20-2000ug/ml），吸光值和蛋白质浓度具有良好的线性关系。
a.梯度稀释牛血清白蛋白（BSA,2mg/ml）标准品：BSA终浓度分别为2000ug/ml、1500ug/ml、1000ug/ml、750ug/ml、500ug/ml、250ug/ml、125ug/ml、25ug/ml、0ug/ml（空白）。
b.配制BCA工作液：将50份BCA试剂A和一份BCA试剂B混合（试剂A与试剂B的比率=50:1），制备工作液。
c.取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各100ul，加入到做好标记的试管中。
d.在每个试管中加入2ml工作液，充分混匀，置于37度反应30min，将所有试管冷却至室温。
e.用分光光度计在562nm出测定各孔吸光度，将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。
f.将BSA标准品在562nm处经过空白校正的吸光值对其浓度（ug/ml）作图，绘制标准曲线，并使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的蛋白质浓度。
g.将蛋白质样品分装后-20℃保存。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
a.制胶
12%聚丙烯酰胺分离胶配方：
表6
5%聚丙烯酰胺浓缩胶配方：
表7
(4)上样
在已经聚合的分离胶上灌注浓缩胶后，立即插入梳子，避免产生气泡，将凝胶垂直室温放置30-45min。
样品处理：取分装好的细胞总蛋白或浆蛋白，加入5×上样缓冲液，100℃水浴5min。
待浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子，立即用电泳缓冲液冲洗加样孔，以去除没有聚合的丙烯酰胺。
将玻璃板装入电泳槽，加满1×电泳缓冲液。
用微量加样器向加样孔中加入处理好的样品和预染蛋白Marker。
接通电源，上层浓缩胶时调节电压为80mv，当溴酚蓝前沿进入下层分离胶后，将电压提高110mv继续电泳。当溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳取下玻璃板，分离凝胶。
（5）转膜
a.电泳结束后，戴上手套，裁6张滤纸和一张PVDF膜其大小应与凝胶大小一致，在膜的一角做好标记。
b.将PVDF膜放于甲醇中激活5-6min至半透明。然后再放入转膜缓冲液中浸润10-15min。
c.将凝胶、滤纸和海绵垫一起放入转膜缓冲液中浸润15min。
d.按“三明治”方法安装转移装置。
在黑色面上放置一块海绵垫，在其上放置3张滤纸，然后用玻璃试管在滤纸上滚动以排除气泡。
将凝胶放在滤纸上，用玻璃管滚动以排除气泡。
将PVDF膜放在凝胶上，用玻璃管滚动，保证凝胶和PVDF膜间没有气泡存留。
然后将另外3张滤纸放在PVDF膜上，同样保证不留有气泡。
最后放上另外一块海绵垫，合上夹子，放入转移装置。
e.倒入转膜缓冲液，放入冷却装置。接通电源，150mA横流转移120min。
f.电转移结束后，拆卸转移装置，取出PCDF膜，用ddH2O洗2遍，每次5min，去除甲醇。并标出作为分子量标准的参照蛋白的位置。
（6）封闭
将PVDF膜置于封闭液中室温缓摇1h，以封闭无关蛋白结合位点。
（7）一抗孵育
封闭结束后，将一抗取出用5%脱脂奶粉稀释好。加入鼠抗人DR4单克隆抗体（按1:500稀释），加入兔抗人DR5单克隆抗体（按1:500稀释）；加入兔抗人DcR1单克隆抗体(按1:500稀释)；加入兔抗人DcR2单克隆抗体(按1:500稀释)；加入加入兔抗人JAK1单克隆抗体（按1:1000稀释）；加入兔抗人JAK2单克隆抗体（按1:1000稀释）；加入兔抗人p-STAT3单克隆抗体（按1:1000稀释）；加入兔抗人NF-κB单克隆抗体（按1:1000稀释）；加入兔抗人Caspase-3抗体（按1:1000稀释）；加入兔抗人Caspase-8抗体（按1:1000稀释）；加入鼠抗人Caspase-9(按1:1000稀释)；加入鼠抗人GAPDH单克隆抗体（按1:5000稀释），4度孵育过夜。
二抗孵育
一抗孵育结束后将膜放入TBST中，洗膜4次，每次10min，将洗好的膜中加入用5%脱脂奶粉稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG抗体（按1:8000稀释），室温孵育1.5h。二抗孵育结束后，用TBST洗膜4次，每次10min。
ECL显影
将ECL化学发光检测试剂A和B按比例混匀。将混合好的ECL试剂加到PCDF膜上，用发光成像系统拍照。
1.2.4 siRNA的转染
对于6孔板的转染程序如下：
（1）siRNA由锐博公司合成，每个siRNA序列5nmol。
si-JAK2 靶序列：GAAATATATTGGTGGAGAA
正义链：5‘ GAAAUAUAUUGGUGGAGAA dTdT 3
反义链：3‘ dTdT CUUUAUAUAACCACCUCUU 5
si-STAT3靶序列：GCCTCTCTGCAGAATTCAA
正义链：5‘ GCCUCUCUGCAGAAUUCAA dTdT 3
反义链：3‘ dTdT CGGAGAGACGUCUUAAGUU 5
（2）a. 开盖前，先短暂离心，将粉末收集于管底，加入250ul的无RNase的H2O，配制成20uM的溶液。
b.转染前一天，接种细胞至培养板中，使转染时细胞密度能够达到50%。
c.稀释转染试剂lipo2000:将lipo2000转染试剂轻轻摇匀，然后取5ul，用250ulOpti-MEM I稀释，轻轻混匀，室温孵育5min。
d. 稀释siRNA：用250ulOpti-MEMI稀释5ul 20uM的siRNA，轻轻混匀。
e. 稀释好的lipo2000经过5min的孵育后，与上述稀释好的siRNA轻轻混合，室温培养20min，以形成siRNA-lipo2000混合物。
f.将siRNA-lipo2000混合液加入含有1.5ml培养液的六孔板中，轻轻摇晃混合。
g.将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养至检测时间。
1.3 统计方法
剂量资料数据均采用“均数±标准差”表示，各种统计图采用SPSS20.0 for windows 及Microsoft Excel 统计软件获得。每组数据若方差齐性，则行单因素方差分析（one-way ANOVA）。若方差不齐，则行Kruskal-Wallis检验，两组之间两两比较采用Wilcoxon秩和检验，均以P<0.05为差异显著。
2、结果
2.1 Ruxolitinib单独用药对Kasumi-1细胞TRAIL及受体RNA水平的影响。
如图7所示，实时定量荧光PCR检测JAK1、JAK2、CD45、TRAIL及TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2 mRNA水平变化。Ruxolitinib（10uM）作用于Kasumi-1细胞，分别作用6、12、24、48h，结果与正常未加药对照组细胞比较，以β-actin作为内参，实验重复3次，相同时间内与对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义。
2.2 Ruxolitinib单独及联合rsTRAIL对Kasumi-1细胞TRAIL及受体蛋白水平的影响。
如图8所示，Ruxolitinib（0、1、5、10uM）单独用于Kasumi-1细胞48h后JAK1、JAK2、p-STAT3蛋白变化水平。
如图9所示，Ruxolitinib和rsTRAIL联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察TRAIL及死亡受体（DR4、DR5），诱骗受体（DcR1、DcR2）的蛋白水平变化。
如图10所示，Ruxolitinib（0、1、5、10uM）单独用于Kasumi-1细胞48h后DR4蛋白变化水平。
如图11所示，Ruxolitinib和rsTRAIL联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察DR4蛋白水平变化
2.3 Ruxolitinib（10uM）单独及联合rsTRAIL（10ng/ml）对Kasumi-1细胞相关凋亡蛋白水平的影响。
如图12所示，Ruxolitinib和rsTRAIL单独及联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察凋亡蛋白Caspase8和9水平变化。
如图13所示，Ruxolitinib和rsTRAIL单独及联合应用于Kasumi-1细胞48h，观察Caspase3和促凋亡蛋白Bax水平变化。
2.4 siRNAJAK2、STAT3对Kasumi-1细胞中DR4水平的影响。
如图14所示，Kasumi-1细胞经siRNA干扰JAK2，STAT3后对DR4蛋白水平影响。siJAK2、siSTAT3的效率，以mRNA水平表达测定，干扰效率分别达（87.91%±2.67%）、（90.12%±2.53%）(P<0.05)。
如图15所示，干扰JAK2后，TRAILs受体DR4的蛋白水平变化。
如图16所示，干扰STAT3后，TRAIL受体DR4的蛋白水平变化。
2.5 Ruxolitinib单独及联合rsTRAIL对Kasumi-1细胞NF-κB蛋白活性的影响。
如图17所示，Ruxolitinib单独及联合rsTRAIL作用于Kasumi-1细胞，NF-κB蛋白水平变化。
3、结论
（1）Ruxolitinib可以上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达，从而增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。
（2）Ruxolitinib通过激活caspase-3、上调Bax的表达，增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。
（3）Ruxolitinib通过抑制NF-κB蛋白活性，增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。
综上所述，药物Ruxolitinib不仅本身对肿瘤细胞Kasumi－1具有抑制生长和诱导凋亡作用，而且其通过上调TRAIL死亡受体DR4的mRNA及蛋白质水平的表达、上调细胞凋亡蛋白Bax表达、激活凋亡蛋白caspase-3和抑制NF-κB蛋白活性从而增强了肿瘤细胞Kasumi－1对药物rsTRAIL的敏感性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属上海市第五人民医院
<120> Ruxolitinib在制备治疗M2型急性髓系白血病药物中的应用
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<170> PatentIn version 3.3
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