技术领域
本发明涉及柞蚕提取领域，具体而言，涉及一种柞蚕蛹提取物、规模化生产方法及应用。
背景技术
昆虫没有专门的免疫系统，也没有产生免疫蛋白的细胞，但是昆虫先天免疫和后天所获得的免疫能力却是惊人的。近年来，对昆虫防御机制的研究发现，给蓖麻蚕、天蚕、家蚕以及棕尾别麻蝇等昆虫的幼虫或者蛹注射非致命细菌、疫苗菌等，都能诱导昆虫血淋巴产生免疫活性多肽和蛋白，这些蛋白或者多肽具有较强的广谱杀菌能力。
柞蚕是一种饲养于野外的经济昆虫，经常受到各种病毒、细菌以及自然界恶劣环境的侵袭，但柞蚕却能够适应十分恶劣的生态环境，并能够生存和发展。由此可见，柞蚕具有独特的防御和免疫系统，以及很强的抗病毒和细菌能力。
许多研究已经证实，柞蚕体内的血淋巴中，存在若干种抗病活性物质，但由于这些物质的浓度较低，采用一般的实验手段难以进行有效提取，现有的提取方法还仅停留在实验室研究阶段，并没有成熟的工业规模化的提取生产工艺。
为了解决无法工业化提取柞蚕体内有效物质的问题，现有技术中也做出了大量的努力。现有技术(《柞蚕抗病活性物质的提取及应用》，李树英，中国蚕业，第36期第1卷，第20-24页)，就公开了一种通过大肠杆菌突变株进行生物诱导，以激发柞蚕防御体质，从而促进生成足量活性物质，并进一步提取的方法。同时，现有技术(“柞蚕蛹发育过程中生理活性物质和蛋白质的变化研究”孟楠等，中国蚕业，第36卷第3期，第24-27页)，也公开了以柞蚕链球菌诱导柞蚕抗菌活性物质，并提取的方法。
然而，这些现有技术中虽然取得了一定的进展，但作为柞蚕蛹提取物工业化生产的前期研究而言，还存在较多问题。例如：(1)现有的提取方法中容易出现干扰，严重影响活性物质的质量；(2)以柞蚕链球菌和大肠杆菌为诱导剂所进行的提取反应获得的成品收率低；(3)大肠杆菌和柞蚕链球菌都不属于可食用菌，在功能性食品及药品生产应用中存在风险。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种柞蚕蛹提取物规模化生产方法，本发明方法中，以可食用菌为诱导剂，因此所得到的提取物安全性高；同时，本发明方法提取物总收率高，适宜工业规模化生产；进一步的，本发明方法对于不同活性成分含量的提升也有所侧重，能够满足不同的生产需求。本发明方法具有安全高效、产率高，适于规模化生产等优点。
本发明的第二目的在于提供一种由本发明方法提取得到的柞蚕蛹提取物。本发明柞蚕蛹提取物以可食用菌进行诱导并提取得到，因此具有提取物安全性高等优点。
本发明的第三个目的在于提供一种所述柞蚕蛹提取物的应用。本发明柞蚕蛹提取物安全性好，且有效成分含量高，因此适于作为原料以制备用于疾病治疗的药物或者保健食品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种柞蚕蛹提取物规模化生产方法，所述方法包括如下步骤：将处于滞育期的柞蚕蛹储存后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，并培养；采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥，并粉碎过筛，即得柞蚕蛹提取物；
其中，所述菌液为PZ1、PZ2或者PZ3中的一种或几种的混合物；
进一步的，PZ1为动物双歧杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3003；
PZ2为嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3342；
PZ3为嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.2467。
本发明中，通过使用动物双歧杆菌以及嗜酸乳杆菌等可食用菌种作为诱导剂，从而可以使得进一步提取所得到的提取物具有很好的安全性，并适于作为原料以制备相应的药物；同时，本发明以可食用菌种进行诱导，也可以获得较高的产率，还能够在一定程度上控制提取物中不同活性物质的含量，因而适于工业化的规模生产，也适于对产品中活性物质要求有所不同的大规模生产中。
可选的，本发明中，可以通过控制光照的方法进行解除滞育。
可选的，本发明中，所述储存为将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d；例如，本发明中，可以将处于滞育期的柞蚕蛹在1、2或者3℃的条件下，储存15、30、45、50、55、60或者65d。
本发明中，通过对待提取的滞育期柞蚕蛹储存温度和储存时间的选择和调整，从而可以使得本发明中待提取柞蚕蛹具有良好的生物活性，并有利于进一步生物细菌刺激以及活性成分的高效提取。
可选的，本发明中，所述注射处理为每个柞蚕蛹注射40～60μL菌液，菌液浓度为1×105～1×108cells/ml；例如，本发明中，每个柞蚕蛹可以注射45、50或者55μL菌液，菌液的浓度可以为1×106或者1×107cells/ml等。
本发明中，通过对用以诱导的菌液用量及浓度的选择和调整，从而可以对柞蚕蛹进行有效的生物刺激。
可选的，本发明中，所述培养为将注射处理后的柞蚕蛹在18～24℃条件下，培养3～7d；例如，本发明中，注射处理后的柞蚕蛹可以在19、20、21、22或者23℃条件下，处理4、5或者6d。
可选的，本发明中，所述采集培养后柞蚕蛹的血淋巴为在冰浴条件下采集血淋巴。
本发明中，通过在冰浴条件下采集血淋巴，从而可以有效保持提取物中有效物质的活性。
可选的，本发明中，所述冷冻干燥的时间为12～24h；例如，本发明所述冷冻干燥的时间可以为，但不限于13、15、17、20、22或者23h等。
本发明中，通过对冷冻干燥时间的选择和调整，从而可以在对提取物有效干燥纯化的同时，还能够避免冷冻干燥时间过长所导致的整体制备效率的降低以及对活性成分的结构破坏。
可选的，本发明中，所述方法还进一步包括将柞蚕蛹提取物消毒的步骤。
本发明中，通过进一步在提取后增加消毒的步骤，从而能够进一步提高本发明柞蚕蛹提取物的安全性。
可选的，本发明中，所述消毒为Co60辐照消毒。
进一步的，本发明提取方法步骤如下：
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为PZ1、PZ2或者PZ3中的一种或几种的混合物；
进一步的，PZ1为动物双歧杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3003；PZ2为嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3342；PZ3为嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.2467。
一种柞蚕蛹提取物，所述提取物是由本发明所述方法提取得到的。
本发明中，通过以本发明所述方法提取得到柞蚕蛹提取物，因此提取得到的柞蚕蛹提取物安全性高，适于作为制备药物及保健食品用原料。
本发明所述柞蚕蛹提取物在制备治疗疾病药物或保健食品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明以可食用菌为诱导剂，因此所得到的提取物安全性高；同时，本发明方法提取物总收率高，适宜工业规模化生产，还能够满足不同的生产需求；
(2)本发明方法中，通过对各步骤条件的进一步调整和优化，从而进一步提高了本发明柞蚕蛹提取物的提取效率；
(3)本发明柞蚕蛹提取物安全性好，并适于作为制备药物以及保健食品所用原料。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为PZ1，即动物双歧杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3003；
进一步的，实施例1方法柞蚕蛹提取物的收率为2.8％。
实施例2
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为PZ2，即嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3342；
进一步的，实施例2方法柞蚕蛹提取物的收率为2.6％。
实施例3
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为PZ3，即嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.2467；
进一步的，实施例3方法柞蚕蛹提取物的收率为2.5％。
实施例4
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为PZ1与PZ2的混合物，其中，PZ1为动物双歧杆菌，生物保藏号为CGMCC 1.3003；PZ2为嗜酸乳杆菌，生物保藏号为CGMCC1.3342；
进一步的，实施例4方法柞蚕蛹提取物的收率为2.2％。
对比例1
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为大肠杆菌E.eoliKl2D31；
进一步的，对比例1方法柞蚕蛹提取物的收率为0.5％。
对比例2
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为柞蚕链球菌(1010)；
进一步的，对比例2方法柞蚕蛹提取物的收率为2.2％。
对比例3
将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下，储存10～70d后取出，并解除滞育；然后，用菌液对柞蚕蛹进行注射处理，每只柞蚕蛹注射40～60μL浓度为1×105～1×108cells/ml的菌液；并在18～24℃条件下，培养3～7d；在冰浴条件下，采集培养后柞蚕蛹的血淋巴，冷冻干燥为12～24h，并粉碎，即得柞蚕蛹提取物，然后将所得柞蚕蛹提取物进行Co60辐照消毒；
其中，所述菌液为柞蚕链球菌(1212)；
进一步的，对比例3方法柞蚕蛹提取物的收率为2.0％。
实验例1
进一步的，分别取等量实施例1-4以及对比例1-3所制得的柞蚕蛹提取物，并分别测试不同组柞蚕蛹提取物中柞蚕抗菌肽以及柞蚕溶菌酶等活性物质的含量，检测步骤具体如下：
(一)抗菌肽的活性检测
1.材料
(1)细菌菌株大肠杆菌(E colikl2D31)。
(2)玻璃培养皿(直径7.5cm)灭菌备用。
(3)打孔器外直径2.7mm。
2.试剂的配制
(1)LB液体培养基
用5moL/L NaOH调pH至7.4，121℃高压灭菌20min，备用。
(2)E+B缓冲液(50×)
加50ml蒸馏水溶解，定容至100ml，121℃高压灭菌20min。
(3)液体应用培养基
(4)LB固体培养基:
LB液体培养基 10ml
Agar 1.0g
121℃高压灭菌20min。
3.样品的处理
在冰浴下采取诱导蛹血淋巴(血淋巴冻干物按1:10，溶于生理盐水)，然后置100℃水浴中加热5min，取上清液于3 000r/min离心5min，取离心上清液为供试样品。
4.抗菌活性测定
(1)大肠杆菌菌液的制备
用接种环挑取E.coliKl2D31斜面菌种接种于液体应用培养基中，37℃静止培养16h。从中吸取0.2ml培养菌液再转接于新鲜的5ml液体应用培养基中，37℃振荡培养4～6h，使每毫升菌液约含大肠杆菌106个左右。
(2)检测平板的制备
将100ml LB固体培养基溶化后降温至55℃，按终浓度2％加E+B缓冲液(50×)、1.0％葡萄糖溶液(20％)、0.1％硫酸链霉素(250 000U/ml，充分混匀后加人大肠杆菌菌液50μl。迅速振荡充分混匀后，倾人玻璃培养皿内，6.5ml/皿，水平放置，凝固后4℃保存备用。
(3)活力测定
用打孔器在检测平板上打出直径2.7mm的小圆孔，并标示待测样品、对照样品编号。分别吸取待测样品和对照品各5μl，按编号逐一注入小孔中，每个样品都设3个重复。每块平板上都带有对照品作为内控。盖好皿盖，静置10min后倒置于37℃恒温箱中培养12～18h，可见清晰的抑菌圈。用游标尺测量其直径，分别记录待测样品和对照品的抑菌圈直径。
(二)柞蚕蛹溶菌酶活力测定方法
用Beckman DU-7型分光光度计测定并自动记录与扫描。具体方法如下:
1.底物的调制
用0.1moL/L，pH6.2磷酸盐缓冲液将溶壁微球菌菌体调制成0.72 OD450nm的悬浊液，置于18％～20％水浴中，随配随用。
2.溶菌酶标准液的调制
精确称取溶菌酶制剂，溶解于0.1mol/L、pH6.2磷酸盐缓冲液中，使成为1mg/ml的母液，随即吸取0.1ml注入预先盛0.9ml缓冲液的小离心管中，用时再稀释25倍，便成4mg/ml的标准液。
3.测定步骤
将2.5ml底物悬浊液移入比色杯中(1cm直径)，恒温18～20℃，加入标准溶菌酶液O.5ml，充分混合1min，立即用分光光度计自动记录和扫描450nm OD值的变化。连续记录3min。在平均每分钟下降0.02～O.04OD值的情况下，反应时间与OD值下降呈线性关系。
4.溶菌酶活力单位计算
20℃，每分钟使450nm波长消化值减少0.001OD的酶量为一个活性单位。实验证明空白消光值⊿A0为0。试样消光值,⊿A/min系指作用时间1～3min的平均浓度下降值,具体计算公式如下：
柞蚕蛹提取物活性物质含量检测结果如下所示：
由上述检测结果可知，由本发明提取得到的柞蚕蛹提取物明显活性物质含量更高。
本发明以可食用菌为诱导剂诱导柞蚕蛹产生活性物质，并进一步将诱导所得活性物质进行提取，因此所得到的提取物安全性高，并能够作为药物及保健食品的生产原料；同时，本发明方法提取物总收率高，适宜工业规模化生产，还能够满足不同的生产需求。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。