蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102166207 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 102166207 B *CN102166207B* (21)申请号 201010618561.X (22)申请日 2010.12.31 A61K 31/357(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61P 43/00(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军第三军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 张健 王艳艳 黄复生 (74)专利代理机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 11275 代理人 赵荣之 CN 156199。

2、4 A,2005.01.12, 权利要求 1-5. G. S. Humphreys et al.Amodiaquine and Artemether-Lumefantrine Select Distinct Alleles of the Plasmodium falciparum mdr1 Gene in Tanzanian Children Treated for Uncomplicated Malaria.Antimicrobial Agents and Chemotherapy .2006, 第 51 卷 ( 第 3 期 ),991-997 页 . 胡晓飞 等 .TEP1 分子在蚊天然免。

3、疫中的研 究进展 .中国病原生物学杂志 .2009, 第 4 卷 ( 第 1 期 ),59-61 页 . 张健 等 . 按蚊感染疟原虫后差异表达基因 的研究进展 . 国外医学寄生虫病分册 .2004, 第 31 卷 ( 第 4 期 ),164-168 页 . Yanyan Wang et al.Effect of artemether on the expression of genes involved in the mosquito immune response to Plasmodium infection. The American Journal of Tropical Medic。

4、ine and Hygiene .2010, 第 83 卷 ( 第 5 （增刊） 期 ),86 页左栏 . (54) 发明名称 蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用 (57) 摘要 本发明涉及生物领域， 特别涉及蒿甲醚在制 备按蚊免疫系统抑制剂中的运用 , 本运用为现场 预防药物的选择提供了重要的信息 ； 这既对发展 有效疟疾媒介控制策略和现有药物的更合理使用 有意义， 又对抗疟药物的设计提供了一条非常有 意义的途径。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 谌侃 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专。

5、利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 蒿甲醚在制备按蚊 EX213125 基因表达抑制剂中的运用。 权 利 要 求 书 CN 102166207 B 2 1/5 页 3 蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用 技术领域 0001 本发明涉及生物领域， 特别涉及蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用。 背景技术 0002 疟疾是世界上危害最为严重的三大传染病之一。 随着疟原虫对抗疟药以及蚊虫对 杀虫剂抗性的出现， 传统的综合防制措施未能取得理想效果。再加上疟原虫抗原复杂及多 态性、 免疫调节和逃避， 造成疟原虫干扰有效免疫产生， 以致难以获得。

6、广泛认可且有效的疟 疾疫苗。 0003 化学药物的防治目前仍然是最重要方法和措施。常用的抗疟药主要分为以下几 类 ： 1.喹啉类， 如氯喹 ； 2.叶酸代谢抑制药 ； 3.青蒿素类衍生物 ； 4.抗菌药类， 此外， 还有芳 甲醇类 ( 如本芴醇 )、 杂环氨酚类 ( 如咯萘啶 ) 等。由于抗疟药不是医药市场的关键产品， 利润低， 容量有限。 1995年以来， 抗疟药研究发展缓慢， 无新结构抗疟药物问世， 仅有几种复 方制剂获得了注册。 0004 目前， 疟原虫可能对每种常用的抗疟药都产生了抗药性， 严重阻碍了疟疾的控制， 同类药物之间的交叉抗药性使这个问题更加严重。由于抗药性的迅速蔓延， 特别。

7、是多重抗 药性恶性疟在不断地扩散与蔓延， 目前在很多地区， 可供选择的抗疟药物已十分有限， 而新 药研究周期长， 短期内很难有新型抗疟药物面市。因此， 在加速新药研究开发的同时， 还应 该拓宽抗疟药的使用范围， 并对新型抗疟药的设计和筛选提供新的非常有意义的途径和理 论依据。然而目前有关各种抗疟药物的研究仅局限于对疟原虫的有影响， 较少关注抗疟药 能否作为按蚊免疫系统的调节剂。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的在于提供蒿甲醚的新运用， 该运用可以下调按蚊的免疫 系统。 0006 为实现上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0007 蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用。 0008 。

8、进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 AsSP1 基因表达抑制剂中的运用 ； 0009 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 AsSP2 基因表达抑制剂中的运用 ； 0010 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 Serine protease inhibitor 基因表达抑制剂中的运 用 ； 0011 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 AsNOS 基因表达抑制剂中的运用 ； 0012 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 EX213125 基因表达抑制剂中的运用 ； 0013 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 EX214763 基因表达抑制剂中的运用 ； 0014 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 AsTEP1 基因表达抑制剂中的运用 ； 0015。

9、 进一步， 蒿甲醚在制备按蚊 AsPPO 基因表达抑制剂中的运用。 0016 本发明的有益效果在于 ： 本运用可以下调按蚊的免疫系统， 本运用为现场预防药 说 明 书 CN 102166207 B 3 2/5 页 4 物的选择提供了重要的信息 ； 这既对发展有效疟疾媒介控制策略和现有药物的更合理使用 有意义， 又对抗疟药物的设计提供了一条非常有意义的途径。 附图说明 0017 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述， 其中 ： 0018 图 1 中， 1-A 为感染 7 天 , 正常感染组斯氏按蚊蚊胃卵囊发育情况 ； 1-B 为感染 7 天 。

10、, 感染后给蒿甲醚 2 天， 斯氏按蚊蚊胃卵囊发育情况。 0019 图 2 为按蚊感染 BY265 疟原虫 7 天的感染度分析图。 0020 图 3 为感染后 2 天， 蚊胃 6 个免疫基因半定量结果 （Z ： 吸正常血组， Hz ： 吸正常血 给蒿甲醚组， G ： 感染组， H ： 感染给蒿甲醚组） 。 0021 图 4 为感染后 2d， 血淋巴 2 个免疫基因半定量结果 （Z ： 吸正常血组， Hz ： 吸正常血 给蒿甲醚组， G ： 感染组， H ： 感染给蒿甲醚组） 。 具体实施方式 0022 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面对本发明的优选实施例进 行详细的描述。 。

11、0023 一、 实验材料 0024 ( 一 )、 供试蚊媒、 疟原虫和小鼠 0025 1、 斯氏按蚊 (Anopheles stephensi) ： 为中国人民解放军第三军医大学基础部病 原生物学教研室长期繁殖、 饲养的 Hor 株。 0026 2、 约氏疟原虫(Plasmodium yoelii) ： BY265 株， 每周用昆明株小鼠血传1次， 每5 周内蚊传 1 次。 0027 3、 小鼠 ： 昆明株小鼠由本校实验动物中心提供， 体重 16 20g。 0028 ( 二 )、 主要试剂 0029 RNA 提取试剂盒 ： Tripure Isolation Reagent 购自 Roche 。

12、公司。 0030 RT-PCR 试剂 ： Olig(dT)15, 10mM dNTPs, 100M DTT, RNase 抑制剂、 二乙基焦碳 酸酯 (DEPC), MMLV 反转录酶均购自 promega 公司 ； SYBR Premix EX Taq (Perfect Real Time) 购自 Takara 公司 ； 蒿甲醚购自上海医药工业研究院合成 0031 ( 三 )、 主要仪器 0032 PCR 仪 (Amplitron ， Thermolyne， 美国 ) 0033 二、 实验方法 0034 （一） 、 抗疟药 - 蒿甲醚的给药方式 0035 1、 药品制备 ： 将 0.0632。

13、g 蒿甲醚加入 Tween-80 中研磨至药品溶解， 再加入 1ml 10% 蔗糖水充分溶解后， 取 1ul 稀释成 100ul， 制成终浓度为 632ng/ml 备用。 0036 2、 蚊媒分组及给药 0037 吸正常血组 （Z） ： 斯氏按蚊吸正常小鼠血约 2 h， 将饱血雌蚊移出， 常规饲养。 0038 吸正常血给蒿甲醚组 (Hz) ： 斯氏按蚊吸正常小鼠血约 2 小时， 选饱血雌蚊于吸血 后立即给药 2 天， 以后常规饲养。 说 明 书 CN 102166207 B 4 3/5 页 5 0039 感染组 （G） ： 按常规腹腔接种健康小鼠， 3 天后， 经过血检选择原虫血症为 10% 。

14、以 上的小鼠为供血鼠， 供斯氏按蚊吸血约 2 小时， 选取饱血雌蚊常规饲养。 0040 感染给蒿甲醚组 （H） ： 感染同前， 选饱血雌蚊于感染后立即给药 2 天， 以后常规饲 养。 0041 以上几组蚊均在 24 25 ， 相对湿度 70% 80% 的养蚊室饲养。 0042 3、 半定量 PCR 检测按蚊免疫反应相关的基因表达变化 0043 （1） 收集斯氏按蚊蚊胃和总 RNA 的提取 0044 感染后 2 天， 四组分别乙醚 25 支雌斯氏按蚊， 在解剖显微镜下用解剖针扯拉腹 部后两节将蚊胃拖出， 去除马氏管， 将蚊胃置于冰预冷的匀浆器 （氯仿处理） 内， 加入 1mL Tripure 充。

15、分研磨。按照试剂盒说明提取斯氏按蚊蚊胃总 RNA。 0045 (2) 离心法收集斯氏按蚊血淋巴和总 RNA 的提取 0046 感染后2天， 四组分别冷冻麻醉100支雌斯氏按蚊， 在解剖显微镜下用解剖针撕开 腹部后两节， 将蚊虫置于冰预冷、 管盖和管底部已用 18 号针头在打了孔的 0.5 ml EP 管 中， 每管 25 只雌斯氏按蚊， 然后将 0.5 ml EP 管放入含 100L Tripure 的 1.5 ML EP 管 中， 4 375g 离心 10 分钟。按照试剂盒说明提取斯氏按蚊血淋巴总 RNA。 0047 （3） 组织总 RNA 的质量和纯度 0048 取 1uL 样品， 检测 。

16、OD260/OD280的比值测出样品总 RNA 的纯度。一般较纯的 RNA 的 OD260/OD280值应在 1.9-2.1。 0049 (4)RT-PCR 0050 在 0.5mL EP 管中加入以下试剂 ： 0051 0052 0053 （5） 半定量 PCR 检测 0054 根据 GenBank 中 AsSP1（Genebank 登录号为 AY559301） , AsSP2（Genebank 登 说 明 书 CN 102166207 B 5 4/5 页 6 录号为 EX224535） ， Serine protease inhibitor（Genebank 登录号为 AY583529） 。

17、， AsNOS （Genebank 登录号为 EX219351） , EX213125（Genebank 登录号为 EX213125） ， EX214763 （Genebank 登 录 号 为 EX214763） ， AsTEP1（Genebank 登 录 号 为 EF076041）和 AsPPO （Genebank 登录号为 AY559300） 八个基因序列分别设计合成 PCR 适用的特异引物 ： 0055 AsSP1 ： 5 -tccgttgtgcggttgct -3 ， 0056 5 cgtcagttctcatcgtccac- 3 ； 0057 AsSP2 ： 5 -ttacatcctg。

18、acggcggcaca -3 ， 0058 5 cacactccttctgattcacggttgg-3 ； 0059 Serine protease inhibitor 5 -acaaagcgttcatcgaggtg -3 ， 0060 5 -ggtcattaagtgtggtggtttg -3 ； 0061 AsNOS ： 5 -catgcgtggtagtggcgttgc -3 ， 0062 5 - ggcgtgatgattggcttctgg -3 ； 0063 EX213125 : 5 - cagtggcgtatggaagt- 3 ， 0064 5 - tatgtaaagggaaaccgat。

19、- 3 ； 0065 EX214763 ： 5 -ggacaaccgccgatagtg- 3 ， 0066 5 -cgtgccaagcgagaacag -3 ； 0067 AsTEP1 ： 5 -tcggactgctcaaggctggct- 3 ， 0068 5 -caatccgtaggcggtcgtttcg -3 ； 0069 AsPPO ： 5 -tgttccccgactcgtttgt-3 ， 0070 5 -cccgtgatagttgccgtag-3 。 0071 斯氏按蚊 S7 基因作为半定量 PCR 的内对照 (Genebank 登录号 : AF53991)， 根据 该片段设计的 S。

20、7 特异引物序列为 ： 0072 AsS7 ： 5 tcgcattctgcccaagcc- 3 ， 0073 5 - tcccacgacgcacagtagc- 3 。 0074 二、 结果 0075 1 卵囊发育情况 0076 图 1-A 显示了感染疟原虫 7 天 , 感染组按蚊蚊胃卵囊发育情况 ； 图 1-B 为感染疟 原虫 7 天并在感染后给蒿甲醚 2 天， 感染给蒿甲醚组按蚊蚊胃卵囊发育情况。结果显示， 感 染给蒿甲醚组按蚊的卵囊数明显高于感染组。从图 2 可以看出， 感染给蒿甲醚组卵囊的平 均数约为感染组的 3 倍。 0077 2 半定量 PCR 检测与按蚊免疫反应相关的基因表达变化 。

21、0078 如图 3 所示 ： 通过对 Z 组和 Hz 组蚊胃中 AsEX2146763、 AsEX213125、 AsSP2、 AsSP1、 AsSNP 和 AsNOS 六个基因的条带亮度比较， 显示 Hz 组的六个基因的条带亮度明显暗于 Z 组 的基因条带亮度， 说明蒿甲醚明显抑制了以上六个按蚊基因的表达量 ； 通过对G组和H组蚊 胃中 AsEX2146763、 AsEX213125、 AsSP2、 AsSP1、 AsSNP 和 AsNOS 六个基因的条带亮度比较 , 显示H组的六个基因的条带亮度略微暗于G组的基因条带亮度, 说明蒿甲醚明显抑制了以 上六个按蚊基因的表达。 0079 如图 4。

22、 所示 ： 通过对 Z 组和 Hz 组血淋巴中 AsTEP1 和 AsPPO 两个基因的条带亮度 比较， 显示 Hz 组的两个基因的条带亮度明显暗于 Z 组的基因条带亮度， 说明蒿甲醚明显抑 说 明 书 CN 102166207 B 6 5/5 页 7 制了以上两个按蚊基因的表达量 ； 通过对 G 组和 H 组血淋巴中 AsTEP1 和 AsPPO 两个基因的 条带亮度比较,显示H组的六个基因的条带亮度明显暗于G组的基因条带亮度, 说明蒿甲 醚明显抑制了以上两个按蚊基因的表达。 0080 通过对上述基因的抑制作用， 可以证明蒿甲醚对按蚊免疫体统的抑制。 0081 最后说明的是， 以上实施例仅用。

23、以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说 明 书 CN 102166207 B 7 1/5 页 8 中国人民解放军第三军医大学 蒿甲醚在制备按蚊免疫系统抑制剂中的运用 16 1 17 DNA 人工序列 引物 assp1 F 1 tccgttgtgc ggttgct 17 2 20 DNA 人工序列 引物 assp1 R 2 cgtcagttct catcgtccac 20 3 21 DNA 人工序列 引物 。

24、assp2 F 3 ttacatcctg acggcggcac a 21 4 25 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102166207 B 8 2/5 页 9 引物 assp2 R 4 cacactcctt ctgattcacg gttgg 25 5 20 DNA 人工序列 引物 Serine protease inhibitor F 5 acaaagcgtt catcgaggtg 20 6 22 DNA 人工序列 引物 Serine protease inhibitor R 6 ggtcattaag tgtggtggtt tg 22 7 21 DNA 人工序列 引物 asnos F 7 。

25、catgcgtggt agtggcgttg c 21 8 21 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102166207 B 9 3/5 页 10 引物 asnos R 8 ggcgtgatga ttggcttctg g 21 9 17 DNA 人工序列 引物 EX213125 F 9 cagtggcgta tggaagt 17 10 19 DNA 人工序列 引物 EX213125 R 10 tatgtaaagg gaaaccgat 19 11 18 DNA 人工序列 引物 EX214763 F 11 ggacaaccgc cgatagtg 18 12 18 DNA 人工序列 序 列 表 CN 。

26、102166207 B 10 4/5 页 11 引物 EX214763 R 12 cgtgccaagc gagaacag 18 13 21 DNA 人工序列 引物 astep1 F 13 tcggactgct caaggctggc t 21 14 22 DNA 人工序列 引物 astep1 R 14 caatccgtag gcggtcgttt cg 22 15 19 DNA 人工序列 引物 asppo F 15 tgttccccga ctcgtttgt 19 16 19 序 列 表 CN 102166207 B 11 5/5 页 12 DNA 人工序列 引物 AsPPO R 16 cccgtgatag ttgccgtag 19 序 列 表 CN 102166207 B 12 1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102166207 B 13 2/2 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102166207 B 14 。