技术领域
本发明属于中药领域，涉及一种治疗感染性疾病的药物、其制备方法 及用途。
背景技术
下呼吸道感染性疾病，常见慢支炎、各种类型的肺炎、支气管扩张并 感染、肺脓疡、肺心病并肺部感染等，是呼吸系统常见病、多发病。在所 有感染性疾病中发病率最高，即使在抗菌药物开发突飞猛进的今天，其发 病率、病死率依然居高不下。我国每年约有250万例肺炎发生，12.5万人 (5％)因肺炎死亡。在美国，肺炎约占入院诊断的1/10，居死亡原因的第 五位。小儿肺炎为我国小儿第一位死亡原因，其死亡率占儿童死亡的1/5。 据世界卫生组织(WHO)统计，目前世界人口死亡原因中感染性疾病占 1/3，而急性呼吸道感染(主要为肺炎)死亡人数占其中的1/4，不少慢性 疾病患者不是死于原发病，而是死于肺部感染。近20年来，肺部感染的 菌谱所发生的变化，已为大家所熟知，霉菌的继发亦引起临床医师的重视。 各种原因造成免疫缺陷患者的增加，使一些过去很少致病的病原体如卡氏 肺囊虫和巨细胞病毒，同样威胁患者生命，成了诊断和治疗中的难题。由 于病原体的变迁，细菌耐药率的上升，人口老化，免疫损害宿主的增多， 重症监护医学的发展与机械通气应用的增多使得目前呼吸道感染日益复 杂化，尤其是2003年2月开始波及我国及东南亚和欧美各国的非典型肺 炎(SARS)以及2005年肆虐一时的禽流感，对呼吸系统感染控制提出一 个新的极其严峻的挑战。
炎症反应是下呼吸道感染性疾病的核心环节，目前针对炎症反应引起 的肺损伤主要的治疗措施有：
(一)抗生素
目前针对病原体最主要的治疗方法是应用抗生素控制感染，临床针对 不同的病原体，常用的抗生素有β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素两大 类)、喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖甙类等。
(二)糖皮质激素
糖皮质激素(以下简称激素)具有减轻感染性和非感染性炎性反应， 减少渗出，抑制免疫反应，抗休克，抗毒素等药理作用，被应用于治疗炎 症反应引起的肺损伤。
(三)血管活性药物
重症肺炎存在明显的肺微循环障碍，近年来血管活性药作为辅助用药 在小儿重症肺炎的治疗中取得明显的效果。常用的有血管紧张素转换酶抑 制剂，通过抑制血管紧张素转换酶，使血管紧张素II及醛固酮生成减少， 从而扩张动脉，减少水钠潴留。同时抑制激肽酶II的活性，使激肽降解减 少，前列腺素(PGE2、PGI2)合成增加，后者可扩张静脉，改善肺微循环。
(四)炎症细胞因子拮抗剂
在与炎症性肺损伤相关的细胞因子中最受关注和研究较多的是肿瘤 坏死因子(TNF)、IL-1β、IL-6和IL-8。当肺上皮和内皮受到直接或间接 损伤时，这类细胞因子大量表达和分泌，通过激活中性粒细胞，使其渗出、 聚集、与周围细胞发生粘附等作用而介导肺损伤。细胞因子抗体、抑制剂 及其受体的拮抗剂通过阻断细胞因子的上述作用，起到阻滞炎症发生、发 展的作用，从而发挥明显的临床疗效。
(五)中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂
中性粒细胞弹性蛋白酶能分解多种蛋白质包括细胞外基质成分、弹性 蛋白、纤维蛋白原、蛋白多糖和胶原质，并可损伤微血管内皮细胞导致肺 水肿。因此，中性粒细胞弹性蛋白酶是治疗肺部炎证损伤的一个靶点。
(六)抗前列腺素类
实验研究表明，在炎症反应的急性期，前列腺素产生增多主要依赖于 环氧合酶(COX)-2的合成。巨噬细胞被认为是COX-2上调后产生前列腺素 的主要源泉，而且COX催化产生的前列腺素可诱导IL-6的表达，故选择 性抑制COX-2可以降低肺巨噬细胞的IL-6的产生。另外，在角叉菜胶诱 导产生的鼠皮下气肿模型和胸膜炎模型中，特异的COX-2阻断剂可成功 地减轻炎症反应，提示COX-2阻断剂可应用于治疗各种炎症而不产生有 害副作用。
(七)活性氧的相关治疗
生物体内有氧化和抗氧化平衡关系，SOD、过氧化氢酶(CAT)、过氧 化物酶等是体内重要的抗氧化剂。炎症反应时，大量氧自由基产生导致氧化 和抗氧化平衡失调。外源性给予SOD、CAT可减少O2、H2O2的产生和纠正 PGI2/TXA2平衡紊乱，减轻肺损伤。
(八)中医中药治疗
根据肺部感染性疾病的病理特点，中医药治疗的中心多集中于清热解毒 的基础上，重点防治痰热的危害。例如双黄连粉针剂由金银花、连翘、黄芩 组成，现代药理研究证实，该药有明显抗菌、抗病毒作用。近年来已被广泛 应用于临床感染性疾病。通过病源学及病理学方面的研究，提示该药对感染 性疾患的作用是多方面的，不仅表现了对病毒、致病菌有一定的抑制和杀灭 作用，同时还有增强机体免疫力的作用，在抑制病毒，消除症状方面更显其 优点。从其药物组成来看，不仅适用于外感风热、风温的初期，而对多种温 热病的实热证均可使用。该针剂不仅可静脉给药，而且雾化吸入同样效果显 著，可使药物直接作用于气管或支气管粘膜，有利于消除炎性充血水肿，有 较好的止咳祛痰作用。
关于上述药物治疗的现状分析如下：
抗生素应用之初大大提高了人们对感染性疾病的治愈率，延长了人类的 寿命。然而，由于抗生素的长期不合理应用，现阶段出现了很多问题，除了 抗生素本身的毒性反应(如对神经系统、血液系统、肝、肾功能损害、胃肠 道反应)、过敏反应、易造成二重感染外，当前呼吸道感染治疗所面临的主 要问题是细菌耐药情况越来越严重，越来越复杂。无论是革兰氏阳性菌还是 革兰氏阴性菌，我们都遇到了一些难对付的细菌，这些细菌有些至今无可靠 的治疗药物，而另外一些细菌的耐药性正以惊人的速度在增长，病原菌变迁 给临床治疗和康复带来了许多新难题。
在SARS流行期间，激素强大的抗炎作用被用来防止机体对SARS病毒感 染的过度防御反应所致的组织损伤和器官衰竭，在降低病死率方面是较为成 功的，但在挽救了很多患者生命的同时，也带来了多方面的副作用，如SARS 恢复期的骨坏死、二重感染、结核播散、电解质紊乱以及糖尿病等，因此激 素的应用，仍是一个有争议的问题。
针对炎症级联反应病理环节研发的新药，如炎症细胞因子拮抗剂、中性 粒细胞弹性蛋白酶抑制剂以及抗前列腺素类等，现在大多尚处于体外实验和 动物实验阶段，仅有一小部分药物进入临床研究。在最近10年内，国外学者 对于拮抗炎症介质的治疗曾进行过大规模、耗巨资、跨国度的多中心前瞻性 临床试验，从已经完成的多项三期临床试验结果来看，不能证明在缓解症状 和降低病死率方面有益处。
中医采用传统汤剂治疗该类疾病作了许多尝试，并对古方化裁基础上又 有许多中药颗粒剂、口服液以及静脉针剂问世，尽管有分型、分期、论治脏 腑的不同，清热解毒仍为其基本治则，但是清热解毒煎剂可使血液粘度升高， 纤溶活性降低，这表明寒性的清热解毒药对血液流动性和微循环产生不良影 响和副作用。此外，中医治疗缺乏理论上的突破，中药复方发挥疗效的有效 成分、作用方式、途径和靶点等机理尚不十分清楚，且传统口服给药方式收 效慢，临床治疗中也只能将其纳入辅助用药的范围。
所有这些方面都提示需要探寻更新的控制炎症的策略。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种治疗感染性疾病的药物，通过改善炎症 反应造成的肺损伤而达到治疗作用。本发明的另一个目的是提供所述药物 的制备方法及用途。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种治疗感染性疾病的药物，所述药物包括以下成分：黄芩、 栀子、灯盏细辛和胆酸。
进一步，所述药物仅包含以下四味有效成分：黄芩、栀子、灯盏细辛和 胆酸。
更进一步，所述的药物，其主要成分按重量份计包括：黄芩(以黄芩苷 计)60～120份、栀子(以栀子苷计)25～75份、灯盏细辛(以灯盏花乙素 计)2～4份、胆酸25～75份。
再进一步，优选地，所述的药物，其主要成分按重量份计包括：黄芩(以 黄芩苷计)120份、栀子(以栀子苷计)25份、灯盏细辛(以灯盏花乙素计) 4份、胆酸25份。
本发明提供的所述药物选自如下的制剂：注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊 剂、软胶囊剂、滴丸、口服液、散剂、丸剂。
本发明还提供了所述药物的制备方法，包括以下步骤：
1)取黄芩加水提取三次，每次60min，滤过，收集滤液，合并，浓缩至 原体积1/2左右，加盐酸调节pH值至1～2，静置过夜，离心分离，沉淀物加 水，加石灰水调pH值至7.0，滤过，收集滤液用盐酸调节pH值至1～2，静置 过夜，离心分离，沉淀用乙醇洗涤，干燥，即得黄芩苷；
2)取栀子加水提取三次，每次60min，滤过，滤液浓缩，上树脂柱，用 50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得；
3)取灯盏细辛加75％乙醇回流提取三次，每次2h，滤过，滤液回收乙 醇，水沉，上树脂柱，用水洗脱，收集洗脱液，浓缩，滤过，沉淀用10％硫 酸溶液调pH值至2.0～2.5，静置，滤过，沉淀用乙醇、水洗至中性，干燥， 用乙醇重结晶，干燥，粉碎，即得；
(4)取以上步骤1)-3)所得三种提取物与胆酸混合均匀，按本领域常 用的方法制成制剂，优选地，所述胆酸为根据《中国药典》(2010年版二部) 制备的熊去氧胆酸或根据《国家药品标准》制备的猪去氧胆酸；
5)取以上步骤1)-4)所得四种成份混合均匀，加辅料适量，用注射用 水溶解，超滤，分装，制成注射剂；
6)取以上步骤1)-4)所得四种成份混合均匀，加辅料适量，分别制成 口服制剂。
本发明还提供了所述药物在制备用于治疗下呼吸道感染性疾病的药物 中的应用。
进一步，所述下呼吸道感染性疾病选自：慢性支气管炎、肺炎、支气管 扩张和/或感染、肺脓疡、肺心病和/或肺部感染。
本发明还提供了所述药物在制备用于抗微生物、抗炎/抗变态反应、清除 氧自由基和抗氧化损伤、调节免疫功能、抗凝血和抗血栓形成、改善微循环 和/或保护血管内皮细胞的药物中的应用。
本发明还提供了所述药物在制备用于抗菌、抗流感病毒、镇咳和/或抗炎 消肿的药物中的应用。
经大量现代药理学研究发现，本发明提供的药物中的成分对感染性疾病 的多个病理环节都有影响，不仅对病原微生物具有直接的抑制和杀伤作用， 更重要的是药物对过度的炎性反应具有抑制作用，该作用的实现体现在两个 方面：一是抗损伤作用，即抗微生物、抗炎、抗变态反应、清除自由基和抗 氧化等，也就是中医所谓的“驱邪”；二是促修复作用，即通过调节免疫功能、 保护受损的血管内皮细胞、改善微循环状态等增强机体的抗损伤能力，促进 组织修复，也就是中医所谓的“扶正”，体现了“驱邪”和“扶正”的统一。中药 在抗菌、抗病毒方面远远不如西药抗生素，但中药的抗内毒素、抗炎、抗氧 化以及增强机体免疫力的功能，是抗生素所不具备的，这也正是中药抗感染 的优势所在。
本发明提供的治疗感染性疾病的药物，主要成分的配伍作用分析如下：
下呼吸道感染性疾病在临床上大多表现为发热、咳嗽、咳痰、胸痛或胸 闷、气急或气喘、或伴尿频、尿急、尿痛等，表现为热毒炽盛之象，因此清 热解毒是该类疾病的经典治法，然而，根据病变局部实变、水肿、糜烂、溃 疡、缺血、血运障碍、组织变性、增生等病理改变与血络瘀阻的现代病理学 概念相似，将活血化瘀通络之法引入到呼吸系统感染性疾病的治疗中。活血 通络药物具有保护受损的内皮细胞、降低血液粘稠度，改善微循环的作用， 有利于渗出液的吸收和痰的排出，促进支气管肺组织功能的恢复，能够运用 于呼吸道感染性疾病的治疗。
清热解毒煎剂与活血煎剂配伍对内毒素血症和非特异性炎症动物模型 的作用为，两类药配伍能使前列腺素E2、内毒素血浓度、全血还原粘度降低， 伊文斯蓝渗出量减少，足爪肿胀百分率下降，血浆皮质醇含量增加，纤溶活 性增强。其中多数测定结果均优于两类单独用药的动物模型组。由此证明， 清热解毒煎剂与活血煎剂配伍后，更有利于解毒、消炎和炎症的治疗[43]。同 时由于活血药对清热解毒药其副作用有对抗作用，清热解毒活血煎剂可使血 液粘度降低，纤溶活性明显增强，因此，两类药合用可加速血液循环，以利 毒素的清除，减少清热解毒药的副作用。清热解毒药与活血化瘀配伍应用能 增加生理情况下腹腔对细菌吸收能力及腹膜炎情况下的吸收能力[44]。清热解 毒药与活血化瘀药同用后产生的协同作用还表现在抑制病毒性肺炎小鼠肺 指数的升高，肺部病变的减轻，并能对抗病毒性肺炎家兔的发热效应，控制 炎性病灶，在降低血粘度，提高超氧化物歧化酶的活力方面也有协同作用。
因此，本发明提供的药物遵循中医药理论配伍而成，同时以研究实验和 临床实践为基础，将清热解毒和凉血通络相结合，能有效阻抑下呼吸道感染 性疾病炎症损伤级联反应。
经过本发明人的大量实验验证，本发明药物各主要成分的抗炎症性损伤 的药理作用具体如下：
(一)抗微生物作用
黄芩含有的黄芩苷具有广谱的抗菌作用，如对金黄色葡萄球菌、溶血性 链球菌与肺炎链球菌等革兰氏阳性菌和脑膜炎奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌等革 兰氏阴性球菌有抑制作用。黄芩苷与B-内酰胺类青霉素如羟氨苄青霉素合用 能有效提高对耐青霉素酶金黄色葡萄球菌的抗菌效价。黄芩苷还有抗肺炎衣 原体和保护细胞作用。此外，黄芩苷在体外有较好的抗白念珠菌作用
栀子对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、卡他球菌、白喉杆菌、人型结 核杆菌等具有中等强度抗菌作用。其水浸液在体外能抑制各种皮肤真菌，水 煎液在体外能杀死钩端螺旋体及血吸虫，并且有抗埃可病毒的作用。
胆酸也显示了对革兰氏阳性球菌较强的抑菌活性。
(二)抗炎、抗变态反应作用
黄芩苷、黄芩素及其它黄酮类化合物对多型变态反应有不同程度的抑制 作用，尤其对I型变态反应为强。黄芩抑制抗原与IgE结合，抑制肥大细胞 释放组胺而成为较好的临床抗变态反应剂。与变态反应有关的疾病最常见的 是支气管哮喘，黄芩素对支气管过敏性收缩及过敏性气喘均有缓解作用，并 与麻黄碱有协同作用。
栀子生品的抗炎作用最强，并具有抗过敏反应的作用。
胆酸也具有抗炎、抗变态反应作用。
(三)清除氧自由基和抗氧化损伤
黄芩苷具有较强的自由基清除活性。
灯盏花素同时具有清除氧自由基和抗氧化损伤的作用。
牛黄具有抗氧化损伤的作用。
(四)调节免疫功能
黄芩苷对红细胞免疫粘附功能具有促进作用。
栀子与当归组成的复方对与细胞免疫系统的机能失常有关贝切特氏综 合征所表现的口腔粘膜病变和外生殖器溃疡有效，且抑制IV型过敏性反应并 对细胞免疫有抑制作用。
(五)抗凝血和抗血栓形成
黄芩素能抑制凝血酶及凝血酶受体紧张肽诱导的血纤维蛋白溶酶原激 动剂抑制因子-1(PAI-1)的生成。
栀子甙具有抗血栓作用。
灯盏花总黄酮在体外和体内对ADP、花生四烯酸(AA)或血小板活化 因子(PAF)引起的血小板聚集均有明显抑制作用。灯盏花素既能影响内源 性凝血途径，又能作用于外源性凝血途径，其对血小板第3因子有较强的抑 制作用，能减少凝血酶原转化为凝血酶，并能显著增加纤维蛋白的纤溶活性。
(六)改善微循环
灯盏花素具有改善微循环的作用。
(七)保护血管内皮细胞
黄芩苷虽不能消除细菌内毒素(ET)所致的内皮细胞脱落现象的发生， 但却很大程度上保护内皮细胞间的细胞连接，减轻ET所致的胞浆疏松，线粒 体肿胀和内质网扩张。
栀子果实提取物(GFE)体外能增强内皮细胞的增殖。栀子果实水提取 物可显著增加细胞中DNA和蛋白质的合成。
灯盏花素对血小板活化因子(PAF)致肺微血管内皮细胞损伤具有保护 作用。灯盏花素可抑制PAF诱导的肺微血管内皮细胞损伤。
综上所述，本发明的有益效果如下：
本发明提供的治疗感染性疾病的药物，从中医络病理论出发，将中医 宏观辨证与西医微观辨病相结合，根据临床实践的基础上形成的中医理论 -“毒损肺络”病机理论，并结合现代医学有关下呼吸道感染性疾病病理过 程及治疗的研究成果，由黄芩、栀子、灯盏细辛和胆酸配伍而成，针对感 染性疾病的中心环节-炎症反应，清除炎症介质和自由基等有害物质，改 善局部微循环状态，从而减轻炎症病理损伤，同时具有调节整体内环境的 作用，能够有效治疗下呼吸道感染以及由感染诱发的急性肺损伤，且药效 物质和作用机理相对清楚。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为RT-PCR扩增产物电泳图；
图2为扩增熔解曲线图，其中，从左到右分别为：TLR7、β-actin、 Myd88、IRAK4、P65、TRAF6。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解， 这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常 规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次 出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
以下实施例以举例的方式，旨在说明本发明治疗感染性疾病的药物的 具体配方组成、制备方法及其功能和效果。
实施例1
取黄芩(以黄芩苷计)120mg、栀子(以栀子苷计)25mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)4mg、胆酸25mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，各综合指标和主要影响因素肺指数、全血白细胞总数、存活 率、肺系数均为最佳水平。
实施例2
取黄芩(以黄芩苷计)60mg、栀子(以栀子苷计)75mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)2mg、胆酸25mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，能使全血白细胞数、肺泡灌洗液淋巴细胞百分比显著降低。
实施例3
取黄芩(以黄芩苷计)60mg、栀子(以栀子苷计)50mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)2mg、胆酸50mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，能使肺灌洗液中白细胞数显著降低。
实施例4
取黄芩(以黄芩苷计)60mg、栀子(以栀子苷计)25mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)2mg、胆酸50mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，能使全肺泡灌洗液肿瘤坏死因子显著降低。
实施例5
取黄芩(以黄芩苷计)120mg、栀子(以栀子苷计)50mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)4mg、胆酸75mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，动物存活数最高。
实施例6
取黄芩(以黄芩苷计)120mg、栀子(以栀子苷计)25mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)4mg、胆酸75mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，能使肺指数显著降低。
实施例7
取黄芩(以黄芩苷计)60mg、栀子(以栀子苷计)25mg、灯盏细辛(以 灯盏花乙素计)4mg、胆酸75mg按药品常用制备方法制备。制成的制剂用 于药效学研究，能使肺匀浆中NO浓度显著降低。
实施例8和9研究了本发明提供的治疗感染性疾病的药物的抗病原微 生物作用。下呼吸道感染通常统称为肺部感染，病原微生物是引起各种肺 部感染、炎症性疾病的主要因素，主要有细菌，其次为病毒、支原体，偶 有衣原体、立克次体等，在我国仍属细菌感染性疾病高发的国家。病原微 生物在肺内的生长繁殖，能造成多种组织损伤和功能活动的改变，引起各 种呼吸道症状，因此抑杀病原微生物对肺部感染的治疗具有重要意义。
实施例8：体外抗菌作用
(一)实验目的
观察本发明药物体外对呼吸道感染常见细菌的抑杀作用，并采用试管 稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC)。
(二)实验材料
1、实验用菌株：实验所用菌株均为北京中医药大学基础医学院医学 病原实验室提供。
金黄色葡萄球菌(简称“金葡”)(26102)
乙型链球菌(简称“乙链”)(32204)
枯草杆菌(简称“枯草”)(44813)
大肠埃希菌(简称“大肠”)(44813)
铜绿假单胞菌(简称“绿脓”)(10104)
白色念珠菌(简称“白念”)
2、培养基：营养肉汤、含血清营养肉汤、营养琼脂、真菌培养基， 均为健力园医药公司提供。
3、药物：实施例1提供的药物(以下简称“例1药物”)，颜色：外观呈棕 黄色，含量：17.4mg/ml，批号：20060410；
双黄连，600mg，批号0501004，哈药集团中药二厂；
青霉素G钠，批号0503032，华业制药集团股份有限公司；
硫酸链霉素，批号05111102，山东瑞阳制药有限公司。
(三)实验方法
1、菌液配制：
金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌分别接种于营 养肉汤中；乙型链球菌接种于血清肉汤中；白色念珠菌接种于真菌培养基 中，37℃，18～24h培养后，将培养18h的细菌用比浊法配制成1.5亿/ml 的菌液，4℃保存(3天内使用)备用。
2、药液配制：
用营养肉汤配制，药物原液浓度为：例1药物，原液；双黄连，40mg/ml； 配好药物原液4℃保存备用。药物的最终浓度：例1药物(ml/ml)：0.5、 0.25、0.125、0.0625、0.0313、0；双黄连为(mg/ml)：20、10、5、2.5、 1.25、0.625、0。
3、试管法测定例1药物、双黄连及抗生素对不同细菌的最小抑菌浓度 (MIC)：
每种待测药取8支试管，每支试管加入营养肉汤1ml，第1支试管加 待测药原液1ml，混匀后取出1ml加入第2支，依次连续对倍稀，第7支 为空白对照，第8支为实验菌对照。液体总量为1ml/管。药物最终浓度同 2、药液配制。每管加入1.5亿/ml的菌液各0.1ml。37℃，24h培养，观察 结果，再将培养液转种至固体培养基上(金葡、枯草、大肠、绿脓接种于 普通平板，乙链接种于血平板，白念接种于虎红平板)，观察有无细菌生 长，测出其MIC。
4、试管法测定例1药物与抗生素配伍对细菌的MIC：
实验分2组进行，独立组检测抗生素单独对不同细菌的MIC；伍用组 检测例1药物与抗生素伍用后对不同细菌的MIC。方法采用试管稀释法。
独立组每种待测药取11支试管，每支试管加入液体培养基1ml，第1 支加入待测药原液1ml，混匀后取出1ml加入第2支试管，依次连续对倍 稀释，第10支为空白对照，第11支为菌株对照。液体总量为1ml/管。药 物最终浓度见表1。每管加入1.5亿/ml的菌液各0.1ml。37℃，24h培养， 观察结果。
伍用组根据独立组得出的不同抗生素的MIC，除对照管外每支试管中 加入0.5ml例1药物，抗生素最终浓度同独立组。方法同前。
表1不同抗生素在试管内的最终浓度
(三)实验结果及分析
1、例1药物与双黄连对不同细菌的MIC(见表2)：
表2例1药物及双黄连对不同细菌的MIC
结果显示：例1药物对乙型链球菌具有一定的抑杀作用，但较双黄连 效果小。
2、例1药物与抗生素配伍后对细菌MIC的影响(见表3)：
表3抗生素与0.5ml/ml例1药物伍用前后MIC的变化(μg/ml)
结果显示：青霉素G钠与例1药物配伍后，其MIC无变化。硫酸链 霉素与例1药物配伍后，对金黄色葡萄球菌及枯草杆菌的MIC降低了4～ 8倍；对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌，配伍前后无变化。
结论：毒热平的体外抗病毒研究表明，毒热平在病毒感染后的48h抗 病毒效率最高，基本上可以完全抑制病毒增殖，且在高浓度(≥0.27mg/ml) 时药物的抗病毒作用不随时间增长而有明显变化。在与Rib相近浓度下， 与RHL的几个实验浓度相比其抗病毒效率占优势。
实施例9：体外抗流感病毒作用
(一)实验目的
观察本发明药物体外对流感病毒亚甲型鼠肺适应株(FM1)感染性的 抑制作用以及时效关系，为该药物抗病毒作用及其机理提供实验依据。
(二)实验材料
1、病毒：流感病毒亚甲型鼠肺适应株，中国中医药研究院中医所提供， 本实验室-76℃保存备用。于九日龄鸡胚尿囊腔连续传代两次后，测血凝滴 度为1∶512，小鼠的LD50为10-2.2。
2、细胞：狗肾细胞株(MDCK)购自军科院细胞室，由本室传代后使 用。
3、药物：例1药物，棕色液体，17.4mg/ml；阳性对照药：注射用双黄 连(冻干粉)：600mg干粉/支，实验前用无血清DMEM培养液配制成40mg/ml 备用，批号：0501004(哈药集团中药二厂)；利巴韦林：100mg/ml，批号： 0506251(石药集团欧意药业有限公司)。
4、试剂：Dulbecco’s Modified Eagle medium培养基(DMEM培养基)， GBICO公司产品；新生牛血清：民海生物公司产品。四甲基偶氮唑盐(MTT) 及二甲基亚砜(DMSO)均为Amresco产品。生长液：含10％新生牛血清的 DMEM培养液；维持液：不含血清而含2μg/ml胰蛋白酶的DMEM培养液。1％ 结晶紫：称取1g结晶紫先加入20ml无菌三蒸水，于研钵边加水边研磨至细末， 最后定容至100ml，粗滤纸过滤后4℃存放备用。33％冰醋酸：用去离子水配 制。
(三)实验方法
1、药物细胞毒性实验(MTT比色法)
待MDCK细胞生长状态最好时，用0.02％EDTA和0.5％胰酶消化细胞，用 生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液加入96孔细胞培养板中，100μl/r， 于37℃的5％CO2培养箱中培养至致密细胞单层。用维持液将例1药物(DRP)、 利巴韦林(Rib)和双黄连(RHL)稀释为不同浓度，加入细胞培养板中， 100μl/r，每个药物稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37℃ 的5％CO2培养箱中培养72h后，用MTT(终浓度为0.5mg/ml)比色法检测药 物对MDCK细胞的毒性，按Reed-Muench法计算药物最大无毒浓度(TC0)和 半数中毒浓度(TC50)。
2、病毒感染性测定(TCID50的测定)
用无血清DMEM培养液对流感病毒FM1进行连续10倍递次稀释，将各稀 释度的病毒接种于3×105/ml的MDCK细胞中，每个稀释度平行做6个复孔，同 时设正常细胞对照。37℃吸附2h后吸弃病毒液换用维持液继续培养，每日在 倒置显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，并记录病变程度和孔数，以细胞 对照无明显退变，病毒感染细胞病变率达50％及以上的细胞孔为病变孔，细 胞病变率小于50％的为非病变孔，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50(median tissue culture infective dosage)。
3、本发明药物抗病毒作用的时效关系
用100TCID50的FM1流感病毒50μl/r于37℃吸附单层MDCK细胞2h后，吸 弃病毒液换用系列稀释浓度的例1药物作为实验药物组，设利巴韦林(Rib) 和双黄连(RHL)为阳性药物对照组，同时设有正常细胞对照组，每浓度3 个复孔。在37℃的5％CO2培养箱中分别继续培养24h、36h、48h和72h，弃培 养液用冷甲醇固定20min后1％结晶紫染色，室温20min后漂洗96孔细胞培养 板，37℃干燥后用33％冰醋酸溶解，100μl/r，待结晶紫完全溶解后于570nm 波长下测定吸光度A值(OD570)。
药物抗病毒有效率(effective rate，ER％)按下列公式计算：
同时计算药物对病毒的半数抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI)。
TI＝TC50/IC50
4、本发明药物不同加药方式的抗病毒作用
根据病毒复制周期，本实验设计3个药物抗病毒作用靶点，并设一个药 物预防组，共有4个处理组，每个药物浓度平行做3复孔。同时设阳性药物对 照组和正常细胞对照组。病毒攻击浓度为100TCID50，病毒加入为50μl/r。加 药方式分别为：①抗病毒生物合成组：病毒先在37℃吸附细胞2h后换含药维 持液；②抗病毒吸附组：病毒和含药维持液同时加入已成单层的MDCK细胞 中；③直接作用组：含药维持液与病毒混合，于37℃共同孵育1.5h后再感染 细胞，病毒吸附2h后换不含药的维持液；④药物预防组：将含药维持液加入 细胞37℃孵育24h后，弃维持液换病毒吸附2h，再换不含药维持液。以后各 组细胞在37℃继续培养3d，当病毒对照孔的细胞病变达75％～100％时，同实 验3，用1％结晶紫染色，测OD570(A值)，并计算药物的抗病毒有效率(ER％)。
(四)实验结果
1、药物细胞毒性实验(见表4)
表4例1药物对MDCK细胞的TC0和TC50(mg/ml)
2、病毒感染性测定
根据实验结果，按Reed-Muench法计算的流感病毒FM1的TCID50＝ 10-3.3/0.1ml。
3、本发明药物抗病毒作用的时效关系(见表5、6、7)
表5例1药物对病毒的IC50(μg/ml)和治疗指数(TI)
从治疗指数来看，例1药物的安全性较双黄连和利巴韦利高。
表6例1药物抗流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1作用的时效关系(n＝4)
表7例1药物抗流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1作用的时效关系(n＝4)
根据表6、7的结果，病毒感染在36h达到高峰，DRP的抗病毒效率在48h 最高，且随着药浓降低，抗病毒效率逐渐下降。低浓度随作用时间延长，效 率降低，高浓度(≥0.27mg/ml)随时间延长抗病毒作用较稳定。DRP与Rib 比，在作用的24h其对细胞似有保护作用，Rib此时对病毒感染没有抑制作用， 但随作用时间延长其抗病毒作用增强，在72h又有下降趋势。DRP的抗病毒 作用在4个时段均比RHL和Rib作用明显。
4、本发明药物不同加药方式的抗病毒作用结果(见表8、9)
表8例1药物不同加药方式抗流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1的作用(n＝4)
注：方式①：药物作用于细胞24h后病毒感染；方式②：病毒经药物预处理 后感染细胞；方式③：药物与病毒同时加入；方式④：病毒先吸附后加药。
表9例1药物不同加药方式抗流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1的作用(n＝4)
注：方式①：药物作用于细胞24h后病毒感染；方式②：病毒经药物预处理 后感染细胞；方式③：药物与病毒同时加入；方式④：病毒先吸附后加药。
从表8、9可见，例1药物可以明显抑制病毒在细胞内的复制即病毒的生 物合成过程，能阻止病毒吸附于细胞，在高浓度(0.14mg/ml)时有直接杀 病毒作用。利巴韦林能明显阻止病毒吸附，但是无预防作用，不能直接杀灭 病毒。与双黄连比，例1药物抗病毒作用在实验浓度下较之明显。
结论：本发明药物的体外抗病毒研究表明，该药物在病毒感染后的48h 抗病毒效率最高，基本上可以完全抑制病毒增殖，且在高浓度(≥0.27mg/ml) 时药物的抗病毒作用不随时间增长而有明显变化。在与Rib相近浓度下，与 RHL的几个实验浓度相比其抗病毒效率占优势。
实施例10和11研究了本发明提供的治疗感染性疾病的药物的抗病原 微生物镇咳化痰作用。急性支气管肺部感染，或慢性感染急性发作，常引 起咳嗽、咳痰等症状。轻度咳嗽有利于排除呼吸道的分泌物或异物，保持 呼吸道清洁畅通，但是频繁的剧咳，可给患者带来不适和痛苦，或有可能 导致并发症，如气胸、咯血、疝气等，严重者可危及生命。本研究采用经 典的小鼠氨水致咳法、小鼠气管酚红排泌量法观察了本发明药物的镇咳化 痰作用。
实施例10：对浓氨水所致咳嗽的影响
(一)实验目的
观察本发明药物对浓氨水所致小鼠咳嗽的影响，研究其镇咳的药理作 用。
(二)实验材料
1.药品与试剂
受试药：例1药物，颜色：外观呈棕黄色，含量：17.4mg/ml。批号： 20060410。临床拟用量：348mg/d，静脉注射。
阳性对照药：枸橼酸喷托维林片，由天津力生制药股份有限公司生产， 批号：0511023。痰热清注射液由上海凯宝药业有限公司提供，批号：060301。
试剂：浓氨水
2.动物
昆明(KM)小鼠，雌雄兼用，体重18～22g，60只，由中国科学院遗传 与发育生物学研究所动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2002-2006。
(三)实验方法
1、分组及给药
取健康昆明种小鼠50只，体重18～22g，随机分为6组，每组10只， 分别为空白对照组、例1药物低、中、高剂量组、阳性药对照组。除阳性 药喷托维林组外，给药均采用腹腔注射法，每天一次，共用3d。空白对照 组给予生理盐水，药物组分别给予例1药物13.05mg/kg、52.2mg/kg、 91.35mg/kg，阳性药组给予枸橼酸喷托维林片，剂量为50mg/kg，采用灌 胃法给药，痰热清注射液剂量为3ml/kg。
2.造模及检测方法
于给药1h后，将小鼠置于有200μl浓氨水的500ml广口瓶内，记录小 鼠2min内咳嗽次数(典型咳嗽是小鼠腹肌收缩，同时张大嘴，可有咳声) 及咳嗽反射潜伏期(由喷入氨雾开始至产生咳嗽所需的时间)。
(三)实验结果及分析
比较各组小鼠2min咳嗽次数和致咳潜伏期，组间比较采用T检验。结 果见表10。
表10例1药物对浓氨水所致咳嗽的影响
注：各组与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示：例1药物各剂量、痰热清、喷托维林均可显著减少浓氨水 喷雾所致的小鼠咳嗽次数，与对照组组相比有显著性差异(P＜0.01)，并可 延长致咳潜伏期，其中该药物高剂量组与对照组相比具有差异性(P＜0.05)， 说明本发明药物具有镇咳作用。
实施例11：对气管酚红排泌量的影响
(一)实验目的
观察本发明药物对小鼠气管酚红排泌量的影响，研究其祛痰的药理作 用。
(二)实验材料
1.药品与试剂
受试药：例1药物。
阳性对照药：氯化铵，分析纯，北京北化精细化学品有限责任公司， 批号：20060220；痰热清注射液由上海凯宝药业有限公司提供，批号： 060301。
试剂：酚红
2.动物
KM小鼠，雌雄兼用，体重18～22g，60只，由中国科学院遗传与发 育生物学研究所动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2002-2006。
3.仪器
752型紫外可见光栅分光光度计，北京光学仪器厂产品。
(三)实验方法
1、分组及给药
取健康昆明种小鼠60只，体重18～22g，随机分为6组，每组10只， 分别为空白对照组、例1药物低、中、高剂量组、2阳性药对照组。除阳 性药组外，给药均采用腹腔注射法，每天一次，共用3d。空白对照组给予 生理盐水，药物组分别给予例1药物13.05mg/kg、52.2mg/kg、91.35mg/kg， 阳性药组给予氯化铵50mg/kg，采用灌胃法给药，以及痰热清注射液 3ml/kg。
2、造模及检测方法
各药末次给药30min后，腹腔注射5％酚红0.1ml/10g，再过30min后 处死小鼠，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨至气管分叉处的一段气管， 放入2ml生理盐水中，加入1mol/L的氢氧化钠2滴，用721分光光度计 于波长546nm处测吸光度(A)值。
(四)实验结果及分析
各组小鼠气管酚红排泌量结果见表11。
表11例1药物对气管酚红排泌量的影响
注：各组与模型组(生理盐水组)相比，**P＜0.01。
结果显示：例1药物、氯化铵均可使气管酚红排泄量增加，其中例1 药物中、高剂量、氯化铵组与生理盐水组比较有显著性差异(P＜0.01)。吸 光度越大表示酚红排泌量越多，说明药物的祛痰作用越强。结果提示本发 明药物具有很好的祛痰作用。
实施例12～14研究了本发明提供的治疗感染性疾病的药物的抗炎消肿 作用。在各种肺部感染中，炎症反应是造成组织病理损伤的重要环节。炎 症反应具有三个明显的时相：急性期以局部的血管扩张和毛细血管通透性 增加为特征；亚急性期以白细胞和吞噬细胞的浸润为特征；慢性增殖期以 组织变性和纤维化为特征。本研究采用了反应急性、亚急性病变特征的炎 性肿胀实验和以肉芽肿为特征的慢性炎症模型，观察了本发明药物的抗炎 作用。
实施例12：对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响
(一)实验目的
通过角叉菜胶所致大鼠足肿胀的急性炎症模型，观察本发明药物的抗 炎作用。
(二)实验材料
1、药品与试剂
受试药：例1药物。
阳性对照药：痰热清注射液由上海凯宝药业有限公司提供，外观呈棕 色，批号：060301。地塞米松由天津金耀氨基酸有限公司生产，批号： 0508051。
试剂：角叉菜胶购自sigma公司，用注射用生理盐水配制成0.1％的混 悬液。
2、实验动物
SD大鼠，雌雄兼用，体重180～200g，由中国科学院遗传与发育生物 学研究所动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2002-2006。
3、仪器
游标卡尺，0.02mm，哈尔滨量具刀具集团有限责任公司。
(三)实验方法
1、分组及给药
将SD大鼠随机分为6组，每组10只，例1药物分为三个剂量组：高 剂量组71.05mg/kg、中剂量组40.6mg/kg、低剂量组10.15mg/kg，阳性药 为地塞米松10mg/kg，痰热清注射液2.33ml/kg，模型对照组给予等量生理 盐水，各药均采用腹腔注射，每日一次，连续3d。
2、造模方法及测量
于末次给药后用游标卡尺测量大鼠左后足趾关节处厚度，同时各组立 即以1％角叉菜胶0.1mL注射于左后足趾皮下以致炎，于给药后1、2、4、 6h分别测定一次左后足趾厚度，以致炎前厚度减去致炎后厚度为肿胀度 (cm)。
(四)实验结果及分析
各组大鼠足肿胀度结果见表12。
表12例1药物对角叉菜胶所致大鼠足肿胀度的影响
注：各组与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示：地塞米松、痰热清在1h、2h、4h、6h均可显著抑制角叉 菜胶所致的大鼠足趾肿胀，例1药物中、高剂量在2h、4h、6h亦可明显 抑制角叉菜胶所致的足趾肿胀。(P＜0.01，P＜0.05)。
实施例13：对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
(一)实验目的
通过二甲苯所致小鼠耳肿胀的炎症模型，观察本发明药物的抗急性炎 症反应作用。
(二)实验材料
1、药品与试剂
受试药、阳性对照药同实施例12。
2、动物
KM小鼠，雌雄兼用，体重18～22g，71只，由中国科学院遗传与发 育生物学研究所动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2002-2006。
3、仪器
游标卡尺，0.02mm，哈尔滨量具刀具集团有限责任公司；AEG-220 型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品。
(二)实验方法
1、分组及给药
KM小鼠60只，雌雄各半，体重18g～22g，随机分为6组。分别为 模型组(生理盐水组)、例1药物高、中、低剂量组(剂量分别为91.35mg/kg、 2.2mg/kg、13.05mg/kg)和阳性药对照组，阳性药为地塞米松和痰热清注 射液，地塞米松剂量为10mg/kg，痰热清剂量为3ml/kg各组小鼠分别腹腔 注射药物。
2.造模方法及测量
末次给药30min后向每只小鼠右耳准确滴加二甲苯0.05mL复制耳肿 胀模型，末次给药后1h处死小鼠，用8mm打孔器打下左、右相应部位耳 片，分别称重，以两耳重量之差值表示肿胀度。
(三)实验结果及分析
各组小鼠耳肿胀度的结果见表13。
表13例1药物对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
注：与模型组相比*P＜0.05。
结果显示：模型组小鼠耳肿胀明显，例1药物中、高剂量组耳肿胀情 况与模型组相比明显减轻，具有显著差异(P＜0.05)。
实施例14：对棉球所致大鼠肉芽肿增生的影响
(一)实验目的
通过棉球所致大鼠肉芽肿增生模型，观察本发明药物的抗炎症性增生 作用。
(二)实验材料
1、药品与试剂
受试药、阳性对照药同实施例12。
2、动物
SD大鼠，雌雄兼用，体重180～220g，由中国科学院遗传与发育生物 学研究所动物中心提供，合格证号：SCXK(京)2002-2006。
3、仪器
AEG-220型电子分析天平，日本岛津仪器公司产品。
(三)实验方法
棉球准备：制备重量为30mg的棉球，大小松紧相近，高压灭菌后于 每个棉球加入氨苄青霉素1mg/0.1ml，在50℃烤箱烤干备用。
手术过程：取健康SD大鼠60只，雄性，体重180～220g，乙醚麻醉， 下腹部去毛，皮肤常规消毒。将大鼠仰卧位固定，下腹部切口，将两个经 上述过程制备的棉球分别植入大鼠两侧腹股沟皮下，缝合伤口，于手术后 8d，以颈椎脱臼法处死大鼠，取出棉球于60℃烤箱放置12小时后精密称 重，将此重量减去原棉球重，即为肉芽肿净重。
动物分组：大鼠植入棉球后随机分为5组，每组10只，例1药物分为三 个剂量组：高剂量组71.05mg/kg、中剂量组40.6mg/kg、低剂量组 10.15mg/kg，阳性对照药为地塞米松剂量为10mg/kg，痰热清注射液对照组 剂量为2.33ml/kg，对照组给予等量生理盐水，以上各组均腹腔给药，一日 一次，连续7d，于末次给药后4h处死动物，记录各组肉芽肿重量，肉芽肿 抑制率(％)＝[(治疗组肉芽肿净重量-空白对照组肉芽肿净重量)/空白对 照组肉芽肿净重量]×100％。
(四)实验结果及分析
各组大鼠肉芽肿净重结果见表14。
表14例1药物对棉球所致大鼠肉芽肿增生的影响
注：与模型组相比**P＜0.01。
结果显示：地塞米松可明显抑制棉球所致大鼠肉芽肿增生，与模型组 比较有显著性差异(P＜0.01)。例1药物各剂量组、痰热清均显示出一定的 抑制肉芽肿增生的作用，但与模型组比较无显著性差异。
实施例12～14的结论：本发明药物中、高剂量可明显抑制角叉菜胶所 致的足趾肿胀和二甲苯所致小鼠耳肿胀，表明该药物在急性亚急性炎症期 能有效减少渗出，缓解急性炎症的肿胀程度，对炎症慢性期的肉芽组织增 生有一定的抑制作用。提示该药物具有一定的抗炎作用，尤其对炎症反应 的急性期效果明显。
实施例15～18为本发明提供的治疗感染性疾病的药物对流感病毒亚甲 型小鼠肺适应FM1株所致小鼠肺损伤的药效学研究，通过观察该药物对流 感病毒所致小鼠肺炎的治疗作用，以确定该药的抗病毒、抗炎作用及其相 关机制，为该药物的临床应用提供依据。
实施例15：对流感病毒亚甲型小鼠肺适应FM1株感染小鼠保护率实验
(一)实验方法
1、造模方法：
取病毒原液90μl，加于3510μl的生理盐水中，混匀置于冰浴中；
将小鼠用乙醚轻度麻醉后，正常组以生理盐水50μl滴鼻，其他以配好 的病毒液(病毒原液1∶40稀释)滴鼻感染，每只50μl。待小鼠复苏后称重， 除正常组(20只)外其他随机分为6组，分别为：模型组(24只)、利巴韦 林阳性对照组(20只)、双黄连阳性对照组(20只)、例1药物小剂量组(20 只)、例1药物中剂量组(20只)和例1药物大剂量组(20只)。
2、给药方法：
正常组：生理盐水腹腔注射，每只0.3ml；
模型组：生理盐水腹腔注射，每只0.3ml；
利巴韦林组：利巴韦林稀释液(原液1∶12稀释)腹腔注射，每只0.3ml；
双黄连组：双黄连稀释液(45mg/ml)腹腔注射，每只0.3ml；
例1药物小剂量组：1∶8例1药物稀释液腹腔注射，每只0.3ml；
例1药物中剂量组：1∶4例1药物稀释液腹腔注射，每只0.3ml；
例1药物大剂量组：1∶2例1药物稀释液腹腔注射，每只0.3ml。
死亡保护率＝病毒感染对照组死亡率×实验组死亡率/病毒感染对照组 死亡率×100％
(二)实验结果及分析
例1药物对流感病毒亚甲型小鼠肺适应FM1株感染小鼠保护率实验结 果见表15、16。
表15死亡保护率实验观察数据(小鼠感染病毒后存活天数)
表16各组感染鼠流感病毒小鼠死亡保护率实验结果
注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01。
结果显示：例1药物大、中、小剂量死亡保护率分别是29.1％、29.1％、 12.8％，与模型组比较，经χ2检验，显示该药物大、中剂量组对流感病毒 FM1感染小鼠具有明显的保护作用(p＜0.05)。
实施例16：对感染鼠流感病毒小鼠肺指数的影响
(一)实验方法
造模：将小鼠用乙醚麻醉后，正常组及模型组N.S.滴鼻，每只50μl， 其他各组用1∶400流感病毒鼠肺适应株稀释液滴鼻，各50μl/只。给药方法同 上。第七天称重，摘眼球放血，处死后无菌摘取肺脏，用无菌滤纸吸去多 余液体后分别称量肺重。
肺指数＝肺脏重量(mg)/小鼠重量(g)
肺脏指数抑制百分率＝(对照组肺脏指数均数-试验组肺脏指数均数) /对照组肺脏指数均数
(二)实验结果及分析
各组小鼠肺指数测定结果见表17。
表17例1药物对感染鼠流感病毒小鼠肺指数的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01。
结果显示：模型组的肺指数明显增大(P＜0.001)，说明流感病毒感染 造成小鼠肺脏水肿，重量增加；与模型组相比，例1药物大、中、小剂量 组的肺指数均明显下降(P＜0.01)，提示该药物大、中、小剂量均可减轻流 感病毒感染小鼠肺脏的水肿状态。
实施例17：对感染鼠流感病毒小鼠肺脏病理的影响
(一)实验方法
造模、给药及取材方法同上。
每组各取5块肺组织，用10％福尔马林固定后，肺组织病理切片HE染 色，并在光学显微镜下观察肺组织病理变化。具体步骤为：
1)固定：每组各取5个肺组织，用10％福尔马林固定，一个月之内更 换固定液；
2)洗涤修块：将固定液倒尽，用自来水冲洗浸泡24h，每1h换水一次， 将组织修出平整的切面；
3)脱水：将水倒尽，50％、70％、80％、95％各级乙醇溶液脱水各60min， 放入95％、100％乙醇溶液各两次，每次90min，浸入前用滤纸将残余液体 吸干；
4)透明：浸入二甲苯溶液后，盖紧盖子，以防空气进入，35min后更 换新的二甲苯浸泡35min；
5)透蜡：两遍，每次90min，保持箱内温度在55～60℃左右；
6)包埋：将熔化的石蜡倒入容器内，将经过透蜡的组织放入熔化的 石蜡中，注意切面朝下，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块；
7)切片：将蜡块固定在切片机上进行切片，切片厚度为6μm，用单面 刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察 切片是否良好，选取部分贴片；
8)脱蜡复水：石蜡切片经二甲苯I、II脱蜡各5～10min，然后放入 100％、95％、90％、80％、70％等各级酒精溶液中各3～5min，再放入蒸馏 水中3min；
9)苏木精染色：约15min，用自来水冲洗约15min，随时用显微镜检 查见颜色变蓝为止；
10)返蓝分色：将切片放入1％盐酸乙醇液(盐酸1份+70％乙醇100份) 中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟；切片再放入自 来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞 质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次，切片入 50％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3～5min；
11)伊红染色：用0.5％伊红乙醇液对比染色2～5min；
12)酒精脱水：放入95％乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇 中3～5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇；
13)封片：光学树胶封存；
14)显微镜观察照相。
(二)实验结果及分析
各组小鼠肺组织HE染色结果可见：
正常组可见组织结构完整，细胞呈红色，核呈蓝色，肺泡大小匀称， 细胞壁厚度正常；模型组主要表现为间质性炎症，可见肺间质内血管充血， 水肿以及大量的炎性细胞(淋巴细胞、单核细胞)浸润，肺泡壁增厚，肺 泡被压缩，纤维组织增生，肺泡腔内渗出；双黄连组与正常组相比，细胞 壁稍有增厚，有少量的炎性细胞浸润，但结构完整，肺泡大小正常匀称； 例1药物小剂量组可见少量淋巴细胞浸润，肺泡大小接近正常，伴有少量 渗出和充血。例1药物中剂量组可见组织结构完整，肺泡间隔基本正常； 例1药物大剂量组可见组织结构完整，细胞壁基本接近正常，有少量的炎 性细胞浸润。结果显示：该药物可明显减轻肺组织的充血、水肿与炎性渗 出，保护肺组织的结构完整。
实施例18：对感染鼠流感病毒小鼠免疫功能的影响
(一)实验方法
动物造模、给药及取材方法同上。
1、脾脏T淋巴细胞增殖能力的测定
采用MTT法。将实验小鼠摘眼球放血处死后无菌摘取脾脏(操作在冰 浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，加入10～15mlTris-NH4Cl，室温5～10分 钟，用无血清的1640洗两遍(1500rpm，10min，4℃)，再用完全RPMI1640 培养基调节细胞浓度至5×106/ml，加至96孔板中，100μl/孔。分别加入含 ConA完全RPMI640溶液100μl/孔(ConA终浓度为5μg/ml)，置于37℃的 5％CO2培养箱孵育68h，取出，各孔吸出100μl上清，加入MTT10μl/孔(终 浓度0.5mg/ml)，继续孵育4～6h，加入0.01NHCl-10％SDS100μl/孔，振荡， 4℃过夜，次日酶标仪570nm下测定各孔A值。
2、脾脏B淋巴细胞增殖能力的测定
采用MTT法。将实验小鼠摘眼球放血处死后无菌摘取脾脏(操作在冰 浴中进行)，常规制备脾细胞悬液，加入10～15mlTris-NH4Cl，室温5～10min， 用无血清的1640洗两遍(1500rpm，10min，4℃)，再用完全RPMI1640培 养基调节细胞浓度至5×106/ml，加至96孔板中，100μl/孔。再加入含LPS完 全RPMI1640溶液100μl/孔(LPS终浓度为10μg/ml)，置于37℃的5％CO2培 养箱孵育68h，取出，各孔吸出100μl/孔，振荡，4℃过夜，次日酶标仪570nm 下测定各孔A值。
3、INF-γ的诱生及活性测定
采用ELISA方法。将处理后的实验小鼠摘眼球放血处死后，无菌摘取 脾脏，常规制备脾细胞悬液，用完全RPMI1640培养液调节细胞浓度至 5×106/ml，加入24孔板中，1ml/孔，加入ConA使终浓度为5μg/ml，置于37℃ 的5％CO2培养箱孵育72h，取出，吸出上清，3000rpm离心10min，吸取上 清即得INF-γ粗制品，分装于effendoff管中，-75℃保存。用ELISA试剂盒检 测INF-γ含量。检测程序如下：
1)配液：PBST：0.5mlTween-20溶于1L的PBS中；PBST-B：2mlBSA 溶液(10％)+38mlPBST；
2)洗板：PBST300μl/孔，洗板3次，最后一次在滤纸上扣干；
3)加样品及细胞因子标准品：100μl/孔加入样本和细胞因子，盖上封 板膜。37℃孵育2h，设置空白孔，用PBST代替样本和标准品；
4)洗板：扣出孔内液体，PBST300μl/孔洗板6次，最后一次在滤纸上 扣干；
5)加检测抗体：100μl/孔加入Biotinylated detector antibodies工作液， 盖上封板膜，37℃孵育1h；
6)洗板：扣出孔内液体，PBST300μl/孔洗板6次。最后一次在滤纸上 扣干；
7)加SPP：100μl/孔加入SPP工作液，盖上封板膜，37℃孵育1h；
8)洗板：扣出孔内液体，PBST300μl/孔洗板6次，最后一次在滤纸上 扣干；
9)加TMB(酶底物)：加入TMB工作液100μl/孔，室温显色10-30min；
10)终止反应：待空中液体显色适度，立即加入2M的H2SO450μl/孔， 终止反应；
11)读板：λ＝450nm读数。
4、腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
采用中性红比色法。将实验小鼠摘眼球放血处死后，以含肝素的冷PBS 灌洗腹腔，每只吸取腹腔液约6ml，以PBS洗细胞两次(1500rpm，10min， 4℃)，用完全RPMI1640调节细胞浓度至4×106/ml，加至96孔板中，100μl/孔， 每组六孔，37℃，5％CO2孵育4h，弃上清，加入0.075％中性红溶液200μl/孔， 30min后以温PBS洗1～2次，加入巨噬细胞溶解液(50％无水乙醇+50％0.1M 醋酸)200μl/孔，4℃过夜，次日酶标仪530nm下测定各孔A值。
5、肺匀浆NO含量测定
将实验小鼠摘眼球处死后，无菌摘取肺脏，按照1∶9的比例加入冷的生理 盐水，匀浆后离心(1500rpm，10min)取上清，加入96孔板中，100μl/孔， 加入等量的Griess液，室温放置10min，酶标仪530nm下测A值。
6、血清NO含量测定
小鼠称重后摘眼球处死取血2ml，待凝集后离心机离心，3000rpm，10min， 取血清加入96孔板中，50μl/孔，加入等量的Griess液，室温放置10min，酶标 仪530nm下测A值。
7、肺匀浆IL-1含量测定
采用ELISA的方法。将小鼠摘眼球放血处死，摘取肺脏，按照1∶9的比例 加入冷的生理盐水，匀浆后离心(1500rpm，10min)，取上清按试剂盒操作 步骤进行检测：
1)包被：将10×包被缓冲液放置室温，取2.5ml加入22.5ml的DI H2O；取 包被抗体(Capture Ab)48μl+12ml上述配好的包被缓冲液；将上述稀释好 的包被抗体加于96孔板中，每孔100μl，封板4℃过夜；
2)洗涤：用PBS-Tween20洗各孔3次，每孔不得少于300μl，翻转96孔 板，在吸水纸上吸去残余的缓冲液；
3)10ml的5×化学稀释液(Assay diluent)+40ml的DI H2O→1×化学稀释 液；加入96孔板，200μl每孔，室温孵育1小时；
4)如步骤2)中所述洗板；
5)加样：取10μl标准品+10ml化学稀释液(Assay diluent)→最高稀释 浓度的标准品，取100μl加于适当的孔中，然后进行对倍稀释，以作出标准 曲线，加待测样品，每孔100μl，封板室温孵育2小时；
6)如步骤2中所述洗板，共洗5次。
7)加酶标抗体：取48μl酶标抗体(Detection Ab)+12ml的1×化学稀释 液(Assay diluent)加板，每孔100μl，封板，室温孵育1小时；
8)如步骤2中所述洗板，共洗5次。
9)48μl酶(Avidin-HRP)+12ml化学稀释液；加板，100μl/孔，封板， 室温孵育30min；
10)如步骤2中所述洗板，在此步中，弃液之前用洗液浸泡板孔1～2min， 共洗板7次；
11)加底物液(Substrate Solution)，100μl/孔，室温孵育15min；
12)加50μl/孔终止液；
13)450nm下读数。
8、肺匀浆TNF-α含量测定
采用ELISA的方法，按试剂盒操作步骤进行检测。
9、肺匀浆IL-4含量测定
采用ELISA的方法，按试剂盒操作步骤进行检测。
10、肺匀浆中IL-10含量测定
采用ELISA的方法，按试剂盒操作步骤进行检测。
(二)实验结果及分析
1、脾脏T淋巴细胞增殖能力的测定结果见表18。
表18例1药物对感染鼠流感病毒小鼠T淋巴细胞增殖能力的影响
注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。
结果显示：与正常组比较，模型组A值下降(P＜0.05)，说明小鼠感染流 感病毒FM1后对免疫功能具有抑制作用，可造成T淋巴细胞增殖能力下降； 与模型组相比，例1药物小、中、大剂量组A值均增高(P＜0.01，P＜0.001)， 提示该药物可提高感染流感病毒小鼠T淋巴细胞增殖能力，增强其免疫功能。
2、脾脏B淋巴细胞增殖能力的测定结果见表19。
表19例1药物对感染鼠流感病毒小鼠B淋巴细胞增殖能力的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001。
结果显示：与正常组比较，模型组A值显著下降(P＜0.001)，说明小鼠 感染流感病毒FM1后对免疫功能具有明显的抑制作用，可造成B淋巴细胞增 殖能力显著下降；与模型组相比，例1药物小、中、大剂量组A值均显著增 高(P＜0.001)，提示该药物可提高感染流感病毒小鼠B淋巴细胞增殖能力， 增强其免疫功能。
3、INF-γ的诱生及活性测定结果见表20。
表20例1药物对感染鼠流感病毒小鼠INF-γ的含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001。
结果显示：与正常组比较，模型组INF-γ含量显著下降(P＜0.001)；与模 型组相比，例1药物小、中、大剂量组INF-γ含量均显著增高(P＜0.01，P＜0.001)， 提示该药物可提高感染流感病毒小鼠的抗病毒能力。
4、腹腔巨噬细胞吞噬功能测定结果见表21
表21例1药物对感染鼠流感病毒小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001； 与双黄连组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。
结果显示：与正常组比较，模型组A值显著下降(P＜0.001)，说明小鼠 感染流感病毒FM1后腹腔巨噬细胞吞噬功能显著下降；与模型组相比，例1 药物小、中、大剂量组A值均显著增高(P＜0.01，P＜0.001)，而且与阳性药 双黄连组相比，该药物中、大剂量组A值也显著增高(P＜0.05，P＜0.01)，提 示该药物可显著提高感染流感病毒小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，该作用优于 双黄连。
5、肺匀浆NO含量测定结果见表22。
表22例1药物对感染鼠流感病毒小鼠肺匀浆NO含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001。
结果显示：小鼠感染流感病毒FM1后肺匀浆NO释放量显著升高，与正 常组比较差异显著(P＜0.001)；例1药物小、中、大剂量对其具有显著下调 作用，与模型比较差异显著(P＜0.001)。
6、血清NO含量测定结果见表23。
表23例1药物对感染鼠流感病毒小鼠血清NO含量的影响
注：与正常组比较，#P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示：小鼠感染流感病毒FM1后血清NO含量升高，与正常组比较 差异显著(P＜0.05)；例1药物小、中、大剂量及阳性药对其均具有显著下调 作用，与模型比较差异显著(P＜0.05，P＜0.01)，尤其例1药物中剂量组作用 较明显。
7、肺匀浆IL-1含量的测定结果见表24。
表24例1药物对感染病毒小鼠肺匀浆IL-1含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001。
结果显示：与正常组比较，模型组肺匀浆IL-1含量显著升高(P＜0.001)； 与模型组相比，例1药物小、中、大剂量及阳性药均可降低流感病毒感染小 鼠肺匀浆IL-1含量(P＜0.001)。
8、肺匀浆TNF-α含量的测定结果见表25。
表25例1药物对感染病毒小鼠肺匀浆TNF-α含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，***P＜0.001。
结果显示：与正常组比较，模型组肺匀浆TNF-α含量显著升高(P＜0.001)； 与模型组相比，例1药物小、中、大剂量及阳性药均可降低流感病毒感染小 鼠肺匀浆TNF-α含量(P＜0.001)。
9、肺匀浆IL-4含量的测定结果见表26。
表26例1药物对感染病毒小鼠肺匀浆IL-4含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，**P＜0.01，***P＜0.001； 与双黄连组比较，△P＜0.05。
结果显示：小鼠感染流感病毒FM1后肺匀浆IL-4含量显著升高，与正常 组比较差异显著(P＜0.001)；例1药物小、中、大剂量及阳性药对其均具有 显著下调作用，与模型组比较差异显著(P＜0.01，P＜0.001)，而且与阳性药 双黄连组相比，例1药物中、大剂量组对肺匀浆IL-4含量的下调作用更为明 显(P＜0.05)，提示该药物在降低感染流感病毒小鼠肺匀浆IL-4含量方面优于 双黄连。
10、肺匀浆中IL-10含量的测定结果见表27。
表27例1药物对感染病毒小鼠肺匀浆IL-10含量的影响
注：与正常组比较，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，***P＜0.001；与 双黄连组比较，△P＜0.05。
结果显示：小鼠感染流感病毒FM1后肺匀浆IL-10含量显著升高，与正常 组比较差异显著(P＜0.001)；例1药物小、中、大剂量及双黄连对其均具有 显著下调作用，与模型组比较差异显著(P＜0.05，P＜0.001)，而且与阳性药 双黄连组相比，例1药物中剂量组的下调作用更为明显(P＜0.05)，提示例1 药物中剂量在降低感染流感病毒小鼠肺匀浆IL-10含量方面优于双黄连。
实施例19：对内毒素(LPS)所致大鼠急性肺损伤的药效学研究
(一)实验目的
观察本发明药物对内毒素(LPS)所致大鼠急性肺损伤的保护作用，并 深入探讨其相关机制，为该药物的临床应用提供依据。
(二)实验材料
1、实验动物
健康清洁级SD大鼠120只，雌雄各半，体重210-240g(北京维通利华实 验动物技术有限公司)。
2、药品与试剂
例1药物，痰热清注射液(上海凯宝药业有限公司，批号：040607)，LPS (EcoliO55B5，sigma公司)，实验中的其它试剂均为分析纯(购自北京化学 试剂公司)。Bradford蛋白定量试剂盒，P-selectin ELISA试剂盒(cat.NO.3R262 RB公司)，sICAM-1 ELISA试剂盒(cat.NO.3R110 RB公司)。
(三)实验方法
1、动物模型的制备
乙醚麻醉大鼠，舌下静脉注射LPS，6mg/kg(10mg的LPS溶于4ml的0.9％ 的NS中，实际给药0.24ml/100g)。
2、分组及给药
动物实验前适应性喂养2天。动物随机分组为正常组，模型对照组，例1 药物大剂量组，例1药物中剂量组，例1药物小剂量组，阳性对照组(痰热清 注射液)，每组10只。
采用腹腔注射方式给药。正常组注射生理盐水，各给药组在舌下注射LPS 后立即腹腔注射给药一次，模型对照组腹腔注射相应容积的生理盐水，之后 每12h给药一次，24h后处死动物，取材。
各给药组用量如下(大鼠剂量是人临床用药量的6倍)，例1药物：大剂 量组0.3ml/100g、中剂量组0.2ml/100g、小剂量组0.1ml/100g；痰热清注射液： 大鼠临床等效量0.2ml/100g。
3、取材与处理
(1)取血：腹主动脉采血约5ml，其中2ml加入到已经加好EDTA的管中， 轻轻混匀置于冰上用于测血常规，测完血常规后剩余血液离心取上清液得血 浆；3ml加入另外管中静置待有血清析出后低温离心取血清。
(2)取双侧肺脏与收集肺泡灌洗液：
分离气管，环状软骨下方用手术刀片做倒T型切口(取材时避免血液进 入气管，影响灌洗液的成分)，将自制塑料软管插入气管，用缝合线固定(避 免漏气)，分离心肺(切勿触及肺脏以免影响灌洗)。夹闭右侧肺叶支气管， 用注射器抽取1.6mlPBS液缓慢注入左肺中再缓慢抽出，连续进行3次，总量 共4.8ml，要求回收率大于75％(必要时用纱布轻柔挤压肺组织)。
(3)右肺膈叶，滤纸吸干，用于测定肺组织干(湿)重比以及肺含水 量。右肺其余组织经甲醛固定，做形态学观察。
4、指标检测与分析
(1)肺含水量及肺湿重/干重比：取右肺膈叶，滤纸吸干，在分析天平 上准确称湿重，然后80℃恒温烘烤48小时，待质量不再变化准确称量干重， 计算肺组织干(湿)重比以及肺含水量。肺含水量＝(湿肺重-干肺重)/湿肺重 ×100％。
(2)肺泡灌洗液细胞计数：肺泡灌洗液经低温离心机离心(3000r/m， 15min)，离心后沉降的细胞用200μL的PBS重新悬起，加两滴冰醋酸后，进 行细胞计数。
(3)肺泡灌洗液总蛋白和TNF-α含量测定：肺泡灌洗液经低温离心机 离心(3000r/m，15min)，取上清液，用于测定总蛋白的含量和TNF-α。肺 泡灌洗液蛋白定量采用Bradford蛋白定量试剂盒超敏感方案，肺泡灌洗液中 TNF-α含量采用放免法测定。
(4)肺组织病理学观察：右肺组织经10％福尔马林固定，修取中叶， 常规石蜡包埋，5μm厚切片，HE染色，光镜观察肺损伤程度。
(5)计算肺通透系数：血浆蛋白含量测定采用Bradford蛋白定量试剂盒。 肺通透系数＝肺泡灌洗液蛋白含量/血浆蛋白含量×100％。
(6)血清IL-1β，IL-8含量测定：采用放免法。
(7)血清P-selectin和sICAM-1含量测定：采用ELISA方法。
5、数据统计处理方法
各组实验数据用均数±标准差表示，组间差异显著性采用方差分析(One way-Anova)。
(四)实验结果及分析
1、肺含水量测定结果见表28。
表28例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠肺组织含水量的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与痰热 清阳性药组比较，△P＜0.05。
结果显示：LPS致急性肺损伤，24h后肺含水量增高，与正常组比较有显 著性差异(P＜0.01)，例1药物中、大剂量组可有效减轻肺含水量，与模型组 比较差异显著(P＜0.05，P＜0.01)，且优于痰热清组(P＜0.05)。
2、肺湿重/干重比结果见表29。
表29例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠肺湿/干重比的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05；与痰热清阳性药组 比较，△P＜0.05。
结果显示：LPS致大鼠急性肺损伤后肺湿重/干重比增高，与正常组比较 有显著性差异(P＜0.01)，说明LPS引起肺水肿，使肺脏含水量明显增加；例 1药物小、中、大剂量组的肺湿重/干重比均下降，与模型组比较差异显著 (P＜0.05)，提示例1药物可有效降低肺含水量，减轻肺水肿状态，尤其是中 剂量组的作用更为明显，优于痰热清组(P＜0.05)。
3、肺通透系数检测结果见表30。
表30例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠肺通透系数的影响
注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果显示：与正常组比较，模型组的肺通透系数增高，说明急性肺损伤 后肺毛细血管的通透性增加，蛋白渗出增加；例1药物小、中、大剂量组和 痰热清组的肺通透系数均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，提示例1药物可降低 急性肺损伤后肺毛细血管的通透性，减轻渗出。
4、肺泡灌洗液中细胞计数结果见表31。
表31例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液中细胞计数的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；
结果显示：与正常组比较，模型组的肺泡灌洗液中细胞计数增高 (P＜0.01)；与模型组比较，例1药物小、中、大剂量组和痰热清组的肺泡灌 洗液中细胞计数均显著降低(P＜0.01)，提示该药物可减轻急性肺损伤后的 炎症细胞浸润。
5、肺泡灌洗液中TNF-α含量检测结果见表32。
表32例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示：与正常组比较，模型组的肺泡灌洗液中TNF-α含量显著增高 (P＜0.01)；与模型组比较，例1药物小、大剂量组和痰热清组的肺泡灌洗液 中TNF-α含量均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。
6、血清IL-1含量检测结果见表33。
表33例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠血清IL-1含量的影响
7、血清IL-8含量检测结果见表34。
表34例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠血清IL-8含量的影响
8、血清P-selectin含量检测结果见表35。
表35例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠血清P-selectin含量的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01。
9、血清sICAM-1含量检测结果见表36。
表36例1药物对LPS致急性肺损伤大鼠血清sICAM-1含量的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示：与正常组比较，模型组血清sICAM-1含量显著增高(P＜0.01)； 与模型组比较，例1药物大剂量组和痰热清可有效降低急性肺损伤大鼠血清 sICAM-1含量(P＜0.05，P＜0.01)。
实施例20～22为本发明提供的治疗感染性疾病的药物对流感病毒感染 巨噬细胞抗病毒作用机制的研究，通过观察该药物对流感病毒感染后巨噬 细胞分泌的多种细胞因子含量及其相关信号传导通路的影响，探讨该药物 抗病毒的免疫学机制。
实施例20：对流感病毒感染巨噬细胞上清中NO含量的影响
(一)实验方法
复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，培养至最佳状态时接种于96孔细胞培养 板，大部分细胞贴壁后，用100TCID50的流感病毒FM1株攻击细胞1.5h，然后 换用不同浓度的含药维持液。于不同设定时间取细胞上清，加入96孔板中， 100μl/孔，加入等量的Griess液，室温放置10min，酶标仪530nm下测A值。
(二)实验结果与分析
表37例1药物对流感病毒感染巨噬细胞上清中NO含量的影响
结果显示：与正常细胞对照组相比，流感病毒感染后巨噬细胞产生的NO 含量明显增高，且随着时间的延长而增加；与病毒感染对照组比较，例1药 物各剂量组均可降低流感病毒感染后巨噬细胞上清液中NO含量，并显示出 明显的量效关系，即随着药物浓度的增加，对NO含量的降低更明显。
结论：1、巨噬细胞被流感病毒感染后释放NO增加。2、本发明药物能 够抑制病毒感染巨噬细胞NO的释放，而且随药物浓度升高，其抑制作用更 明显，有明确的量效关系。3、本发明药物抑制NO释放随药物作用时间延长 而加强。
实施例21：对流感病毒感染巨噬细胞上清中细胞因子含量的影响
(一)实验方法
复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，待生长状态良好时接种于24孔细胞培养 板，孵箱过夜，用100TCID50的流感病毒攻击细胞1.5h，同时设病毒对照孔 和细胞对照孔。后换用不同浓度的含药维持液继续培养6h、12h和24h，分别 于不同时间点取上清，用试剂盒ELISA法检测IFN-beta、IL-6、MIP-1a的含量。
(二)实验结果
表38例1药物对流感病毒感染巨噬细胞上清中IFN-beta含量的影响
注：病毒对照与细胞对照比较，*P＜0.05，**P＜0.01；例1药物实验组与病毒 对照组比较，##P＜0.01。
结果显示：与正常细胞对照组相比，流感病毒感染后巨噬细胞上清中 IFN-beta含量明显增高(P＜0.05，P＜0.01)；与病毒感染对照组比较，例1药 物各剂量组均可明显升高流感病毒感染后巨噬细胞上清中IFN-beta含量 (P＜0.01)，并随着药物浓度的增加，作用增强；在药物作用的三个时间点 中，以12小时作用最强。
表39例1药物对流感病毒感染巨噬细胞上清中IL-6含量的影响
注：病毒对照与细胞对照比较，**P＜0.01；例1药物实验组与病毒对照组比 较，##P＜0.01。
结果显示：与正常细胞对照组相比，流感病毒感染后巨噬细胞上清中IL-6 含量明显增高(P＜0.01)；与病毒感染对照组比较，例1药物各剂量组均可明 显降低流感病毒感染后巨噬细胞上清中IL-6含量(P＜0.01)，并随着药物浓度 的增加，作用增强；在药物作用的三个时间点中，以12小时作用最强。
表40例1药物对流感病毒感染巨噬细胞上清中MIP-1a含量的影响
注：病毒对照与细胞对照比较，**P＜0.01；例1药物实验组与病毒对照组比 较，##P＜0.01。
结果显示：与正常细胞对照组相比，流感病毒感染后巨噬细胞上清中 MIP-1a含量明显增高(P＜0.01)；与病毒感染对照组比较，例1药物各剂量组 均可明显降低流感病毒感染后巨噬细胞上清中MIP-1a含量(P＜0.01)，并随 着药物浓度的增加，作用增强；在药物作用的三个时间点中，以12h作用最 强。
实施例22：对TLR7介导的信号转导通路的系列标志物的影响
(一)实验方法
通过大量阅读国外相关文献，设计出各标记物的引物，并在实验前一周 合成相关的引物。然后进行RT-PCR实验。RNA提取按Trizol提取试剂盒操作 说明书进行，制备cDNA，在ABI的PRISM7700型荧光定量PCR仪进行实时定 量PCR反应。
(二)实验结果
荧光定量PCR产物经琼脂糖电泳，紫外灯下扫描分析结果见图1，扩增 的基因长度符合设计长度，结果与荧光定量PCR一致。
熔解曲线见图2，未见其它杂峰，无非特异扩增。
以样本cDNA稀释后求得的β-actin的扩增标准曲线斜率为-3.273，相关系 数为-0.998，模板浓度对数值与Ct值之间呈良好的线性关系。根据标准曲线 求出待测样本目的基因mRNA的相对拷贝数，与相对应的β-actin的相对拷贝 数比较，求出其mRNA表达水平，如表41所示。
表41例1药物作用12h对TLR7介导的信号传导分子的mRNA表达的影响
注：病毒对照组与细胞对照组比较，**P＜0.01。实验组与病毒对照组比较， ##P＜0.01。
表42例1药物作用24h对TLR7介导的信号传导分子的mRNA表达的影响
注：病毒对照组与细胞对照组比较，**P＜0.01。实验组与病毒对照组比较， ##P＜0.01。
结果显示：病毒对照组巨噬细胞TLR7mRNA的高表达，12h表达水平高 于24h，同时病毒对照组的P65、MyD88、IRAK4、TRAF6都显著高于正常细 胞对照组，佐证了病毒感染后免疫系统的积极反应。用例1药物处理后， MyD88依赖的信号通路中沿途各分子表达水平都下降，显示了例1药物对巨 噬细胞免疫功能的调节作用。
实施例20～22结论：
1.流感病毒感染巨噬细胞后，活化的巨噬细胞释放大量的前炎症因子 IL-6、MIP-1a，在感染早期有利于机体清除病毒，但是持续分泌会导致炎细 胞和Th1型细胞在病灶的聚集而产生序列反应，包括炎症因子的进一步释放 和直接的组织损伤。本发明药物可显著降低IL-6、MIP-1a的含量，从而减轻 炎症反应造成的组织损伤，发挥组织保护作用。
2.在信号传导过程中，病毒感染后的巨噬细胞TLR7的和MyD88表达明 显高于正常的细胞对照。提示流感病毒感染后，免疫系统以TLR7信号传导 通路为主产生系列反应。本发明药物作用后，该通路的多种分子标志物均明 显下调，提示该药物通过抑制该通路的接头蛋白而抑制巨噬细胞活化，从而 发挥免疫调节作用。
3.本发明药物除保护机体受到炎症损伤外，还对流感病毒具有主动杀 伤作用，该药物处理病毒感染的巨噬细胞产生高水平的IFN-β干扰素，该干 扰素有明确的抗病毒作用。