技术领域
本发明是关于酪氨酸酶抑制剂的提取方法，特别涉及一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸 酶抑制剂的方法。
背景技术
黑色素沉积形成的各类色斑给现代人尤其是女性造成了生理和心理的困扰，祛斑已 是众多女性美容的首要目标。研究表明，酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶。酪氨酸酶是 一类广泛存在于生物体内的铜结合酶，通过将酪氨酸羟化，产生L-3,4-二羟基苯丙氨酸 （L-DOPA），然后再将L-DOPA进一步氧化成多巴醌，从而形成黑色素。同时，酪氨 酸酶在果蔬保存和运输过程产生的褐变中扮演着重要角色，能降低果蔬的外观和品质， 从而降低其价值。因此，对酪氨酸酶的抑制不仅能有效抑制黑色素形成，从而阻滞人体 各类色斑的形成，而且能有效防止果蔬褐变，保持其品质和价值。
茶叶籽粕是茶叶籽榨油后的固体残渣。自2009年12月卫生部批准将茶叶籽油列入 新食品资源，茶叶籽油生产规模不断扩大，造成茶叶籽粕这一加工副产物的产量也不断 增加。研究表明，茶叶籽粕中含有包括多酚、多糖、皂苷和蛋白等多种生物活性成分， 具有极高的开发价值。然而，目前除少量茶叶籽粕被作为肥料低价值利用外，这一生物 资源还未被有效开发。近年来，从植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制剂备受关 注。目前还未见从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的相关报道或专利。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能有效利用茶叶籽粕资 源，且能提取出天然酪氨酸酶抑制剂的方法。为解决上述技术问题，本发明的解决方案 是：
提供一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法，包括粉碎茶叶籽粕，包括以下 具体步骤：
步骤A：将茶叶籽粕预处理后进行脱脂，以茶叶籽粕和体积浓度95%的乙醇水溶液 为1g：15ml～1g：25ml的比例，向脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇水溶 液，在40～50℃下提取30～40min，然后以12000转/分钟离心20分钟后，得到滤渣和 提取液；
步骤B：以步骤A得到的滤渣和缓冲液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向步骤A 得到的滤渣中加入缓冲液，在40～60℃下浸提2～3h，再超声提取10～20min后，以 12000转/分钟离心20分钟，得到提取液；所述缓冲液为PH是7～9，且含占脱脂后茶 叶籽粕干重3～5%的碱性蛋白酶的缓冲液；
步骤C：将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/15，然后以浓缩后的 提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取，得到 萃余液；
步骤D：将步骤B得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/7，过D101大孔树脂 进行柱层析，用体积浓度分别为20％、60％和100％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱流 速为1ml/min，收集60%乙醇洗脱液；
步骤E：将步骤C中得到的萃余液和步骤D中得到的60%乙醇洗脱液混合，浓缩 后冷冻干燥，即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。
作为进一步的改进，所述步骤A中的预处理是将茶叶籽粕粉碎，然后过40～60目 筛。
作为进一步的改进，所述步骤A中的脱脂方法是：按照预处理后的茶叶籽粕和正己 烷为1g：10ml～1g：20ml的比例，向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷，在30～50℃ 下浸提1～2h，然后以5000转/分钟离心15分钟后弃上清液，取残渣烘干。
作为进一步的改进，所述步骤B中的碱性蛋白酶的活力不小于20000U/g。
作为进一步的改进，所述步骤B中的缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
作为进一步的改进，所述步骤B中的超声提取的频率是150～250W。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过极性区别提取有效提高了目标物的萃取精度，并通过酶法结合超声提取 大大提高了提取的效率，适用于产业化生产。同时，本发明中制备的酪氨酸酶抑制剂一 种天然高效的酪氨酸酶抑制剂，对酪氨酸酶的抑制效果显著。此外，本发明技术可以有 效提高茶叶籽粕资源的经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中提取的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制效果对比图。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
本发明从茶果皮中提取血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂的方法具体步骤包括：
步骤A：将茶叶籽粕预处理，预处理方法是将茶叶籽粕粉碎，然后过40～60目筛； 茶叶籽粕预处理后进行脱脂，脱脂方法是：按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为1g： 10ml～1g：20ml的比例，向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷，在30～50℃下浸提1～ 2h，然后以5000转/分钟离心15分钟后弃上清液，取残渣烘干。以茶叶籽粕和体积浓度 95%的乙醇水溶液为1g：15ml～1g：25ml的比例，向脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓 度95%的乙醇水溶液，在40～50℃下提取30～40min，然后以12000转/分钟离心20分 钟后，得到滤渣和提取液。
步骤B：以步骤A得到的滤渣和缓冲液为1g：20ml～1g：30ml的比例，向步骤A 得到的滤渣中加入缓冲液，在40～60℃下浸提2～3h，再用频率为150～250W的超声 提取10～20min后，以12000转/分钟离心20分钟，得到提取液。所述缓冲液为PH是 7～9，且含占脱脂后茶叶籽粕干重3～5%的碱性蛋白酶的缓冲液，所述碱性蛋白酶的活 力不小于20000U/g，缓冲液优选磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。
步骤C：将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/15，然后以浓缩后的 提取液和氯仿的体积比为1：1的比例，向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取，得到 萃余液；
步骤D：将步骤B得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5～1/7，过D101大孔树脂 进行柱层析，用体积浓度分别为20％、60％和100％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱流 速为1ml/min，收集60%乙醇洗脱液；
步骤E：将步骤C中得到的萃余液和步骤D中得到的60%乙醇洗脱液混合，浓缩 后冷冻干燥，即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。
下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式 限制本发明。
实施例1
步骤A：将茶叶籽粕预处理，预处理方法是将茶叶籽粕粉碎，然后过40目筛；茶 叶籽粕预处理后进行脱脂，脱脂方法是：按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为1g：10ml 的比例，向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷，在30℃下浸提2h，然后5000转/分钟， 离心15分钟后弃上清液，取残渣烘干；以茶叶籽粕和体积浓度95%的乙醇为1g：15mlml 的比例，向20g脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇，在40℃下提取40min， 然后12000转/分钟，离心20分钟后，得到滤渣和提取液；
步骤B：以步骤A得到的滤渣和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为1g：20ml的比例， 向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，在40℃下浸提3h，再用频 率为150W的超声提取20min后，12000转/分钟，离心20分钟，得到提取液；所述磷 酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为PH是7，且含占脱脂后茶叶籽粕干重3%的碱性蛋白酶 的缓冲液，所述碱性蛋白酶的活力不小于20000U/g；
步骤C：将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5，然后以浓缩后的提取液 和氯仿的体积比为1：1的比例，向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B得到的提取液真空浓缩到原体积的1/5，过D101大孔树脂进行 柱层析，用体积浓度分别为20％、60％和100％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为 1ml/min，收集60%乙醇洗脱液；
步骤E：将步骤C中得到的萃余液和步骤D中得到的60%乙醇洗脱液混合，浓缩 后冷冻干燥，即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂0.72g，得率为3.6%（占脱脂后 茶叶籽粕干重）。
实施例2
步骤A：将茶叶籽粕预处理，预处理方法是将茶叶籽粕粉碎，然后过50目筛；茶 叶籽粕预处理后进行脱脂，脱脂方法是：按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为1g：15ml 的比例，向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷，在40℃下浸提1.5h，然后5000转/分钟， 离心15分钟后弃上清液，取残渣烘干；以茶叶籽粕和体积浓度95%的乙醇为1g：20ml 的比例，向20g脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇，在45℃下提取35min， 然后12000转/分钟，离心20分钟后，得到滤渣和提取液；
步骤B：以步骤A得到的滤渣和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为1g：25ml的比例， 向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，在50℃下浸提2.5h，再用 频率为200W的超声提取15min后，12000转/分钟，离心20分钟，得到提取液；所述 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为PH是8，且含占脱脂后茶叶籽粕干重4%的碱性蛋白 酶的缓冲液，所述碱性蛋白酶的活力不小于20000U/g；
步骤C：将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/10，然后以浓缩后的提取液 和氯仿的体积比为1：1的比例，向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B得到的提取液真空浓缩到原体积的1/6，过D101大孔树脂进行 柱层析，用体积浓度分别为20％、60％和100％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为 1ml/min，收集60%乙醇洗脱液；
步骤E：将步骤C中得到的萃余液和步骤D中得到的60%乙醇洗脱液混合，浓缩 后冷冻干燥，即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂0.86g，得率为4.3%（占脱脂后 茶叶籽粕干重）。
实施例3
步骤A：将茶叶籽粕预处理，预处理方法是将茶叶籽粕粉碎，然后过60目筛；茶 叶籽粕预处理后进行脱脂，脱脂方法是：按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为1g：20ml 的比例，向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷，在50℃下浸提1h，然后5000转/分钟， 离心15分钟后弃上清液，取残渣烘干；以茶叶籽粕和体积浓度95%的乙醇为1g：25ml 的比例，向20g脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇，在50℃下提取30min， 然后12000转/分钟，离心20分钟后，得到滤渣和提取液；
步骤B：以步骤A得到的滤渣和磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为1g：30ml的比例， 向步骤A得到的滤渣中加入磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，在60℃下浸提2h，再用频 率为250W的超声提取10min后，12000转/分钟，离心20分钟，得到提取液；所述磷 酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为PH是9，且含占脱脂后茶叶籽粕干重5%的碱性蛋白酶 的缓冲液，所述碱性蛋白酶的活力不小于20000U/g；
步骤C：将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/15，然后以浓缩后的提取液 和氯仿的体积比为1：1的比例，向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取，得到萃余液；
步骤D：将步骤B得到的提取液真空浓缩到原体积的1/7，过D101大孔树脂进行 柱层析，用体积浓度分别为20％、60％和100％的乙醇溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为 1ml/min，收集60%乙醇洗脱液；
步骤E：将步骤C中得到的萃余液和步骤D中得到的60%乙醇洗脱液混合，浓缩 后冷冻干燥，即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂0.98g，得率为4.9%（占脱脂后 茶叶籽粕干重）。
将上述3个实施例的酪氨酸酶抑制剂进行酪氨酸酶抑制效果验证：将从茶叶籽粕中 提取酪氨酸酶抑制剂溶解于蒸馏水中，取100μl上述溶液，加入PH为6.8的磷酸盐缓 冲液56μl与2.0mmol/L的酪氨酸溶液94μl，待混合均匀后，在冰浴中迅速加入酪氨酸 酶溶液50μl(50U)，在37℃中温育10min，于490nm处测定吸光度。
酪氨酸酶抑制率计算如下：
酪氨酸酶抑制率(%)=[(a-b)-(c-d)]/[a-b]×100％
a：未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度；
b：未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度；
c：加提取物和酶的混合液所测的吸光度；
d：加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。
如图1所示，从实验数据可以看出，应用本发明技术从茶叶籽粕中提取的酪氨酸酶 抑制剂对酪氨酸酶具有显著的抑制作用，并且呈现剂量依赖效应，可以应用于美容祛斑 等药物和保健品开发，以及果蔬护色保鲜等领域。