维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用.pdf

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1、10申请公布号CN104232502A43申请公布日20141224CN104232502A21申请号201410080745322申请日20140306CGMCCNO723120130130C12N1/20200601C12N15/74200601A61K39/02200601A61P31/04200601C12R1/0120060171申请人北京市水产科学研究所地址100068北京市丰台区角门路18号72发明人姜娜马志宏邢薇李铁梁罗琳74专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司11006代理人梁挥祁建国54发明名称维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用57摘要本发明公开了一种维罗纳气单胞。

2、菌菌蜕、其制备方法及其在疫苗制备中的用途。所述菌蜕由裂解基因E表达盒裂解维罗纳气单胞菌而形成，具有完整的外膜结构，制备维罗纳气单胞菌菌蜕时裂解效率较高，达到999996。免疫鱼体时，所述菌蜕无需佐剂即能诱导机体产生保护性抗体，可保护鱼体免受致病性维罗纳气单胞菌活菌株的攻击，与灭活疫苗相比具有更高的保护性。83生物保藏信息51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表1页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表1页附图3页10申请公布号CN104232502ACN104232502A1/1页21一种维罗纳气单胞菌菌蜕，所述菌蜕是由裂解基因E在维罗纳气单。

3、胞菌中的诱导表达而形成的完整细菌空壳。2根据权利要求1所述的维罗纳气单胞菌菌蜕，其特征在于，所述维罗纳气单胞菌为保藏编号CGMCCNO7231的维罗纳气单胞菌CL0901。3根据权利要求1所述的维罗纳气单胞菌菌蜕，其特征在于，所述裂解基因E有效地连接到质粒PBBR1MCS2上得到质粒PBBR1MCS2E。4一种制备维罗纳气单胞菌菌蜕的方法，所述方法包括以下步骤1构建有效地连接有裂解基因E表达盒的重组质粒PBBR1MCS2E；2将重组质粒PBBR1MCS2E电转化大肠杆菌S171菌株的感受态细胞；3以含重组质粒PBBR1MCS2E的大肠杆菌S171菌株转化维罗纳气单胞菌；4培养转化有重组质粒PB。

4、BR1MCS2E的重组维罗纳气单胞菌，在42诱导裂解基因E的表达；和5诱导表达后1216小时，收集菌蜕。5根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述维罗纳气单胞菌为保藏编号CGMCCNO7231的维罗纳气单胞菌CL0901。6根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2所使用的转化方法为接合转化。7一种注射制剂，含有权利要求13中任一项所述的维罗纳气单胞菌菌蜕，或根据权利要求46中任一项的方法所获得的维罗纳气单胞菌菌蜕，和磷酸盐缓冲液。8根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述制剂的给药方式为腹腔注射。9一种用于鱼类的疫苗，含有权利要求13中任一项所述的维罗纳气单胞菌菌蜕，或根据权利要求46。

5、中任一项的方法所获得的维罗纳气单胞菌菌蜕。10根据权利要求9所述的疫苗，其中所述鱼类包括锦鲤和鲟鱼。权利要求书CN104232502A1/6页3维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法及应用技术领域0001本发明属于分子生物学和免疫学领域，具体地，涉及一种维罗纳气单胞菌菌蜕、其制备方法以及其应用。背景技术0002细菌菌蜕（BACTERIALGHOST，BG）是革兰氏阴性细菌被噬菌体PHIX174裂解基因E的产物裂解后形成的完整细菌空壳。噬菌体PHIX174的裂解基因E编码具有91个氨基酸的疏水蛋白，它能够在革兰氏阴性细菌的细胞膜上形成一个直径约为40200NM的特异性的跨膜孔道，在渗透压的作用下使革兰氏。

6、阴性细菌的胞质内容物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳。经电子显微镜观察，该特异性的跨膜孔道并不是在细胞膜上随机分布，而是仅限于细胞的中央和两端。而这种灭活过程不会引起细菌表面结构的任何物理化学变化，其内外膜结构也保存良好。0003菌蜕的生产是通过对裂解基因E的严格表达调控实现的。PHIX174的裂解基因E受控于多个表达系统，如温敏的启动子及其调控基因PL/PRCI857系统，或某些化学诱导性启动子LACPOLACIQ，或TOL等表达系统，其中应用最多的是在PL/PRCI857转录控制下实现E基因的可控表达。0004实验证实，除大肠杆菌外，很多革兰氏阴性细菌均能在裂解基因。

7、E的作用下产生菌蜕，如鼠伤寒沙门氏菌（SALMONELLATYPHIMURIUM），胸膜肺炎放线杆菌（ANTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAE），霍乱弧菌（VIBRIOCHOLERAE），溶血性巴氏杆菌（PASTEURALLAHAEMOLYTICA），多杀性巴氏杆菌（PASTEUELLAMULTOCIDA），幽门螺杆菌（HELICOBACTERPYLORI），肺炎克雷伯氏菌（KLEBSIELLAPNEUMONIA）等。0005由于制备菌蜕的过程中无需像制备灭活疫苗那样添加甲醛等化学物质，也无需高温物理灭活，因此细胞壁在很大程度上被完整地保存下来。细菌菌蜕可以作为一种很好的疫。

8、苗，因为其保留了活菌状态下的包膜结构和相关的抗原蛋白，如脂多糖、肽聚糖和菌毛等，从而能有效地被抗原呈递细胞（APCS）吞噬、加工和呈递。目前已知菌蜕可通过腹腔注射、肌肉注射、鼻饲、皮下、口服等途径免疫小鼠、兔子和猪等动物，并取得了良好的免疫效果。KATINGERA等人用胸膜肺炎放线杆菌（ACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAE，APP）菌蜕制成气雾剂来免疫猪，可诱导产生特异性黏膜免疫应答，完全抵抗由该种病原菌引起的胸膜炎，并且安全性很好（KATINGERA,ETA1PIGSAEROGENOUSLYIMMUNIZEDWITHGENETICALLYINACTIVATEDGHOS。

9、TSORIRRADIATEDACTINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAEAREPROTECTEDAGAINSTAHOMOLOGOUSAEROSOLCHALLENGEDESPITEDIFFERINGINPULMONARYRECOMBICELLULARANDANTIBODYRESPONSESJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,1999,7323251260）。HENSEL等人还将福尔马林灭活的APP和APPBG经肌肉注射免疫猪，两组均能对相关的临床疾病起到完全防护作用，然而，只有菌蜕组对携带者有防护作用，可以防止疾病在猪群中的传播。幽门螺杆菌（HELICOBACTERP。

10、YLORI）菌蜕疫苗口服免疫小鼠后，在没有使用佐剂的情况下，其中一组的10只小鼠均得到了保护，说明书CN104232502A2/6页4另外一组10只小鼠中的5只得到了保护；当菌蜕和霍乱毒素共同使用免疫时，保护率达到了100。嗜水气单胞菌（AEROMONASHYDROPHILA）菌蜕经口服免疫银鲫，菌蜕组和甲醛灭活组均产生了保护作用，保护率分别为7895和579，显示菌蜕疫苗比普通灭活疫苗能更有效地激活鱼体的免疫保护反应（HENSELA,HUTERV,KATINGERA,ETA1INTRAMUSCULARIMNUNIZATIONWITHGENETICALLYINACTIVATEDGHOSTSAC。

11、TINOBACILLUSPLEUROPNEUMONIAESEROTYPE9PROTECTSPIGSAGAINSTHOMOLOGOUSAEROSOLCHALLENGEANDPREVENTSCARRIERSTATEJVACCINE,2000,182629452955）。0006维罗纳气单胞菌（AEROMONASVERONII）隶属于弧菌科（VIBRIONACEAEVERON）气单胞菌属（AEROMONAS），是一类革兰氏阴性杆菌，普遍存在于淡水、污水、淤泥及土壤中。维罗纳气单胞菌可致水产动物的病害，如引起丁鱼岁溃疡病、中华鳖穿孔病、腐皮病、口咽腔溃烂综合症、斑点叉尾鮰急性死亡、中华绒螯蟹细菌感染等。

12、疾病。0007目前，鱼类病害的防治方法主要是内服传统兽用抗生素和外用化学消毒剂。抗生素和消毒剂的长期使用和滥用，不仅会导致鱼类病原菌产生越来越多的耐药菌株，而且还会造成鱼体药物残留、水环境污染、影响生态环境的平衡等一系列问题。因此，作为有效解决农产品质量安全问题的一个重要途径，研制安全有效、无公害的渔用疫苗来有针对性地预防鱼类体表溃疡病和暴发性细菌病已是迫在眉睫。发明内容0008本发明提供了一种维罗纳气单胞菌菌蜕，所述菌蜕是由裂解基因E在维罗纳气单胞菌中的诱导表达产物使宿主细胞裂解，而形成的完整细菌空壳。0009在一个优选的技术方案中，所述维罗纳气单胞菌为鱼类致病性维罗纳气单胞菌CL0901（。

13、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNO7231）。0010在一个优选的技术方案中，所述裂解基因E有效地连接到质粒PBBR1MCS2中，得到质粒PBBR1MCS2E。0011本发明还提供了一种制备维罗纳气单胞菌菌蜕的方法，所述方法包括以下步骤00121）基于质粒PBBR1MCS2构建含有裂解基因E表达盒的重组质粒PBBR1MCS2E；00132）将重组质粒PBBR1MCS2E电转化大肠杆菌S171菌株的感受态细胞；00142）以含重组质粒PBBR1MCS2E的大肠杆菌S171菌株转化维罗纳气单胞菌；00153）培养转化有重组质粒PBBR1MCS2E的重组维罗纳气单胞菌，在42。

14、诱导裂解基因E的表达；和00164）诱导表达后1216小时，收集菌蜕。0017在一个优选的技术方案中，所述维罗纳气单胞菌为鱼类致病性维罗纳气单胞菌CL0901。0018根据本发明，所述转化方法是本领域技术人员公知的。在一个优选的技术方案中，步骤2）所使用的转化方法为接合转化。0019本发明还提供了一种注射制剂，含有维罗纳气单胞菌菌蜕和磷酸盐缓冲液。0020在一个优选的技术方案中，所述制剂的给药方式为腹腔注射。0021根据本发明，所述制剂可应用于鱼类，在一个优选的技术方案中所述鱼类包括锦鲤和鲟鱼。说明书CN104232502A3/6页50022在一个优选的技术方案中，所述制剂的给药剂量为4851。

15、107CFU/条鱼。0023本发明还提供了一种用于鱼类的疫苗，含有维罗纳气单胞菌菌蜕。0024在一个优选的技术方案中，所述鱼类包括锦鲤和鲟鱼。0025本发明所公开的裂解质粒PBBR1MCS2E是基于质粒载体PBBR1MCS2构建而成的，本发明的方法在制备维罗纳气单胞菌菌蜕时裂解率较高，可高达999996。0026本发明所公开的维罗纳气单胞菌菌蜕，通过形态学观察，具有典型的菌蜕特征，有效地保留了其外膜结构，大部分的胞内核酸等物质被释放，降低了回复突变的可能性。0027本发明所公开的菌蜕制备工艺简单易行、成本低、时间短，与传统的活菌疫苗和灭活疫苗制备相比，都具有一定的经济性。0028经鱼体免疫实验。

16、证实，维罗纳气单胞菌菌蜕副作用小、安全性高，可诱导产生保护性抗体，保护鱼体免受强剂量维罗纳气单胞菌致病株的攻击。附图说明0029图1示出裂解基因E盒的序列；0030图2示出表达E基于的重组维罗纳气单胞菌PCR鉴定结果；0031图3A示出维罗纳气单胞菌菌蜕的透射电镜结果；0032图3B示出维罗纳气单胞菌菌蜕的扫描电镜结果；和0033图4示出血清凝集效价结果。具体实施方式0034下面结合具体实施例来进一步描述本发明，使得本发明的优点和特点更为显而易见。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案的形式。

17、和细节进行各种修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。0035试验材料00361、菌株及质粒0037维罗纳气单胞菌（AEROMONASVERONII）CL0901株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京，保藏编号CGMCCNO7231，2013年1月30日），为鱼类致病性维罗纳气单胞菌病原株。0038大肠杆菌ECOLIS171株（中国普通微生物菌种保藏管理中心，北京，保藏编号CGMCCNO8863，2013年2月26日），为接合转化供体菌株。0039质粒PBBR1MCS2E，带有裂解基因E表达盒。所述质粒PBBR1MCS2E的温敏表达系统为PL/PRCI857控制系统。

18、。0040裂解质粒PACYCLYSIS张瑞平,ETAL利用展示尿素酶B表位的大肠杆菌菌蜕递送幽门螺杆菌核酸疫苗生物化学生物物理进展2011,386536542。00412、仪器和试剂0042核酸电泳仪（BIORAD，POWERPACBASIC），PCR扩增仪（BIORAD，MYCYCLERTHERMALCYCLER），分光光度计（BIORAD，SMARTSPECPLUSSPECTROPHOTOMETER），台式高速冷冻离心机（SIGMA，115K），台式高速离心机（SIGMA，MICROCENTRIFUGE），电子天平（余姚市金诺天说明书CN104232502A4/6页6平仪器有限公司，TD）。

19、，电穿孔基因导入仪（东胜创新生物科技有限公司，ECM630），透射电子显微镜（HITACHI，H7650）。0043主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物（碧迪医疗器械有限公司），T4DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司），限制性内切酶（NEB公司，北京），小提质粒提取试剂盒、TAQPCRMASTERMIX（天根生化科技（北京）有限公司），PCR产物纯化试剂盒、PCR产物胶纯化回收试剂盒（PROMEGA公司）。0044引物合成及DNA测序服务由北京六合华大基因科技股份有限公司提供。0045实施例1维罗纳气单胞菌菌蜕的制备、鉴定004611质粒PBBR1MCS2E的构建0047以大肠杆菌裂解质粒载体PAC。

20、YCLYSIS为模板，以LYSIS5CGGGATCCTCAGCCAAACGTCTCTTCAG和LYSIS5CGGGATCCTCACTCCTTCCGCACGTAAT为引物，进行PCR扩增，得到裂解基因E的表达盒（序列见图1）。将裂解基因E表达盒纯化后，用T4DNA连接酶与经BAMHI单酶切消化的PBBR1MCS2载体（参见MICHAELEKOVACHET,ALGENE,1661995175176）相连接，转化ECOLIDH5的CACL2感受态细胞，涂布含50G/ML卡那霉素的LB平板，30倒置培养一天，挑取阳性克隆测序，将测序正确的载体命名为PBBR1MCS2E。0048ECOLIS171电转化。

21、感受态细胞的制备将大肠杆菌ECOLIS171接种于3MLLB培养基中，30振荡培养至OD600为03504；将培养物在冰中静置15MIN，然后4、13000G离心1MIN，小心弃去上清；加无菌纯净水洗1遍；加10甘油（去离子水配制）清洗2遍；用10甘油重悬菌体，每管分装成48L。0049电转化操作方法将2L鉴定正确的质粒PBBR1MCS2E与48L感受态细胞混合后，冰上放置35MIN，注入预冷的01CM电极杯（BIORAD）中，将电穿孔基因导入仪调至电压18KV、电容25F、电阻200进行电转化。电击完成后，迅速加入1ML预冷的LB培养基，将电击液转移到15ML无菌EP管中，28、150RPM。

22、复苏培养2H；涂布于含50G/ML卡那霉素的LB平板上，28倒置培养。005012质粒PBBR1MCS2E接合转化维罗纳气单胞菌CL0901株0051以含PBBR1MCS2E的ECOLIS171作为供体菌，以维罗纳气单胞菌CL0901作为受体菌，将两种菌混合，在28下温育1小时，将细胞悬液稀释后涂布于含100G/ML氨苄青霉素和50G/ML卡那霉素的双抗LB平板上，28倒置培养。转化子通过菌落PCR鉴定，结果见图2。0052实验结果PCR扩增转化后的重组维罗纳气单胞菌CL0901（PBBR1MCS2E）株，1琼脂糖电泳检测，条带大小正确，说明质粒PBBR1MCS2E已成功转入维罗纳气单胞菌CL。

23、0901株中。在图2中，第一泳道为分子量标记MARKERIII，第二、三、四泳道为重组克隆，第五泳道为阳性对照。005313维罗纳气单胞菌菌蜕的制备及裂解效率测定0054将鉴定正确的重组维罗纳气单胞菌CL0901（PBBR1MCS2E）株于28培养至OD600为0406左右，将培养物分为两组，一组将培养温度迅速升高到42诱导裂解基因E的表达，另一组将培养温度维持在28，继续培养约1216小时，稀释涂平板菌落计数，计算裂解率。0055另一方面，将鉴定正确的重组维罗纳气单胞菌CL0901（PBBR1MCS2E）株在28扩说明书CN104232502A5/6页7大培养至OD600为0406左右，42。

24、诱导裂解基因E的表达，诱导约1216小时后，收集裂解液。离心收集菌体。PBS洗涤后4保存，用于后续实验0056实验结果菌落计数结果显示，重组维罗纳气单胞菌CL0901（PBBR1MCS2E）株的裂解效率高达999996。005714维罗纳气单胞菌菌蜕的电镜观察0058取维罗纳气单胞菌CL0901株菌蜕细胞经PBS洗涤3次；用25戊二醛2多聚甲醛（01MOL/L二甲砷酸钠缓冲液配制）于4固定2H，离心后清洗；用01MOL/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次；用1锇酸固定液室温固定2H，蒸馏水漂洗3次；乙醇逐级脱水；环氧丙烷置换2次，包埋剂浸透，包埋聚合；用醋酸双氧铀染色20MIN，蒸馏水冲洗干净后晾干，。

25、柠檬酸铅染色5MIN，晾干后透射电镜下观察、照相（图3A）。0059取维罗纳气单胞菌CL0901株菌蜕细胞经PBS洗涤3次；用25戊二醛2的多聚甲醛（01MOL/L二甲砷酸钠缓冲液配制）于4固定2H；离心有清洗；用01MOL/L二甲砷酸钠缓冲液清洗3次；用吸管滴一滴于盖玻片上，待样品自然晾干后用1的饿酸4固定2H；蒸馏水清洗2次；乙醇逐级脱水；醋酸异戊酯置换；六甲基二硅胺烷干燥10MIN；离子溅射镀膜，喷金仪喷金200S；扫描电镜下观察、照相（图3B）。0060实验结果绝大多数维罗纳气单胞菌被裂解为菌蜕，内部形成可见的空腔，并能看到溶菌孔道，直径为200400NM之间。菌蜕保留了完整的细菌外膜。

26、，但因为胞内物质被释放，细菌发生明显皱缩。0061实施例2维罗纳气单胞菌菌蜕的免疫效果0062将维罗纳气单胞菌菌蜕通过腹腔注射免疫锦鲤，并对菌蜕诱导的免疫保护进行分析。006321实验动物及方法0064健康锦鲤，体重35G，购自北京市黑庄户渔场。在水温为（241）的水族箱内充氧饲养。观察7天，证实无病后，用于试验。0065设对照组、甲醛灭活疫苗组和菌蜕组，每组三个重复，每个重复放27尾鱼。挑CL0901株（对照）和CL0901（PBBR1MCS2E）株单菌落分别接种于3ML无抗和AMP、KAN双抗的LB液体培养基中，28200/MIN摇床过夜培养；次日，分别转接于100ML无抗和AMP、KAN。

27、双抗的LB液体培养基中，28200/MIN摇床培养至OD600为0406时，CL0901株加入甲醛灭活，CL0901（PBBR1MCS2E）株迅速升温至42，诱导裂解基因E的表达，诱导1216H。用无菌磷酸缓冲液PBS稀释成75107CFU/ML菌悬液，以制备灭活疫苗。分别在第0、2、4周时，以02ML/尾腹腔注射锦鲤进行免疫，共免疫三次。006622全菌凝集试验0067分别在第1、2、3、4、5、6周进行尾静脉采血，分离血清，70保存备用。0068在96孔U型微量血凝板上，将被测血清用无菌PBS做倍比稀释至第8管，每孔含稀释血清50L，然后向每孔加入50L抗原（甲醛灭活的CL0901菌体浓度。

28、为107CFU/ML），将血清板振荡混匀，于37静置过夜。分别在2H及第二天上午进行观察若微量血凝板U型底部出现菌体沉积、边缘模糊化则判定为阳性反应；若U型底部出现轮廓清晰的圆形沉积物则判定为阴性反应。呈明显阳性反应的最高稀释度为该血清的效价。0069实验结果说明书CN104232502A6/6页80070随着加强免疫次数的增加，菌蜕组的凝集效价逐渐增高；在注射免疫后第5周时，菌蜕组全菌凝集效价出现峰值，最高的个体血清凝集效价高达128；并且，血清效价的升高可持续一段时间，例如第三次免疫两周后，即第6周时，血清凝集效价仍保持在125以上（图4）。与菌蜕组相比，甲醛灭活组的凝集效价明显低，最高值。

29、出现在免疫后第4周，约123，从第3周到第6周，血清凝集效价变化不大。对照组的效价基本为0。007123攻击试验0072在锦鲤注射菌蜕疫苗第5周，用128107CFU/ML维罗纳气单胞菌CL0901株菌悬液对三个大组的锦鲤进行背鳍基部注射攻毒，每尾注射剂量为0203ML，每组设三个重复，每个重复15尾鱼。连续观察14天并记录其发病及死亡情况，根据公式计算免疫保护率（RPS），RPS（1免疫组死亡数/对照组死亡数）100。0073试验结果菌蜕组的存活率为978，免疫保护率为75，高于甲醛灭活组（25）。0074结论菌蜕组的鱼血清凝集效价可达125以上，甲醛灭活组的最高值仅为123，说明菌蜕刺激鱼体产生致病菌特异性抗体的能力显著优于甲醛灭活菌。不同疫苗免疫的鱼在受到致病性维罗纳气单胞菌攻击后，免疫保护率有显著差异，其中菌蜕组RPS最高，说明免疫菌蜕的鱼对于致病菌的攻击具有很好的保护作用。0075本发明的维罗纳气单胞菌菌蜕也可应用于鲟鱼的维氏气单胞菌病的预防。说明书CN104232502A1/1页90001序列表CN104232502A1/3页10图1图2说明书附图CN104232502A102/3页11图3A说明书附图CN104232502A113/3页12图3B图4说明书附图CN104232502A12。