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一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌及其生产方法
    本发明涉及生产超氧化物歧化酶(SOD)的新菌株筛选及其生产工艺，是对申请号91108549.1的改进和提高。

    本发明专利申请人于91年9月2日申请的发明名称为《利用芽孢杆菌生产超氧化物歧化酶的方法》，专利申请号91108549.1申请人在试验研究过程中，发现该申请利用的芽孢杆菌CGMCC 0137菌株SOD含量低，且筛选方法陈旧，其生产工艺环节多，时间长，酶的损失大，产出率低。

    本发明的目的是：对芽孢杆菌进行诱变处理，从中筛选SOD酶含量高的新菌株，并且简化提取分离生产工艺，从而达到降低成本，提高SOD酶产量的目的。

    本发明的特征在于：一种产生超氧化物歧化酶的芽孢杆菌菌株，该菌株分类为芽孢杆菌Bacillus cereus，保藏号为：CGMCC NO.0175，菌种编号为：M-22，保藏日为：1992年6月18日，芽孢杆菌经诱变处理获得菌株(保藏号CGM CCV0175)，菌种扩大培养，发酵菌液，间歇通气，渗透压破碎，经30％和90％硫酸铵沉淀，Sephadex G-25脱盐，分离，提取工艺。

    (一)高SOD含量菌株的筛选：

    按91108549.1专利申请说明书第4页所示方法筛选的菌株SOD含量不高，为此，采用了诱变的方法筛选到SOD含量为0.420mg/g菌的新菌株，(保藏号CGMCC0175)。诱变方法如下：①将植物组织中分离得到的芽孢杆菌接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，在超净工作台上，用15W紫外灯距离20cm照射5分钟，于25-30℃培养18小时与对照相比仅5％菌存活，选择存活菌株单独培养，测定SOD的含量，选含量为0.420mg/g菌的菌株，保藏号为(CGMCC0175)。

    本发明菌株的生物学特性。

    芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株直杆状，链生，一般大小为1.0-1.2×3.0-5.0um，电镜下测量为0.9-1.2×2.0-4.0um。革兰式反应阳性。芽孢椭圆形，中生或近中生，不膨大。原生质中含量不着色颗粒。菌落圆形，稍隆起，无光泽，蜡质。可压氧生长，接触酶阳性，V-P反应阳性，V-P培养液PH为4.3-5.6。生长最高温度35-45℃，最低温度10-20℃，在溶菌酶0.001％中可生长，7％Nacl可生长，PH5.7生长，葡萄糖产酸，水解淀粉，利用柠檬酸，可还原NO₃为NO₂，可分解酪氨酸。

    (二)发酵方法：

    1、菌种活化：

    将高SOD含量菌株划线接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28-30℃培养24小时，然后配成孢子悬浮液。培养的时间不能超过24小时，因为此时处于芽孢杆菌培养的对数生长期，菌活力最高。

    2、发酵培养条件：

    ①发酵罐接种后培养时间不宜超过18-20小时，否则大量生成芽孢，难以破碎。使酶产量降低。

    ②发酵中，发酵通气量为1-2Vol/Vol/min，改连续通气为间歇通气，每通气2小时后，停止通气40-60分钟，从而诱导芽孢杆菌中SOD含量的提高。

    ③发酵液要求：

    发酵菌液含量为60亿/ml，培养18-20小时放罐，此时菌量达到最高而且很少芽孢生成。

    (三)菌细胞的破碎：

    由于所采用的菌株为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其细胞壁具蜡质，极难破碎，每升菌糊加入50mg溶菌酶，250W功率下超声波处理10分钟仍有30-40％菌未能破碎，因此，在经溶菌酶和超声波处理后，又采用渗透压破碎法。具体方法为：每克菌体加20ml，0.0005M EDTA、0.5M葡萄糖、0.03M PH8的Tris缓冲液于23℃下振荡10分钟，可使破碎率达95％以上。用渗透压破碎还可以减小溶菌酶的用量。

    (四)粗酶生产工艺

    粗酶生产工艺包括30％硫酸铵沉淀，90％硫酸铵沉淀和Sephadex G-100柱层析三步。

    1、30％硫酸铵沉淀：

    91108549.1专利申请说明书中沉淀浓度为55％，经反复试验，55％硫酸铵沉淀后的沉淀中有大量的酶损失，选择30％硫酸铵沉淀，SOD酶无损失，将粗提液加入30％硫酸铵后，搅拌时间为60分钟，静置2小时即可进行离心。

    2、90％硫酸铵沉淀：

    原专利中采用75％硫酸铵沉淀，上清液中仍有大量SOD酶活性，离心的上清液再加入90％硫酸铵沉淀SOD，则能使酶全部得以沉淀。

    3、Sephadex G-25脱盐：

    原专利申请说明书中脱去沉淀中的盐离子采用动态透析的方法，时间为24-48小时，现改为Sephadex G-25柱层析脱盐，仅需2-3小时，大大节约了时间，具体方法是：将经90％硫酸铵沉淀的酶样溶解在最小量的5mM PH7.8的磷酸缓冲液中，经Sephadex G-25柱层析，部分收集。G-25柱预先用5mMPH7.8的磷酸缓冲液充分平衡，用奈氏试剂检测收集脱盐的SOD酶液。

    4、Sephadex G-100柱层析：

    预先用5mM PH7.8磷酸缓冲液平衡Sephadex G-100柱，将脱盐后的粗酶液加到G-100柱中，全自动分步收集。将SOD活力好的部分收集。测SOD活力，同时用电泳检测纯度。

    5、粗酶制剂质量要求：

    粗酶提取液经Sephadex G-100以后，以活达1200以上，产率达65％，电泳检测主要为SOD酶带。

    (五)精制酶的生产工艺：参见：91108549.1专利申请说明书第8-9页。

    本发明与现有技术相比其优点在于：

    (1)菌株SOD含量高：

    通过诱变的方法得到的新菌株精制SOD的含量高达0.42mg/g菌，比原专利所用菌株0137高57％。

    (2)该菌株含有Cu、Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD，其中Cu、Zn-SOD占25％，Mn-SOD占40％，Fe-SOD占55％。

    (3)以该菌株提取的酶稳定性很高，在90℃下5分钟对活性没有影响，90℃，50分钟才完成失活：在PH3-9范围内活性皆不受影响。

    (4)本发明所创立的SOD提取工艺可以得到不同纯度的酶制剂，即可用于医药、兽药、作物抗逆增产，日用化妆品、保健饮料等，还可用于酶的性质，结构、氨基酸顺序测定等研究，具有广泛的开发应用前景。

    (5)该工艺流程简化，减少了损耗，且节约能源，降低了成本。

    (6)该菌株繁殖快，来源方便，低廉，适于工厂化生产。

    附图说明：

    图1：是高SOD含量的菌株选育图

    图2：生产SOD的发酵工艺流程图

    图3：SOD粗提液工艺流程图

    图4：SOD粗酶制剂生产工艺流程图

    图5：粗制SOD制剂生产工艺流程图

    实例：用100公斤芽孢杆菌菌糊生产8.6克SOD为例。

    1、从植物体组织中筛选出芽孢杆菌，在15W紫外光下，距20cm，诱变5分钟，得到SOD含量为0.42mg/g的蜡制芽孢杆菌株(Bacillus cereus)编号为M-22，保藏号CGMCC NO 0175，保藏日期：1992年6月18日。

    2、用15吨发酵罐生产发酵菌液14吨。将发酵罐先灭菌，装上培养液后再灭菌。灭菌采用高压蒸汽灭菌，即在121℃、压力0.5kg/cm²条件下，灭菌30分钟，发酵罐培养液灭菌搅拌速度250rpm。然后降温至28℃，按2％的接种量将种子罐发酵菌液接入发酵罐。发酵罐接种后，在30℃条件下培养24小时。通气量2Vols/Vol/min，氧气含量40％，间隔60分钟，通气2小时。

    发酵罐培养液配方为：牛肉汁0.5％，蛋白胨0.5％，Nacl0.5％，豆油0.5％，葡萄糖0.2％，淀粉0.4％，硫酸镁0.008％，磷酸二氢钾0.04％，碳酸钙0.5％，800UM的Cu、Zn、Mn、Fe，搅拌。PH值消毒前7.6，消毒后7.4。

    发酵菌液含菌量在每毫升60亿以上，芽孢成熟前放罐，PH值为7.5，无杂菌污染。

    3、将菌细胞离析。发酵罐菌液在控制流量400L/h注入离心机，离心机以4000rpm/min速度将菌细胞离析沉淀以菌糊自动流出，进入生理盐水糟，经三次洗涤，离心后收集到100公斤菌糊。

    4、将菌细胞破碎。按菌糊与缓冲液以1∶3体积比例加入50mM、PH7.8的磷酸钾缓冲液，搅拌成菌液。按每升菌糊加入50mg溶菌酶，在4℃低温条件下搅拌30分钟。用250W功率超声波细胞粉碎机在0-4℃低温条件下对菌液处理10分钟，每处理1分钟间隔50秒，超声波处理后对菌液镜检细胞破碎情况。视破碎率用渗透压法继续破碎，破碎率达95％以上。然后将菌液以4000rpm离心。收集到130kg上清液作为SOD的粗提液。

    5、提取粗酶：

    (1)30％硫酸铵沉淀。将粗提液加入硫酸铵，使粗提液中硫酸铵达到30％饱和度。在22℃下利用搅拌器搅拌60分钟，采用膜过滤系统过滤得到滤液。

    (2)90％硫酸铵沉淀。在30％硫酸铵沉淀后的滤液中，加入硫酸铵使其饱和度达到90％，在室温下利用搅拌器搅拌60分钟，离心13000rpm，将沉淀溶于最小量的5mM、PH7.8磷酸钾缓冲液中(内含2mM EDTA)，然后用上述缓冲液和SephadexG-25脱盐，得到10gkg粗酶提取液。

    (3)Sephadex G-100柱层析。Sephadex G-100柱，预先用PH7.8、5mM的磷酸钾缓冲液平衡；将脱盐后的粗酶提取液80kg加入到柱中，并用上述缓冲缓冲液洗脱。采用全自动分步收集系统收集洗脱液，合并SOD活力高的收集液部分。

    6、不同种类SOD的精制酶的制备：

    (1)Cu、Zn-SOD：将经Sephadex G-100柱层析后的粗酶液通过预选用PH7.8、5mM的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用上述0.005-0.3mM缓冲液梯度洗脱，将酶活力高的收集液合并，得到Cu、Zn-SOD纯酶液。将Cu、Zn-SOD纯酶液浓缩，冷冻干澡可得到Cu、Zn-SOD纯酶粉剂1.30克；

    (2)Mn-SOD：将上述经DE-52柱梯度洗脱前的淋洗液收集，加热到65℃，5分钟后置于低温下迅速冷却，依此重复3次，通过加压过滤分离出滤液，将滤液浓缩。

    将浓缩液通过用PH5.5、40mM的醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，并用PH5.5、0.04-0.20M的醋酸钾缓冲液进行梯度洗脱，同时进行收集，将酶活性高的收集液合并一起，得到Mn-SOD纯酶液，再经浓缩、冷冻干燥得到Mn-SOD纯酶粉3.44克。

    (3)Fe-SOD：将经90％饱和度的硫酸铵沉淀，并已脱盐的粗酶50kg通过预先用PH5.5、0.01M醋酸钾缓冲液平衡的CM-52柱，以上缓冲液洗脱，收集酶活力高的洗脱液，用PH7.8、50mM磷酸钾缓冲液透析。将透析液通过预先用PH7.8、5mM的磷酸钾缓冲液平衡的DE-52柱，用同样缓冲液洗柱，并以5-50mM、PH7.8的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，将符合纯酶标准的收集液混合，加硫酸铵使达到80％饱和度，再经过滤得到的为纯Fe-SOD，将过滤物用PH7.8、50mM磷酸钾缓冲液透析或通过加压过滤得到Fe-SOD纯酶液，再经浓缩、冷冻干燥得到Fe-SOD纯酶粉剂3.87克。

    共获得SOD纯酶粉剂8.6克。