技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备治疗艾滋病药物中的应用，具体是涉及毛莲菜提取物在制备治疗艾滋病药物中的应用。
背景技术
艾滋病是1981年发现的新病毒性传染病，中医过去对其未有记载。中医对艾滋病辨证，认为艾滋病属于疫病范畴。病因为疫毒热邪侵袭，正气虚弱而致。病机主要为卫外不固，阳气损伤，脏腑受累，引起肺虚脾虚肾虚，继发感染。热伤脉络，气血凝滞，形成癥积肿块肿瘤。
中医辨“证”：主要辨别邪正消长和虚证实证。艾滋病病毒为邪毒，邪毒入里而传变，与机体正气的邪正抗争的动态变化，为疾病的发展过程。感染早期以邪实为主，中期“因实致虚”，晚期“因虚致实”。艾滋病病情复制多变，艾滋病及其继发感染都可形成“病”，且有不同“型”和“期”。中医对艾滋病有辨证辨病，分型分期等不同诊治方案。
艾滋病的中医药治疗目前仍属于研究阶段，目前国内外尚未有公认疗效肯定被批准生产的抗艾滋病病毒中药或中药单体化合物。抗艾滋病病毒植物药和中药研究主要分3种途径，烟具获得的抗艾滋病病毒中药植物药及其成分，有些已在临床试用。
自艾滋病病毒发现以来，国际上用艾滋病病毒细胞培养和逆转录酶，蛋白酶和整合酶等体外实验方法，广泛筛选化合物的同时，也大量筛选植物和中草药提取物及其成分，也研究了一些中药复方制剂，发现在体外抑制艾滋病毒的有效药物，有的可抑制猴免疫缺陷病毒（SIV）感染猴的病毒血症。有些已在临床试用，尚未明确效果。
我国自1987年派中西医结合医疗队去非洲治疗艾滋病病人。国内在2002年以前，缺乏特效抗艾滋病病毒药物，中西医在临床根据中医理论，对艾滋病病人辨病与辨证相结合，以清热解毒，扶正固本，或凉血补肾，活血化瘀等治则，按中药性能，选择中药，处方治疗。通过临床实践，认为有些中药复方治疗艾滋病可改善症状，缓解病情。近年来对实验诊断确诊的艾滋病病人，采用中药治疗，设对照组，在治疗期间，定期检测血液病毒载量（HIV-RNA）和CD4细胞水平，评价效果。有报道可改善症状，提高免疫力，大多仍在临床验证中。进入临床的抗HIV单味中药或植物药及中药复方如下：
甘草甜素：甘草甜素（glycyrrhizin，GL）是中药甘草（Glycyrrhiza glabra L）提取的甘草皂苷，有广谱抗病毒作用，体外抑制HIV-1逆转录酶，在细胞培养内抑制HIV细胞融合，也抗流感病毒和SARS病毒，体内实验证明可保护流感病毒感染小鼠引起的肺炎死亡和肺病变；保护小鼠的CCl4中毒性肝损伤；诱生γ-干扰素；有类激素作用。日本常用其静脉点滴治疗慢性乙型肝炎，也曾试用治疗艾滋病病人，可抑制血清HIV-1-P24抗原，升高CD4细胞。吕维柏教授1988-1992年在非洲坦桑尼亚应用甘草甜素口服制剂克艾可治疗艾滋病病人可改善症状，CD4细胞略有上升。其效果尚未被验证。
天花粉蛋白：天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS，GLQ223，Q物质）为中药栝楼（Trichosanthes kirilowii）属葫芦科（Cucurbitaceae），我国民间用于流产的中药复方的主要中药成分为栝楼，我国科学家分离鉴定器抗早孕和引产的有效成分为天花粉蛋白，分子量为27kD，其一、二级结构和三维结构已完全弄清，为抑制蛋白合成的植物毒蛋白，是单链的核糖体失活蛋白（Ribosome Inactivating Protein, RIP）。美国在筛选抗HIV-1药物时，发现其在淋巴细胞培养内抑制HIV-1细胞融合，其后发现在单核巨噬细胞培养内HIV-1的P24抗原和RNA，在3只猴艾滋病病毒（SIV）感染猴静脉注射可抑制血浆HIV-1。美国在林场使用静脉点滴治疗艾滋病病人，可抑制外周血HIV-1感染的T淋巴细胞和单核巨噬细胞内HIV-1-P24抗原，使CD4/ CD8比例略有升高。由于可引起过敏性反应死亡，神经毒性的精神失常和肾毒性反应，临床实验已中止。近年来从天花粉中分离出其他蛋白TAP29，分子量在29 kD，也有抑制HIV-1的作用，但毒性较小，未在临床试用。此外苦瓜（MOmordica charantia）的苦瓜蛋白和商陆（Phytolacca americana）的商陆蛋白（Pokeweed protein）等都有抑制HIV的作用。
金丝桃素：植物贯叶金丝桃（St. John Wort, Hypericum perforatum）民间传统用其提取物治疗抑郁症，从花提出的活性成分是金丝桃素（hypericin），是芳香族多环二聚蒽醌类化合物，为抗抑郁症药物，已全合成。金丝桃素具有多种抗病毒活性，在细胞培养内抑制HIV，其作用机制为阻断病毒的脱衣，装配和释放，有杀病毒作用，可通过血脑屏障。在细胞培养内可抑制鼠白血病病毒繁殖。在体内可抑制鼠白血病病毒感染小鼠引起的脾肿大，也可抑制鸭乙型肝炎病毒感染鸭血请病毒DNA，并有广谱抗细菌活性。曾在临床I/II期试用治疗艾滋病患者，因有光敏感作用已停止试验。
右旋胡同素A：右旋胡同素A（+Calanolide A）是1992年报道从马来西亚热带雨林植物Calophyllum lanigerum 中分离的天然化合物，鼠香豆素类化合物，抑制HIV-1逆转录酶，但对HIV-2无效。属于非核苷类HIV-1逆转录酶抑制剂，在细胞培养内多对多住临床分离的AZT敏感和耐药HIV-1有效，并与AZT, NVP有协同作用。在HIV空纤维管小鼠体内实验模型（HIV hollow fiber mouse model）中证明有抗艾滋病病毒作用，与AZT联合应用可增强药效。已全合成，进行了I-II其临床试验证明有抑制HIV-1感染的治疗效果，毒性小，副作用轻，有头痛和食欲不振等，与AZT联合用药有效。是目前唯一进入II期临床实验的单一植物成分，正在观察验证疗效中，尚未批准生产。
小柴胡汤：小柴胡汤（柴胡，人参，半夏，黄芩，甘草，生姜，大枣）
是张仲景伤寒论方。日本用其治疗乙型肝炎，发现其在细胞培养内抑制HIV。美国在临床用于治疗数例艾滋病病人，可降低血清P24抗原。我们证明其有抑制HIV-1逆转录酶和在细胞培养内抑制HIV-1的作用。分别研究其7种成分中药的效果，发现仅黄芩水提物及其成分黄芩苷（baicalin）有抑制HIV-1作用，在体外无细胞系统中抑制HIV-1逆转录酶，在人T细胞和外周血单核细胞培养内抑制HIV-1细胞病变，病毒荧光抗原和P24抗原，体内鼠白血病病毒感染小鼠口服可抑制脾肿大和血白细胞升高。日本Ono报道黄芩苷元（baicalien）抑制HIV-1逆转录酶。
中研I号：中研I号（主药有紫花地丁，天花粉等组成）商品名为：艾
克冲剂，以清热解毒为治则，由我国中药研究院组方1992-1993年在非洲坦桑尼亚对早中期艾滋病临床应用，认为有一定改善症状，提高免疫力的效果。实验室证明该药体外抑制HIV逆转录酶活性，体内对猴艾滋病毒感染猴实验治疗结果表明，能降低血浆病毒滴度，并且能提高CD4细胞数目及CD4/CD8比值和T, B淋巴细胞数值，诱生干扰素和产生免疫调节功能。曾在非洲和我国临床试用，尚未批准临床验证。
中研2号：中研2号（黄芪，人参，当归，枸杞和甘草等）是我国中医
研究院医疗队组方。1992年在非洲坦桑尼亚治疗艾滋病病人。1998-1999年在非洲专科门诊对29例艾滋病病人治疗，2/16例HIV病毒载量下降，CD4 8/29例CD4升高。2001-2002年在北京佑安医院治疗15例艾滋病病人，3/15例病毒载量下降，CD4 1/15例CD4升高。有改善症状的效果。实验证明该药在人体内对猴艾滋病毒感染猴实验治疗表明，用药4-12周能降低血浆病毒滴度，P27抗原，并且能提高CD4细胞数目，对感染猴淋巴细胞有激活作用。
毛莲菜：为菊科植物毛莲菜（Picris japonica Thunb.）的干燥地上部分。夏、秋二季花开时采收，除去杂质，晒干。收载于1998年《中华人民共和国卫生部药品标准 蒙药分册》。性凉、糙，味苦。杀“粘”，止痛，清热，消肿，解毒。用于瘟疫，结喉，乳腺炎，胸刺痛，腮腺炎，阵刺痛。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关毛莲菜的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。现代研究表明，毛莲菜含有毛连菜苷（picriside）A、B、C，山莴苣素（lactucin），11β-13-二氢山莴苣素（11β-13-dihydrolactucin），假还阳参甙（caepidiaside）A及苦荬菜内酯（ixerin）F等，还含有多糖和黄酮类化合物，其他化学成分不详；药理作用研究表明，毛莲菜水提取，过D101大孔树脂，水洗脱部分具有降血糖，调节血脂作用。详见文献：席啸虎，葛睿，高建平。日本毛连菜水洗部位降血糖、调血脂作用研究，中国医药导报，2011,8（13）:34-36。其他药理作用未见报道。
国内专利检索结果，未见毛莲菜相关专利。
上述文献及专利等，尚未见毛莲菜或毛莲菜提取物用于制备治疗艾滋病药物的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供毛莲菜提取物的在制备治疗艾滋病药物中的应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明所用毛莲菜为菊科植物毛莲菜（Picris japonica Thunb.）的干燥地上部分。
本发明毛莲菜提取物是按如下方法制备得到:
（1）毛莲菜，用浓度50%-90%乙醇作为溶剂，在10℃-35℃温浸提取，提取次数为3-8次，每次提取时间为12～48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21-25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；
（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加10-20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，得到毛莲菜提取物B；
（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度10%-70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；
（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。
毛莲菜提取物的制备方法为:
（1）毛莲菜，用浓度55%乙醇作为溶剂，在25℃温浸提取，提取次数为5次，每次提取时间为24小时，每次溶剂用量为药材重量的23倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；
（2）将步骤（1）得到的提取物A加15倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A。将沉淀A，采用高速逆流色谱法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：3：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；
（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；
（4）上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。
本发明的毛莲菜提取物主要含有：中美菊素 C （Zaluzanin C）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素 C 3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzanin C 3-O-β-allopyranoside）；木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷；金丝桃素（hypericin）；共4主要成分。
本发明的毛莲菜提取物，可以通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的各种口服剂型。
本发明首次探索研究以菊科植物毛莲菜（Picris japonica Thunb.）的干燥地上部分为原料提取制备治疗艾滋病提取物。本实验研究表明，本发明的毛莲菜提取物可用于制备治疗艾滋病药物，在MAGI细胞中对HIV-1 IIIB毒株有明显抑制作用，浓度为50μg/ml时，抑制率90%以上；在MT4细胞中对HIV-1 IIIB毒株有明显的抑制作用，浓度为100μg/ml时，抑制率95%以上。
本发明的毛莲菜提取物与化学药或中药或天然药物组成治疗艾滋病药物。
具体实施方式
下面通过具体实验例和实施例对毛莲菜提取物在制备治疗艾滋病药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。
实施例1：毛莲菜提取物及单体化合物制备
（1）毛莲菜10kg，用浓度55%乙醇作为溶剂，在25℃温浸提取，提取次数为5次，每次提取时间为24小时，每次溶剂用量为药材重量的23倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩干燥，得毛莲菜提取物A；
（2）将步骤（1）得到的毛莲菜提取物A加15倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：3：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；
（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；
（4）上述毛莲菜提取物B和毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。
如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素 C （Zaluzanin C）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素 C 3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzanin C 3-O-β-allopyranoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。
如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实施例2：毛莲菜提取物及单体化合物制备
（1）毛莲菜5kg，用浓度50%乙醇作为溶剂，在35℃温浸提取，提取次数为3次，每次提取时间为12小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的21倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；
（2）将步骤（1）得到的提取物A加10倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；
（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度10%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集10%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；
（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C，其中一种或两种按一定比例混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。
如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素 C （Zaluzanin C）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素 C 3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzanin C 3-O-β-allopyranoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。
如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实施例3：毛莲菜提取物及单体化合物制备
（1）毛莲菜10kg，用浓度90%乙醇作为溶剂，在10℃温浸提取，提取次数为8次，每次提取时间为48小时，每次溶剂用量为毛莲菜重量的25倍；滤过，合并提取液，回收乙醇，浓缩，干燥，得毛莲菜提取物A；
（2）将步骤（1）得到的提取物A加20倍量水溶解，滤过，得药液A和沉淀A；将沉淀A，采用高速逆流色谱法(HSCCC)，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2：2：1：1)为溶剂系统，进行分离纯化，回收溶剂，浓缩干燥，即得到毛莲菜提取物B；
（3）将步骤（2）得到的药液A，通过聚酰胺柱柱，用水洗脱，再用浓度70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩干燥，即得毛莲菜提取物C；
（4）上述毛莲菜提取物B、毛莲菜提取物C混匀，即得本发明的毛莲菜提取物。
如上所述方法制备毛莲菜提取物B，再经200-300目硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（10:0.5-5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，丙酮-乙烷（1:2）重结晶，分别得到中美菊素 C （Zaluzanin C）；9α-羟基-11β,13-二氢中美菊素 C 3-O-β-吡喃别苷（9α-Hydroxy-11β,13-dihydrozaluzanin C 3-O-β-allopyranoside）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98.5%。
如上所述方法制备毛莲菜提取物C，再经200-300目硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱（100:1-2.5:1），薄层跟踪检测，合并相同流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，金丝桃素（hypericin）等成分，以上各化合物的化学结构均经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经高效液相色谱检测均大于98%。
实验例1：毛莲菜提取物抗HIV-1活性试验。
1.材料
细胞：MT-4细胞、MAGI test（Multinuclear Activation of Galactosidase Indicator）又称Single Life Cycle，所用细胞为Hela-CD4-LTR-β-gal。北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。
毒株：HIV-1 B北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。
药物：本发明实施例1、实施例2、实施例3所得毛莲菜提取物，编号为：毛莲菜提取物1、毛莲菜提取物2、毛莲菜提取物3。
2.毛莲菜提取物在MT4细胞中抗HIV-1B活性试验
离心收集500万MT-4细胞，加入lml含10000 TCID50 HIV-1 IIIB的RPMI 1640培养液，37℃ 、5% CO2孵箱中孵育2小时。1500rpm离心后，RPMI 1640培养液洗涤一次，离心，加入10ml RPMI 1640培养液重悬,96孔板每孔加入100 u1细胞病毒悬液(含5×104细胞/孔)。选用药物最高浓度为50μg/ml, 5倍比稀释4个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100u1(药物终浓度减半)。同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。于37℃ 、5% CO2孵箱中继续培养5天，期间，第3天更换药液。逐日观察细胞生长与形态变化。细胞对照组细胞生长状态良好，病毒对照组于培养后第3-4天出现合胞体。培养第5天，收获培养上清，以测定p24抗原的方法，检测培养上清p24抗原含量，以示病毒的增殖情况。将给药组与病毒对照组进行比较，以下列公式计算药物的抑制率:
抑制率=（病毒对照组p24含量－给药组p24含量）÷病毒对照组p24含量
以P24抗原检测法测定药物对HIV-1 IIIB毒株的抑制作用，结果见表1。以药物浓度的对数为横坐标，以对病毒的抑制率为纵坐标绘制曲线，利用直线回归方法计算回归任线，计算各样品对HIV-1 IIIB毒株的50%抑制病毒浓度(IC50)。
表1毛莲菜提取物在MT4细胞中对HIV-1 IIIB毒株的抑制作用。
3.毛莲菜提取物在MAGI细胞中的抗HIV-1 IIIB活性试验
MAGI test又称single life cycle，反应病毒在此细胞中仅进行一个周期的复制，病毒的复制是同步的，不同时段表示进入病毒生活史的某阶段，因此接种病毒后不同时段加入药物，观察药物对病毒复制周期的不同阶段的抑制作用，可以判定药物作用于病毒作用的阶段。所用细胞之一系由HeLa细胞系衍生而来。本法可以定量测定HIV的滴度，以计算药物对病毒的抑制率，发生的时相。
取一个96孔细胞培养板每孔接种0.6万细胞MAGI细胞。选用药物最高浓度为100μg/ml, 5倍比稀释5个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100 ul。同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。将各孔中培基吸出，病毒对照组和药物测试组中，每孔接种病毒液(2000 TCID50) 100 u1。在接种病毒的同时加入100u1上述稀释的药液(药物终浓度减半)。37℃ , 5%CO2孵育40-48h，固定，染色。倒置显微镜下计数蓝斑数目(见表2) 。
表2毛莲菜提取物在MAGI细胞中对HIV-1 IIIB毒株的抑制作用
结果显示：毛莲菜提取物的最高浓度对HIV-1 IIIB的抑制率可达到95%以上。