本发明涉及到一种生产特种细菌的工艺方法，即一种将梭菌转化成同步的具有特定长度的细胞或折光性的内生孢子的方法。该菌可用来生产产溶媒细胞、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白以及折光性的内生孢子梭菌属细菌的营养细胞，并可大量地转化成为特定长度的产溶媒细胞。 在诱导折光性内生孢子形成的过程中，可实现上述转化。更详细地说，在售有选择性的阻止细胞任意生长的、可缓慢代谢的碳源培养基中，再次培养使该菌在细胞数量和质量上可以同步化。同步化的细胞最少延长到营养细胞的三倍，此时，细胞就成为产溶媒的。通过在培养基中添加某一二价阳离子，其浓度不得少于0.01M左右，就可以稳定细胞在质量和数量上的同步化。如果要使细胞保持产生溶媒，必须通过化学或物理地方法使得细胞生长受到抑制。如果需要制备产生酶、抗生素或毒素蛋白的细胞，可通过抑制细胞分裂即DNA复制，细胞生长可限制在被选择的生长时期中而不进入产溶媒时期。
梭菌属的某些厌氧的、嗜热的、形成内生孢子的细菌的代谢产物，或者限于酶、抗生素、毒素蛋白，或者通过丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵局限于溶媒。该属这种特殊的能力主要归结于它们在遗传学上的多样性，只有在特殊的生理学上的条件下，内生孢子才有效的产生。内生孢子具有抵抗摧毁营养细胞的极端条件的能力，梭菌细胞在形态学上所表现出的改变与细胞酶活性的变化有关，根据培养条件，这些细菌在生长过程中或者能进入产酸时期，或者能进入产溶媒时期。这样，孢子形成过程的全面调控是商品化生产细胞代谢产物必须的先决条件。
梭菌属的某些种能够直接将廉价的生物废料，如木聚糖或其它的戊糖聚合体不经预先的产物降解就能转化成溶媒，依据某些梭菌是嗜热厌氧的事实，利用该属菌的工业发酵过程可以直接从发酵窗口中蒸馏。发酵产品的回收所需的能量就更省，真空回收产品也解决了溶媒对发酵细胞的毒害的问题，由于减少了产物在反映器里的残留时间，梭菌就具有高的反映率，因而终产物对细胞的比率也就提高了，总的生物反应也就提高到最大程度。除此之外，在嗜热系统中利用简单培养基和接种大量纯化的细胞，从而确保了反映系统更难于受到污染。因此，原材料的灭菌可以省去。
细菌发酵过程中所利用的最低廉且最丰富的原料，是含木质纤维素的生物原料，它具有三种主要的组成份：晶体纤维素，半纤维素和木质素，每种组成成份必须分别处理。用酸或酶做催化剂可将纤维素水解成葡萄糖，然而酸催化剂会继续降解反应产物葡萄糖，而且，酶处理还没有很好地发展起来，其经济效益不是很高。半纤维素大部分由木聚糖组成，容易水解但是利用发酵技术很难发酵成为乙醇。木质素不是糖的聚合物，因此不能发酵产生乙醇，但通过热化学的方法可把它转化为可利用的液体燃料添加剂。
在本世纪二十年代，就有人开始以甘蔗的糖蜜为原料利用厌氧丙酮丁醇梭菌来生产工业溶媒，然而获得的最佳溶媒产量只有1.87%左右，甚至这个产量因丙酮丁醇梭菌对噬菌体的敏感性而不稳定、不可靠。此项发明能够控制产品形成的产率和产量，并能够利用更廉价的木质纤维素为原料。在特别选择的形式下，该项发明利用梭菌属的嗜热微生物，正因为该微生物具有在高温下生长的能力，从而使得该发明的方法在节能上更有效。此外，嗜热梭菌不易受噬菌体的感染。
该项发明的作者之一，Edward J.Hsu在《孢子研究》的一章中描述了热解糖梭菌的同步化延长。该文由Academic Press出版（London、1976、PP.223～242），但是，文中没有提到在增殖的过程中，二价阳离子的存在能够使同步化生长的细胞稳定下来。
产生乙醇的热解糖梭菌的突变体，在美国专利NO.4，652，526中，由该项发明者之一Edwardsu描述过。该项专利没有提及到在生长基培养中的同步化生长的细胞在加入二价阳离子的条件下稳定下来。
Hartmanis在Applied Microbiology and Biotechnolgy、Vol.23（1986）、PP.369～371中描述了℃lostridium acetobutylium在含有大量二价阳离子的培养基中的重复再次培养。在起始培养体中含有少量的钙可阻止细胞在另有三次转接后的退化。这样添加℃a℃O3后，在多达十次的转接中不会发生退化。因此，添加钙就排除了为制备起始培养体而进行复杂的热休克处理的需要。然而，细胞在数量和有效质量上的同步化的生长不能产生大量的同源细胞群体。作者们描述了如下的过程：每次接种培养在有二十四小时以上的间隔就会产生抗热性的孢子，及在生长培养基中加入少量的钙就会提高孢子的抗热性。
Ishida等申请的美国专利No.4，778，760描述了少量的钙（4PPM）对稳定核菌网中产生某种热稳定的a-淀粉酶的嗜热厌氧细菌的效果。然而，钙不能做为生长培养基的组成份而被细菌细胞利用。
本发明的目的是用廉价饲料原料做为制备特殊的细胞的生长培养基，将梭菌属的细菌制备用来选择性地生产溶媒，诸如乙醇和丁醇，大大地提高其产量，并使溶媒回收率达到大约11%左右，并且可选择地生产酶或抗生素，在细胞制备的方法可选择地完全形成孢子的过程中进行，全部过程比以前的方法更为有效。
这种方法包括大量厌氧梭菌细胞在数量和质量上同步化生长到某一特定长度。细胞在分批培养中以廉价的碳源培养基生长，产生的同步细胞是处于分裂循环中的相同时期，细胞个体和它所代表的过程被称为“准备状态”，根据所需要的终产物，细胞可以被收获并储存起来，即上述过程通过加入二价离子来稳定细胞而使其继续下去，从而在细胞浓度达到109时抑制细胞的生长。产生的细菌能继续代谢一段长的时期。
可以从这种细胞中分离的最终代谢产物包括溶媒，分解糖类的酶、蛋白酶、脂酶、核酸酶、抗生素、不规则状蛋白质晶体，以及其它的毒素蛋白，例如像用做有机钉虫剂那样的毒素蛋白。
选择性的生长培养型是某种微生物特殊的基础培养基，含有大约0.1～15%（w/v）的慢代谢碳源基质。细菌在这种培养基中的生长率应比它在最适培养基中所表现的最大生长率Km小10～90%。更可取的碳源是戊糖聚全物如木聚糖，这种糖能很方便地从小麦杆、稻草、稻壳、玉米茎、玉米棒、果皮、半纤维以及来自纸厂废料纤维素残留物或其它合适的有机农业、工业、城市废料中获得。
细胞通过一种或多种的方法达到同步化。这些方法有反复稀释、离心的方法和膜过滤方法，每种方法须经反复培养。细胞在其最适生长温度的-20℃到+10℃某一温度上生长，生长的时间限制在约1.0～1.5代，即1.0～1.5倍于复制的时间，也就是培养体扩大2～3倍于初浓度所需要的时间，为了使细胞同步，至少需要3～4个分离的生长周期分别分散于2～3次稀释、离心或膜过滤中来除去代谢废物。在最佳方案中，同步化的细胞基本上都具有同样的特定长度，其范围至少三倍于标准营养细胞的长度;甚至于4倍到20倍。然而，细胞可延长到营养细胞长度的100倍。
延长后的同步化的细胞经再次培养，以便让它们进一步增殖一到十二代，这就是说，需要使培养体的浓度增加2到4，096倍所需的时间，在含有二价离子℃a、Mg、Mn、Fe、Zn来稳定细胞活性并阻止它们死亡，裂解或聚集的生长培养基中，细胞再次培养，通过加入不少于0.01M左右的二价阳离子到生长培养基中，可获得好的结果。
大量的二价阳离子可被利用，这样，在培养基中就超过了它的溶解度，随着过量的二价化合物做为二价离子源的溶解，便构成了进行增殖细胞的组成份。如果二价阳离子的浓度可保持在不少于0.01M～0.2M之间的某一水平，就可得到更好的结果。因为更可取的二价阳离子尝试是不少于0.1M左右的。
有三种培养基可以利用：（1）以木聚糖为唯一碳源，并以二价阳离子补充木聚糖;（2）木聚糖和另外的碳源一起提供，这种另外的碳源必须是有机酸的二价盐的碳源;（3）有机酸的二价盐做为唯一碳源。推广的有机钙化合物有葡萄糖酸钙、乳酸钙、丙酸钙、丁酸钙或甲酸钙，即使在生长抑制剂存在的条件下，用葡萄糖酸钙稳定的同步化细胞能够维持六个月。
葡萄糖酸钙是最可靠的二价阳离子源，因为它不仅提供所需要的钙离子，而且，还可做为极好的碳源，其分解方式类似于葡萄糖，只是速率慢许多。
在一种含有缓慢代谢的碳源培养基中，经连续转接（不少于两次接种培养）而获得同步化的培养体，产生了限制细胞分裂的某种类型。以前，任何种类的细胞包括梭菌细胞还没有这方面的报导。依照该项发明，细胞延长16倍至20倍，并形成一隔膜把细胞按一种不寻常的方式进行分裂，以致于丝状体相等地分配到两细胞中，该细胞仍是延长的。对新形成的8倍到10倍长的细胞的膜进行观察时，它或者再次把细胞进行等分裂，或者最终形成孢子的隔膜。因此，延长到16倍的细胞等分裂成两个8倍长的细胞，随后，分裂成4倍长的四个细胞（特定长度）。
可缓慢代谢的碳源的合适来源包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、丰乳糖、糖原、蜜二糖、α-甲基葡萄糖、β-甲基莸萄糖苷、棉子糖、水杨苷、淀粉、海藻糖、木聚糖、乙酸钙、丁酸钙、柠檬酸钙、甲酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙。
以前试图生产没有折光性孢子的热解糖梭菌（C.thermosac-cha-rolyticum）的相对同源性的群体一直没有成功，本发明的方法包括引起下述培养条件发生，即允许营养细胞完全分化到100%没有折光性孢子的培养条件发生。
如果所需的终生物是做为商品出售的细胞，它们可以被收获并通过反复离心、重新县浮或通过滤来洗涤，再在4℃下储存起来。在另一方面，如果所需终产物是孢子，稳定培养的温度更可取地升高或降低到超过培养生长的温度范围，例如，最适生长温度的-20℃至约+10℃。尽管在这种温度下细胞的分裂将会停止，但是细胞的分化，孢子的形成和代谢将会继续下去。如果所需的终产物是由延长了的正在形成孢子的细胞中所产生的一种产物，如溶媒，产生同步化的、稳定的细胞的生长更可聚地通过温度限制，或通过利用抗微生的化学试剂如抗生素和染料来抑制，孢子的形成和细胞的分裂因加入这类物质而停止，但代谢过程如溶媒的产生却继续进行。
通过这种方法制作成的溶媒回收水平在11%时丁醇和乙醇回收比为2∶1;当溶媒回收水平在6.5%时，乙醇回收率可增加到1∶1。大大地高于以往溶媒回收率，以往溶媒回收率一般不超过1～2%。
下面结合附图对本发明的工艺方法作进一步的说明：
图1通过图解的方式描述了可选择的途径：只生产孢子、生产孢子和产溶媒细胞或只生产产溶媒细胞;
图2以图解的方式描述了纯培养在补充葡萄糖酸钙加富的木聚糖基础培养中，同步生长与溶媒产量及利用石油的相互关系（分别由曲线A、B和C表示）;
图3描述了在木聚糖基础培养基中补充葡萄糖酸钙后，同步培养体的个体细胞结合钙的情况;
图4描述了在木聚糖基础培养基中补充碳酸钙后，同步培养体的个体细胞的结合钙的情况;
图5描述了在葡萄糖酸钙培养基中，同步培养的细胞个体结合钙的情况。
参风图1，易于调控、经诱导后延长的同步生长的细胞可选择地用来实现分别称之为途经A，B，C的代谢过程。如果细胞用来实现途径A，延长的细胞是产溶媒的并且当细胞分裂被抑制时，溶媒可产生相当长的时期。如果通过物理的方法如温度的交替使细胞分裂受到抑制，并继续培养的话，孢子就开始形成，最终成为主要的产物。如果用抗微生物试剂抑制生长，即使延长培养的时间，溶媒却仍然是主要产物。当细胞用来实现途径B时，产物主要是孢子。当细胞用来实现途径℃时，产物主要是溶媒。
依照推的程序，通过补充液体蛋白胨-酵母膏来制备1号基础生长培养基，或者是制备含常用成分及缓慢代谢的碳源的其它培养基，细菌在推广的培养基中的生长速度至少比它在最适培养基中的生长速度Km小10%，在这方面被推广的生长培养基是以戊糖为原料如木聚糖。为了得到0.5%（w/v）戊聚糖，必须加足木聚糖。
木聚糖是一种普遍存在于植物细胞壁和木头组织中的一种戊聚糖，可以通过磨碎麦杆或大量的农业、工业和城市有机废料来获得。木聚糖可以未经处理并以粉末的形式加入基础培养基中。木聚糖可用热稀酸或其他的酸水解成木糖，木糖是一种结晶的醛糖，其通式为C5H10O5。木聚糖也可以通过联合培养一种水解纤维的微生物获得。例如，在本方法中以纤维素做基础培养基将C.ther-mocellum与C.thermosac-charolyticum一起培养。
将处于对数生长期的梭菌属的细胞接种到合适的肉汤培养基中，例如用豌豆肉汤来制备原培养基，特别可取的梭菌类型是热水解多糖（thermosaccharolyticum）的种类：ATCC7956.N℃A3814.然而，可以利用的种类有perfrinqens AT℃℃＃13124.thermocel-lum ATCC＃27405，thermohydrosulfuricum ATCC＃35045，ace-tobutylicum ATCC＃824，thermosulfurigenes ATCC＃33743，thermoaceticum DSN＃521，thermoautotrophicum DSM＃1974，beijerinckii ATCC＃25752和butyricum ATCC＃19398。
通过常规的系列稀释、过滤或离心技术，生长着的细胞可以达到同步化。随后，在最适生长的温度下培养，培养的时间是梭菌最少达到1×106个/ml所需的时间，大约一个体积的原培养体接种于10个体积的木聚糖基础培养基，后者做为分批培养，在图1中它称为1号基础培养基。
含有梭菌的1号基础培养基，做为分批培养，直到增加2～3倍的浓度，即大约1.0～0.5代，当然，对于不同的梭菌培养时间和温度都不相同。
然后制备2号基础培养基，它的成分与1号培养基相同，大约一个体积的1号培养基中的梭菌分批培养体转移到10个体积的2号基础培养基，再做为分批培养来培养。相似地，这种培养体在最适合生长的温度下培养，直到培养体浓度增加2到3倍，最少约每毫升2～3×105个细胞即在约1.0～0.5代。
用来维持细胞按照代谢途径A或B进行代谢的生长培养基，是通过像先前描述过的木聚糖培养基中补充无机的或有机的二价离子来制备的。代谢途径℃所需的培养基含有蛋白胨-酵母膏培养基，并补充有机酸的二价盐做为唯一碳源，为了使细胞不至于死亡、裂解和聚集而保持稳定，必须使用上述阳离子推广的二价离子有Mg、Mn、Fe、Zn和Ca，最好的离子来源包括有机钙化合物中提供的钙。
如果要生产溶媒细胞和孢子，可用途径A，最好的稳定剂是葡萄糖酸钙，通过补充至少4.3%（w/v）（0.1）的葡萄糖酸钙于木糖基础培养基中来制备3号生长培养基。
约1个体积的2号培养基中的分批培养体接种到100个体积的3号生长培养基中。这稀释的1∶100倍的接种物做为分批培养来培养，直到细胞在质量和数量上再次表现出同步，并且延长至少4倍于营养细胞的长度。这些细胞的细胞分裂受到限制，致于子细胞仍然延长到特定长度，同步细胞的二分裂通过物理的方法如升高或降低温度来抑制。这种受抑制的同步的培养体再经培养就会产生抗菌素、酶、不规则蛋白晶体，最终具有折光性的、成熟的自由孢子，而溶媒的比例很小。
如果所需终产物只是产溶媒细胞，最好的代谢途径是图1中的℃号途径，这种途径利用5号培养基做为生长培养基。其制作方法是将有机钙化物做为唯一的、缓慢代谢的碳源补充于含有通常组成份的液体蛋白胨-酵母膏培养基，最好的有机钙化合物是浓度不小于4.3%（w/v）（0.1）葡萄糖酸钙.
2号基础培养基中的一个体积的分批培养体接种于100个体积的5号生长培养基中，这1∶100稀释的5号接种物做为分批培养体来培养，直到细胞在质量和数量上表现出同步化，并且通过限制细胞分裂，使细胞延长到营养细胞长度的四倍而达到特定长度。此后可收获到含有少量孢子的同步产溶酶的细胞。如果以代谢途径℃生产溶媒做为目的，通过物理的方法，如温度的交替，或通过利用抗微生物试剂，可以抑制DNA的复制和细胞分裂，再继续培养培养体直到溶媒从大量产生到产生量很小为止。
途径A，B，及C的代谢产物可依据各种常规的方法来收回。例如，如果产物是高温下产生的溶媒，这就是说，在50℃以上，可用下述两种真空发酵的方法回收，一种方法是D.L.Pavia等写的“实验室有机物导论，一种现代方法”第548～552页，（W.B/Saun-der.1976）;另一种是Cysewski和Wilke提出的“用真空的快速乙醇发酵及细胞回收”（生物技术和工程19卷1125～1143页，1977）。如果产物是在50℃以下产生的溶媒，可通过标准的蒸馏过程来回收。酶，例如糖水解酶是胞外产物，可通过过滤或离心除去细胞碎片来回收。如果酶需要进一步纯化。可按照D.I.C.wang等在“发酵和酶技术”中的第238～310页（John wiley & Sons，1979）介绍的方法回收。混在孢子中的不规则状蛋白颗粒和有用的毒素蛋白，可通过反复离心或过滤来回收。细胞经两次离心或过滤重新悬浮后，再次离心或过滤而收集。然后回收纯化而干燥的孢子。如果产物是抗菌素，可用有机溶剂如丙酮或丁乙酸萃取的常规方法回收，这种方法由Crueger及℃rueger在生物技术：工业微生物学课本的第99～103页中描述过。
在上述的过程中，1号和2号木聚糖基础培养基可代替5号生长培养基。上述步骤的其他方面包括最终把培养体以1∶100的稀释比例稀稀释到5号生长培养基仍保持不变。稀释的接种物做为分批培养体培养到前面所述的细胞延长。同步和限制细胞分裂为止。最终可收获到同步的产溶媒的细胞。里面的孢子数几乎可以忽略不计。
做为另外一种可选择的步骤，抑制同步产溶媒的细胞的生长，可把细胞的能量引导到代谢上而不是用在细胞分裂上，并且可收获它们在此以后的代谢产物。细胞及其生长培养基的温度可增加到最适生长温度以上10度或降低到最适生长温度以下20℃，或者通过加入半致死剂量的抗微生物试剂来控制。当抑制的培养体继续培养时，就可产生溶媒，里面伴随的孢子可忽略不计。在一定的时期之后，这个时期随着菌种的不同而不同。所产生的溶媒比例从6%到12%变化，而丁醇和乙醇比例都在1∶1到2∶1之间变化。
在其它的具体方案中，可以重复在第二个基础培养基中再次培养的步骤，并且于转移到第三种生长培养基之前，重复向新鲜培养基中稀释的步骤。最初，向新鲜培养基中稀释的比例可以从1∶2变化到1∶100，这个步骤可以重复，最后稀释比例可以从1∶2到1∶500变化。做为使培养体同步化的方法，重复离心或膜过滤，重复县浮可代替系列稀释。
在所有试验过的具体的方案中，为了使产生溶媒具有较长时期，延长的同步细胞常常需要一种缓慢代谢的碳源，正常的细胞分裂必须通过温度的交替或添加化学生长抑制剂来阻止。以及细胞必须与钙结合。图3-5把单个同步化的Clostridium thermosac-charolyticum细胞结合钙的情况下典型的异步的，短的，营养细胞与钙结合的情况进行了比较。正像图3-5中曲线A1-A4所例举的那样，钙的结合稳定了产溶媒细胞，并保护其免受随后产生高浓度溶媒的影响。相反，每个图中曲线B所代表的细胞，在加入过量钙之前不是同步化的，仍然保持典型的，短的，营养细胞，它们不与高浓度的钙结合，主要是产酸细胞。然而，即使在这些产酸的细胞中，当在45小时通过变温到35℃使细胞分裂停止时，细胞闵延长，产生溶媒，同时会出现钙结合的增加。
具体地说，在利用某种碳源可选择性地生产下列代谢终产物：溶媒、酶、抗菌素、有用的毒素蛋白或孢子时可按下列方法进行：
第一种方法：
向每毫升含有1×106数的梭菌属细胞的生长培养基中提供一种缓慢的代谢碳源，在预先决定的条件下，该菌普遍能够分解这种碳源产生下列代谢产物：如溶媒、酶、抗菌素、蛋白质、孢子等中的某一种;
提供至少0.01M左右的二价阳离子来稳定上述细胞;
在使得上述细胞在数量上同步化生长的同时，通过下列方法诱导细胞至少延长三倍而达到某一特定长度：a）在上述的生长培养基中再次培养细胞使其浓度有限地只增加到起始的2～3倍，在培养的过程中，培养基保持在该菌最适生长温度的-20℃～+10℃范围内;b）此后，让细胞再次培养使其浓度比先前浓度增大2～3倍，培养时所用的生长培养基的温度保持在步骤a）范围内的某一温度，这徉就不会产生大量代谢产物，从而不会干扰上述细胞的同步生长;c）之后，在步骤b）的生长培养基中补充至少0.01M的二价阳离子来稳定上述细胞，即在这种培养基中，使细胞再次培养，使其浓度比先前浓度再增加至少二倍;
使由c）步产生的细胞处于抑制细胞分裂的状态。
为了使细胞的延长和细胞在数量和有效质量上同步化生长可通过下列步骤来完成：重复上述方法中的步骤b）代替步骤c）;为了稳定上述细胞，在添加一种阳离子的同时，再次重复上述方法中的步骤b），此后，再次培养细胞使其细胞浓度至少增加到先前的两倍左右;最后使最终产生的细胞易于处于抑制细胞分裂的状态。
第二种方法：
向每毫升不小于1×106个梭菌属的细胞的生长培养基中提供一种缓慢的代谢碳源，在预先决定的条件下，细菌普遍具有分解这种碳源产生上述溶媒的能力;
在使得上述细菌在数量和有效质量上同步化生长的同时，通过下列方法诱导细胞延长到至少三倍而达到某一特定长度：a）、再次培养，使细胞在上述培养基中的浓度增加到不少于2×10个/ml～3×10个/ml左右，在培养的过程中，培养基的温度保持在该菌最佳生长温度的-20℃～+10℃范围内的某一温度;b）、取出一部分含有上述细胞的生长培养基，并用新鲜生长的培养基从1∶2稀释至1∶100左右，此后，使细胞再进一步增殖到其浓度至少约为2×10个/ml～3×10个/ml，在增殖时，培养基的温度保持在步骤a）的温度范围内;c）重复步骤b），此时稀释度为1∶2至1∶500左右，同时添加至少0.01M左右的二价阳离子来稳定上述细胞，此后使细胞进一步增殖到其浓度为2×10个/ml左右;
使由步骤c）产生的细胞处于抑制细胞分裂的状态。
为了使细胞的延长和细胞在数量和有效质量上的同步化生长，可通过下列步骤来完成：
重复步骤b）代替步骤c），及再次重复步骤b），此时，稀释度从1∶2～1∶500左右，同时增加二价阳离子源来稳定细胞，此后，使进一步增殖到浓度不少于2×10个/ml左右;最后，使产生的细胞处于抑制细胞分裂状态。
或者，从生长培养基中分离上述细胞，并重新悬浮于一定量的新鲜生长培养基中，然后，使细胞进一步增殖到其浓度不少于4×10个/ml到6×10个/ml左右，在增殖时，培养基的温度保持在步骤a）的范围;并重复上述步骤，直到其细胞浓度至少为4×10个/ml左右。
第三种方法：
向每毫升不小于1×106个梭菌属的细胞的生长培养基中提供一种缓慢的代谢碳源，在预先决定的条件下，细菌在遗传上能代谢这种碳源，可产生一代谢产物，包括溶媒、酶、抗抗拒菌素、蛋白质或孢子等;
细菌在数量和有效质量上同步化生长的同时，通过毓的再次培养和稀释来诱导同步化的细菌细胞的延长而达到至少三倍的某一特定长度，毓的再次培养和稀释时的温度控制，在菌的最适生长温度为-20℃-+10℃范围内的某一种温度，每次培养的时间不得超过细胞增殖2-3倍吉原始浓度所需的时间;
最后，在细胞增殖的最后阶段，加入不少于0.01M左右的二价阳离子把细胞稳定下来。
在利用某种碳源在细菌发醉过程中生产包括乙醇在内的有机溶媒时，采用如下工艺方法：
向每毫升不少于1×106个梭菌属的细菌的生长培养基中提供一种缓慢代谢的碳源，在预先决定的条件下，上述细菌在遗传上具有分解这种碳源产生上述溶媒的能力;
细胞在数量和有效质量上同步化生长的同时，可通过下列步骤来诱导细胞延长至少三倍而达到某一特定长度：a）、再次培养细胞，使其在上述培养基中增殖约1.0～1.5代，增殖时，培养基的温度保持在该菌最适生长的温度的-20℃～+10℃左右的范围内;b）、此后，再次培养细胞使其在某一生长培养基中进一步增殖1.0～1.5代左右，增殖时，生长培养基的温度保持在步骤a）的范围内，这样就不会产生大量的细胞内代谢物，从而不干扰上述细胞的同步化生长;c）重复步骤b），同时至少添加0.01M左右的二价阳离子来稳定细胞，此后使细胞进一步增殖至少约一代;
最后，使由步骤c）产生的细胞处于抑制细胞分裂的状态。
上面的各种工艺方法中所提及到的碳源、细菌的浓度、培养基、二价阳离子、细菌的最适生长温度及细胞的保持等在前面已作了途述，在此不再描述。
下面结合各种范例对本发明作进一步的说明：
范例1
此范例提出了使得生长者的细胞在数量和质量上的同步化过程，并改变了野生型Clostridium thermosaccharolyticum ATCC＃7956菌株在纯培养中的细胞分裂。
1、豌豆肉汤培养基
六颗干燥的阿拉斯加种豌豆加入10ml2%蛋白胨溶液中，灭菌15分钟，立即用2ml无菌的vaspar覆盖。
2、原种培养
处于以数生长的C.thermosaccharolyticum的培养体接种于豌豆肉汤掊养基中，随后在56℃下接着8小时。接着原种培养储存于4℃。每间隔3～6个月，转接原种培养。原种培养在56℃培养12小时即被活化。
3、分批培养
1毫升活化后的培养种体接种于10毫升新鲜的基础培养基中做为分批培养。
4、基础培养基
0.2%蛋白栋;0.5%的酵母膏;0.01%CaCl2·2HO0.1%（NH4）2SO4;0.01%MgSO4;0.01%MnSO4.H2O;0.0005%ZnSO4·7H2O;0.0005%CuSO54H020.0.0001%（NH4）6MO7O244HO;0.000002%对氨基苯甲酸p-aminobenzoic acid;0.0001%盐酸硫胺thiamine hy-drochloride;0.0000001%生物素biotin
溶于1公升水中盐酸硫胺素和生物素经过过滤除菌，再加入来菌后的培养基中，0.5%（w/v）木聚糖加入培养基做为碳源。培养基用1M氢氧化钠调至pH7后灭菌。接种前培养基在56℃预温，并在一天内使用。
5、步骤：
所有的步骤均采用Hungate方法在无菌条件下进行。原种培养活化后，转接于预温的含有0.5%木聚糖做为碳源的基础培养基中，接着在56℃下培养六小时，此时细胞的浓度大约为每毫升三亿，1毫升的这种液体培养体无菌地转接于10毫升预温的新鲜木聚糖基础培养基，再让它做为分批培养在56℃下生长。
四小时后，接着体中的细胞浓度大约为每毫升一亿。1毫升这种液体培养体无菌地转接于100毫升预温的新鲜木聚糖培养基，这种培养基至少补充4.3%（0.01M）葡萄糖酸钙。培养体保持在稀释的瓶中，并用40毫升无菌矿物油覆盖，以确浓度达到每毫升二十亿。
这些产溶媒的细胞按下述方法收获：在22，000xg下离心30分钟，重新悬浮于无菌蒸馏水中，此过程重复一次，然后再以上述速度离心30分钟，此时细胞易于静止并在4℃下储存起来。
上述细胞用Pertroff Hausser计数器在显微镜下进行差别计数，以确定细胞总数、单个细胞长度、孢子囊数目、及折光性孢子数目。上述观察是利用放大400倍olypus的位相差显微镜，而形态学的测定则在一千倍下进行。
培养体的上清液用气-液色谱分析，这种色谱Hewlett-Packard气-液色谱，装有火焰检测器和strip-chart记录仪，最初的代谢物在不锈钢柱（0.31cm×1.82m）中分离，柱内填充吸附有10%SP-1000/1%H PO的100-120hromosorb WAW担体（Supelco，Inc）.柱在200℃条件下处理48小时，分析时进样口温度为200℃，检测器温度为250℃。预先纯化的氮气为载气，流速为40ml/min.这样打入10ml样品后，恒温在80℃保持2分钟，接着以每分钟8℃程序升温到170℃，随后保持2分钟，从参考的标准峰面积可以计算出代谢物的百分比并换算成毫摩尔浓度。
为计数和气-液色谱分析，获得的样品在2200g速率下进一步离心30分钟以便从培养基中分离细胞，将这些细胞再悬浮在无菌蒸馏水中，经声波打散到90%，这可通过位相差显微镜来检验。配备有hewlett-Pac-Kard9000计算机和autosampler的模型为400的Dionex离子色谱用来进行离子色谱分析。阳离子在CS-1柱上分离。钠、铵、钾的洗脱物是8mM盐酸加上1mM2，3-二氨基丙铜酸，其流速为2ml/min镁，锰和钙的洗脱物是48mM的盐酸加上8mM的2，3-二氨基丙酮酸，流速为0.8ml/min.阴离子AS4A柱上分离，洗脱物为1.92mM碳酸钠加上2.4mM碳酸氢钠，流速为2ml/min。
6、结果
重复转移到木聚糖培养基生长在六小时内而同步化的培养体，进一步在含有过量葡萄糖酸钙的木聚糖培养基中生长45小时，证明了细胞在数量和质量上均有高度的同步化。差别计数表明了细胞质量上的同步化可达69.3%。数量上的上述同步化可达76.7%。90%以上的同步化的产溶媒的细胞至少延长四倍，并且显示一种修饰过的细胞分裂保持在至少4倍于营养细胞长度的特定长度上。折光性的孢子几乎可以忽略不计。
范例2
除下列步骤外，其它步骤同范例1。第一次将原种培养以1∶10的稀释培养，紧接着这种培养体以1∶10的稀释于预温的新鲜木聚糖基础培养基进行第二次培养。这样稀释物再在56℃下做为分批培养来培养。四小时之后，细胞浓度可达大约一亿。这个步骤插入之后再进行范例1中的其他步骤，90%以上的同步细胞延长至四倍，并且展示一种修饰过的细胞分裂保持在至少四倍子营养细胞长度的特定长度上。折光性孢子的数目可忽略不计。
范例3
重复范例I的步骤，但到45小时培养之后，培养体放于冰浴中使其温度下降到35℃，再转移到35℃的旋转器中，培养135小时（总培养时间为180小时）。180小时后，培养体的细胞浓度可达到每毫升约二十亿，通过这种方式制备的细胞可产生10.6%的溶媒，丁醇与乙醇比为2∶1。
图5表明了同步化的细胞数量与相应的溶媒浓度之间的关系。曲线A表明了总的细胞数，并附注有同步化的百分比在括符内。曲线B表明所产溶媒的绝对浓度，并注有体积对体积的酒精浓度在括符内。溶媒的总的毫摩尔的浓度等于各种溶媒：丙酮、丁醇、乙醇、民丙醇和甲醇浓度的总和。
尽管从发酵的开始就有溶媒的产生，但是正如曲线B所表示的那样，总的毫摩尔数量是相当低的，此时细胞正处于曲线A所表示的同步化生长时期内。培养45小时之后，将温度变为35℃时，被捕捉到的延长的细胞进入溶媒产量增加的时期。以致于在115小时总浓度度达到3.6%，130小时浓度达到6.3%，145小时浓度进一步增加到9.8%，在175小时浓度达到最高，为10.6%。
范例4
除下述步骤外，其他过程同范例3。在例3中56℃下培养45小时后，接着降低培养温度，使培养体在35℃下继续培养155小时（总培养时间为200小时），200小时之后，细胞浓度达到大约每毫升20亿。按这种方式制备的细胞，其溶媒产量可达6.5%，其中丁醇与乙醇之比为1∶1。
范例5
除下述步骤外，其他过程同范例3，例3中56℃下培养45小时后，接着降低培养温度，使培养体在35℃下继续培养200小时（总培养时间为245小时），245小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生大量的抗菌素，如多粘菌素、杆菌素、醣类水解酶、如淀粉酶、蛋白酶、脂及酶、核酸酶、不规则状-蛋白晶体、以及有折光性的成熟的自由孢子。
范例6
除下例步骤外，其它过程同范例1，范例1培养45小时后，接蓍将培养体转移到温度为70℃，使培养体在70℃再培养135小时（总培养时间为180小时）。180小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿。按这种方式制备的细胞可产生10.6%的溶媒，其中丁醇与乙醇之比为2∶1。
范例7
除下列步骤外，其它过程同范例6，培养器中温度升到70℃后，使培养体70℃下再培养155小时（总培养时间为200小时），200小时后，培养体的浓度达到每毫升二十亿，按照这种方式制备的细胞可产生6.5%溶媒，其中丁醇与乙醇之比为1∶1。
范例8
除下列步骤外，其他过程同范例6，范例6中温度变为70℃后，使培养体在70℃下再培养200小时（总培养时间为245小时），245小时后细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按照这种方式制备的细胞可产生抗菌素、醣水解酶、不规则状蛋白晶状，以及折光性的成熟的自由孢子。范例9
除下列步骤外，其他过程同范例1。范例1中培养45小时后，为了抑制细胞分裂，向培养体中加终浓度为20mM的氯微素。培养体再培养27小时（总培养时间为72小时）。72小时后细胞浓度为可达到大约为每毫升二十亿。按这种方式制备的细胞可产生10.6%的溶媒，其中丁醇与乙醇之比为2∶1。
范例10
除下列步骤外，其他过程同范例9，例9中加入氯微素后，培养体培养42再小时（总培养时间为87小时）。87小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿。按这种方式制备的细胞可产生6.5%溶媒，其中丁醇与乙醇之比为1∶1。
图3表明了在含有葡萄糖酸钙的木聚糖基础培养基中培养的单个同步化的细胞结合钙的情况。正像曲线A1-A4表示的那样，溶媒产量最高的时候也是钙结合最高的时候。曲线A1，（A2，A3，A4）中，通过加氯微素，曲线A2加萘啶酮酸、曲线A3加丝裂微素、曲线A4加吖啶橙，细胞分裂在45小时处停止。曲线A2中用萘啶酮处理的细胞在72小时处可产生7。1%的溶媒，这与最高钙结合，3.162毫微摩尔相对应。曲丝4表示同样培养基中加入吖啶橙至已同步化细胞，溶媒浓度可达到8.1%，此时结合钙为1.163毫微摩尔。曲线B代表在同样培养基中非同步化的细胞个体结钙的情况。
范例11
除下列步骤外，其他过程同范例1。例1中所用培养基改为含有1.1%（0.1M）碳酸钙的木聚糖孢子形成培养基，45小时后，细胞在数量和质量上表现出高度的同步化。细胞的差别计数表明细胞在质量上48.8%同步化。数量上有56.3%同步化。90%以上的这些同步化产溶媒细胞至少延长四倍，并展示一种修改过的细胞分裂保持至少四倍于营养细胞长度的特定长度上。折光性的、成熟自然孢子可忽略不计。
范例12
除下列步骤外，其他过程同范例11。例11中培养到45小时后，把培养体放入冰浴中使其温度降至35℃并转于35℃下旋转的培养器。培养体在35℃下再培养200小时（总培养时间为245小时）。245小时后细胞浓度可达到每毫升约二十亿。按这种方式制备的细胞可产生抗菌素、醣水解酶、不规则状蛋白晶体，以及折光性的、成熟的自由孢子。
范例13
除下列步骤外，其他过程同范例12。例12中培养45小时后，把培养体转移到70℃的旋转培养器中使其温度增加至70℃，培养体在70℃下再培养200小时（总培养时间为245小时）。245小时后，细胞浓度可达每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生抗菌素、醣水解酶、不规则状蛋白晶体，以及折光性的，成熟的自由孢子。
范例14
除下列步骤外，其他过程同范例11。例11中培养到45小时后，为了抑制细胞继续分裂，加入终浓度为20mM的萘啶酮酸。培养体再培养27小时（总培养时间为72小时），72小时后细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞产生可以忽略不计的溶媒，但可产生抗菌素、醣水解酶、不规则状蛋白晶体以及有折光性的成熟的自由孢子。
图4表明了培养在含有碳酸钙木聚糖培养基中单个同步化细胞结合钙的情况。尽管这些细胞不产生高含量的溶媒，但正像曲线A1-A4所表示的那样，最高溶媒产量（0.2～0.4%）与最高结合钙相互关联。通过加入氯微素，萘啶酮酸，丝裂微素，吖啶橙，细胞分裂在45小时停止，见曲线A1，A2，A3，A4。曲线A2中用萘啶酮酸抑制的同步细胞在72小时结合12.492毫微摩尔的钙，并且40-50%的细胞表现出末端膨大的迹象，这表示孢子的形成从第Ⅳ期进入第Ⅴ期。相反的，曲线A4用吖啶橙抑制的生长在相同培养基中的同步化细胞只结合754毫微摩尔的钙，产生0.4%的溶媒。曲线B代表培养在相同培养基非同步化的单个细胞结合钙的情况。
范例15
除下列步骤外，其他过程同范例1，将例1中所用培养基改为含有4.3%萄糖酸钙做为叭一碳源的孢子形成培养基，培养45小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞是高度延长并产生溶媒的。折光性的、成熟的自由孢子及折光性的孢子产生很少。
范例16
除下列步骤外，其他过程同范例15。范例15中培养到45小时后，接着把培养体放入冰浴中后温度降至35℃并转移于35℃旋转的培养器来将温度降到35℃。在35℃再继续培养135小时（总培养时间为180小时），经180小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生10.6%的溶媒，其丁醇与乙醇的比为2∶1。
范例17
除下列步骤外，其他过程同范例16，例16中温度降低后，细胞培养155小时（总培养时间为200小时），200小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生6.5%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为1∶1。
范例18
除下列步骤外，其他过程同范例15，例15中培养45个小时后，接着把培养体转移到70℃的旋转培养器中使培养温度增加至70℃，在70℃再培养135小时（总培养时间为180小时），180小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生10.6%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为2∶1。
范例19
除下列步骤外，其他过程同范例18。例18中增加温度后，再在70℃下培养155小时（总培养时间195小时）。195小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞可产生6.5%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为1∶1。
范例20
除下列步骤外，其他过程同范例15。范例15中培养45小时后，为了阻止细胞进一步分裂，向培养基中加终浓度为20mM的氯微素。培养体再培养27个小时（总培养时间为72小时）。27小时后，细胞浓度可达到大约每毫升二十亿，按这种方式制备的细胞，可产生10.6%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为2∶1。
范例21
除下步骤外，其他过程同范例15，例15中培养45小时后接着加入氯微素，培养体再继续培养42小时（总培养时间为87小时），87小时后细胞浓度可达到大约每毫升为二十亿，按这种方式制备的细胞可产生6.5%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为1∶1。
图5表明了培养过程中葡萄糖酸钙与培养基中同步培养的单个细胞结合钙的情况。曲线A1-A4表示溶剂产生的高峰与结合钙之间的相互关系。通过加入氯微素（萘啶酮，丝裂酶素，吖啶橙）细胞分裂在26小时停止（分见曲线A1，A2，A3，A4）。用萘啶酮酸处理过的同步化细胞在72小时处产生9.1%的溶媒（见曲线A2），与1.940毫微摩尔的结合钙相对应。曲线B代表培养在相同培养基中的非同步化单个细胞结合钙的情况。
范例22
除了下列步骤外，其它过程同范例1。在基础培养基中，利用葡萄糖酸钙做为唯一碳源，其浓度至少4.3%，培养26个小时后，培养体的细胞浓度可达到每毫升二十亿左右。通过这种方式制作的细胞是高度延长和产溶的。所产生的折光性的、成熟自由孢子或折光性的孢子襄的数量甚少。
范例23
除了下例步骤外，其它过程同范例7。培养26个小时后，将培养体放入冰浴中使温度降到35度并转移到35度的旋转培养器中继续培养135个小时（总培养时间为180个小时）。180个小时后，培养体的细胞浓度可达到二十亿左右。通过这各方式制作的细胞可产生10.6%的溶媒，其丁醇与乙醇的比例为2∶1。
范例24
除了下例步骤外，其它过程同范例22。温度降低后，细胞再培养155个小时（总培养时间为200个小时）。之后培养体的细胞浓度为二十亿。通过这种方式制作的细胞可产生6.5%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为1∶1。
范例25
除了下列步骤外，其它过程同范例22。培养26个小时后，培养体转移到70度下的旋转培养中使温度啬到70度。之后，培养体再在35度培养135个小时（总培养时间为180个小时）。180个小时后，培养体的细胞浓度可达到二十亿左右。通过这种方式制作的细胞产生10.6%的溶媒，其中丁醇与乙醇的比例为1∶1。
范例26
除下列步骤外，其它过程同范例22。温度增加后，培养体在70度下再培养155个小时（总培养时间为195个小时）。195个小时后，培养体的细胞浓度可达到二十亿左右。通过这种方式制作的细胞产生6.5%的溶媒，其中丁醇与乙醇的比例为1∶1。
范例27
除下列步骤外，其它过程同范例22。培养26个小时，为了阻止细胞进一步分裂，向培养基中加入微素，其终浓度为20UM。培养体再培养27个小时（总培养时间为72个小时）。72个小时后，培养体的细胸浓度达到二十亿左右。通过这种方式制作的细胞产生10.6%的溶媒，其中丁醇与乙醇的比例为2∶1。
范例28
除下列步骤外，其它过程同范例22。添加氯霉素后，培养体再培养42个小时（总培养时间为87个小时）。之后，培养体的细胞浓度可达二十亿左右。通过这种方式制作的细胞可产生6.5%的溶媒，其丁醇与乙醇之比为1∶1。
在细胞增殖过程中，利用油质原料做为生长培养基的覆盖层，此油层具有保持厌氧和提供第二种碳源的双重功能，饱和烃如蜡油是好的油剂，主要是因为它价廉易得。因此，利用石蜡油做为生长培养基的覆盖物质为一般的容器进行发酵提供了条件，从而避免了必须利用昂贵的发酵设备，而这种设备常由冷却、通气和搅拌工具组成。在上述过程中，在没有干扰排气、油层粘性的条件下，对生长培养基进行适当的缓慢搅动即可。顶端具有开口的水泥容器，金属容器或木容器都可。这样就允许利用现有的结构。
同样地，基于唯一需要的外界能量是使生长培养基的温度增加到某一需要水平，如热解糖梭菌大约在56℃，在许多情况下，从太阳能获得的热能就够了。尤其是，生长培养基装在太阳下的金属容器里。如果碳源是来自纸桨工厂里废弃的桨状物，而这些桨状物通常来自至少90℃左右温度下的工厂，那么，在开始上述发酵工艺之前只须要冷却到所需温度。
综上所述，本发明能充分利用现有的条件设备达到比较好的效果，可普遍用于细胞及代谢物的生长过程中。