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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510823350.2 (22)申请日 2015.11.13 A61K 31/216(2006.01) A61P 31/18(2006.01) C07C 69/734(2006.01) C07C 67/48(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510006 广东省广州市番禺区大学城外 环东路 132 号 (72)发明人 顾琼 徐峻 江程 罗盼 (54) 发明名称 一种黄苞大戟提取物及其在制备防治 HIV 病 毒感染药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供一种黄苞大戟提取物在制备防治 HIV-1 病毒感染药物中的新应用，。
2、 并给出 2 个新 的化合物， 同时给出黄苞大戟提取物及新化合物 的制备方法， 本发明提供的黄苞大戟提取物对于 HIV-1 的复制具有明显的抑制效果， 且对宿主细 胞毒性相对较小， 具有一定的安全性， 可应用于制 备防治 HIV 病毒感染的药物。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 CN 105496997 A 2016.04.20 CN 105496997 A 1.一种黄苞大戟提取物在制备防治HIV病毒感染药物中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的黄苞大戟提取物含有如下化合物中 的。
3、一个或全部。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述的提取物为carolignan木质素。 4.一种权利要求1-3任一项中所述的黄苞大戟提取物的制备方法， 其特征在于， 将黄苞 大戟(Euphorbia sikkimensis)地上部分， 晒干， 粉碎， 用95乙醇室温浸提三次， 每次24小 时， 合并浓缩液， 分别用石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取， 得到石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇部 分， 乙酸乙酯部分过大孔树脂， 乙醇/水分别按百分比0100、 1090、 3070、 5050、 7030、 80 20、 9010、 1000过柱， 馏分再经反复分离得到。 5.如权利要求1-3任。
4、一项中所述的黄苞大戟提取物， 其特征在于， 所述的提取物的结构 式为式(1)或式(2)。 6.一种用于预防或治疗艾滋病的药物组合， 所述药物组合含有有效量的权利要求1-2 或5任一项中的提取物或化合物。 7.如权利要求6所述的药物组合物， 其特征在于还包括制药学上可接受的载体或辅料。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105496997 A 2 一种黄苞大戟提取物及其在制备防治HIV病毒感染药物中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及中药活性成分和药物技术领域， 更具体地， 涉及一种黄苞大戟提取物 及其制备方法和在制备防治HIV病毒感染药物中应用。 背景技术 0002 艾滋病(Acq。
5、uired Immuno-deficiency yndrome， AIDS， 获得性免疫缺损综合征， 简称艾滋病)是当今世界威胁人类健康的不可根治致死性疾病之一。 导致艾滋病的病原体 即人类免疫缺损病毒(Human Immunodeficiency Virus， HIV)， 1983年获得分离确证， 有两 种亚型HIV-1和HIV-2， 若干变异株。 HIV繁殖过程已被阐明， 不同类型的化合物被相继研究 和应用于抗艾滋病病毒。 全世界已对约20000个化合物进行过抗HIV活性的研究， 目前已成 功地研制出了一系列抗逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的艾滋病药物。 如逆转录酶抑制剂 (AZT， DDC。
6、， DDI， D4T， 3TC， Nevirapine， Delavirdine， Efavinavir， Amprenavir)， 这些药虽被 批准用于临床， 客观上延长了艾滋病患者的生命， 但同时又有严重的毒副作用， 如骨髓抑制 和健忘以及导致耐药病毒株的出现。 患者往往难以忍受这些毒副作用而带来的痛苦， 而拒 绝服用。 因临床上急需研制出高效低毒的抗艾滋病新药。 从中草药中发现天然产抗HIV活性 化合物或先导物是目前国内外研究的重要方面和非常活跃的领域。 至今发现100多种天然 化合物具有抗HIV活性， 分属于倍半萜、 二萜、 三萜、 甾体、 黄酮、 香豆素、 肽类、 生物碱、 多糖、 。
7、天花粉蛋白等， 其中活性较强的如： 甘草甜素， 金丝桃素， 姜黄素， 大豆皂苷， 喜树碱， 栗精 胺， 香菇多糖， 天花粉蛋白等。 目前约有近百个品种正在进行临床前研究和临床试验。 0003 中草药黄苞大戟为大戟科大戟属植物黄苞大戟的地上部分， 在我国分布广泛， 资 源丰富。 黄苞大戟(Euphorbia sikkimensis Boiss)作为一种鄂西民族植物药材， 根入药， 具泻水、 清热、 解毒之功效， 用于肾炎水肿、 腹胀、 便秘， 疟疾， 风湿， 黄疸等疾病的治疗。 对它 的成分研究涉及二萜、 三萜、 生物碱、 酚类化合物、 香豆素、 黄酮、 甾体、 生育酚衍生物、 脂肪 酸等， 而。
8、活性主要见于抑制血管细胞生成和细胞毒性两方面的报道。 而现有的技术中未见 carolignan类型木质素的抗HIV活性的报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种黄苞大戟提取物在制备防治HIV病毒感染的药物中的 应用。 0005 具体地， 提供一种carolignan型木质素在制备防治HIV病毒感染的药物中的应用。 0006 更具体地， 作为优选， 由于本发明提供的黄苞大戟提取物中有2个新化合物， 因此 提供所述的提取物结构式为(1)或(2)， 化合物1， 2互为对映异构体。 说 明 书 1/7 页 3 CN 105496997 A 3 0007 第二方面， 本发明还提供一种防治艾滋。
9、病的药物组合， 所述药物组合中包含有效 量的式(1)或式(2)以及与其配伍的其他药学上可接受的载体或辅料。 0008 本发明的另一目的提供所述的黄苞大戟提取物的制备方法。 0009 上述的黄苞大戟提取物的制备方法， 将黄苞大戟(E.sikkimensis)地上部分， 晒 干， 粉碎， 用95乙醇室温浸提三次， 每次24小时， 合并浓缩液， 分别用石油醚、 乙酸乙酯和 正丁醇萃取， 减压浓缩回收溶剂， 得到石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇部分， 乙酸乙酯部分先过 大孔树脂(D101)， 以乙醇/水梯度洗脱， 得到4个馏分。 各馏分再分别过MCI柱， 硅胶柱， 反相 C18柱和半制备液相色谱柱， 反复分。
10、离得到。 0010 所述的乙醇/水体系中乙醇和水的体积比为： 0100、 1090、 3070、 5050、 7030、 8020、 9010、 1000。 0011 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是： 0012 本发明实施例提供了一种黄苞大戟提取物在制备防治HIV病毒感染的药物中的应 用。 在MT-4细胞模型中， 将一定浓度药物与50TCID50/孔的病毒加入培养基中， 共同培养三 天， 收集上清， 用荧光素酶检测体系测定细胞病毒相互作用。 荧光素酶与底物反应， 产生荧 光， 通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性， 从而反应药物作用病毒感染的强度， 实 验结果显示粗提物及化合物。
11、组荧光强度均大于空白对照， 且与阳性对照齐多夫定相当， 进 一步测试其半数有效浓度(EC50)发现均在10 M以内。 另外， 细胞内毒性实验也证明， 黄苞大 戟乙酸乙酯粗提物及化合物1， 2也具有较好的安全性。 这表明， 黄苞大戟乙酸乙酯粗提物及 化合物1， 2可用于制备防治HIV病毒感染的药物。 附图说明 0013 图1.新化合物1的结构及活性 0014 图2.新化合物2的结构及活性 具体实施方式 0015 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。 除非特别说明， 本发明采用 的试剂、 设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、 设备和常规使用的方法。 0016 实施例1 0017 从黄苞。
12、大戟(E.sikkimensis Boiss)中制备化合物1-2的方法： 0018 黄苞大戟(E.sikkimensis)全株(20kg)， 晒干， 粉碎， 用95乙醇室温浸提3次， 每 次1天， 合并浓缩液， 得粗提物(2562g)， 分别用石油醚、 乙酸乙酯、 正丁醇萃取， 乙酸乙酯层 说 明 书 2/7 页 4 CN 105496997 A 4 (334g)直接经大孔树脂(D101)， 用乙醇/水(0100、 1090、 3070、 5050、 7030、 8020、 90 10、 1000， V/V)梯度洗脱， 每500mL收集一份， TLC检测合并相同部分， 共得到四个馏分A-D。 。
13、B 部分过C18反相柱， 用甲醇/水(30-100)梯度洗脱得到四个小组分(B1-B4)。 B1部分过正相 柱， 以二氯甲烷/甲醇(10， 1001， 151)进行洗脱得到六个组分(B1a-B1f)。 合并组分B1d、 B1e两部分， 先利用制备薄层层析(二氯甲烷/乙酸乙酯501)富集， 然后用半制备液相(乙 腈/水5545)得到化合物1， 最后用半制备手性柱(甲醇/水， 91， 3mL/min)拆分得到化合物 1、 2。 1， 2互为对映异构体。 0019 化合物1(新化合物)： (-)-7 R， 8 S-erythro-7 -methylcarolignan E(1)： 白色粉末； 20D。
14、-16.2(c 0.1， CHCl3)； UV(MeOH) max(log )231(4.58)， 288(3.87)， 327(4.68)nm； ECD(MeCN) max( )232 (1.03)， 211(-3.72)nm； IR vmax 3407， 2962， 2930， 2853， 1704， 1633， 1599， 1514， 1460， 1428， 1262， 1096， 1027， 803cm-1； 1H NMR(CDCl3， 400MHz)and13C NMR(CDCl3， 100MHz)data， 见表2； HRESIMS m/z 743.27039M-H-(calcd 。
15、for C41H43O13， 743.27091)， 绝对构型为7 R， 8 S。 0020 化合物2(新化合物)： (+)-7 S， 8 R-erythro-7 -methylcarolignan E(2)： 白色粉末； 20D+17.1(c 0.1， CHCl3)； UV(MeOH) max(log )231(4.58)， 288(3.87)， 327(4.68)nm； ECD(MeCN) max( )232 (-1.03)， 211(3.80)nm； IR vmax 3407， 2962， 2930， 2853， 1704， 1633， 1599， 1514， 1460， 1428， 1。
16、262， 1096， 1027， 803cm-1； 1H NMR(CDCl3， 400MHz)and13C NMR(CDCl3， 100MHz)data， 见表2； HRESIMS m/z 743.27039M-H-(calcd for C41H43O13， 743.27091)， 绝对构型为7 S， 8 R。 0021 实施例2 实施例1所得的乙酸乙酯粗提物和2个化合物的药效相关实验 0022 本发明乙酸乙酯粗提物及化合物1和2对HIV-1裂解复制抑制活性测定。 0023 (1)细胞培养。 体外培养MT-4细胞。 使用含有10胎牛血清， 链霉素(100 g/ml)， 青 霉素(100单位/毫。
17、升)的RPMI1640培养基， 在37， 5二氧化碳浓度条件下进行常规维持培 说 明 书 3/7 页 5 CN 105496997 A 5 养和传代。 0024 (2)药物干预。 用排枪向96孔微量细胞板各孔中加入100 LRPMI1640培养液， 再向 首行加入100 M药液100 L混匀， 逐行下移100 L行倍比稀释。 同时设正常细胞对照及病毒对 照孔。 向全板各孔加50 L生长旺盛的MT-4细胞(104个/孔)。 将50TCID50病毒液(NL4-3- nanoluc-sec)50 L加入除正常细胞外的各孔中， 置于37培养箱中， 培养3天。 0025 (3)测试方法。 收集板内上清液。
18、， 加入100 L荧光素酶检测溶液， 反应五分钟后， 置 于Victor 2荧光计下检测荧光吸收强度。 0026( 4 ) 结 果 处 理 。按 照 公 式 ： ( 计算 各化合物在不同浓度下对HIV裂解复制的相对抑制值。 以HIV-1相对抑制值为纵坐标， 药物 浓度为横坐标绘制各化合物对HIV-1裂解复制的抑制曲线图， 并计算各药物的抑制裂解复 制50的药物浓度(EC50)以评价各化合物对HIV-1裂解复制的作用效果。 如表2所示， 化合物 1和2显示较好的HIV-1病毒复制抑制活性， 其EC50分别为6.3 M和5.3 M。 0027 表1乙酸乙酯粗提物及化合物1和2抑制HIV-1复制裂解。
19、活性及细胞毒性 0028 实施例3本发明乙酸乙酯粗提物及化合物1和2对宿主细胞毒性测试 0029 (1)细胞培养。 体外培养MT-4细胞。 使用含有10胎牛血清， 400ug/mL G418， 100ng/mL四环素的RPMI1640培养基， 在37， 5二氧化碳浓度条件下进行常规维持培养和 传代。 0030 (2)测试方法。 调整对数生长期MT-4细胞密度为5105cells/ml， 使用不同浓度化 合物处理细胞， 每个浓度设3个平行复孔， 3天后使用细胞毒性检测系统(普洛麦格公司、 一 种检测死细胞在细胞群中相对数量的发光检测试剂盒)测试不同浓度粗提物及化合物的细 胞毒性。 0031(3)。
20、结果处理。 按照公式：计算各 化合物不同浓度下的相对毒性和半数致死剂量(CC50)， 用于评价各化合物的细胞毒性。 0032 本发明乙酸乙酯粗提物及化合物1和2的治疗指数(Selective Index， SI)。 按照公 式： 选择抑制常数(SI)CC50/EC50计算各化合物的选择抑制常数， 以评价各化合物的用药 安全性。 其SI3， 说明乙酸乙酯粗提物及化合物1和2能有效抑制HIV-1裂解复制。 说 明 书 4/7 页 6 CN 105496997 A 6 表2化合物1和2的氢谱和碳谱数据 说 明 书 5/7 页 7 CN 105496997 A 7 说 明 书 6/7 页 8 CN 105496997 A 8 说 明 书 7/7 页 9 CN 105496997 A 9 图1 图2 说 明 书 附 图 1/1 页 10 CN 105496997 A 10 。