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1、10申请公布号CN104195142A43申请公布日20141210CN104195142A21申请号201410431244522申请日20140829C12N15/29200601C12N15/82200601C12N15/66200601A01H5/0020060171申请人云南省农业科学院花卉研究所地址650205云南省昆明市盘龙区北京路2238号72发明人周旭红莫锡君马璐琳苏艳施自明蒋亚莲桂敏田敏74专利代理机构昆明合众智信知识产权事务所53113代理人康珉54发明名称一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法57摘要本发明公开了一种香石竹PS1基因IHPRNA表达载体的构建方法。
2、，本发明首次从香石竹中获得一个与2N配子形成相关的PS1基因，该基因CDNA全长3423BP，编码1140个氨基酸。以香石竹DNA为模板，扩增PS1基因466BP外显子和85BP内含子序列，然后扩增466BP外显子反义片断，将正义和内含子片断以及反义片断同时插入到PCAMBIA13012206表达载体中，从而构成反向互补发卡结构的RNAIIHPRNA表达载体，本发明简化了构建的步骤，且无需专门的RNAI载体，具有简单、快速、高效和成本低等优点，为大规模的植物功能基因研究提供了一个高通量的平台。51INTCL权利要求书2页说明书11页序列表9页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利。
3、申请权利要求书2页说明书11页序列表9页附图5页10申请公布号CN104195142ACN104195142A1/2页21一个与香石竹DIANTHUSCARYOPHYLLUSL减数分裂相关PS1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法，包括以下步骤1香石竹PS1基因正义和内含子片段的克隆及连接、测序和转化以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAI2259F和PS1RNAI2259579INTROR引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因正义和内含子片段PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载体PMD18T，连接产物转化大肠杆菌DH。
4、5感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测序，得到目的正义内含子片段重组子，命名为PMDFINTRO，正义和内含子片段的序列如SEQIDNO2所示；所述PS1RNAI2259F引物的碱基序列如SEQIDNO6所示，PS1RNAI2259579INTROR引物的碱基序列如SEQIDNO7所示；2香石竹PS1基因反义片断的克隆及连接、测序和转化以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAIINVERSEF和PS1RNAIINVERSER引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因反义片断PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载体PMD18T，连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，重组子经PCR鉴定。
5、后测序，得到目的反义片断重组子，命名为PMDR，反义片断的序列如SEQIDNO3所示；所述PS1RNAIINVERSEF引物的碱基序列如SEQIDNO8所示，PS1RNAIINVERSER引物的碱基序列如SEQIDNO9所示；3表达载体PCAMBIA13012206的构建HINDIII/ECORI双酶切PCAMBIA1301，HINDIII/ECORI双酶切PBI2206，回收PCAMBIA1301的大片段和PBI2206的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5感受态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体PCAMBIA13012206；4重组载体的双酶切和回收提取含有P。
6、MDFINTRO重组子质粒和PMDR重组子质粒，PMDFINTRO重组子质粒用BAMH/KPN双酶切，回收香石竹PS1基因正义和内含子片段，PMDR重组子质粒用KPN/SAC双酶切，回收香石竹PS1基因反义片断，表达载体PCAMBIA13012206用BAMH/SAC双酶切，回收PCAMBIA13012206片段；5回收片段的连接将步骤4回收的香石竹PS1基因正义和内含子片段、香石竹PS1基因反义片段和PCAMBIA13012206片段用T4DNA连接酶连接即得香石竹PS1基因IHPRNA载体。3根据权利要求2香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法，其特征在于步骤5所述的载体构建方法为正义。
7、和内含子片断及反义片断同时连接到表达载体PCAMBIA13012206中，PCAMBIA13012206表达载体香石竹PS1基因正义和内含子片断香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为133311。4一种香石竹PS1基因IHPRNA载体，其特征在于IHPRNA载体含有香石竹PS1基因的正义和内含子片段及反义片断；所述的香石竹PS1基因的正义和内含子片段的碱基序列如SEQIDNO2所示，所述的香石竹PS1基因的反义片断的碱基序列如SEQIDNO3所示。5根据权利要求2所述的一种香石竹PS1基因IHPRNA表达载体的构建方法，其特征在于所述的内含子片断为PS1基因本身的内含子。6权利要求4所述香石竹PS。
8、1基因IHPRNA载体在提高香石竹2N配子频率方面的应权利要求书CN104195142A2/2页3用。权利要求书CN104195142A1/11页4一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法技术领域0001本发明属于植物基因工程技术领域，特别涉及一种香石竹PS1基因和香石竹PS1基因IHPRNA载体及其构建方法。背景技术0002RNA干扰RNAINTERFERENCE，RNAI是通过双链RNADOUBLESTRANDEDRNA，DSRNA介导，特异性地降解靶MRNA，使同源的靶基因发生沉默，即序列特异性转录后基因沉默POSTTRANSCRIPTIONALGENESILENCING，PTGS。
9、，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAI现象普遍存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。RNAI已成为分析基因功能的重要工具之一。随着RNAI技术在植物基因功能分析上的广泛应用，迫切需要一种高通量构建含内含子发夹结构RNAIHPRNA表达载体的新方法。0003多倍体植物因其花大、花色浓艳等特点而具有重要的观赏价值。2N配子是多倍体产生的主要途径，多倍化是真菌、植物、无脊椎动物、脊椎动物，尤其是植物进化的主要途径。2N配子是植物育种的重要工具，2N配子在花卉育种如百合、香石竹、红三叶草和报春等也得到了广泛的应用。0004拟南芥中ATPS1基因与减数分裂纺缍体的方向有关，A。
10、TPS1基因突变产生平行、融合和三级纺缍体，形成二分体、三分体和四分体，导致2N花粉产生。ATPS1基因包含7个外显子和6个内含子，编码1477个氨基酸，N端具有FHA结构域，C端具有PINC结构域。在土豆中，PS/PS基因型能形成FDRCO型RSTDIVISIONRESTITUTIONWITHCROSSOVER2N配子，能传递亲本80左右的杂合性。纯合的PS/PS基因突变，在第二次减数分裂产生平行纺缍体和三极纺缍体，导致2N花粉的产生，提示香石竹中PS1基因可能与2N配子的形成有关。0005因此，采有RNAI技术沉默与香石竹PS1基因，不仅有利于揭示香石竹PS1基因的功能，得出PS1与2N配。
11、子形成的相关性，为香石竹利用2N配子进行多倍体育种奠定基础。发明内容0006本发明目的在于提供一种香石竹PS1基因IHPRNA载体及其构建方法，为功能基因的研究打下基础。本发明还提供了一个与香石竹DIANTHUSCARYOPHYLLUSL减数分裂相关PS1基因。0007本发明的技术方案如下00081、一个与香石竹DIANTHUSCARYOPHYLLUSL减数分裂相关PS1基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。00092一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法，包括以下步骤00101香石竹PS1基因正义和内含子片段的克隆及连接、测序和转化0011以香石竹总DNA为模版，用PS1R。
12、NAI2259F和PS1RNAI2259579INTROR引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因正义和内含子片段PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯说明书CN104195142A2/11页5化后，连接克隆载体PMD18T，连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测序，得到目的正义内含子片段重组子，命名为PMDFINTRO，正义和内含子片段的序列如SEQIDNO2所示；是所述PS1RNAI2259F引物的碱基序列如SEQIDNO6所示的，PS1RNAI2259579INTROR引物的碱基序列如SEQIDNO7所示；00122香石竹PS1基因反义片断的克隆及连接、测序和转化。
13、0013以香石竹总DNA为模版，用PS1RNAIINVERSEF和PS1RNAIINVERSER引物对进行PCR扩增，得到香石竹PS1基因反义片断PCR产物，该PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，连接克隆载体PMD18T，连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，重组子经PCR鉴定后测序，得到目的反义片断重组子，命名为PMDR，反义片断的序列如SEQIDNO3所示；所述PS1RNAIINVERSEF引物的碱基序列如SEQIDNO8所示，PS1RNAIINVERSER引物的碱基序列如SEQIDNO9所示的是；00143表达载体PCAMBIA13012206的构建0015HINDIII/ECORI双酶切PC。
14、AMBIA1301，HINDIII/ECORI双酶切PBI2206，回收PCAMBIA1301的大片段和PBI2206的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5感受态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体PCAMBIA13012206；00164重组载体的双酶切和回收0017提取含有PMDFINTRO重组子质粒和PMDR重组子质粒，PMDFINTRO重组子质粒用BAMH/KPN双酶切，回收香石竹PS1基因正义和内含子片段片段，PMDR重组子质粒用KPN/SAC双酶切，回收香石竹PS1基因反义片断，表达载体PCAMBIA13012206用BAMH/SAC双酶切，回收PCAM。
15、BIA13012206片段；00185回收片段的连接0019将步骤4回收的香石竹PS1基因正义和内含子片段、香石竹PS1基因反义片和PCAMBIA13012206片段用T4DNA连接酶连接连接即得香石竹PS1基因IHPRNA载体。00203根据技术方案2所述的香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法，步骤5所述的载体构建方法为正义和内含子片断以及反义片断同时连接到表达载体PCAMBIA13012206中，表达载体PCAMBIA13012206香石竹PS1基因正义和内含子片断香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为133311。00214一种香石竹PS1基因IHPRNA载体，所述香石竹PS1基因IH。
16、PRNA载体含有香石竹PS1基因的正义和内含子片段及反义片断；所述的香石竹PS1基因的正义和内含子片段的碱基序列如SEQIDNO2所示，所述的香石竹PS1基因的反义片断的碱基序列如SEQIDNO3所示。00225根据技术方案2所述的一种香石竹PS1基因IHPRNA表达载体的构建方法，所述的内含子片断为PS1基因本身的内含子。00236一种香石竹PS1基因IHPRNA载体是用技术方案2或3所述的一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法构建得到。00247技术方案4或6所述的香石竹PS1基因IHPRNA载体在提高香石竹2N配子频率方面的应用。0025与现有技术相比，本发明的有益效果是0026。
17、1、本发明首次从香石竹中获得一个与2N配子形成相关的PS1基因，为揭示2N配说明书CN104195142A3/11页6子形成的遗传因素及多倍体种质的创新打下基础；00272、本发明所构建的香石竹PS1基因IHPRNA载体及其构建方法用所述香石竹PS1基因本身的内含子作为间隔区，能够提高基因沉默的效率。00283本发明所述载体的构建方法，将正义和内含子片段、反义片断和表达载体片段同时连接，一步即可构建成香石竹PS1基因IHPRNA载体，具有简单、快速、高效和成本低等优点，为大规模的植物功能基因研究提供了一个高通量的平台。0029序列表中SEQIDNO1所示的是与香石竹DIANTHUSCARYOP。
18、HYLLUSL减数分裂相关PS1基因的核苷酸序列。0030序列表中SEQIDNO2所示的是香石竹PS1基因正义和内含子片段的核苷酸序列。0031序列表中SEQIDNO3所示的是香石竹PS1基因反义片断的核苷酸序列。0032序列表中SEQIDNO4所示的是PS1LEN117F引物的碱基序列。0033序列表中SEQIDNO5所示的是PS1LEN3509R引物的碱基序列。0034序列表中SEQIDNO6所示的是PS1RNAI2259F引物的碱基序列。0035序列表中SEQIDNO7所示的是PS1RNAI2259579INTROR引物的碱基序列。0036序列表中SEQIDNO8所示的是PS1RNAII。
19、NVERSEF引物的碱基序列。0037序列表中SEQIDNO9所示的是PS1RNAIINVERSER引物的碱基序列。附图说明0038图1是香石竹PS1基因全长CDNA电泳图。泳道MDNAMARKER；1香石竹PS1基因全长CDNAPCR产物。0039图2是香石竹PS1基因IHPRNA载体构建示意图。0040图3是香石竹PS1基因正义和内含子片断，以及香石竹PS1基因反义片断电泳图。14香石竹PS1基因正义和内含子片断PCR产物；58香石竹PS1基因反义片断PCR产物；MDNAMARKER。0041图4是PCAMBIA13012206表达载体及香石竹PS1基因正义和内含子片断及香石竹PS1基因反。
20、义片断双酶切图。图AMDNAMARKER；10042PCAMBIA13012206表达载体BAMH/SAC双酶切产物；2含香石竹PS1基因正义和内含子片断重组质粒的BAMH/KPN双酶切产物；图BM1和M2DNAMARKER；1香石竹PS1基因正义和内含子片断重组质粒的BAMH/KPN双酶切产物；24含香石竹PS1基因反义片断重组质粒的KPN/SAC。0043图5是香石竹PS1基因IHPRNA载体PCR鉴定图。MDNAMARKER；14香石竹PS1基因正义和内含子片断PCR产物；58香石竹PS1基因反义片断PCR产物。0044图6是香石竹PS1基因IHPRNA载体酶切鉴定图。MDNAMARKE。
21、R；泳道1香石竹PS1基因IHPRNA载体BAMH/KPN双酶切产物，泳道1箭头所指的酶切条带是香石竹PS1基因正义和内含子片断条带；泳道2香石竹PS1基因IHPRNA载体KPN/SAC双酶切产物，泳道2箭头所指的酶切条带是香石竹PS1基因反义片断条带；泳道3香石竹PS1基因IHPRNA载体BAMH/SAC双酶切产物，酶切条后带较小的片断包含香石竹PS1基因正义和内含子片断，以及香石竹PS1基因反义片断。说明书CN104195142A4/11页7具体实施方式0045下面结合附图对本发明作进一步的详细说明下述实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。0046试验材料00471菌株与载体大肠杆菌菌。
22、株DH5购自北京全式金生物技术有限公司；表达载体PCAMBIA13012206由南京农业大学农学院细胞研究所惠赠；克隆载体PMD18T购自TAKARA公司。00482主要试剂TAQDNA聚合酶、DNAMARKER、限制性内切酶、T4DNA连接酶、MMLV反转录酶购自TAKARA公司；TRIZOL购自INVITROGEN公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯。00493本发明设计了三对引物对PS1LEN117F和PS1LEN3509R；0050PS1RNAI2259F和PS1RNAI2259579INTROR；PS1RNAIINVERSEF和。
23、0051PS1RNAIINVERSER；各引物上海捷瑞生物工程有限公司合成。0052PS1LEN117F引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO4所示。0053PS1LEN3509R引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO5所示。0054PS1RNAI2259F引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO6所示。0055PS1RNAI2259579INTROR引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO7所示。0056PS1RNAIINVERSEF引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO8所示。0057PS1RNAIINVERSER引物的碱基序列如序列表中SEQIDNO9所示。00584植物材料香石竹DIANT。
24、HUSCARYOPHYLLUSL为市售。0059实施例1香石竹PS1基因的克隆00601香石竹总RNA的提取及纯化00611提取RNA所用的枪头、离心管、镊子、剪刀、小钢勺、研钵、量筒等用01的DEPC于37恒温箱中处理至少12H后进行高压灭菌。00622取香石竹1112CM长的花蕾置于研钵中，加液氮充分研磨后分装于加有1MLTRIZOL的15ML离心管中，漩涡震荡15SEC，室温静置5MIN；006334、12,000RPM离心15MIN，小心将上清液移入新的15ML离心管，加入等体积的酸酚氯仿异戊醇25241混合液，漩涡震荡15SEC后室温静置10MIN；006444、12,000RPM离。
25、心10MIN，将上清液移至新的15ML离心管，加入等体积的氯仿异戊醇241混合液，漩涡震荡15SEC后室温静置10MIN；006554、12,000RPM离心10MIN，将上清液移至新的15ML离心管，加入等体积异丙醇，室温下静置10MIN；006664、12,000RPM离心15MIN，去除上清，RNASEFREE水配制的75乙醇洗涤；006774、12,000RPM离心5MIN，去除上清，加适量RNASEFREE水2040L溶解总RNA。00682CDNA合成00691在MICROTUBE管中配制下列模板RNA/引物混合液。0070说明书CN104195142A5/11页8试剂名称使用量R。
26、NA3LOLIGODT18PRIMER50M1LRNASEFREEDH2O3LTOTALVOLUME7L0071270保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。00723离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于MICROTUBE管底部。00734在上述MICROTUBE管中配制下列反转录反应液。0074试剂名称使用量上述模板RNA/引物变性溶液7L5MMLVBUFFER2LDNTPMIXTURE各10MM05LRNASEINHIBITOR40U/L025LRNASEMMLV200U/L025LTOTALVOLUME10L0075542保温1小时。0076670保温15分钟后冰上冷却，得到的C。
27、DNA溶液用于PCR扩增。00773香石竹PS1目的基因的获得00781PCR反应0079以PS1LEN117F和PS1LEN3509R为引物，扩增全长香石竹PS1基因CDNA序列，按下列组成配制PCR反应液，全量50L。0080试剂名称使用量CDNA溶液1LDNTPMIXTURE各25MM4LPS1LEN117F10M2LPS1LEN3509R10M2L说明书CN104195142A6/11页910EXTAQBUFFERMG2PLUS5LTAKARAEXTAQ5U/L025LDH2O3575LTOTALVOLUME50L0081PCR反应条件如下0082941MIN，9430SEC，5530。
28、SEC，723MIN40CYCLES，7210MIN。00832RTPCR扩增结果0084PCR反应结束后，全量PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。用胶回收试剂盒，切胶回收目的条带。00854连接、转化、测序00861在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5L。0087试剂使用量0088PMD18TVECTOR1L0089PS1基因全长CDNA4L00902加入5L等量的SOLUTIONI。0091316反应30分钟。00924全量10L加入至50LDH5感受态细胞中，冰中放置30分钟。0093542加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。00946加入500LLB培养基，37振荡培养。
29、60分钟。00957在含有XGAL、IPTG、AMP的L琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。00968挑选白色菌落，使用PCR法确认阳性克隆。00979阳性克隆送上海杰李生物技术有限公司进行序列测定。测定的香石竹PS1目的基因序列如序列表中SEQIDNO1所示。该基因CDNA全长3423BP，编码1140个氨基酸。0098实施例2表达载体PCAMBIA13012206的构建参见中国发明专利20101050179940099HINDIII/ECORI双酶切PCAMBIA1301PCAMBIA1301购自澳大利亚国际农业分子生物学应用中心，HINDIII/ECORI双酶切PBI2206购自北京鼎国昌。
30、盛生物技术有限责任公司，回收PCAMBIA1301的大片段和PBI2206的小片段，T4DNA连接酶连接，连接产物转化DH5感受态细胞，提取质粒，进行双酶切验证，得到改造好的表达载体PCAMBIA13012206。0100实施例3香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建0101香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建以香石竹DNA为模板，扩增PS1基因466BP外显子和85BP内含子的序列，然后扩增466BP外显子反义片断，将正义和内含子片断，以及反义片断同时插入到PCAMBIA13012206表达载体中。具体步骤如下0102香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建过程如图2，具体步骤如下01031。
31、香石竹总DNA提取说明书CN104195142A7/11页1001041把少量香石竹叶片和茎段放入液氮中迅速研磨成粉末；01052加入650ULCTABBUFFER溶液65预热与离心管内，放于水浴锅内温浴45MIN1H10MIN摇一次；01063水浴过后加入等体积241的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。10000RPM离心10MIN，抽提2次；01074将上清液转入另一离心管中，加入2/3倍体积20预冷的异丙醇，混匀，放置30MIN。观察DNA沉淀生成；0108510000RPM离心10MIN，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液；01096用70乙醇洗涤沉淀，吹干101。
32、5MIN；01107加入50LDDH2O溶解；01118电泳检测。01122香石竹正义和内含子片断，以及反义片断的获得01131香石竹正义和内含子片断，以及反义片断的PCR扩增0114用PS1RNAI2259F和PS1RNAI2259579INTROR引物扩增香石竹PS1基因正义和内含子片断，用PS1RNAIINVERSEF和PS1RNAIINVERSER引物扩增香石竹PS1基因反义片断，两个扩增均按下列组成配制的PCR反应液和PCR反应条件进行PCR扩增。0115PCR反应条件如下0116941MIN，9430SEC，6430SEC，723MIN40CYCLES，7210MIN。01172P。
33、CR扩增结果0118PCR反应结束后，全量PCR反应液进行了琼脂糖凝胶电泳，结果如图3。用胶回收试剂盒，切胶回收目的条带。01193连接、转化、测序01201在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5L。0121试剂使用量0122PMD18TVECTOR1L0123香石竹PS1基因正义和内含子片断或香石竹PS1基因反义片断4L01242加入5L等量的SOLUTIONI。说明书CN104195142A108/11页110125316反应30分钟。01264全量10L加入至50LDH5感受态细胞中，冰中放置30分钟。0127542加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。01286加入500LLB培养基。
34、，37振荡培养60分钟。01297在含有XGAL、IPTG、AMP的L琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。01308挑选白色菌落，使用PCR法确认阳性克隆。01319阳性克隆送上海杰李生物技术有限公司进行序列测定。测定的香石竹PS1基因正义和内含子片断的序列分别如序列表中SEQIDNO2所示。测定的香石竹PS1基因反义片断的序列如序列表中SEQIDNO3所示。得到香石竹PS1基因正义和内含子片段、命名为PMDFINTRO；得到香石竹PS1基因反义片段重组子，命名为PMDR。01324重组载体DNA的双酶切0133用质粒提取试剂盒提取含有PMDFINTRO和PMDR重组子的质粒，重组质粒PMDFI。
35、NTRO用BAMH/KPN双酶切，重组质粒PMDR用KPN/SAC双酶切，表达载体PCAMBIA13012206用BAMH/SAC双酶切，酶切时间为3小时如图4。双酶切反应体系50L，按以下组份配制0134试剂名称使用量PMDFINTRO8LBAMH2LKPN2L05K25DH2O355全量50L0135试剂名称使用量PMDR8LSAC2LKPN2L1L5DH2O33说明书CN104195142A119/11页12全量50L0136试剂名称使用量PCAMBIA130122068LBAMH2LSAC2L05K25DH2O355全量50L01375酶切片段回收、连接与转化0138用胶回收试剂盒回收。
36、酶切片断，将目的条带切胶回收后，载体香石竹PS1基因正义和内含子片断香石竹PS1基因反义片断的摩尔比为133，16连接16小时，连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞。0139连接体系总量为20L，按以下组份配制0140试剂名称使用量PCAMBIA13012206片段2L正义和内含子片断6L反义片断6L10T4DNALIGASEBUFFER2LT4DNALIGASE2LDH2O2L全量20L01416重组子的鉴定0142将步骤5的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取白色大肠杆菌，放入2MLLBAMP抗性的液体培养基内，37200RPM振荡培养16小时。01431PCR鉴定0144用PS1R。
37、NAI2259F和PS1RNAI2259579INTROR引物扩增香石竹PS1基因正义和内含子片断，用PS1RNAIINVERSEF和PS1RNAIINVERSER引物扩增香石竹PS1基因反义说明书CN104195142A1210/11页13片断，两个扩增均按下列组成配制的PCR反应液和PCR反应条件进行PCR扩增。01450146PCR反应条件如下0147941MIN，9430SEC，6430SEC，723MIN40CYCLES，7210MIN。01482PCR扩增结果0149PCR反应结束后，全量PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5。扩增出香石竹PS1基因正义和内含子片断以及香石竹P。
38、S1基因反义片断为阳性重组子。01503双酶切鉴定0151用质粒提取试剂盒提取含有阳性重组子的质粒，重组质粒分别用BAMH/KPN、KPN/SAC双酶切和BAMH/SAC双酶切，酶切时间为3小时，双酶切反应体系50L，按以下组份配制0152试剂名称使用量重组质粒8LBAMH2LKPN2L05K25DH2O355全量50L0153试剂名称使用量说明书CN104195142A1311/11页14重组质粒8LSAC2LKPN2L1L5DH2O33全量50L0154试剂名称使用量重组质粒8LBAMH2LSAC2L05K25DH2O355全量50L0155酶切结果如图6，分别切出香石竹PS1基因正义和内。
39、含子片断561BP、香石竹PS1基因反义片断476BP和插入的DNA片断1037BP包括香石竹PS1基因正义和内含子片断，以及香石竹PS1基因反义片断，表明构建了香石竹PS1基因IHPRNA载体。说明书CN104195142A141/9页15云南省农业科学院花卉研究所一种香石竹PS1基因IHPRNA载体的构建方法/9PATENTINVERSION3313423DNA香石竹（DIANTHUSCARYOPHYLLUSL）1ATGTCGAAACTCCAAAAAGAGAGAGAAATCCCAGTTTTCACAGTTTGGAAGAACAATGCC60ATACTCAAGAACATCTTCCTCATCGAT。
40、AATCCTCCTAATTTCAACGATAATCAAGAACGT120AACGACGATGAAATTCAACGAGAAGTCGAAGAAACGTTGTTAGTCGGTCGACATCCAGAT180TGTGATATTCGAGTGGAACATCCGAGTATTAGCAGATTTCATCTCCGCATTCATTCGTTA240CCGACATTGAATCTCCTCTTTATTACTGATTTATCTTCTGTGCACGGGACGTGGGTGTCA300GATAAAAGGATTGAACCGAACATAAGAACGCCGATAAAAGTGGGTGATCATCTTAGGATT360GGAGGGTCTAGT。
41、AGGGTTTACAAGCTTCACTGGATTCCTTTGAGCCTTGCTTATGACGTG420TCGAAACCATTTGTGCCGCCCCTTGATTTCTCTGTGCAGCGCGAAGATGAGGACGAAATC480GTCAAGGACGAGATTTCAGTAGGGTTAGAAGACGAGAAGGTGAATAATGTCGATAACATT540TCTGATGACGTTTCAAACGTTCTGGAGTCTTTGGATCTATGTAATGGTGATGAGACGGTT600ACTCAGAAACCTGTTTTGTTGGAAGATGTGGGTACTGAATTGGTGGATGTCAATTTCGAA。
42、660序列表CN104195142A152/9页16CATTGCGATGGCATATCTCGAGAACTTGTGCGAAAAGAAATGCTCCTGGAACCTCTTACT720GGAGACAATGAATCTGAAAACGAAGATATTCAGTCAATGGACTCTCTTCTGGAAGGGTTG780GTGCCTCTTTTCTTGGGTGAGAACTGGGAATGGGTTGGTCAGGATGAGAACTGTCTTCCA840CGTTCGACAGAAGACGATAATCATCTGCTGTCTTCTAAAGAAACCGAAAAAGATCTTGGC900GGTGCAGTATTGGAGGGATCAA。
43、ATGATTCGTTTTCAATTGAGAATTTAGAACTTTTAACT960CAGAGAGAGACCTCGTCAGCGACTCTTGTACCCGAACACATGGAATTTCCTAAGGCAGAA1020AACGTGGATGACATCAAAGCTGAAGGAAGACAGGATCCTACAGAAGTAGATCATTGTCTA1080CCGTCAACTGGATTTGTTAGCCCGGTGTTGGAGGGATCAAATGTTACGTTTGTGGATGAG1140AACTCTGAATTGTTACACCAGAAAACCAGCTCATTGGAGGCTCCAATTTCAGAAGACGTG1200GAA。
44、TTTTCTACGGCAGAAAACATGGATGGCATCACAGCTGAAGGAAGACAGGATCCTACA1260GAAGTAGATCGTTGTCTACCGTCAACAGGGTTTGTTAGCCCGGTGTTGGAGGGATCAAAT1320GTTACGTTTGTGGATGAGAACTCTGAATTGTTACACCAGAAAACCACCTCATTGGAAGCT1380CCAATTTCAGAAGACGTGGAATTTTCTACGGCAGAAAACATGGATGGCATCACAGCTGAT1440GGAGTACAGGAGGAATTAGTATCTGAAGTTTTAGGAGAAGCCGTTGA。
45、TCCATGGAGTTTC1500TGGTGTGGAACACTTGTAGAATCATCATCATCTCCTGTCACTGCAGAGTATCAGCCACTT1560GTCGATACTTTATTCCTAGACGAGAACTTCGGACTGCTAGCTCAGAAAGGCACATCATCA1620GCAACAGAAAACATATATAACCTCATTGCTGAAGAAAAAAACAATAAAATTGTTGAAGAA1680GATGTTGAAGATAAAGCCTGGAGTTTTTGGTGTGGGAGTCATCAACCTGGTGTAGAAAAT1740GACAAGACAACAAACGAATCAGCTGAA。
46、GCATTGTCTAAAAAAGCATCCTCAGGAAGCTCG1800序列表CN104195142A163/9页17AGTTCAGACCTGAATTCACCGACCAAGGAACACCCAGGAAATGAACTGTGGAGTTTTTGG1860TCAGGAAAGATGGGGGTCGAATCCGTTTGCTCAGCATTGTCCGATGCAGAACCCTTCTCA1920GATTCGGAATATAAATCGTTGCCAAATGGTTATCTGAGTTCCCCTATGATATCGTCAGGA1980CAAAACTCTGCCCACGGTTTTTGGTCCAAGAGAGAATTACCGAAAGAT。
47、ACATCTTGTGGA2040GACTGTTATCGAAGCCCAACATCCAACAGTTCTGTCATAGGGCGATTGGGGAGTCCTCTT2100ATGACATCTGACCAGAACCCTATGGATAGTATTTGGTTGAGAAGAGGTAAATTAGCGAGC2160GCTCCTCAAGTTCTAACCAGCAGAACCGAAGAAAAGAAAGGAAACTCAGATCAGAAGAAC2220GCCAAGCGTGAATCCATCTCGAGGATGCTTTTTAAAGGGAATGATGATGAGGAGGAGGAG2280GAAGAGGAAGAAGTCTTCACTCCCGATA。
48、AAGAAAATTTCACCCCTACTACACACAAGTCC2340ATGAGAAAGTTTACAATTTTGAAAGAGATTAATAATAATTCGAGTCCAGGCAAATCACCC2400CTTTCCAAGATGACTTTTAGTCCTGACAGCCGTTGCGTGGATGTCGTCTCTCCCTTGTCA2460GATAAAGAAAATTACTCGACAAGAACTAAAGGAAAGAAGAAAACTGCAACACGTGGTTCC2520GCAAATCGAGTACGATCAGTCAAGCTGAAAGAGAGAAATGCAGTTCGGATGCCATTCCAA2580TCGCTGCT。
49、AGCTAATTCACCCCAGAAGAGTGATACTGAATACTACATTGCTGAACTTGAA2640ACAAGAAATGCAAGTTCCGTCGATGATCCAAATGTTATCACACGAAAGGTAAAATGCGTT2700AAAGAGGAACTTCAACAGTGGAACATGGTAGTGGATACGACAACTCTACTGAACAAGGAA2760TCGAGAAAGGCATTGCAGCTTCTTGAAGGTCTGAAAGGAACCAAACTAATCGTCCCCAGA2820ATAGTGATCACGGAGCTTTCAAGCTTGAAACGACAGTTAAGCTTCTTCAGAAGAAATACG2880GAGGTACTGTCAGCCTTGGAATGGATACAAGAATGTATGCTGAAAACTGGATGGTGGATT2940CAGGTCCGAAACTCGGCGGAAGAAGGCCGACCAGTTGCACC。