技术领域
本发明涉及免疫技术领域，具体的涉及一种多价脑膜炎球菌结合疫苗及其制备方法。
背景技术
由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)感染所致的流行性脑脊髓膜炎(流脑)，是一种世界范围内发病的急性呼吸道传染病，根据Nm荚膜多糖构成的不同，可将其分成13个血清群，且所有血清群均可致病，其中尤以A、B、C、Y、W135群所致疾病为主，约占Nm疾病的95％以上，且可引起爆发和流行。
疫苗接种是预防流脑疾病既经济又有效的途径。世界各国根据各自流脑疾病菌群致病特点，开发了不同种类和不同组合的脑膜炎球菌疫苗，其中包括荚膜多糖疫苗：A群、C群、AC群、ACYW135群及由破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)、白喉无毒变异株(CRM197)为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗有：A群、C群、AC群、ACYW135群。B群脑膜炎球菌疫苗有：古巴Finlay研究所生产的VA-MENGOC-BC疫苗，含B群OMV，C群CPS(荚膜多糖)，AL(OH)3佐剂，及诺华4C Men B(Bexsero)疫苗，含有fHbp Ⅰ型蛋白，Nad A蛋白和NHBA蛋白，后又加入新西兰B群OMV疫苗(MeNZB)组成。
目前，国际、国内研究及已上市的各种组合的脑膜炎球菌多糖-蛋白结合疫苗，所用载体蛋白分别有CRM197(无毒白喉变异株类毒素)、TT(破伤风类毒素)、DT(白喉类毒素)。这些蛋白载体虽也能刺激机体产生相应的抗体，但这些抗体与脑膜炎球菌疾病的预防无关，仅具有载体效应。并且，TT和DT是由各自细菌毒素经甲醛或戊二醛脱毒而来的，在百白破三联疫苗的应用中为规避出现毒性逆转，需要加入微量甲醛或戊二醛来维持其脱毒效果的稳定性。但是，在以TT或DT为蛋白载体的结合疫苗中是不加甲醛或戊二醛的，因而存在着蛋白载体“毒性逆转”的风险。并且，破伤风毒素是高致敏原性物质，难免存在着因脱毒不彻底而致的破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)为载体蛋白的多糖-蛋白结合疫苗接种的包括“过敏反应”等的安全隐患。
当使用单一载体蛋白的多价多糖结合疫苗接种时，难免会引起接种机体抗原位点竞争现象，因接种机体的同一种载体特异性T细胞数量是有限的，因此在单一载体的多种多糖结合物间会产生竞争性抑制，而某些抗原找不到相应结合位点，使得免疫效果下降。这种现象称为“抗原位点竞争”。文献报导，TT引起的表位抑制现象更明显。
另外，由于多价多糖－蛋白结合疫苗仅用一种载体蛋白，由于载体蛋白太单一，造成每次接种时载体蛋白的接种剂量太大，因而导致接种机体针对载体蛋白大量及多次重复接种后的免疫耐受，影响其结合到载体蛋白上的多糖的免疫原性，致使免疫应答下降。这种现象称为“免疫耐受”。已引起国内、外学者的高度关注和重视。
因此，有必要开发一种有效预防A、C、Y和W135群脑膜炎球菌感染性疾病的疫苗。
发明内容
本发明的第一个目的在于规避由TT或DT为蛋白载体结合疫苗而引起的毒性逆转、过敏反应等不安全风险，同时克服由单一载体蛋白制备多价多糖结合疫苗所致的抗原位点竞争、免疫耐受影响免疫效果的缺陷，提供一种有效预防A、C、Y、W135群脑膜炎球菌感染性疾病的疫苗。本发明的第二个目的在于提供一套以二株不同血清型B群外膜蛋白为载体的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗规模化生产工艺，实现产业化生产方案。
为达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，具体的，所述疫苗为4价结合疫苗，含有A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与B群血清型4型和15型外膜囊蛋白中的一种外膜囊蛋白偶联获得的多糖-蛋白偶联物。
可选的，在所述疫苗中，A、C、Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖中的两种荚膜多糖分别与B群血清型4型外膜囊蛋白共价偶联形成以B群血清型4型外膜囊蛋白为载体的两种多糖-蛋白偶联物，另外两种荚膜多糖分别与B群血清型15型外膜囊蛋白偶联形成以B群血清型15型外膜囊蛋白为载体的另外两种多糖-蛋白偶联物。
例如，在本发明的一种实施方式中，A和C群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与B群血清型4型外膜囊蛋白共价偶联形成以B群血清型4型外膜囊蛋白为载体的两种多糖-蛋白偶联物，另外两种荚膜多糖，即Y和W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖分别与B群血清型15型外膜囊蛋白偶联形成以B群血清型15型外膜囊蛋白为载体的两种多糖-蛋白偶联物。以上共获得四种多糖-蛋白偶联物，将这四种多糖-蛋白偶联物混合后获得本发明所述的4价结合疫苗。
在本发明中，所述B群脑膜炎球菌包括按照不同分型方法划分的不同亚型、基因型、克隆群和来自于不同地区的优势致病菌株。
在本发明中，所述疫苗的生产菌株来源于CMCC，但不限于其他来源的同一血清群和不同血清型菌株。
可选的，A群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29201；
C群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29205；
Y群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29028；
W135群脑膜炎球菌的荚膜多糖来自菌株CMCC29037；
B群血清型4型脑膜炎球菌的外膜蛋白来自菌株CMCC29356；
B群血清型15型脑膜炎球菌的外膜蛋白来自菌株CMCC29361。
在本发明的脑膜炎球菌结合疫苗中，所述疫苗中游离多糖的含量≤15，游离蛋白的含量≤3％；所述疫苗免疫动物后，血清抗体阳转率≥90％。
可选的，每种荚膜多糖在所述脑膜炎球菌结合疫苗的每剂免疫剂量中各有4-20μg/mL。
可选的，(1)所述疫苗为液体剂型时，任选含或不含铝佐剂；不含铝佐剂时稀释液为缓冲生理盐水；含铝佐剂时，所述铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝；
(2)所述疫苗为冻干剂型时，任选含有的赋形剂包括乳糖、蔗糖、明胶、山梨醇或人血白蛋白。
可选的，所述疫苗为冻干剂型，用于稀释疫苗的稀释液是缓冲生理盐水、生理盐水；或者所述稀释液为含有铝佐剂的缓冲液或生理盐水，其中，每毫升稀释液中铝含量为0.2-1.0mg。
为达到本发明的第二个目的，本发明提供了所述脑膜炎球菌结合疫苗的制备方法，其中，A群、C群、Y群、W135群荚膜多糖的制备包括以下步骤：
(1)分别对A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传代至第4或第5代进行发酵罐培养，甲醛杀菌，离心收获培养上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，离心收集复合多糖，以氯化钠或氯化钙解聚复合多糖，分步乙醇沉淀，收获粗制多糖；
(2)以中性醋酸钠溶液溶解粗制多糖，再以冷酚抽提或离子交换层析和分子筛层析，收获精制多糖，除菌过滤，获得符合质量标准要求的多糖原液。
可选的，B群血清型外膜蛋白的制备包括以下步骤：
(1)分别对B群血清型4型、15型脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传代至第4或第5代进行发酵罐培养，待细菌生长至对数生长期后期或静止期前期，终止培养，离心收获菌体；
(2)外膜囊蛋白溶出：用生理盐水或pH6-8.8的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤并离心收获菌体，向菌体中加入0.5-1.5M NaCl溶液或0.1-0.5M氯化锂-醋酸钠提取液溶出外膜囊蛋白，离心收集上清液；
(3)外膜囊蛋白纯化：将步骤(2)的上清液用冷乙醇分步沉淀，离心收集沉淀，用注射用水复溶后，加硫酸铵分步沉淀，注射用水溶解后加脱氧胆酸钠解聚，超滤收集浓缩液，用三氯醋酸沉淀，离心收集沉淀，注射用水溶解后超滤浓缩，并依次进行离子交换层析，疏水层析，分子筛层析，收集样品，除菌过滤，取样检定，符合质量要求的为合格外膜囊蛋白原液，置2-8℃保存或冷冻干燥保存。
(4)步骤(3)的技术参数具体为：向步骤(2)的上清液中加入冷乙醇至终浓度为55-75％；离心收沉淀，注射用水复溶后，加硫酸铵至终浓度为15-65％进行分步沉淀，分别收获上清或沉淀物，沉淀物复溶后加入脱氧胆酸钠至终浓度0.2-1.0％，振荡后进行超滤，收集浓缩液，加入三氯醋酸至终浓度0.2-3.0％，离心收集沉淀，注射用水溶解，超滤，然后依次进行离子交换层析，疏水层析和分子筛层析，收集样品。
可选的，所述方法包括将四种多糖-蛋白偶联原液混合获得4价结合疫苗，其中多糖-蛋白偶联原液的制备包括以下步骤：
分别量取脑膜炎球菌多糖，经CNBr活化后，再在活化糖链上连接ADH，形成荚膜多糖-ADH衍生物，超滤去除游离的CNBr和ADH后，加入B群血清型OMV，混合均匀，经加入的EDAC缩合作用，在ADH的桥联作用下形成共价结合的多糖-蛋白偶联物，超滤去除残余的EDAC等小分子物质并浓缩体积，经分子筛层析，收集高分子量多糖-蛋白偶联物。
本发明所提供的脑膜炎球菌结合疫苗有效规避了由单一载体蛋白制备多价疫苗存在的免疫耐受和抗原位点竞争所致的影响疫苗免疫应答的风险，及以TT、DT为载体蛋白制备结合疫苗存在的过敏反应和毒性逆转等的安全性风险，并能够增进A群免疫作用，提供较广泛范围的针对B群有保护作用的杀菌抗体。同时提供了完整的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗生产工艺，并能适应规模化生产。研究表明，本疫苗具有良好的免疫原性及可靠的安全性及稳定的免疫持久性。
本发明具有以下优点：
1、以二株B群不同血清型OMV为载体蛋白制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗显示了良好的载体效应和更好的免疫应答。与TT、DT为载体蛋白的各血清群偶联物的多糖回收率比较，OMV载体偶联物回收率更高，尤其是C群、W135群的回收率更高，具有统计学差异。
2、动物免疫原性抗体效价，OMV载体偶联物的二针次免疫效价相等于TT载体偶联物三针次免疫效价水平且高于三针次DT载体偶联物免疫效价水平。这可能与单一TT或DT载体蛋白多价偶联物的抗原位点竞争作用有关，有待更进一步深入研究、分析。
3、各血清群多糖偶联物的抗原相融性良好，在小鼠的免疫针次效应研究中，间隔二周的三针次免疫后血清IgG抗体效价测定中，具有显著的免疫回忆应答反应，血清抗体呈现明显的几何级增长，也包括针对B群二个血清型的抗体增长。
4、各血清群菌株的发酵培养，抗原原液制备及偶联物制备工艺稳定、实用。产品质量可控性强，稳定性好，奠定了规模化生产可靠的基础。
5、经动物安全性研究，包括急性毒性、异常毒性、过敏原性、热原检测、无菌检查及免疫原性试验等，证实疫苗具有可靠的安全性和有效性。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1
实施例1用于说明本发明的脑膜炎球菌结合疫苗的制备方法。
本疫苗中各血清群菌的抗原成分如下：
A群脑膜炎球菌：菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29201，抗原成分是：荚膜多糖(CPS)；
C群脑膜炎球菌：菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29205，抗原成分是：荚膜多糖(CPS)；
Y群脑膜炎球菌：菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29028，抗原成分是：荚膜多糖(CPS)；
W135群脑膜炎球菌：菌株来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29037，抗原成分是：荚膜多糖(CPS).
B群脑膜炎球菌血清型4型菌株，来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29356，抗原成分是：外膜囊蛋白(OMV)；
B群脑膜炎球菌血清型15型菌株，来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，菌株号：CMCC29361，抗原成分是：外膜囊蛋白(OMV)。
1、A群、C群、Y群、W135群荚膜多糖的制备：
(1)分别对A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传代至第4或第5代进行发酵罐培养，甲醛杀菌，离心收获培养上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，离心收集复合多糖，以氯化钠解聚复合多糖，分步乙醇沉淀，收获粗制多糖；
(2)以中性醋酸钠溶液溶解粗制多糖，再以离子交换层析和分子筛层析，收获精制多糖，除菌过滤，取样检定，符合质量标准要求，为合格多糖原液。置-20℃以下液体保存。
2、B群血清型外膜蛋白的制备包括以下步骤：
(1)分别对B群血清型4型、15型脑膜炎球菌菌株进行种子扩增培养，并连续传代至第4或第5代进行发酵罐培养，待细菌生长至对数生长期后期或静止期前期，终止培养，离心收获菌体；
(2)外膜囊蛋白溶出：用生理盐水或PH6-8.8的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤并离心收获菌体，向菌体中加入0.5-1.5M NaCl溶液或0.1-0.5M氯化锂-醋酸钠提取液溶出外膜囊蛋白，离心收集上清液；
(3)外膜囊蛋白纯化：将步骤(2)的上清液用冷乙醇分步沉淀，离心收集沉淀，用注射用水复溶后，加硫酸铵分步沉淀，注射用水溶解后加脱氧胆酸钠解聚，超滤收集浓缩液，用三氯醋酸沉淀，离心收集沉淀，注射用水溶解后超滤浓缩，并依次进行离子交换层析，疏水层析，分子筛层析，收集样品，除菌过滤，取样检定，符合质量要求，为合格外膜囊蛋白原液，置2-8℃保存或冷冻干燥保存。
(4)步骤(3)的技术参数具体为：向步骤(2)的上清液中加入冷乙醇至终浓度为55-75％；离心收沉淀，注射用水复溶后，加15-65％硫酸铵分步沉淀，分别收获上清或沉淀物，沉淀物复溶后加入脱氧胆酸钠至终浓度0.2-1.0％，振荡后进行超滤，收集浓缩液，加入三氯醋酸至终浓度0.2-3.0％，离心收集沉淀，注射用水溶解，超滤，然后依次进行离子交换层析，疏水层析和分子筛层析，收集样品。
3、多糖-蛋白偶联原液的制备：
(1)A群、C群脑膜炎球菌偶联物制备：分别量取A群或C群脑膜炎球菌多糖，各自经CNBr活化后，再在活化糖链上连接ADH，形成荚膜多糖-ADH衍生物，超滤去除游离的CNBr，ADH后，加入B群血清型4型OMV，混合均匀，经加入的EDAC缩合作用，在ADH的桥联作用下形成共价结合的多糖-蛋白偶联物，超滤去除残余的EDAC等小分子物质并浓缩体积，经分子筛层析，收集高分子量多糖-蛋白偶联物，并经除菌过滤后，取样检定，符合质量要求，为合格的A群或C群多糖-蛋白偶联原液，置2-8℃保存。
(2)Y群、W135群脑膜炎球菌偶联物制备：分别量取Y群或W135群脑膜炎球菌多糖，各自经CNBr活化后，再在活化糖链上连接ADH，形成多糖-ADH衍生物，超滤去除游离的CNBr，ADH后，加入B群15型OMV，混合均匀，经加入的EDAC缩合作用，在ADH的桥联作用下形成共价结合的多糖-蛋白偶联物，超滤去除残余的EDAC等小分子物质并浓缩体积，经分子筛层析，收集高分子量多糖-蛋白偶联物，并经除菌过滤后，取样检定，符合质量要求，为合格的Y群或W135群多糖-蛋白偶联原液，置2-8℃保存。
4、ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗稀释、配制、分装、冻干：
(1)根据A、C、Y、W135群多糖－蛋白偶联原液检测的各自多糖含量，依据每剂人用剂量要求，稀释至每毫升含每群多糖各8μg，再加12.5％附加剂量计数，混合四种多糖-蛋白偶联物获得4价结合疫苗半成品混合液。
(2)在(1)混合液中补加含乳糖赋形剂20mg/ml的稀释液至疫苗抗原含量，混合均匀后进行分装。
(3)疫苗内包材为2ml中硼硅西林瓶，每剂分装量为0.5ml。分装后加硅胶塞为半压塞状态。置预冷冻干机内进行冷冻干燥。
(4)疫苗冻干：分装后疫苗进入预冷冻干机内，经冷冻、一次升华、二次升华、板温干燥(＜30℃)后，真空压塞，输出冻干机，加压铝盖后，置2－8℃保存。
(5)冻干疫苗抽样检定，符合各项质控要求，为合格品疫苗，置2－8℃保存。
实施例2
实施例2用于说明不同载体蛋白ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较
1、目的
分别比较由三种不同载体蛋白[B群流脑OMV(ST.4,15),TT,DT]制备的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫原性，并用ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗作对照，了解其各自产生抗体效价的差异性。
2、实验方法
选用6周龄BALB/C小鼠，每组20只，分别设疫苗组、稀释液对照组和空白对照组，皮下注射0.5ml/次，结合疫苗组各含1.5μg/A、C、Y、W135群多糖，分别于0、14、21天各接种1针，共3针，每次免后14天采血，分离血清，采用ELISA测定每只小鼠血清IgG抗体效价。
3、结果判断
以稀释液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值，疫苗组小鼠血清高于Cutoff值判为阳转。计算各组小鼠血清阳转百分率(％)。另外根据测定的每只小鼠血清的ELISA OD值，计算各组OD值几何平均滴度(GMT)。
4、实施结果见表1，不同载体蛋白ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较。
表1
5、结果分析
5.1载体效应：表1结果显示了以多糖疫苗为对照的三种载体蛋白(B.OMV,TT,DT)结合疫苗的不同针次免疫应答的血清ELISA效价，表明结合疫苗各血清群抗体效价明显优于多糖疫苗。多糖－蛋白结合疫苗中蛋白载体效应促进了多糖抗原的免疫原性。
5.2不同载体蛋白的各血清群多糖抗体效价分析结果显示，无论是从各血清群多糖免后GMT和阳转率及针次效应比较可见，以B群OMV(ST4,15，实施例1制备的脑膜炎球菌结合疫苗)为载体蛋白的结合疫苗的抗体效价均优于以TT或DT为载体蛋白的结合疫苗。
5.3根据文献报道，同一载体蛋白的多价结合疫苗联合应用时，有可能会产生免疫耐受和抗原位点竞争性抑制现象，因此，采用二株不同血清型B群流脑OMV为载体蛋白的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的抗体效价，阳转率均优于单一载体(TT,DT)的结合疫苗，也与文献报道结果相符。
实施例3
ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗B群抗体测定及对其他血清型B群菌的交叉抗体效价
1、实验方案
1.1免疫用疫苗：以二株B群(ST4,15)OMV为载体蛋白的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，批号20140601，2040602，20140603。
1.2实验动物：BALB/C小鼠，12-14克/只体重。
1.3分组：每组20只小鼠，雌雄各半，每罐饲养5只同性别小鼠。
1.4免疫：皮下注射；免疫剂量：含A、C、Y、W135群多糖各2.0μg/剂次。
1.5免疫程序：全程免疫三针次，免疫间隔14天，即0、14、28天各免疫一针，末次免后二周采血，分离血清，经ELISA测定每只小鼠血清效价，计算每组几何平均滴度(GMT)。
2、免疫血清ELISA效价见表2，ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗免疫小鼠血清B群抗体及B群交叉抗体GMT。
表2
3、结果分析
表2结果显示，三批ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗的免疫小鼠血清中，针对载体蛋白(ST4,15)显示出很高的ELISA效价，且针对不同血清型别的其他B群菌株B16B6(2a)、S3446(14)、CMCC29316(2)均具有较好的交叉抗体效价。说明载体蛋白具有较好的免疫原性及较广泛的交叉保护性抗原。
实施例4
疫苗的佐剂效应：以同批疫苗半成品配制三种剂型和佐剂应用形式的ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，分别免疫小鼠，采集小鼠血清，ELISA测定每只小鼠血清效价，计算每组GMT，分析、评判佐剂应用的选择。
1、实验方案
1.1疫苗配制
1.1.1抗原来源：同批疫苗半成品批号20140604
1.1.2三种剂型和佐剂组合，见表3，同批疫苗半成品配制三种剂型和不同佐剂疫苗组成及免疫针次的抗体应答。
表3
1.2实验动物：BALB/C小鼠，12-14克/只。
1.3分组：每组10只小鼠，雌雄各半，每罐饲养5只同性别小鼠。
1.4小鼠免疫：皮下注射；免疫剂量，各含A、C、Y、W135群流脑多糖各2μg/次。
1.5免疫程序：全程免疫三针次，免疫间隔14天，即0、14、28天各免疫一针，每次免后14天采血，分离血清，ELISA测定每只小鼠血清IgG抗体效价，并计算每组小鼠血清的几何平均滴度(GMT)。
2、实验结果：见表3
3、结果分析
3.1针次效应：表3所列五种组合结合疫苗各自三针免疫后小鼠血清中各血清群(型)IgG抗体均呈现明显的针次递增效应，说明具有较好的免疫回忆应答。
3.2佐剂效应：表3中含与不含佐剂的二种液体剂型疫苗比较研究说明
3.2.1均能诱导机体产生明显的IgG抗体应答和免疫回忆应答；
3.2.2但在含佐剂和不含佐剂的两种疫苗中，两者在刺激机体快速产生抗体应答、加强免疫后的免疫记忆应答及抗体滴度方面，存在显著差异。
3.2.2.1不含佐剂的结合疫苗，初次免疫即能刺激机体产生较好的抗体应答，但加强免疫后，抗体增长不明显，各血清群(型)的抗体滴度均较低；
3.2.2.2含佐剂的结合疫苗，初次免疫后，仅能刺激机体产生较弱的抗体应答，但加强免疫后，显示了明显的免疫回忆应答，产生较高的抗体滴度。尤其是第三针免疫后产生更高的抗体滴度，免疫针次效应更显著。
实验结果表明，结合疫苗中加入铝佐剂能获得较好的免疫应答效果。
3.3不同剂型含佐剂疫苗免疫应答比较说明
3.3.1无论是AL(OH)3或ALPO4，均具有较好的佐剂效应；
3.3.2其各自针对A、C、Y、W135和B群(B4,B15)的抗体增长无差异性；
3.3.3其各自不同针次的免疫回忆应答效应基本一致。
实施例5
本实施例为急性毒性和异常毒性试验，本试验是利用不同剂量的药物急性毒性反应原理，将一定剂量的供试品溶液注入受试动物(小鼠、豚鼠)体内，在规定时间内观察受试动物出现的毒性反应症状和死亡情况，判定供试品是否符合规定的质量要求及其安全性程度。
1、实验方法：
1.1实验动物
1.1.1小鼠：N1H小鼠，体重18-22克/只，每组5只；
1.1.2豚鼠：体重250-350克/只，每组2只。
1.2注射剂量
1.2.1异常毒性试验：按2010版《中国药典》三部附录XIIF项异常毒性检查法规定的接种剂量：小鼠：空腹注射0.5ml(1个人用剂量)；豚鼠：腹腔注射5ml(10个人用剂量)；
1.2.2重复给药毒性试验：按2.1项试验给药后，观察受试动物三天内未出现异常症状，继续饲养至第七天，受试动物健存，正常，且体重增加。于第八天再次重复给予2.1项同剂量，同途径接种给药，再连续观察7天，判定结果；
1.2.3急性毒性试验：按2010版《中国药典》三部附录XIIF项异常毒性检查法规定接种剂量的5倍量给药，用各价A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖－蛋白偶联原液配制浓缩疫苗，给药剂量为：小鼠：腹腔注射0.5ml(5个人用剂量)，豚鼠：腹腔注射5ml(50个人用剂量)。
1.2.4设立阴性对照组，小鼠腹腔注射生物盐水0.5ml，豚鼠腹腔注射生理盐水5ml。
1.3、实验结果判定
1.3.1异常毒性试验：小鼠、豚鼠接种供试品后，连续观察7天，观察期内，动物应全部健存，且无异常反应，到期动物体重增加，判供试品合格。
1.3.2重复给药毒性试验：第一次给药的实验结果判定，按3.1项判定要求。重复给药后的结果判定，受试动物于第七天，先称量各自体重记录，于第八天再次给药后，连续观察7天，观察期内，动物应全部健存，且无异常反应，到期时动物体重增加，判供试品合格。
1.3.3急性毒性试验：小鼠、豚鼠接种供试品后，连续观察7天，观察期内，动物应全部健存，且无异常反应，到期称量动物体重。继续观察至第14天，动物应全部健存，活动正常，体重增加，判供试品合格。
2、实验结果见表4，ACWY135群脑膜炎球菌结合疫苗毒性研究。
表4
3、结果分析
从常规剂量异常毒性、常规剂量重复给药毒性观察期内各组动物活动、进食均正常，无异常反应，且均健存，到期体重均增加。
仅在5倍常规剂量的急性毒性试验的注射首日，小鼠、豚鼠有活动略显迟缓、进食减少现象，但在接种次日各动物活动、进食均逐渐恢复正常，观察期内未见异常情况，所有动物接种第7天时体重均增加，至第14天时，所有动物体重均已恢复接近阴性对照动物。
以上实验结果说明供试品安全性可靠。
4、结论
ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗异常毒性、重复给药毒性和急性毒性试验合格。
实施例6
过敏原性试验
1、实验目的：检查供试品中是否含有过敏原物质及引起过敏反应的严重程度，以制定制品的安全性。
2、实验原理：当药物作为抗原或半抗原初次进入受试动物体内，刺激机体产生相应的抗体(IgE)。当受试动物再次注入同一类药物时，该抗原与体内抗体结合形成抗原抗体复合物，并刺激肥大细胞及嗜碱性粒细胞释放活性介质，从而引起喉头局部水肿、抓鼻、喷涕、咳嗽、呼吸困难、窒息、痉挛，甚至休克、死亡，属速发型变态反应——过敏反应。
3、试验方案
将1个人用剂量/次供试品溶液注入实验动物(豚鼠)体内，间隔1日，连续3次注射，以致敏动物。然后再适时将2倍剂量供试品经静脉注入致敏动物体内，进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物速发型变态反应——过敏反应。
4、实验方法
4.1分组：共设6组，分别有3批次供试品：ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，20141001批，20141002批，20141003批。每批各设1组；
阳性对照组：破伤风毒素；
阴性对照组：疫苗稀释液、生理盐水
4.2实验动物
健康，无孕豚鼠，体重250-350克/只，每组6只。
4.3实验过程
每组6只豚鼠，间隔一日，每只豚鼠每次分别腹腔注射供试品，阳性对照、阴性对照品各0.5ml，共3次，以致敏动物。然后将每组6只豚鼠各分成2个分组，每分组3只豚鼠，分别在首日注射后第14天和第21天，由静脉注射各组对应的供试品，阳性对照、阴性对照各1ml，进行激发，观察激发后30分钟内每只动物的行为和体征，有无抓鼻、喷嚏、呼吸困难、痉挛、休克及至死亡等过敏反应症状。
5、结果判定
静脉注射各组分供试品、阴性对照组品激发后30分钟内，动物不得出现过敏反应，如有竖毛、喷嚏、干呕、连续咳嗽3声和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现抽搐(痉挛)、休克、死亡现象之一者，判供试品不合格。
阳性对照组动物出现过敏反应及阴性对照组均无过敏反应，判断试验成立。
6、试验结果见表5，ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗过敏原性试验。
表5
7、结果分析
7.1实验中的阴性对照、阳性对照分别成立，说明实验结果有效。
7.2供试品的三批ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，实验致敏动物的首次激发和第二次激发，所有动物均未发生过敏反应症状，过敏试验均合格。
8、结论
ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗20141001、20141002、20141003批过敏原性试验合格。
实施例7
家兔热原试验
1、实验目的：本试验是将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判断供试品中所含热原的限度是否符合质量要求。
2、实验方法和判断标准：2010版《中国药典》三部附录XIID。
3、实验结果见表6，ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗家兔热原试验。
表6
4、结果分析
三批疫苗各三只家兔升温总和在0.5、0.6、0.5℃，试验结果较稳定，符合质量标准要求。
5、结论
三批疫苗家兔热原试验均合格。
实施例8
无菌试验
1、目的：无菌试验是检测供试品在敏感培养基中是否有微生物生长，以此判断供试品的无菌性。
2、实验条件和方法：参考2010版《中国药典》三部XIIA。
3、实验结果见表7，ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗无菌试验。
表7
4、结果分析
阳性对照：有菌生长；阴性对照：无菌生长，试验结果有效。三批次疫苗均无菌生长，无菌试验结果符合质量标准要求。
5、结论：
三批疫苗无菌试验合格。
实施例9
免疫原性试验
1、目的
疫苗的抗原成分是一种来自于致病菌的机体的外源性物质。当接种而进入机体后，机体免疫系统产生应答，包括体液免疫产生的特异性抗体、细胞免疫和免疫辅助系统的协同作用，达到预防疾病的功能。
产生有效的免疫应答，除机体自身的免疫系统保持正常，系统协同的免疫功能状态外，作为激活机体免疫功能的外源性物质——抗原的性质和功能致关重要。免疫原性试验就是检测这种外源物质——抗原进入机体后激活体液免疫，产生特异性抗体强度的一种可量化的检测手段。
2、实验方法
2.1实验动物及分组：选用6周龄NIH小鼠，体重12-14克，每组20只，雌雄各10只，每笼饲养同性别小鼠5只。
2.2组别设定：
2.2.1分别设置空白对照组，不注射任何溶液，同条件饲养；
2.2.2稀释液对照组：含AL(OH)3佐剂，0.6mg/ml，0.85％生理盐水；
2.2.3供试品组：ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗，批号：20141001、20141002、20141003批。
2.3动物免疫
2.3.1免疫剂量：按结合到载体蛋白上的每血清群(A、C、Y、W135)多糖计，各2μg/剂/0.5ml；
2.3.2免疫途径：小鼠腹部皮下注射；
2.3.3免疫程序：分别于0、14、21天各接种一剂。
2.4血清采集分离及测定
于末次免疫后7天(第28天)从小鼠眼眶采血，分离血清，采用间接ELISA测定小鼠血清IgG抗体效价。
3、判断标准：以稀释液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值，疫苗供试品组小鼠血清高于Cutoff值判为阳转。疫苗供试品组应有90％以上小鼠血清抗体效价高于Cutoff值(90％阳转)，判为合格。
4、实验结果见表8，ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性试验。
表8
注：稀释液血清Cutoff值：0.268
5、结果分析及判定
ELISA测定效价的稀释液血清Cutoff值为0.268，三批疫苗供试品组免疫小鼠血清分别测定的针对各血清群(型)抗原成分的每组各20只小鼠血清ELISA效价测定值GMT在2.22－2.63间，均显示高于Cutoff值，判为阳转，其阳转率均为100％。
6、结论
三批疫苗供试品组免疫原性测定的各血清群(型)的阳转率均达到了100％，符合质量标准要求。合格。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。