技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，特别涉及曲札茋苷在制备治疗脑出血或减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途。
背景技术
研究表明，急性缺血性脑卒中是导致人类残疾和死亡的主要原因之一；目前，国内外指南一致推荐重组组织型纤溶酶原激活剂(Tissue Plasminogen Activator，rtPA)静脉溶栓是治疗急性缺血性脑卒中的最佳方案，且发病4.5h内治疗更是溶栓安全性与有效性的保证。因此，溶栓是唯一经国际公认并由临床试验证实的治疗脑梗死的高效策略。然而，溶栓后的出血性转化，是目前影响急性缺血性脑卒中溶栓疗效及制约其发展的关键问题。如何克服rtPA引起的脑出血，如何提高急性缺血性脑卒中溶栓治疗的疗效和安全性，对降低脑中风的致残和致死率具有重要的意义。
出血性转化(hemorrhagic transformation，HT)是指缺血性卒中后继发出血性改变，是急性缺血性脑卒中后常见的并发症，尤其是在溶栓治疗后发生率约3％～43％。近几年，随着超早期静脉溶栓和血管内介入治疗的开展，出血性转化的风险也逐渐增加。据统计，急性缺血性脑卒中即使不行溶栓治疗，其自然出血转化率也可达15％～43％，而使用rt-PA静脉溶栓后出血转化率提高2-3倍。
rtPA为一种丝氨酸蛋白酶，其在维持血液凝固和纤维蛋白溶解过程中起着重要的作用；rtPA不仅对正常中枢神经系统生理和神经元可塑性起调节作用，在中枢神经系统病理方面也起着关键的作用，对缺血大脑均起到显著的保护作用。rtPA已被证明可通过促进基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活化，加剧缺血内皮的损伤和血脑屏障的破裂。已有大量的实验和临床证据表明，rtPA引起血脑屏障的破裂是其造成脑出血的最直接原因之一。此外，缺血会产生一系列严重的炎症反应，该反应会使正常血管壁的完整性破坏，由此造成血脑屏障和血管自我调控能力的损害，闭塞血管再通后，恢复再灌注时，血细胞更易外渗到血管外。
曲札茋苷是一种新型脑保护药物，可有效阻断脑缺血病理机制的多个环节，作用范围涵盖了血管-神经单元，并兼顾对外周体循环系统的调节作用。可明显抑制血小板集聚、降低血液黏度，抑制血栓形成；可降低脑血管阻力、增加脑血流量；能清除自由基、抑制炎症反应和神经细胞凋亡，从而阻断对脑组织的损害作用。迄今为止，尚未见有关曲札茋苷用于减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了曲札茋苷在制备治疗脑出血或减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了曲札茋苷在制备治疗脑出血药物中的用途。
作为优选，治疗脑出血药物还包括药学上可接受的辅料。
作为优选，治疗脑出血药物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂或口服液。
本发明还提供了曲札茋苷在制备减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途。
作为优选，曲札茋苷的用药时间为rtPA溶栓治疗前、rtPA溶栓治疗同时、rtPA溶栓治疗后的任意时间。
作为优选，曲札茋苷的用药时间为rtPA溶栓治疗前60min至rtPA溶栓治疗后40min内的任意时间。
优选地，曲札茋苷的用药时间为rtPA溶栓治疗前50min至rtPA溶栓治疗后30min内的任意时间。
在本发明提供的具体实施例中，曲札茋苷的用药时间为rtPA溶栓治疗前50min、rtPA溶栓治疗同时、rtPA溶栓治疗后30min。
作为优选，减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物还包括药学上可接受的辅料。
作为优选，减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂或口服液。
在本发明中，研究表明曲札茋苷联合rtPA治疗急性脑梗死的机理与抑制MMP-9活化、下调IL-1β或TNFα过表达具有一定相关性。
本发明还提供了曲札茋苷在制备MMP-9活性抑制剂中的用途。
本发明还提供了曲札茋苷在制备IL-1β表达抑制剂中的用途。
本发明还提供了曲札茋苷在制备TNFα表达抑制剂中的用途。
本发明提供了曲札茋苷在制备治疗脑出血或减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途。本发明具有的技术效果为：
本发明采用线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型，于缺血3小时再灌，同时给予临床剂量的rtPA诱导出血，模拟临床上rtPA所致出血转化，考察曲札茋苷于注射rtPA前、注射rtPA同时、注射rtPA后给予干预，对rtPA引起出血转化的保护作用。试验结果表明，大鼠缺血3h再灌注24小时后，rtPA组脑组织血红蛋白含量显著升高，出血率100％；不同时间点给予曲札茋苷，均使模型动物脑组织中的血红蛋白含量显著降低，出血率亦分别降至67％、40％及44％，动物死亡率与脑出血转化呈正相关。
本发明研究表明，在缺血条件下rtPA诱导产生的MMP-9活化、IL-1β、TNFα等炎性因子过表达能被曲札茋苷下调；凝血四项指标测定表明曲札茋苷可有效保护rtPA引起的血管损伤，降低脑组织出血风险；同时抑制血栓形成、保护血管同时又具有一定的抗凝血作用，可有效改善脑缺血后给予rtPA后出现的脑出血、脑组织损伤等不良反应，进而改善动物生存状况。
本试验结果提示，曲札茋苷在降低临床使用rtPA溶栓治疗脑卒中后所致脑组织出血风险、提高患者生存率等方面具有很好的开发应用价值。因此，联合使用曲札茋苷和rtPA是增加溶栓安全性的一种新型对策和手段，具有广阔临床应用前景。
附图说明
图1示脑组织血红蛋白含量，**P＜0.01，vs rtPA组；##P＜0.01，vs rtPA组；
图2示脑组织出血百分率(％)；
图3示脑组织不同程度出血百分率(％)；
图4示MCAO再灌注24小时死亡率；
图5示脑组织出血百分率与大鼠死亡率相关性；
图6示脑梗死体积百分比，*P＜0.05，vs溶剂对照组；
图7示凝血四项指标，*P＜0.05，vs溶剂对照组；**P＜0.01，vs假手术组；#P＜0.05，vs rtPA组；
图8示MMP-9表达水平，**P＜0.01，vs假手术组；#P＜0.05，vs溶剂对照组；
图9示TNF-α表达水平，*P＜0.05，vs rtPA组；##P＜0.01，vs溶剂对照组；
图10示IL-1β表达水平，*P＜0.05，vs rtPA组；##P＜0.01，vs溶剂对照组；
图11示动物体重变化，*P＜0.05，vs假手术组。
具体实施方式
本发明公开了曲札茋苷在制备治疗脑出血或减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的曲札茋苷在制备治疗脑出血或减少脑缺血后rtPA溶栓治疗引起的脑出血的药物中的用途中所用原料药或辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1曲札茋苷对rtPA致脑缺血再灌注大鼠出血转化保护作用的研究
1.试剂及动物
1.1供试品：注射用曲札茋苷，昆药集团股份有限公司，性状：类白色疏松块状物；规格：20mg/支；批号：170101；保存条件：常温、避光；有效期：2019.12.31；
1.2对照品：名称或代号：阿替普酶(rtPA)；德国勃林格殷格翰公司(德国)；性状：类白色疏松块状物；规格：20mg/支(含稀释液)；批号：607009；保存条件：2～8℃，密闭，避光；有效期：2019.05.31；
1.3其它试剂：血红蛋白定量试剂盒(BioAssay Systerms，美国，Cat：DIHB-250)；MMP9ELISA检测试剂盒(R&D，美国，Cat：RMP900)；大鼠TNF-αELISA检测试剂盒(abcam ，美国，Cat：ab100785)；大鼠IL-1βELISA检测试剂盒(abcam ，美国，Cat：ab100768)。
1.4实验动物
SD大鼠：SPF级，雄性，175只，体重：290.4～351.0g，体重个体值在均数± 20％范围内；北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。实验动物室温度20～26℃(日温差≤4℃)，湿度40％～70％，照明12h:12h明暗交替，照度150～300lx，噪声≤60Db；饲养密度：≤5只/笼，饲养环境条件标准：中华人民共和国国标GB14925-2010；饲养环境控制系统：Honeywell公司EBI400自动控制全新风中央空调系统；实验动物使用许可证：SYXK(川)2013-009。每日喂饲鼠用配合饲料，自由饮水，视情况更换笼具和垫料；饲料来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲料生产企业审查合格证：沪饲证(2014)04001。
2.实验内容
2.1动物分组
组别设计：假手术组、溶剂对照组、rtPA组、曲札茋苷组、曲札茋苷(-50min)+rtPA组、rtPA+曲札茋苷(0h)组、rtPA+曲札茋苷(30min)；
分组方法：大鼠MCAO造模后，根据组别区组随机分配。
2.2剂量设计
表1.剂量设计表
2.3给药
给药途径：尾静脉注射，推注时间约2min；给药频率：单次给药；给药体积：5mL/kg。
2.4试验方法
术前禁食8-16小时。将大鼠以异氟烷维持麻醉，仰卧，从颈部正中开辟后，钝性分离肌肉层，暴露右侧颈总动脉，依次分离出颈外、颈内动脉及其他相关血管分支。将颈外动脉从结扎的两道丝线中间剪断，拉住残端使颈外动脉与颈内动脉呈一直线，于颈外动脉作切口，将进行标记了的线栓(型号：2838-A4)缓慢向颈内动脉推进，直至稍感阻力。缺血3小时后，解开缝合线，将线栓完全拔出，扎紧动脉残端，实现再灌注灌，同时给予rtPA(5mg/kg)。剪去多余丝线，缝合皮肤。手术过程中维持大鼠体温35-37℃。假手术组大鼠除不插入线栓外，其他操作同造模组。
2.5观察指标
2.5.1一般状态观察
观察时间和频率：给药当天及再灌注后24小时各1次；
观察结果：给药期受试动物整体状态，包括但不限于给药局部反应。
2.5.2行为学评分
评分时间：于给药前对造模动物进行神经功能损伤行为学评分；
评分方法：5分法(0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾斜；4 分：不能自发行走，意识丧失)，评分在1-3分大鼠判定为造模合格，进行给药。
2.5.3 MCAO再灌注24小时动物死亡率
观察并记录MCAO再灌注后24小时各组动物死亡情况，计算死亡率。
死亡率＝各组死亡动物数量/各组试验动物数量×100％。
2.5.4 MCAO再灌注24小时脑组织出血率
MCAO再灌注后24小时，解剖各组存活大鼠，使用PBS经心脏灌注后取脑组织。观察并记录各组动物脑组织缺血侧出血情况，计算脑组织出血率。
脑组织出血率＝脑组织出血动物数量/存活动物数量×100％。
2.5.5脑组织血红蛋白含量
MCAO再灌注后24小时，分别取各组部分大鼠右侧大脑组织，提取总蛋白，按照血红蛋白定量试剂盒说明书检测血红蛋白含量。
2.5.6脑梗死体积
MCAO再灌注后24小时，解剖各组存活大鼠，每组选择部分存活动物取脑组织，使用1％红四氮唑(TTC)进行染色，计算梗死体积百分比。
脑梗死体积百分比＝右侧梗死体积/右侧大脑体积×100％。
2.5.7凝血指标
MCAO再灌注后24小时，解剖各组存活大鼠，取血约2.0mL，枸橼酸钠抗凝。4℃，3000rpm，离心10min，分离血浆。检测凝血指标：PT，APTT，TT，FIB。
2.5.8脑组织相关因子
MCAO再灌注后24小时，分别取各组部分大鼠右侧大脑组织，提取总蛋白。按照说明书检测MMP9、IL-1β、TNFα含量。
2.5.9体重
手术前及再灌注24小时后各称取一次动物体重。
3.统计分析
试验数据以Mean±SEM表示，采用Kruskal-Wallis H秩和检验(K-W法)进行统计分析。当Kruskal-Wallis H秩和检验显示差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用Mann-Whitney U检验(M-W法)对组间差异进行比较；当Kruskal-Wallis H秩和检验显示差异无统计学意义时(P>0.05)，统计分析结束。
4.试验结果
4.1脑组织血红蛋白含量
MCAO再灌注24小时后，rtPA组大鼠脑组织血红蛋白水平明显升高，显著高于溶剂对照组(**P＜0.01)。注射用曲札茋苷单用、早于rtPA50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA 30min给药，血红蛋白水平均明显低于rtPA组(##P＜0.01)(图1)。注射用曲札茋苷可有效改善大鼠MCAO再灌注同时给予rtPA后导致的脑组织出血不良反应。
4.2脑组织出血百分率
MCAO再灌注24小时后，rtPA组大鼠脑组织出现不同程度出血症状，明显出血(++)率达到66.67％。注射用曲札茋苷组表现出26.67％的轻微出血(+)，低于溶剂对照组。注射用曲札茋苷早于rtPA50min给药组、与rtPA同时给药组、晚于rtPA 30min给药组脑组织出血百分率均低于rtPA组。注射用曲札茋苷可不同程度改善大鼠给予rtPA引起的脑出血不良反应(图2，图3)。
4.3动物死亡率
大鼠MCAO再灌注24小时后，rtPA(5mg/kg)给药组死亡率明显高于溶剂对照组。单独给予供试品注射用曲札茋苷(2mg/kg)，大鼠死亡率明显下降。rtPA给药后30min给予注射用曲札茋苷、相对rtPA给药前50min给药及同时给药，较好地提高了大鼠MCAO再灌注后的生存率(图4)。脑组织出血率与大鼠死亡率呈强相关(图5)。
4.4脑梗死体积
MCAO再灌注24小时后，rtPA组脑梗死体积明显大于溶剂对照组(*P＜0.05)。注射用曲札茋苷组、早于rtPA 50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA 30min给药各组脑梗死体积与rtPA组比较呈下降趋势(图6)。
4.5凝血指标
MCAO再灌注24小时后，溶剂对照组PT高于假手术组，TT低于假手术组(*P＜0.05)(图7A，图7C)。rtPA组APTT低于溶剂对照组(*P＜0.05)。注射用曲札茋苷组、注射用曲札茋苷晚于rtPA 30min给药组APTT显著高于rtPA组(#P＜0.05)(图7B)。MCAO各造模组FIB明显高于假手术组(**P＜0.01)，注射用曲札茋苷早于rtPA 50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA30min给药各组FIB水平与rtPA组比较呈下降趋势(图7D)。
4.6脑组织MMP-9表达水平
大鼠缺血再灌注24小时后，各组随机取部分大脑组织提取总蛋白，检测MMP-9表达水平。溶剂对照组，rtPA组MMP-9表达比假手术组显著升高(**P＜0.01)。rtPA组MMP-9表达较溶剂对照组明显升高(#P＜0.05)。与rtPA组比较，供试品注射用曲札茋苷组、早于rtPA50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA 30min给药各组，MMP-9表达水平表现不同程度降低(图8)。
4.7TNF-α/IL-1β表达水平
大鼠缺血再灌注24小时后，各组随机取部分大脑组织提取总蛋白，检测TNF-α和IL-1β表达水平。
rtPA组TNF-α表达明显高于溶剂对照组和假手术组(*P＜0.05)。与rtPA组比较，供试品注射用曲札茋苷组、早于rtPA50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA 30min给药各组，TNF-α表达水平均表现不同程度降低(图9)。
与溶剂对照组和假手术组比较，rtPA组脑组织中IL-1β表达升高。与rtPA组比较，注射用曲札茋苷组，早于rtPA50min给药、与rtPA同时给药、晚于rtPA 30min给药各组，IL-1β表达水平呈下降趋势(图10)。
4.8体重
各组大鼠造模MCAO再灌注手术前体重无显著差异。再灌注24小时后，各造模组大鼠体重与假手术组比较明显下降(*P＜0.05)(图11)。
4.9行为学评分
MCAO给药前，进行行为学评分，各造模组大鼠行为学评分均值约为2，自主行走多表现为向身体左侧旋转，组间无显著差异。
4.10一般观察
MCAO造模后，大鼠自主活动表现向身体左侧旋转或倾斜，正常行走功能受到不同程度的影响。给药部位未见不良反应。缺血3小时再灌注后2小时内，造模各组出现不同数量的动物死亡。大鼠表现精神萎靡，活动量减少，进食饮水活动减少。再灌注24小时后，各组动物死亡数量有所增加。
5.结论
实验结果明确显示了曲札茋苷对rtPA所致脑卒中后出血转化的拮抗作用。曲札茋苷可通过下调MMP-9过表达，同时降低IL-1β、TNFα等炎性因子的表达，有效改善缺血再灌注同时给予rtPA后脑出血、脑组织损伤等不良反应，进而改善动物生存状况。
综上，曲札茋苷具有降低临床使用rtPA溶栓治疗脑卒中后所致脑组织出血风险，提供有效再灌注，降低颅内出血导致的致残率、致死率，使更多的患者得到规范化治疗，具有很好的临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。