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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710941790.7 (22)申请日 2017.10.11 (71)申请人 中国科学院西北高原生物研究所 地址 810000 青海省西宁市西关大街59号 (72)发明人 江磊 陶燕铎 邵赟 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 齐海迪 (51)Int.Cl. A61K 31/4375(2006.01) A61P 19/10(2006.01) (54)发明名称 槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用及 其药物 (57)摘要 本发。
2、明提供了一种槐定碱在制备抗骨质疏 松药物中的应用及其药物， 涉及生物医药技术领 域。 本发明所述槐定碱在有效剂量内能够抑制 RANKL诱导的破骨细胞的分化成熟的RANKL-ERK- NFAT信号通路中的ERK的磷酸化， 进而抑制RANKL 诱导的破骨细胞的嗜骨能力， 显著降低c-Fos、 NFATc1等破骨细胞分化特异基因的表达， 抑制骨 吸收， 促进骨形成， 最终起到防治骨质疏松的作 用。 本发明槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应 用具有疗效确切、 副作用小的特点， 缓解了现有 治疗骨丢失疾病的药物在临床应用中具有较大 的不良反应的问题。 权利要求书1页 说明书5页 附图9页 CN 10766。
3、9672 A 2018.02.09 CN 107669672 A 1.槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用。 2.根据权利要求1所述槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述骨质 疏松为雌激素缺乏引起的骨质疏松。 3.根据权利要求2所述槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述雌激 素缺乏是由卵巢功能缺失引起的。 4.根据权利要求2所述槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述雌激 素缺乏引起的骨质疏松为骨转化率增强和骨质破坏。 5.根据权利要求4所述槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述槐定 碱抑制雌激素缺乏引起的骨转化率增强和骨质破。
4、坏是基于槐定碱抑制破骨细胞分化基因 的表达。 6.根据权利要求5所述的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述槐 定碱抑制破骨细胞分化基因的表达为阻断RANKL-ERK-NFAT通路信号传导至细胞核。 7.根据权利要求6所述的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述阻 断RANKL-ERK-NFAT通路信号为槐定碱阻断细胞外调节蛋白激酶的启动， 进而抑制通路信号 传导至细胞核。 8.根据权利要求5所述的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在于， 所述槐 定碱抑制破骨细胞分化基因的表达的破骨细胞基因为NFATc1和c-Fos转录因子。 9.根据权利要求18。
5、任一项所述的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 其特征在 于， 所述槐定碱的应用剂量为815mg/kg。 10.一种抗骨质疏松药物， 其特征在于， 所述药物由槐定碱与药学上可接受的一种或多 种载体组成的组合物制备而成。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107669672 A 2 槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用及其药物 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 尤其是涉及一种槐定碱在制备抗骨质疏松药物中 的应用及其药物。 背景技术 0002 骨质疏松是一种以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病。 特别是随着女 性年龄的增长， 雌激素分泌的减少， 骨质疏松的发病率也相应。
6、的显著提高， 据统计我国45岁 以上的妇女中， 三分之一的人患有不同程度的骨质疏松。 骨组织量减少主要由于骨质吸收 增多所致。 0003 破骨细胞是骨组织成分的一种， 是人体内唯一的具有骨吸收功能的细胞， 破骨细 胞的过多生成导致骨吸收的增强， 进而引起骨丢失疾病， 因此， 对破骨细胞的研究是治疗骨 质疏松疾病的关键。 研究发现破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞， 在体内必须依 赖于一些诱因诱导分化发育为多核的成熟破骨细胞， 最后被活化。 目前认为最直接活化破 骨细胞的内源性分子是成骨细胞或骨髓基质细胞分泌的激活核因子NFATc1等受体的配体 RANKL。 RANKL与前破骨细胞表面受体。
7、RANK结合， 募集RANK信号传导的转接蛋白TRAF6,TRAF6 通过激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)启动下游信号通路NFATc1， c-Fos以及钙离子通道， 促 进破骨细胞的分化成熟。 因此， 该通路又称RANKL-ERK-NFAT通路。 0004 现有治疗骨丢失疾病的药物主要是激素替代疗法或骨吸收抑制剂治疗， 例如双磷 酸盐。 但是， 研究发现应用激素替代疗法， 女性患乳腺癌的风险增大， 同时抑制骨吸收的磷 酸盐制剂在临床应用中具有较大的不良反应。 因此， 研究开发一种疗效确切、 副作用小的防 治骨丢失疾病的药物具有十分必要和迫切的要求。 0005 有鉴于此， 特提出本发明。 发明内。
8、容 0006 本发明的第一目的在于提供一种槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用。 0007 本发明的第二目的在于提供一种抗骨质疏松药物， 该药物由槐定碱与药学上可接 受的一种或多种载体组成的组合物制备而成。 0008 本发明提供的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用。 0009 进一步的， 上述骨质疏松为雌激素缺乏引起的骨质疏松。 0010 进一步的， 上述雌激素缺乏是由卵巢功能缺失引起的。 0011 进一步的， 槐定碱抑制雌激素缺乏引起的骨转化率增强和骨质破坏。 0012 更进一步的， 上述槐定碱抑制雌激素缺乏引起的骨转化率增强和骨质破坏是基于 抑制破骨细胞分化基因的表达。 0013 进一步的，。
9、 槐定碱抑制破骨细胞分化基因的表达为阻断RANKL-ERK-NFAT通路信号 传导至细胞核。 0014 更进一步的， 上述阻断RANKL-ERK-NFAT通路信号为槐定碱阻断细胞外调节蛋白激 说 明 书 1/5 页 3 CN 107669672 A 3 酶的启动， 进而抑制通路信号传导至细胞核。 0015 进一步的， 抑制表达的破骨细胞基因为NFATc1和c-Fos转录因子。 0016 本发明提供的一种抗骨质疏松药物， 上述药物由槐定碱与药学上可接受的一种或 多种载体组成的组合物制备而成。 0017 进一步的， 上述药物的给药方式包括口服给药或者注射给药。 0018 与现有技术相比， 本发明的。
10、有益效果为： 0019 本发明提供的槐定碱在制备抗骨质疏松药物中的应用， 槐定碱能够抑制RANKL诱 导的破骨细胞的分化成熟的RANKL-ERK-NFAT信号通路中的ERK的磷酸化， 进而抑制RANKL诱 导的破骨细胞的嗜骨能力， 显著降低c-Fos、 NFATc1等破骨细胞分化特异基因的表达， 抑制 骨吸收， 促进骨形成， 最终起到防治骨质疏松的作用。 0020 本发明提供的抗骨质疏松药物， 所述药物由槐定碱与药学上可接受的一种或多种 载体组成的组合物制备而成。 该制备得到的药物能够有效的抑制破骨细胞的的形成， 具有 疗效确切、 副作用小的特点， 缓解了现有治疗骨丢失疾病的药物在临床应用中具。
11、有较大的 不良反应的问题。 附图说明 0021 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案， 下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前 提下， 还可以根据这些附图获得其他的附图。 0022 图1a为本发明实施例2小鼠血清CTX-I含量测定结果图； 0023 图1b为本发明实施例2小鼠血清OCN含量测定结果图； 0024 图2a为本发明实施例3小鼠胫骨病理切片HE染色图； 0025 图2b为本发明实施例3小鼠胫骨病理切片TRAP染色图； 002。
12、6 图3为本发明实施例3小鼠的近端股骨微电脑断层扫描图； 0027 图4为本发明实施例4使用MTT实验方法评估槐定碱对小鼠骨髓巨噬细胞的细胞存 活率影响； 0028 图5a为本发明实施例5不同浓度的槐定碱抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞的苏 木红染色结果； 0029 图5b为本发明实施例5不同浓度的槐定碱抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞的苏 木红染色结果的定量统计。 0030 图6a为本发明实施例5不同时间加入槐定碱抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞的 苏木红染色结果； 0031 图6b为本发明实施例5不同时间加入槐定碱抑制RANKL诱导小鼠骨髓巨噬细胞的 苏木红染色结果的定量统计； 00。
13、32 图7为本发明实施例6槐定碱抑制破骨细胞形成的转录因子c-FOS和NFATc1表达的 电泳分析结果； 0033 图8为本发明槐定碱抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化成熟的RANKL-ERK-NFAT信 号通路的作用原理图， 其中， TRAF6为募集RANK信号传导的转接蛋白； ERK为蛋白激酶； 说 明 书 2/5 页 4 CN 107669672 A 4 NFATc1和c-Fos为细胞核中的破骨细胞分化基因； SOP为槐定碱。 具体实施方式 0034 为了更清楚地说明本发明， 下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。 本领 域技术人员应当理解， 下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性。
14、的， 不应以此限制本 发明的保护范围。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建议的条件进行。 所 用工具或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产品。 0035 实施例1建立卵巢切除骨质疏松模型小鼠 0036 为表明本发明槐定碱对骨质疏松症具有很好的治疗效果， 现特选取40只4周龄大 的雌性小鼠， 将小鼠随机分为四组， 每组10只， 分别为： 0037 第一组、 假手术组给药(Sham Sop)； 0038 第二组、 假手术组对照(Sham Cn)； 0039 第三组、 手术组给药(Ovx Sop)； 0040 第四组、 手术组对照(Ovx Cn)。 0041 将全。
15、部40只小鼠全部用10的水合氯醛麻醉后， 沿下腹部正中线打开腹腔。 其中， 手术组给药(Ovx Sop)和手术组对照(Ovx Cn)完整切除双侧卵巢， 而假手术组给药(Sham Sop)、 假手术组对照(Sham Cn)不切除卵巢， 暴露卵巢后缝合关闭切口。 0042 随后对小鼠在温度为(232)， 12h光照/12h黑暗周期的环境下进行饲养。 术后 一周开始对手术组给药(Ovx Sop)和假手术组给药(Sham Sop)进行给药， 连续给药28天， 给 药方法为将槐定碱溶解于无菌生理盐水中腹腔注射给药， 按照10mg/kg/d的剂量浓度给药， 手术组对照(Ovx Cn)和假手术组对照(Sha。
16、m Cn)则给予同等剂量的生理盐水。 0043 通过实施例1建立卵巢切除骨质疏松模型小鼠， 可以得到由卵巢功能缺失引起的 雌激素缺乏， 进而导致骨质疏松的动物实验模型。 0044 实施例2对实验小鼠进行血液样本分析 0045 将实施例1用药结束后的小鼠通过眼球后取血， 随后提取小鼠血液中的血清， 对小 鼠的血清进行样本分析。 0046 首先， 采集小鼠血清， 随后使用酶联免疫吸附法对老鼠血清中CTX-I(破骨细胞标 志蛋白)和OCN(成骨细胞标志蛋白)进行测定， 测定结果我们可以发现手术组对照(Ovx Cn)， 即切除双侧卵巢后， 没有进行槐定碱给药的实验组， 该手术组对照(Ovx Cn)的破。
17、骨细 胞标志蛋白CTX-I的含量明显高于其他三组(图1a)， 而各组之间成骨细胞标志蛋白OCN的含 量没有明显变化(图1b)， 这表明， 槐定碱可以抑制切除双侧卵巢后破骨细胞的活动， 但对成 骨细胞的活动没有明显的影响。 0047 实施例3对实验小鼠进行组织学评价 0048 将实施例1用药结束后的小鼠进行安乐死后， 取小鼠右侧大股骨和胫骨， 剃除软骨 组织， 进行组织学评价， 并用微电脑断层扫描分析老鼠骨骼。 0049 1、 组织学评价胫骨： 整个胫骨固定在4甲醛中24h， 随后将胫骨浸入10乙二胺 四乙酸(EDTA)溶液处理10到12周进行脱钙。 脱钙胫骨被嵌入在石蜡。 随后， 对胫骨进行病。
18、理 切片检查， 将切片进行HE染色(苏木红染色)发现， Ovx Sop组和Sham Sop组骨小梁得到了显 著回升(图2a)； 对病理切片进行TRAP染色(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)， 发现Ovx Sop组和 说 明 书 3/5 页 5 CN 107669672 A 5 Sham Sop组的破骨细胞数量下降明显(图2b)。 0050 因此， 针对上述小鼠胫骨的组织学评价， 通过图2a可知， 槐定碱给药后实验小鼠的 骨小梁得到了显著回升， 即槐定碱可以明显促进成骨细胞的生成； 通过图2b可知， 槐定碱给 药后实验小鼠的破骨细胞数量下降明显， 即槐定碱可以明显抑制破骨细胞的生成。 0051 2、 微。
19、电脑断层扫描分析老鼠骨骼： 将各组实验小鼠的近端股骨进行多聚甲醛处理 后， 使用微电脑断层扫描分析仪对小鼠的近端股骨进行扫描分析， 扫描分辨率为9.088毫 米， 电压60kV， 电流220毫安。 其结果如图3所示， 我们可以明显的观察到手术组给药组Ovx Sop与手术组对照Ovx Cn相比， 手术组给药组Ovx Sop骨小梁数量得到了显著性回升， 即槐 定碱可以明显抑制破骨细胞的生成， 进而促进成骨细胞向骨细胞的转化。 0052 实施例4槐定碱对造血干细胞来源单核巨噬细胞的毒性 0053 为表明本发明槐定碱对破骨细胞分化的抑制作用不是由于槐定碱的细胞毒性所 导致的， 现特使用槐定碱对小鼠骨髓。
20、巨噬细胞进行MTT试验， 并用流式细胞仪检验细胞的凋 亡率。 0054 1、 MTT试验(噻唑蓝比色法)： 使用常规试验方法培养小鼠骨髓巨噬细胞， 随后将小 鼠骨髓巨噬细胞以1104个/细胞接种于96孔板， 待细胞长满后弃掉培养基， 分别以终浓度 为0(Control)、 10 g/mL、 30 g/mL、 60 g/mL和90 g/mL将槐定碱加入各新鲜培养基中， 然后 加入96孔板中， 然后， 分别在12、 24、 36和48小时四个时间点使用MTT实验方法评估槐定碱在 小鼠骨髓巨噬细胞细胞增殖的抑制作用(图4)， 发现各浓度的槐定碱均不会引起单核巨噬 细胞死亡。 由上述试验可知， 槐定碱。
21、对小鼠骨髓巨噬细胞没有毒性， 本发明槐定碱对破骨细 胞分化的抑制作用不是由于细胞毒性所导致的。 0055 2、 流式细胞仪检验细胞的凋亡率： 0056 将小鼠骨髓巨噬细胞加入槐定碱(0、 5、 10或15 g/毫升)48小时,然后悬浮在绑定 缓冲和沾膜联蛋白V-PE和7-amino-actinomycin(7-AAD)在室温避光处理15分钟， 随后使用 流式细胞仪检验小鼠骨髓巨噬细胞的凋亡率。 其结果发现， 槐定碱作用于单核巨噬细胞之 后， 用流式细胞仪检验细胞的凋亡率， 槐定碱不会引起单核巨噬细胞凋亡。 即槐定碱对小鼠 骨髓巨噬细胞没有毒性， 本发明槐定碱对破骨细胞分化的抑制作用不是由于细胞。
22、毒性所导 致的。 0057 实施例5槐定碱可以抑制造血干细胞分化为破骨细胞 0058 根据研究发现， 小鼠骨髓巨噬细胞在核因子受体活化因子配体RANKL以及人巨噬 细胞集落刺激因子的刺激诱导下可以向破骨细胞分化。 骨质疏松往往由过多的骨吸收导 致， 是破骨细胞过度活化的结果。 0059 故选择小鼠骨髓巨噬细胞作为细胞模型， 研究槐定碱对RANKL诱导的破骨细胞生 成的影响十分适宜。 观察槐定碱是否能够抑制破骨细胞特异相关基因的表达及其对破骨细 胞噬骨能力的影响， 从而阐述槐定碱在制备用于防治骨质疏松的药物中的应用及机制。 0060 为表明本发明槐定碱可以抑制小鼠骨髓巨噬细胞分化为破骨细胞， 现。
23、将小鼠骨髓 巨噬细胞以1104个/细胞接种于96孔板， 待细胞长满后弃掉培养基， 分别以终浓度为0(空 白对照组)、 5 g/mL、 10 g/mL、 15 g/mL将槐定碱加入各新鲜培养基中， 然后加入96孔板中， 同时RANKL(50ng/mL)、 M-CSF(50ng/mL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化。 然后， 对小 鼠巨噬细胞进行苏木红染色(图5a)， 并对结果进行定量统计(图5b)， 发现随着槐定碱浓度 说 明 书 4/5 页 6 CN 107669672 A 6 的增加可以明显抑制小鼠骨髓巨噬细胞分化为破骨细胞。 0061 由上述实验和图5a、 图5b可知， 本发明所述槐定。
24、碱抑制雌激素缺乏引起的骨转化 率增强和骨质破坏是基于槐定碱抑制破骨细胞分化基因的表达而得到的。 0062 为确定那个时间段加入槐定碱可以更好的抑制破骨细胞的形成， 现将小鼠骨髓巨 噬细胞以1104个/细胞接种于96孔板， 同时RANKL(50ng/mL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破 骨细胞分化， 随后分别在第0天、 第2天、 第4天和第5天弃掉培养基， 加入终浓度为60 g/mL的 槐定碱的培养基。 然后， 对小鼠巨噬细胞进行苏木红染色(图6a)， 并对结果进行定量分析 (图6b)。 结果表明， 为了有效抑制破骨细胞的形成槐定碱需要出现在早期阶段和整个RANKL 诱导分化过程中。 0063 实施例。
25、6槐定碱可以抑制破骨细胞形成转录因子的表达 0064 为表明槐定碱可以有效抑制破骨细胞形成的转录因子c-FOS和NFATc1的表达， 现 特将小鼠骨髓巨噬细胞以1104个/细胞接种于96孔板， 待细胞长满后弃掉培养基， 分别以 终浓度为0 g/mL、 5 g/mL、 10 g/mL、 15 g/mL和20 g/mL的槐定碱加入各新鲜培养基中， 然后 加入96孔板中， 同时RANKL(75ng/mL)诱导小鼠骨髓巨噬细胞向破骨细胞分化。 随后， 对破骨 细胞形成的转录因子c-FOS和NFATc1的表达进行电泳分析(图7)， GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱 氢酶)作为对照组。 实验表明， 随着槐定。
26、碱浓度的增加， 其对破骨细胞形成的转录因子c-FOS 和NFATc1表达的抑制作用明显增强。 0065 由上述实验可知， 本发明所述槐定碱可以有效抑制破骨细胞形成的转录因子c- FOS和NFATc1的表达， 即槐定碱抑制破骨细胞分化基因的表达的破骨细胞基因为NFATc1和 c-Fos转录因子。 0066 实施例7 0067 对小鼠骨髓巨噬细胞进行免疫荧光实验， 随后对细胞中细胞核、 转录因子NFATc1 和f-actin进行染色分析， 进而观察槐定碱是否对NFATc1的入核有影响， 结果发现， 槐定碱 并不影响NFATC1入核。 0068 由此可知， 本发明所述槐定碱并不是直接与NFATC1结。
27、合来抑制破骨细胞的表达， 而是通过阻断RANKL-ERK-NFAT通路信号中细胞外调节蛋白激酶的启动， 进而抑制通路信号 传导至细胞核。 (图8) 0069 综上所述， 本发明提供的槐定碱在有效剂量内能够抑制RANKL诱导的破骨细胞的 分化成熟的RANKL-ERK-NFAT信号通路中的ERK的磷酸化， 进而抑制RANKL诱导的破骨细胞的 嗜骨能力， 显著降低c-Fos、 NFATc1等破骨细胞分化特异基因的表达， 抑制骨吸收， 促进骨形 成， 最终起到防治骨质疏松的作用(图8)。 由槐定碱与药学上可接受的一种或多种载体组成 的组合物制备而成的药物能够有效的抑制破骨细胞的的形成， 具有疗效确切、。
28、 副作用小的 特点， 缓解了现有治疗骨丢失疾病的药物在临床应用中具有较大的不良反应的问题。 0070 最后应说明的是： 以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽 管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依 然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分或者全部技术特征进 行等同替换； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术 方案的范围。 说 明 书 5/5 页 7 CN 107669672 A 7 图1a 图1b 图2a 说 明 书 附 图 1/9 页 8 CN 107669672 A 8。
29、 图2b 图3 说 明 书 附 图 2/9 页 9 CN 107669672 A 9 图4 说 明 书 附 图 3/9 页 10 CN 107669672 A 10 图5a 说 明 书 附 图 4/9 页 11 CN 107669672 A 11 图5b 说 明 书 附 图 5/9 页 12 CN 107669672 A 12 图6a 说 明 书 附 图 6/9 页 13 CN 107669672 A 13 图6b 说 明 书 附 图 7/9 页 14 CN 107669672 A 14 图7 说 明 书 附 图 8/9 页 15 CN 107669672 A 15 图8 说 明 书 附 图 9/9 页 16 CN 107669672 A 16 。