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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201680032390.8 (22)申请日 2016.06.01 (30)优先权数据 2015-113587 2015.06.04 JP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2017.12.01 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2016/002654 2016.06.01 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2016/194372 EN 2016.12.08 (71)申请人 日本医事物理股份有限公司 地址 日本东京都 (72)发明人 冈俊太郎 加奈川优 大高明。
2、治 寺町昌子 渡边聪 永友敏恵 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 杨宏军 (51)Int.Cl. A61K 51/00(2006.01) (54)发明名称 针对癌症的早期骨转移的诊断显像剂 (57)摘要 本发明提供针对癌症的早期骨转移的诊断 显像剂， 其含有反式-1-氨基-18F氟代环丁烷 甲酸或其药学上可接受的盐作为活性成分。 权利要求书1页 说明书9页 附图8页 CN 107847616 A 2018.03.27 CN 107847616 A 1.针对癌症的早期骨转移的诊断显像剂， 其含有反式-1-氨基-18F氟代环丁烷甲酸或 其药学上可接受的盐作为活性成分。。
3、 2.如权利要求1所述的诊断显像剂， 其中， 所述早期骨转移为发生溶骨性反应之前的骨 转移。 3.如权利要求1或2所述的诊断显像剂， 其中， 所述癌症的早期骨转移为乳腺癌或前列 腺癌伴有的骨转移。 4.如权利要求1至3中任一项所述的诊断显像剂， 其用于正电子发射断层扫描。 5.反式-1-氨基-18F氟代环丁烷甲酸或其药学上可接受的盐在制造针对癌症的早期 骨转移的诊断显像剂中的用途。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 107847616 A 2 针对癌症的早期骨转移的诊断显像剂 技术领域 0001 本发明涉及针对癌症的早期骨转移(early bone metastasis from ca。
4、ncer)的诊 断显像剂。 背景技术 0002 作为骨转移的诊断成像， 已在使用X射线、 计算机断层摄影(CT)、 磁共振成像法 (MRI)、 利用锝99mTc羟基亚甲基二膦酸盐(99mTc-HMDP)和锝99mTc亚甲基二膦酸盐(99mTc- MDP)的骨闪烁造影法、 及利用2-18F-2-脱氧-D-葡萄糖(18F-FDG)的正电子发射断层扫描 (PET)。 通过X射线、 CT及MRI可获得骨转移的形态学图像， 通过骨闪烁造影法及PET可获得骨 转移的功能性图像。 因此， 这些方法也被联合用于骨转移的诊断。 0003 18F-FDG反映癌细胞的升高的碳水化合物代谢， 因此， 不仅被用作骨转移。
5、的诊断剂， 还被用作各种恶性肿瘤的诊断剂。 但另一方面， 18F-FDG存在下述问题： (i)18F-FDG也在具有 高水平碳水化合物代谢的正常组织(例如大脑及心脏)中蓄积； (ii)在被施予后， 18F-FDG由 于大量排尿而很快转移至膀胱， 因此， 难以检测膀胱及其外周(periphery)的临床状况； 以 及， (iii)由于18F-FDG也在炎性组织中蓄积， 故而难以区分肿瘤与炎性组织。 因此， 近年来也 开发了各种用于PET的肿瘤诊断剂， 这些肿瘤诊断剂着眼于癌细胞的碳水化合物代谢以外 的代谢能力的升高。 作为反映癌细胞的氨基酸代谢的试剂， 已知例如11C甲硫氨酸(11C-甲 硫 氨。
6、 酸) 、 反 式 - 1 - 氨 基 - 1 8 F 氟 代 环 丁 烷 甲 酸 (t r a n s - 1 - a m i n o - 1 8 F fluorocyclobutanecarboxylic acid)(18F-fluciclovine)等。 这些试剂中， 已在进行将 18F-fluciclovine作为可对前列腺癌(其难以利用18F-FDG进行可视化)加以可视化的诊断 剂的开发(非专利文献14)。 0004 现有技术文献 0005 非专利文献 0006 非专利文献1： Shuster D.等,J.Nucl.Med.(2007),vol.48,No.1,pp.56-63 00。
7、07 非专利文献2： Shuster D.等,Radiology(2011),vol.259,No.3,pp.852-861 0008 非专利文献3： Oka S.等,Mol.Imaging Biol.(2014),vol.16,No.3,pp.322-329 0009 非专利文献4： Inoue Y.等,Asia Oceania J.Nucl.Med.Biol.(2014) ,vol.2, No.2,pp.87-94 0010 非专利文献5： Nakai T.等,Eur J.Nucl.Med.Mol.Imaging(2005),vol.32,No.11, pp.1253-1258 发明内容 。
8、0011 核医学诊断中， 即使是针对同一试验， 在采用不同的诊断剂时， 也会由于各诊断剂 所特有的蓄积机理而呈现出不同的信息。 例如， 99mTc-HMDP及99mTc-MDP反映骨代谢， 而如上 所述， 18F-FDG则反映癌细胞的升高的碳水化合物代谢。 因此， 可检测性有可能根据骨转移类 型的不同而不同。 说 明 书 1/9 页 3 CN 107847616 A 3 0012 骨转移的图像模式大致分为成骨型、 溶骨型及混合型。 骨闪烁造影法对成骨性骨 转移具有高灵敏度， 但溶骨性骨转移则显示为冷缺损(cold defect)、 或在其中无明显变 化。 Nakai T.等,Eur J.Nuc。
9、l.Med.Mol.Imaging(2005),vol.32,No.11,pp.1253-1258报道 了以下内容： 对于99mTc-HMDP而言， 89名患有乳腺癌的患者的所有位点的总 “灵敏度” 为 “78.2” ， 对于18F-FDG而言， 总 “灵敏度” 为 “80.0” ， 两种试剂之间没有差异； 然而， 就基于 由CT判定的骨转移类型的检测率(detection rate)而言， 利用99mTc-HMDP时的成骨性骨转 移的检测率高于利用18F-FDG时的成骨性骨转移的检测率(10055.6)， 而利用18F-FDG 时的溶骨性骨转移的检测率高于利用99mTc-HMDP时的溶骨性骨。
10、转移的检测率(100 70.0)。 0013 近年来， 还提出了小梁间骨转移(intertrabecular bone metastasis)， 所述小梁 间骨转移中， 癌细胞在小梁(骨髓)之间进行组织病理学浸润和增殖， 但在小梁中并未引起 溶骨性改变及成骨性改变。 在成骨性骨转移的早期骨转移、 及包括小梁间骨转移的溶骨反 应发生之前， 难以通过骨闪烁造影法及CT探测骨转移。 0014 小梁间骨转移可使用18F-FDG进行检测， 然而， 18F-FDG也会被摄入进因骨折及炎症 反应而产生的炎性细胞， 因此有可能表现出假阳性。 0015 本发明是鉴于上述情况而完成的， 提供了能够以高准确度检测癌。
11、症的早期骨转移 的技术。 0016 根据本发明的一个方面， 提供针对癌症的早期骨转移的诊断显像剂， 其含有反式- 1-氨基-18F氟代环丁烷甲酸(18F-fluciclovine)或其药学上可接受的盐作为活性成分。 0017 另外， 根据本发明的另一方面， 提供18F-fluciclovine或其药学上可接受的盐在制 造针对癌症的早期骨转移的诊断显像剂中的用途。 0018 根据本发明， 能够以高准确度检测出难以利用现有诊断显像技术(例如骨闪烁造 影法及CT)进行检测的骨转移类型。 附图说明 0019 图1图1(a)至(j)为示出利用乳腺癌溶骨性骨转移大鼠模型得到的 14C- fluciclov。
12、ine的评价结果的图， (a)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的X射线成像结 果的图， (b)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的切片(section)外观的图， (c)为示出 从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的放射自显影照片(autoradiogram)的图， (d)为示出从正 常肢(左后肢)摘除的下肢骨的甲苯胺蓝染色结果的图， (e)为示出从正常肢(左后肢)摘除 的下肢骨的苏木精-伊红染色结果的图， (f)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨 的X射线成像结果的图， (g)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的切片外观的 图， (h)为示出从MRMT-1移植肢(。
13、右后肢)摘除的下肢骨的放射自显影照片的图， (i)为示出 从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的甲苯胺蓝染色结果的图， 以及， (j)为示出从 MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的苏木精-伊红染色结果的图。 0020 图2图2(a)至(j)为示出利用乳腺癌溶骨性骨转移大鼠模型得到的3H-FDG评价 结果的图， (a)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的X射线成像结果的图， (b)为示出从 正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的切片外观的图， (c)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢 骨的放射自显影照片的图， (d)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的甲苯胺蓝染色结 说 明 书 2/9 。
14、页 4 CN 107847616 A 4 果的图， (e)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的苏木精-伊红染色结果的图， (f)为示 出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的X射线成像结果的图， (g)为示出从MRMT-1移植 肢(右后肢)摘除的下肢骨的切片外观的图， (h)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下 肢骨的放射自显影照片的图， (i)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的甲苯胺 蓝染色结果的图， 以及， (j)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的苏木精-伊红 染色结果的图； 0021 图3图3(a)至3(j)为示出利用乳腺癌溶骨性骨转移大鼠。
15、模型得到的99mTc-HMDP 的评价结果的图， (a)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的X射线成像结果的图， (b)为 示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的切片外观的图， (c)为示出从正常肢(左后肢)摘除 的下肢骨的放射自显影照片的图， (d)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的甲苯胺蓝 染色结果的图， (e)为示出从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨的苏木精-伊红染色结果的图， (f)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的X射线成像结果的图， (g)为示出从 MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的切片外观的图， (h)为示出从MRMT-1移植肢(右后 肢)摘除的下肢骨的放。
16、射自显影照片的图， (i)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢 骨的甲苯胺蓝染色结果的图， 以及， (j)为示出从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨的苏 木精-伊红染色结果的图； 0022 图4图4(a)至4(c)为利用18F-fluciclovine得到的患有前列腺癌的患者的PET/ CT图像， (a)为头部图像， (b)为胸部图像， (c)为骨盆图像； 以及， 0023 图5图5(a)至5(c)为患有前列腺癌的患者的核医学图像， (a)为通过最大密度投 影(maximum intensity projection)得到的8F-fluciclovine的PET图像， (b)为。
17、骨闪烁造 影的前视图(anteriorimage)， (c)为骨闪烁造影的后视图(posterior image)。 0024 图6图6(a)至6(d)为示出利用乳腺癌细胞移植后第6天的乳腺癌小梁间骨转移 大鼠模型的三重示踪放射自显影(triple tracerautoradiography， ARG)的评价结果的图， (a)为示出甲苯胺蓝染色的结果的图， (b)为示出99mTc-HMDP的放射自显影照片的图， (c)为 示出14C-fluciclovine的放射自显影照片的图， (d)为示出3H-FDG的放射自显影照片的图。 0025 图7图7(a)至7(d)为示出利用乳腺癌细胞移植后第8天。
18、的乳腺癌小梁间骨转移 大鼠模型的三重示踪ARG的评价结果的图， (a)为示出甲苯胺蓝染色的结果的图， (b)为示 出99mTc-HMDP的放射自显影照片的图， (c)为示出14C-fluciclovine的放射自显影照片的图， (d)为示出3H-FDG的放射自显影照片的图。 0026 图8图8(a)至8(d)为示出利用乳腺癌细胞移植后第11天的乳腺癌溶骨性骨转移 大鼠模型的三重示踪ARG的评价结果的图， (a)为示出从MRMT-1移植肢摘除的下肢骨的切片 外观的图， (b)为示出3H-FDG的放射自显影照片的图， (c)为示出14C-fluciclovine的放射自 显影照片的图， (d)为示。
19、出99mTc-HMDP的放射自显影照片的图， (e)为示出甲苯胺蓝染色结果 的图。 具体实施方式 0027 本发明中，“诊断显像剂” 用于正电子发射断层扫描(PET)， 具体而言能够通过在向 活体施予所述诊断显像剂后， 利用PET设备对身体释放的辐射进行检测及成像从而用于非 侵入性地诊断临床状况。 说 明 书 3/9 页 5 CN 107847616 A 5 0028 本发明中， 癌症的 “骨转移” 是指在骨骼以外的其他组织发生的原发癌转移至骨骼 的临床状况。“在骨骼以外的其他组织发生的癌症” 的例子包括乳腺癌、 肾癌、 甲状腺癌、 多 发性骨髓瘤、 恶性淋巴瘤、 前列腺癌、 小细胞肺癌、 肝。
20、癌及胰腺癌。 本发明的诊断显像剂的对 象优选为乳腺癌及前列腺癌。 骨转移有溶骨型、 成骨型、 小梁间型， 且这些类型可能混合， 仅 要求骨转移在所有病灶中占据主导地位。 0029 本发明中，“癌症的早期骨转移” 是指在发生溶骨性反应、 早期成骨性骨转移、 及小 梁间骨转移之前的任何骨转移。“小梁间骨转移(intertrabecular bone metastasis)” 是 指尽管癌细胞在小梁(骨髓)之间发生组织病理学浸润和增殖， 但在骨骼中并未发生任何改 变。 0030 本发明的诊断显像剂的活性成分为18F-fluciclovine或其药学上可接受的盐。 0031 18F-fluciclov。
21、ine可通过已知方法合成， 例如， 可使用Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals,(1999),vol.42,pp.215-225中记载的方法得到。 0032 本发明中， 作为 “盐” ， 只要是药学上可接受的盐即可， 不受限制。 其例子包括由下 述物质衍生的盐： 无机酸， 如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸及磷酸； 有机酸， 如乙酸、 马来酸、 琥珀 酸、 扁桃酸、 富马酸、 丙二酸、 丙酮酸、 草酸、 乙醇酸、 水杨酸、 吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid)(葡糖醛酸、 半乳糖醛酸等)、 -羟基酸(柠檬酸、 酒石。
22、酸等)、 氨基酸(天冬氨酸、 谷氨酸 等)、 芳香酸(苯甲酸、 肉桂酸等)及磺酸(对甲苯磺酸、 乙磺酸等)； 有机碱， 如氨基酸(甘氨 酸、 精氨酸等)、 氨、 伯胺、 仲胺、 叔胺及环胺(哌啶、 吗啉、 哌嗪等)； 或无机碱， 例如氢氧化钠、 氢氧化钙、 氢氧化钾、 氢氧化镁、 氢氧化锰、 氢氧化铁、 氢氧化铜、 氢氧化锌、 氢氧化铝及氢氧 化锂。 0033 本发明的诊断显像剂优选通过胃肠外途径施予。 其剂型更优选为注射剂， 且优选 为水溶液， 所述水溶液中可适宜含有添加成分(如pH调节剂及药学上可接受的增溶剂、 张度 剂、 稳定剂及/或抗氧化剂)。 0034 本发明的诊断显像剂的18F-f。
23、luciclovine含量不受特别限制， 只要当使用时该试 剂具有能够进行PET显像的辐射量即可。 只要当使用时试剂具有例如50至740MBq的辐射量， 即可实际应用于成人的PET显像。 0035 实施例 0036 以下， 通过实施例对本发明进行更详细说明。 然而， 需要说明的是， 本发明不限于 这些实施例的内容。 0037 0038 1.材料 0039 (1)乳腺癌细胞(MRMT-1)悬浮液的制备 0040 大鼠乳腺癌细胞系MRMT-1得自理化学研究所生物资源中心(RIKEN BioResource Center)。 使用含10胎牛血清(美国典型培养物保藏中心(American Type C。
24、ulture Collection)、 100U/mL青霉素(Life Technologies Japan Ltd.制)及0.1mg/mL链霉素 (Life Technologies Japan Ltd制)的RPMI1640培养基(Life Technologies Japan Ltd. 制)对MRMT-1进行传代培养。 在移植当天， 除去培养容器中的培养基， 向该培养容器中添加 保持在37的胰蛋白酶-EDTA溶液(Life Technologies Japan Ltd.制)， 于37静置约5分 钟。 将MRMT-1从培养容器表面剥离， 向培养容器中添加与胰蛋白酶-EDTA溶液等量的上述培 。
25、说 明 书 4/9 页 6 CN 107847616 A 6 养基。 通过离心(800rpm， 5分钟)使MRMT-1沉淀， 除去上清液， 然后制备在Hank s缓冲液 (Life Technologies Japan Ltd.制)中以2.5105个细胞/mL的浓度悬浮有MRMT-1的细胞 悬浮液。 0041 (2)乳腺癌溶骨性骨转移大鼠模型的制备 0042 在异氟烷(Mylan制)麻醉下， 将作为抗炎镇痛剂的美洛昔康(Metacam)0.5注射 用溶液(Boehringer Ingelheim Vetmedica Japan Co.,Ltd.制)以0.2mg/kg的比率经皮下 注入9周龄雄性。
26、SD大鼠(Japan SLC,Inc.)的右后肢鼠蹊部， 然后切开鼠蹊部处的皮肤。 接下 来， 从肌肉剥除并分离隐动脉、 隐静脉及与它们并行的神经， 将缝合线(3-0)从位于远离腘 动脉分支部的部位的隐动脉下方穿过。 进而， 将腹壁浅动脉分支部周围的组织摘除， 在位于 腹壁浅动脉分支部与腘动脉分支部之间(略微远离腹壁浅动脉分支部的部位)的股动脉下 方穿过缝合线(3-0)。 接下来， 向隐动脉周围滴加数滴盐酸罂粟碱注射液(Papaverine Hydrochloride Injection)40mg(Nichi-Iko Pharmaceutical Co.,Ltd.制)来使血管平滑 肌松弛， 然。
27、后用手术钳夹起穿过隐动脉及股动脉下方的缝合线的各端， 提起隐动脉及股动 脉以压迫动脉。 将棉签放置于隐动脉下方以固定隐动脉， 然后从隐动脉的远端部在中枢方 向上刺入注射针， 缓缓注入MRMT-1悬浮液(0.1mL)。 向注射针的刺入位点滴加一滴手术粘合 剂(Aron Alpha A “Sankyo” (注册商标)， Toagosei Co.,Ltd.制)， 然后将取自手术区的皮下 脂肪块置于刺入位点上方， 将该位点闭合。 将缝合线从隐动脉及股动脉移除， 使血流恢复。 将股动脉至腹主动脉周围的皮下脂肪复位， 用缝合线(5-0)将皮肤闭合。 最后， 以10至20mg/ kg的比率皮下注射作为抗生素。
28、的注射用FOSMICIN-S(FOSMICIN-S 0.5g FOR INJECTION) 0.5g(Meiji Seika Pharma Co.,Ltd.制)。 在移植后第12至第14天， 将制备的模型动物用于 后述实验。 0043 (3)反式-1-氨基-3-氟代环丁烷-1-14C甲酸(14C-fluciclovine)的制备 0044 14C-Fluciclovine按照Nucl.Med.Biol.39,109-119中记载的方法制备。 0045 2.方法 0046 使用微焦X射线成像装置( FX-1000， FUJIFILM Corporation制)对乳腺癌细胞移 植后第12天的乳腺癌。
29、溶骨性骨转移大鼠模型进行拍摄， 然后， 将14C-fluciclovine (1.05MBq， 2.75MBq/kg)注入尾静脉， 于30分钟后将大鼠模型处死。 将右后肢及左后肢包埋 于SCEM(Section-lab Co.Ltd.制)中， 使用异戊烷/干冰或己烷/干冰快速冷冻后， 使用冷冻 切片机(Leica Instruments GmbH制)切成10 m的厚度。 此时， 将Cryofilm IIC(9)型 (Section-lab Co.Ltd.制)粘附于样品表面， 将样品切片从而制备厚度为10 m的骨切片。 使 用双面胶带将骨切片以Cryofilm IIC(9)型朝下的方式粘附于载玻。
30、片(Matsunami Glass Ind.,Ltd.制)上， 在成像板(GE Healthcare Japan制)上暴露1周， 然后使用扫描仪型图像 分析仪(Typhoon FLA 7000IP system， GE Healthcare Japan制)对放射自显影照片进行分 析。 0047 此外， 作为对照， 制备了施予3H-FDG(American Radiolabeled Chemicals制)或 99mTc-HMDP(Nihon Medi-Physics Co.,Ltd.制)来代替14C-fluciclovine的模型。 施予3H- FDG时， 除了施予量为6.66MBq(18.4M。
31、Bq/kg)以外， 实施相同的操作。 施予99mTc-HMDP时， 在乳 腺癌细胞移植后第14天施予至乳腺癌溶骨性骨转移大鼠模型的量为20.3MBq(58.0MBq/ kg)， 2小时后处死大鼠模型， 然后在成像板上暴露2小时， 除此以外， 实施相同的操作。 对于 说 明 书 5/9 页 7 CN 107847616 A 7 成像板的类型而言， 将TR用于 核素、 14C-fluciclovine及3H-FDG， 将SR用于核素、99mTc- HMDP。 0048 然后， 通过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色对各切片进行病理学评价。 甲苯胺蓝 染色中， 从冷冻切片机中取出粘附于载玻片上的骨切片(。
32、厚度为10 m)， 于室温干燥约1分 钟， 然后浸入无水乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制)中约3至5秒， 进而在4 多聚甲醛磷酸缓冲液(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制)中浸泡1分钟以上。 用流 水洗涤切片约10秒， 然后在0 .05甲苯胺蓝溶液(pH7 .0)(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制)中浸泡约5分钟。 然后， 用流水洗涤切片约30秒， 向骨切片的表面滴加 数滴专用密封介质(dedicated mounting medium)SCMM-R3(Section-lab 。
33、Co.Ltd.制)， 并 用切割器切除Cryofilm IIC(9)型的两边。 将样品以骨切片朝下的方式置于另一片载玻片 上， 然后通过用于该专用密封介质的聚合器(R2R3)(Leica Microsystems制)将专用密封 介质聚合。 0049 苏木精-伊红染色中， 以与上述相同的方式将骨切片浸入无水乙醇及4多聚甲醛 磷酸缓冲液中， 然后在苏木精3G(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制)中浸泡约2分钟， 用 流水洗涤约30秒。 接下来， 将切片在伊红(Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.制)中浸泡约1 分钟， 然后用流水洗涤约30秒。 向骨切。
34、片的表面滴加数滴专用密封介质SCMM-R2(Section- lab Co.Ltd.制)， 然后以与甲苯胺蓝染色相同的方式将专用密封介质聚合。 0050 3.结果 0051 结果示于图1-3。 图1(a)至(j)为示出了14C-fluciclovine的结果的图， 图2(a)至 (j)为示出了3H-FDG的结果的图， 图3(a)至(j)为示出了99mTc-HMDP的结果的图。 图1(a)至 (e)、 图2(a)至(e)、 及图3(a)至(e)示出了从正常肢(左后肢)摘除的下肢骨， 图1(f)至(j)、 图2(f)至(j)、 及图3(f)至(j)示出了从MRMT-1移植肢(右后肢)摘除的下肢骨。。
35、 图1(a)和 (f)、 图2(a)和(f)、 及图3(a)和(f)为X射线成像的结果， 图1(b)和(g)、 图2(b)和(g)、 及图3 (b)和(g)为切片的目视外观， 图1(c)和(h)、 图2(c)和(h)、 图3(c)和(h)为放射自显影照片， 图1(d)和(i)、 图2(d)和(i)、 及图3(d)和(i)为甲苯胺蓝染色的结果， 图1(e)和(j)、 图2(e) 和(j)、 及图3(e)和3(j)为苏木精-伊红染色的结果。 0052 图1(f)中的箭头A示出了在MRMT-1移植肢(右后肢)的X射线图像中观察到的溶骨 性病变位点。 图1(g)中的箭头A示出了在MRMT-1移植肢(右。
36、后肢)切片的目视外观中观察到 的骨转移病灶位点， 该病灶位点是与图1(f)中的箭头A相同的位点。 图1(h)中的箭头A示出 了在MRMT-1移植肢(右后肢)的放射自显影照片中观察到14C-fluciclovine蓄积的位点， 其 是与图1(f)中的箭头A相同的位点。 图1(i)中的箭头A示出了在MRMT-1移植肢(右后肢)的甲 苯胺蓝染色图像中观察到的骨转移病灶位点， 其是与图1(f)中的箭头A相同的位点。 图1(j) 中的箭头A示出了在MRMT-1移植肢(右后肢)的苏木精-伊红染色图像中观察到的骨转移病 灶位点， 其是与图1(f)中的箭头A相同的位点。 这些结果确认了14C-fluciclo。
37、vine在溶骨性 病变区域的骨转移处蓄积。 0053 图1(f)中的箭头B示出了下述这样的位点， 在该位点处， 没有在MRMT-1移植肢(右 后肢)的X射线图像中观察到溶骨性病变。 图1(g)中的箭头B示出了在MRMT-1移植肢(右后 肢)切片的目视外观中观察到的骨转移病灶位点， 其是与图1(f)中的箭头B相同的位点。 图1 (h)中的箭头B示出了在MRMT-1移植肢(右后肢)的放射自显影照片中观察到 14C- 说 明 书 6/9 页 8 CN 107847616 A 8 fluciclovine蓄积的位点， 其是与图1(f)中的箭头B相同的位点。 图1(i)中的箭头B示出了 在MRMT-1移。
38、植肢(右后肢)的甲苯胺蓝染色图像中观察到的骨转移病灶位点， 其是与图1(f) 中的箭头B相同的位点。 图1(j)中的箭头B示出了在MRMT-1移植肢(右后肢)的苏木精-伊红 染色图像中观察到的骨转移病灶位点， 其是与图1(f)中的箭头B相同的位点。 这些结果确认 了14C-fluciclovine也在形成溶骨性病变之前的骨转移处蓄积， 而这在X射线图像中是无法 检测的。 如图2(f)至(j)中的箭头A和箭头B所示， 该结果确认了3H-FDG也在溶骨性病变区域 及形成溶骨性病变之前的骨转移处蓄积。 上述结果确认了： 与3H-FDG同样地， 14C- fluciclovine也在溶骨性病变区域及形。
39、成溶骨性病变之前的骨转移处蓄积。 另一方面， 在 生长面(growth plate)及原位松质骨(primary cancellous bone)附近(箭头C)观察到 了99mTc-HMDP的蓄积， 但在溶骨性病变区域(箭头A)或形成溶骨性病变之前的骨转移病灶 (箭头B)处均未观察到蓄积。 0054 0055 试验遵循赫尔辛基宣言及GCP的伦理原则实施。 在试验之前， 已直接获得了自愿参 加试验的书面协议。 0056 1.患者 0057 选定未经治疗的男性患者(69岁， 已通过前列腺穿刺活检而经组织病理学诊断为 前列腺癌)， 其PSA为589.17ng/mL， Gleason评分为8。 005。
40、8 2.试验药物 0059 使用了通过WO2008/75522中记载的方法制造的18F-fluciclovine制剂(NMK36， Nihon Medi-Physics Co.,Ltd.制)。 0060 3.PET/CT 0061 病人在前一天的晚餐后禁食， 然后经静脉注射施予2mL的18F-fluciclovine制剂 (263.1MBq)， 并用盐水冲洗。 为了避免前列腺癌原发病灶对PET/CT图像评价的影响， 在前列 腺穿刺活检日(第1天)的第22天之后施予18F-fluciclovine制剂。 基于衰减校正的目的， 在 施予18F-fluciclovine制剂后， 立刻使用PET/CT。
41、显像仪(Discovery PET/CT600， GE Healthcare制)采集全身CT图像， 然后， 在施予后30分钟以内完成全身PET。 0062 4.现有图像 0063 为了与18F-fluciclovine PET/CT图像进行比较， 在18F-fluciclovinePET/CT施予 日的28天以前， 采集全身对比度增强CT及骨闪烁造影。 对于全身对比度增强CT而言， 施予非 离子性造影剂(contrast agent)(BYSTAGE， FUJIFILM Medical Co.,Ltd.制)， 90秒后， 使用 80排多排探测器CT(Aquilion Prime， TOSHIB。
42、A CORPORATION制)， 从颈部直到骨盆为止， 以 厚度为5mm以下的切片开始CT显像(管电压： 120kV)。 对于骨闪烁造影而言， 施予740MBq的 99mTc-HMDP(CLEAR BONE(注册商标)注射剂， Nihon Medi-Physics Co.,Ltd.制)， 在2小时后 开始拍摄全身平面图像(能量窗： 140keV10)。 0064 5.图像的目视评价 0065 对图像加以评价的两名对受试者背景无了解(blind)的人员各自独立地针对18F- fluciclovine PET/CT、 全身对比度增强CT及骨闪烁造影的图像进行评价。 当两名人员判定 结果不同时， 通。
43、过讨论得出结论。 对骨闪烁造影的全身平面图及全身对比度增强CT图像进 行解释， 并根据其总体发现来确定骨转移的有无。 说 明 书 7/9 页 9 CN 107847616 A 9 0066 6.结果 0067 结果示于图4(a)至(c)及5(a)至(c)。 图4(a)至(c)为18F-fluciclovine PET/CT图 像， 图4(a)为头部图像， 图4(b)为胸部图像， 图4(c)为骨盆图像。 此外， 图5(a)为通过最大密 度投影得到的18F-fluciclovine的PET图像， 图5(b)为骨闪烁造影的前视图， 图5(c)为骨闪 烁造影的后视图。 图4(a)至4(c)及5(a)至。
44、(c)中， 以箭头示出的位点是在图5(b)及(c)的骨 闪烁造影显像中未被可视化的位点、 并且也是在全身对比度增强CT上未被可视化的位点。 因此， 在骨闪烁造影及全身对比度增强CT上未被可视化的病变在18F-fluciclovine图像中 得以被可视化。 0068 0069 1.材料 0070 (1)乳腺癌细胞(MRMT-1)悬浮液的制备 0071 以与实施例1中制备的MRMT-1悬浮液相同的方式制备MRMT-1悬浮液。 0072 (2)乳腺癌骨转移大鼠模型的制备 0073 将MRMT-1悬浮液注入12周龄雄性SD大鼠(Japan SLC,Inc.)的右隐动脉及左隐动 脉， 除此以外， 以与实。
45、施例1中制备的溶骨性骨转移大鼠模型相同的方式制备小梁间骨转移 模型， 在移植后第6天或第8天将其用于后述实验。 病变仅在移植后第6天的模型的右后肢及 移植后第8天的模型的左肢出现。 0074 除了使用12周龄雄性SD大鼠(Japan SLC,Inc.)以外， 以与实施例1中制备的溶骨 性骨转移大鼠模型相同的方式制备溶骨性骨转移模型， 在移植后第11天将其用于后述实 验。 0075 (3)14C-fluciclovine的制备 0076 以与实施例1中制备的14C-fluciclovine相同的方式制备14C-fluciclovine。 0077 2.方法 0078 使乳腺癌细胞移植后第6天或第。
46、8天的乳腺癌小梁间骨转移大鼠模型、 或乳腺癌细 胞移植后第11天的乳腺癌的溶骨性骨转移大鼠模型彻夜禁食， 在施予示踪剂之前， 使用1 异氟烷(Pfizer Inc.制)麻醉； 将2.75MBq/kg的14C-fluciclovine、 74MBq/kg的99mTc-HMDP (Nihon Medi-Physics Co.,Ltd.制)及18.5MBq/kg的3H-FDG(American Radiolabeled Chemicals制)注入相同的大鼠的尾静脉。 在处死大鼠前， 使14C-fluciclovine及3H-FDG在循 环中保持30分钟， 使99mTc-HMDP在循环中保持2小时。 。
47、在麻醉条件下， 通过从腹主动脉抽血从 而将动物处死。 然后， 移除胫骨及股骨并将其包埋入SCEM(Section-Lab Co.Ltd.制)中， 在 异 戊 烷 / 干 冰 中 冷 冻 。 按 照 川 本 膜 ( K a w a m o t os f i l m ) 法 ( K a w a m o t o T .Arch .Histol .Cytol .2003； 66:123-43)中的记载， 使用CM3050S冷冻切片机 (LeicaBiosystems制)于-20将冷冻试样切片(病理学样品及放射自显影样品分别为5 m 厚度切片及10 m厚度切片)。 得到15片连续切片， 将每张切片放置于。
48、载玻片上。 为了获得 由99mTc同位素生成的图像， 将SR成像板(FUJIFILM Corporation制)暴露给包裹在12 m厚的 聚酯膜(LUMIRRORTM， Toray Industries,Inc.制， 其吸收低能量的3H)中的10 m厚的干燥切 片1小时。 在上述条件下， 即使在暴露1小时后， 14C也未导致SR成像板的任何黑化， 因此， 排除 了由99mTc放射自显影中的14C导致的交叉污染。 将与经过99mTc放射自显影的切片相邻的后面 2片冷冻切片于-20保存5天， 使99mTc彻底衰减。 接下来， 将TR成像板(FUJIFILM 说 明 书 8/9 页 10 CN 107847616 A 10 Corporation制)暴露于带有及不带有12 m厚的聚酯膜的干燥切片7天， 由此分别得到14C图 像及3H+14C混合图像(Obata T.等， RADIOISOTOPES.2000； 49:623-36)。 使用FLA-7000成像分 析仪(GE Healthcare UK Ltd制)使成像板显像。 最后， 通过使用ImageJ软件(ver.1.48， NIH)从14C+3H图像中减去14C图像来得到3H图像。 。