技术领域
本发明是涉及药物的用途，特别是辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，属于西药领域。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染大约4亿人，是世界范围内最常见的慢性感染性疾病，是导致原发性肝细胞癌(HCC)的主要原因，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。目前对HBV感染的治疗主要是干扰素和核苷类似物，干扰素治疗的长期有效率仅为30％左右,并且毒副作用较多；核苷类似物如拉米夫定虽然抗病毒能力较强，但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现，使得临床抗病毒方案的实施面临极大的挑战。因此，对慢性HBV感染治疗的积极探索已成为临床研究的重要领域。
病毒本身的基因组非常小，只能编码有限数量的基因，所以病毒必须利用宿主细胞的因子及元件进行复制，尤其是真核细胞基因复制、转录相关的因子。在流感病毒RNA基因的复制过程中，微小染色体维持蛋白(MCMs)起着重要的稳定作用，MCMs是宿主细胞DNA复制起始和延长过程中的重要因子，同时也参与细胞周期调控。MCM7是MCM(Minichromosome Maintenance Protein)蛋白家族成员之一,负责细胞增殖过程中DNA复制的启动。研究发现，在体外应用阿托伐他汀处理的分离所得的兔主动脉平滑肌细胞，可以抑制该细胞的增殖能力。该研究还对E2F活性以及MCM6、MCM7进行检测，发现阿托伐他汀可通过影响E2F活性下调MCM蛋白的表达，而这种抑制作用可 以被外源性MVA解除，证明他汀类药物可能通过其抑制胆固醇合成的作用减少MAV合成，进一步抑制DNA复制因子MCM6、MCM7的表达，阻滞细胞周期进程。
目前临床常用的辛伐他汀是羟甲戊二酰辅酶A还原酶(HMG CoA还原酶)抑制剂，一直被用来治疗高胆固醇血症及预防心血管疾病。目前尚无辛伐他汀以MCM7为靶点抑制细胞增值的相关研究报道，因此阐明辛伐他汀在HBV感染的相关机制研究具有积极的意义和研究价值。
发明内容
本发明的目是：提供一种辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，由于辛伐他汀具有很强的抗乙肝病毒的活性，为临床制备抑制乙肝病毒药物提供了新的有效方法。
本发明的技术方案是：辛伐他汀在制备抑制乙肝病毒药物中的应用，其特征是：所述的辛伐他汀在制备以MCM7为靶标的药物中的应用。
所述的辛伐他汀在制备以MCM7为靶标的抑制乙肝病毒的药物中的应用。
所述的辛伐他汀在制备以MCM7为靶标的抑制肝癌的药物中的应用。
所述的肝癌是由HBV感染引起的原发性肝癌。
本发明的有益效果是：辛伐他汀通过抑制HepG2.2.15细胞中MCM7表达水平，从而抑制了该细胞中HBV的复制，阻滞细胞周期进程。由于辛伐他汀具有很强的抗乙肝病毒的活性，为临床制备抑制乙肝病毒药物提供了新的有效方法。
附图说明
图1是A siRNA干扰MCM7后AdGFP的表达情况；
图2是siMCM7干扰后HepG2.2.15细胞MCM7表达情况；
图3是下调MCM7后，HepG2.2.15细胞水平HBV DNA拷贝数(*VS control，P<0.05)；
图4是不同浓度辛伐他汀对HepG2.2.15细胞增殖率的影响；
图5是不同浓度辛伐他汀对HepG2.2.15细胞细胞计数的影响；
图6是HepG2.2.15细胞干预4d的细胞形态(A：溶剂对照，B:辛伐他汀40μmol/L)；
图7 5×106个HepG2.2.15细胞上清中HBV的DNA拷贝数；
图8 5×106个HepG2.2.15细胞上清中HBV的DNA拷贝数；
图9辛伐他汀对肝癌HepG2.2.15细胞周期的影响；
图10是辛伐他汀干预4d对肝癌HepG2.2.15细胞周期的影响；
图11是辛伐他汀干预后HepG2.2.15细胞周期相关蛋白的表达；
图12A是MCM7转录水平的变化；
图12B是MCM7蛋白水平的变化；
图13是辛伐他汀作用后对HepG2.2.15细胞蛋白水平的影响。
具体实施方式
下面通过给出的具体实施例可以进一步清楚的说明本发明，但不作为对本发明的限定。
本发明的是通过以下的实验得到证实的。
如图1-3所示，通过siRNA技术，抑制MCM7的表达，发现腺病毒的GFP表达明显下降，说明MCM7作为宿主细胞DNA复制因子，参与病毒 的复制。在流感病毒RNA基因的复制过程中，微小染色体维持蛋白(MCMs)起着重要的稳定作用。我们在HepG2.2.15细胞中，通过siRNA技术下调MCM7的蛋白表达，对细胞中的HBV DNA拷贝数进行检测，发现抑制HepG2.2.15细胞中MCM7的表达后，细胞中HBV DNA拷贝数数降低，说明作为宿主细胞DNA复制因子MCM7参与HBV的复制。
首先，采用MTT，细胞计数方法检测不同浓度的辛伐他汀对HepG2.2.15细胞增殖的影响。结果如图4和图5所示：40μmol/L辛伐他汀在药物作用3d后开始抑制HepG2.2.15细胞的增殖，可持续至药物干预后7d；而其他浓度组(5μmol/L,20μmol/L)对细胞增殖无明显作用；阳性对照药物拉米夫定(5μmol/L)对细胞增殖无明显作用。图6是HepG2.2.15细胞干预4d的细胞形态(A：溶剂对照，B:辛伐他汀40μmol/L)。
根据MTT，细胞计数结果，使用40μmol/L和5μmol/L辛伐他汀分别作用于HepG2.2.15细胞，并在不同时间点(1d、4d、7d)收集不同组的细胞及上清，用NP-40裂解细胞后，取部分样品采用PCR-荧光探针法测定上清液中及细胞内HBV DNA的拷贝数，如图7所示。剩余样品计算单位蛋白浓度的HBV DNA拷贝数如图8所示。结果发现：高浓度辛伐他汀在体外抑制HepG2.2.15细胞乙肝病毒复制，上清及细胞水平的HBV DNA拷贝数数均降低，并且细胞内降低更明显，且随着作用时间、作用浓度的增高，抑制作用越明显。证实辛伐他汀在体外确有抗HBV的作用。
用40μmol/L和5μmol/L辛伐他汀分别作用于HepG2.2.15细胞，在1d和4d收集不同组的细胞，采用PI单染法检测细胞周期。结果如图9和10显示：辛伐他汀低浓度组及高浓度组对HepG2.2.15细胞作用1d时，对 周期均无明显影响；而药物作用4d时，低浓度的辛伐他汀对细胞周期则无明显影响，高浓度辛伐他汀则使G1期细胞明显增多，S期及G2/M期细胞均减少。结果表明辛伐他汀可以使HepG2.2.15细胞发生G1期阻滞，且具有时间、浓度的双重依赖性。
用Western-blot检测辛伐他汀作用后HepG2.2.15细胞的MCM7的表达，以及周期相关蛋白P21、P27、P53、cyclin D1、pRb和Rb，结果如图11显示：5μmol/L和40μmol/L作用HepG2.2.15细胞1d时，均无明显抑制MCM7蛋白表达；而在4d时可下调MCM7蛋白水平；在辛伐他汀高浓度作用4d时，cyclin D1、pRb表达下降，P21、P27的表达增高，而Rb、P53表达无明显变化。cyclin D1，pRb，MCM7作为细胞周期促进因子，其表达下降时，而周期抑制因子P27、P21表达增高，可以抑制细胞周期的进程，这也进一步解释了流式细胞仪检测的周期结果。辛伐他汀可能通过抑制HepG2.2.15细胞中MCM7表达水平，从而抑制了该细胞中HBV的复制。
如图12A所示，通过实时荧光定量PCR的方法，检测5μmol/L、40μmol/L的辛伐他汀分别作用于HepG2.2.15细胞后，MCM7的mRNA水平的变化，随作用浓度和作用时间的增加，MCM7的mRNA水平表达均明显增高。这与之前Western-blot的结果相反，如图12B所示。因此，辛伐他汀药物干预后，细胞中MCM7的mRNA水平表达增高，但蛋白水平表达下降。
如图13所示，通过Western-blot检测辛伐他汀作用后的HepG2.2.15细胞中p-eIF2α蛋白的表达，结果发现，随着药物作用浓度和作用时间的增加，p-eIF2α的蛋白表达增强。这说明辛伐他汀对HepG2.2.15细胞进行干预后，会产生类似干扰素样作用。有文献报道AMPK可以激活PERK，从而使eIF2 α磷酸化水平增高，而LKB1是AMPK的上游激酶，所以我们推测辛伐他汀可能通过激活LKB1-AMPK，从而激活PERK，使eIF2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因翻译，MCM7可能是其下游靶基因之一。而检测显示，药物干预后，LKB1、p-AMPK、PERK、p-eIF2α的蛋白表达水平随作用浓度和作用时间的增加而增强，而MCM7随作用浓度和作用时间的增加而降低，提示辛伐他汀可能通过激活LKB1-AMPK通路发挥抗HBV的作用。
实施例1
MTT实验检测细胞增殖能力
取对数生长期肝癌HepG2.2.15细胞，用含0.25％胰酶(Trypsin)+0.02％EDTA的消化液消化细胞离心弃去上清，用完全培养基吹打均匀后使用细胞计数板计数，按细胞数3×104/孔接种于96孔培养板中。孵育24h后用不同浓度的辛伐他汀(如表1)处理细胞，每个浓度设5个副孔。分别在药物作用1、2、3、4、5、6、7d后，加入500μg·ml-1MTT 20μl，37℃孵育4h后先吸弃培养液，随后每孔加入DMSO 150μl，震荡15min混匀，用酶标仪检测570nm下各孔吸光度(A)值。将各测试孔的A值减去本底A值(无细胞培养基加MTT试剂)；根据各平行孔的A值计算平均值。
细胞增殖率％＝(干预组细胞A值-本底A值)/(对照组细胞A值-本底A值)×100％。实验重复3次，绘制抑制率曲线如图4。
表1 辛伐他汀作用浓度
实施例2
细胞计数实验检测细胞增殖能力
取对数生长期肝癌HepG2.2.15细胞，用含0.25％胰酶(Trypsin)+0.02％EDTA的消化液消化细胞离心弃去上清，用完全培养基吹打均匀后使用细胞计数板计数，按细胞数3×104/孔接种于96孔培养板中。孵育24h后用不同浓度的辛伐他汀(如表1)处理细胞，每个浓度设5个副孔。分别在药物作用1、2、3、4、5、6、7d后将细胞用0.25％胰酶消化，充分吹打制备成单细胞悬液。计数板和盖玻片用95％的乙醇擦洗干净，凉干。把盖玻片覆盖在计数板上，充分混匀细胞悬液，吸管吸取细胞，从计数板边缘轻轻滴约10μl细胞悬液，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙中，要避免溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。在倒置显微镜下用10x物镜观察，计数四角的4个大方格，2个以上细胞组成的细胞团按一个细胞计算，压线的细胞只计上线和左线者。按下列公式计算细胞浓度：(4大格细胞总数/4)X 104个/ml。每一样品重复3次，取平均值得细胞悬液浓度。
实施例3
蛋白免疫印记分析法(Western-blot)
1)蛋白样品的准备：将事先培养并做相应处理的细胞去除培养基，用预冷(4℃)的PBS冲洗3遍，尽量将残余PBS充分吸干，之后加入预冷的蛋白裂解液，置于冰上裂解30min。此后，用细胞刮培养皿收集细胞，并于4℃下12000rpm离心2min，取上清。取其中少量上清进行蛋白定量，其余部分加入Loading Buffer液，104℃煮30min，之后置于-20℃保存备用。
2)制备电泳凝胶：按表2配制5％浓缩胶及10％分离胶。总蛋白上样 量为50μg，60V电泳，待样品前沿进入分离胶后，调电压至100V，继续电泳约1.5h。见表2
表-2 凝胶配制
3)蛋白电泳：将蛋白样品调至等浓度后上样，开始先45V电压进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。当目的蛋白移动至距分离胶下缘1cm左右停止电泳。
4)半干式转膜：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和PVDF膜，电泳结束后剥离凝胶，以去离子水漂洗，按PVDF膜>滤纸>凝胶的大小顺序切20层滤纸及一张PVDF膜，PVDF膜在甲醇中浸泡30～60s，后与滤纸一起浸泡在转膜缓冲液中15～30min待用。用半干电转法转膜，在阳极与阴极间依次放置20层滤纸、PVDF膜、凝胶、20层滤纸，设置转膜条件为25V，30min。
5)免疫印迹：转膜成功后，PVDF膜以含有5％脱脂奶粉的TBST，37℃摇床上轻摇60min，封闭非特异结合位点。封闭后用TBST液洗膜，摇床轻摇5min×3次。将膜与稀释的一抗4℃孵育过夜。孵育一抗后TBST液洗膜，摇床轻摇5min×3次。将膜移入二抗工作液(用封闭液按1:2000稀释二抗) 37℃2h。孵育二抗后TBST液洗膜，摇床轻摇5min×3次。弃去TBST，加显色液，曝光采集图像。
实施例4
实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
1)总RNA提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12 000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7 000rpm离心5分钟。RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2)cDNA合成在0.5ml的离心管中加入1ul模板总RNA；2ul随机引物；2ul 10mMdNTP mix；加水至15ul体系。混匀后70℃变性RNA 5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6ul 5×PCR buffer；1ulRNaseout；1ul M-MLV RT；加水至30ul体系。PCR仪中反应条件设置 37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。
3)实时定量PCR按以下反应体系进行:2x RealqPCRMasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul；上游引物F 1ul，下游引物R 1ul；cDNA template 2ul。定量PCR仪扩增反应条件设置：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s-60℃ 60s(40个循环)。
实施例5 siRNA转染
1)转染前一天的准备工作：取对数生长期细胞经胰酶消化后计数。灭菌一次性六孔板一个，每个孔中滴加lxl05个细胞，并补加2ml含10％FBS的DMEM，轻轻晃动培养皿使细胞密度均匀。在37℃，5％C02培养箱中培养24h。
2)转染：100pmol(5u1)siRNA分子和5ul Lipofectamine2000分别用245ulDMEM稀释后，空白组只含5ul Lipofectamine2000，将稀释好的Lipofectamine2000分别加入到对应的稀释好的siRNA分子中，轻轻混合均匀后，于室温下静置20min，使形成siRNA.Lipofectamine2000复合物。取出培养皿，倒去旧的培养基，用PBS洗一次，各转染组分别加入1500ul血清的DMEM。然后分别加入对应的siRNA分子复合物，十字方向晃动培养皿以使混合均匀，37℃，5％C02培养箱中继续培养6h。6h后结束转染，弃去培养基，换成新鲜含10％FBS的高糖DMEM，37℃，5％C02培养箱中继续培养48-72h。
本发明通过上述实验及实施例进一步说明：由于辛伐他汀通过激活 LKB1-AMPK，从而激活PERK，使eIF2α磷酸化水平增高，抑制下游靶基因MCM7的翻译，而下调MCM7的表达可以抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制。MCM7表达受到抑制很可能是辛伐他汀类抗病毒的机制。因此，MCM7是辛伐他汀药物抑制乙肝病毒复制的作用靶点，进一步说明辛伐他汀能够应用于制备以MCM7为靶标的药物中；特别是辛伐他汀在制备以MCM7为靶标的抑制乙肝病毒的药物中的应用；以及所述的辛伐他汀在制备以MCM7为靶标的抑制由HBV感染引起的原发性肝癌的药物中的应用，并为临床治疗乙肝提供了新的有效方法。
本实施例没有详细叙述的部分和英文缩写属本行业的公知常识，在网上可以搜索到，这里不一一叙述。