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1、10申请公布号CN104195265A43申请公布日20141210CN104195265A21申请号201410419410X22申请日20140822C12Q1/70200601C12Q1/68200601C12N15/11200601C12R1/9320060171申请人广东省农业科学院动物卫生研究所地址510640广东省广州市天河区五山白石岗街72发明人张建峰嘎利兵嘎张春红刘志成郭鹏举沈海燕朱余军74专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人郑莹54发明名称一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物和方法57摘要本发明公开了一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗。
2、株的PCRHRM引物和方法。该方法为先从样品中提取病毒DNA作为模板，利用所设计的2对特异性引物和荧光饱和染料进行PCR扩增，并分别以野毒株和疫苗株标准品作为对照对检测样品进行HRM分析，确定犬细小病毒的类型。本发明操作简单，只需PCR反应前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了区分检测所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。51INTCL权利要求书2页说明书6页序列表2页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请。
3、权利要求书2页说明书6页序列表2页附图3页10申请公布号CN104195265ACN104195265A1/2页21一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物，其核苷酸序列如下所示引物P1TGGAAATCACAGCAAACTC（SEQIDNO1）或其核苷酸互补序列，引物P2AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC（SEQIDNO2）或其核苷酸互补，引物P3TGAAAATTATAGAAGAGTGGT（SEQIDNO3）或其核苷酸互补序列，引物P4CGTTAACTGCAGTTTTATCCA（SEQIDNO4）或其核苷酸互补序列。2一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM。
4、方法，其特征在于包括以下步骤1）从样品中提取病毒DNA；2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4和荧光饱和染料进行PCRHRM扩增反应获得扩增产物；4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。3根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2）中的PCR预扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P105L引物P205L模板10LDDH2O30L。4根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2）中的预扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，55退火30S，72延伸30S；循环35。
5、次；72终延伸8MIN。5根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3）中的PCRHRM扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P305L引物P405L模板10L荧光饱和染料1LDDH2O20L。6根据权利要求2或5所述的方法，其特征在于所述的荧光饱和染料为EVAGREEN染料。7根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤3）中的PCRHRM扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，58退火30S，72延伸30S；循环35次；68到80以03/步的速率进行熔解曲线分析。8根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为1）以疫苗株CPVPF标准样品为对照时。
6、，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为疫苗株CPVPF；2）以疫苗株CPVINT标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为疫苗株CPVINT；权利要求书CN104195265A2/2页33）以CPV野毒株标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为CPV野毒株。权利要求书CN104195265A1/6页4一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物和方法技术领域0001本发明涉及病毒疫苗毒与野毒株的鉴别方法，具体涉及一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物和方法。背景技术0002犬细小病毒（CANINEPARVOVIRUS,。
7、CPV）为单链小DNA病毒，是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的主要病原。1977年，EUGSTER和NAIRN首次从患出血性肠炎的病犬粪便中分离到犬细小病毒，并命名为CPV2。自EUGSTER等人首次分离获得CPV2以来，CPV抗原性随时间的推移而不断发生改变，不断有新的CPV基因型和抗原型出现，并在世界范围内广泛传播流行。目前已知的CPV基因型包括CPV2A、CPV2B和CPV2C，原始型CPV2基因型已被新出现的抗原变异株取代，并且原始型CPV2毒株只有以弱毒活疫苗的形式用于犬细小病毒的预防当中。目前，国内用于预防犬细小病的疫苗株主要有美国辉瑞动保公司的CPVPF弱毒活疫苗株和荷兰。
8、英特维公司的CPVINT弱毒活疫苗株，以上两个疫苗株均是原始CPV2株的弱毒株。0003随着国内宠物行业的不断发展，目前临床中大量使用弱毒活疫苗来预防犬细小病，虽然接种疫苗可预防犬细小病的流行，但有报道称接种犬细小病弱毒活疫苗株的犬只发病率增加的现象。此外，接种疫苗也对疾病的及时准确诊断带来了一定的难度。例如，患有犬瘟热的犬只接种弱毒活疫苗后由于粪便当中检测到犬细小病毒疫苗株而误诊为犬细小病引起的肠道疾病，从而影响其疾病治疗效果。因此，快速区分犬细小病毒的疫苗株和野毒株对疫苗株的安全评价及疾病的快速准确诊断具有一定的临床意义。而目前区分犬细小病毒疫苗株与野毒的主要方法为荧光定量PCR法（MGB。
9、探针），此方法虽然能准确区分犬细小病毒疫苗株与野毒株，但同时需要三对或更多的探针价格昂贵，限制其在生产中的实际应用。因此，目前急需一种操作相对简易、检测结果可靠且检测成本低廉的区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的方法。发明内容0004为了解决上述存在的问题，本发明建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCRHRM引物和方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠且检测成本低廉，有利于在临床实践中推广应用。0005本发明的目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCRHRM引物。0006本发明的另一目的在于提供一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCRHRM方法。0007本发明所采取的技。
10、术方案是一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物，其核苷酸序列如下所示说明书CN104195265A2/6页5引物P1TGGAAATCACAGCAAACTC（SEQIDNO1）或其核苷酸互补序列，引物P2AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC（SEQIDNO2）或其核苷酸互补，引物P3TGAAAATTATAGAAGAGTGGT（SEQIDNO3）或其核苷酸互补序列，引物P4CGTTAACTGCAGTTTTATCCA（SEQIDNO4）或其核苷酸互补序列。0008一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM方法，包括以下步骤1）从样品中提取病毒DNA；2）以DNA为模。
11、板，用权利要求1所述的引物对P1和P2进行预扩增反应获得预扩增产物；3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对P3、P4和荧光饱和染料进行PCRHRM扩增反应获得扩增产物；4）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。0009进一步的，上述步骤2）中的PCR预扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P105L引物P205L模板10LDDH2O30L。0010进一步的，上述步骤2）中的预扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，55退火30S，72延伸30S；循环35次；72终延伸8MIN。0011进一步的，上述步骤3）中的PCRHRM扩增反应体系为PREMIXEXTA。
12、Q50L引物P305L引物P405L模板10L荧光饱和染料1LDDH2O20L。0012进一步的，上述所述的荧光饱和染料为EVAGREEN染料。0013进一步的，上述步骤3）中的PCRHRM扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，58退火30S，72延伸30S；循环35次；68到80以03/步的速率进行熔解曲线分析。0014进一步的，上述步骤4）中所述HRM分析的具体分析过程为1）以疫苗株CPVPF标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为疫苗株CPVPF；2）以疫苗株CPVINT标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为疫苗株CPVINT；3。
13、）以CPV野毒株标准样品为对照时，若其基因分型置信值（GCP）大于95则判定为CPV野毒株。0015本发明的有益效果是1）本发明首次建立了一种快速区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的PCRHRM引物和方法，操作简单只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量全部操作说明书CN104195265A3/6页6过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。00162）本发明的PCRHRM引物，对犬细小病毒疫苗株（包括CPVPF和CPVINT。
14、疫苗株）与野毒株均有很好地的扩增性，有助于提高PCR的效率，减少病毒鉴别分型的时间。00173）本发明的PCRHRM引物特异性好，除可以与犬细小病毒疫苗株与野毒株结合外，不与其他常见犬类病毒DNA结合，特异性扩增犬细小病毒DNA，有利于提高本发明对基因型分析的正确性。附图说明0018图1为犬细小病毒疫苗株与野毒株标准样品HRM标准化熔解曲线；图2为犬细小病毒疫苗株与野毒株标准样品HRM峰型化熔解曲线；图3为犬细小病毒疫苗株与野毒株临床样品HRM标准化熔解曲线；图4为犬细小病毒疫苗株与野毒株临床样品HRM峰型化熔解曲线；图5为犬细小病毒疫苗株与野毒株PCRHRM引物特异性凝胶电泳图。具体实施方式。
15、0019下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。0020实施例1（1）引物1）PCR预扩增引物根据犬细小病毒VP2基因序列设计出扩增犬细小病毒VP2部分基因的引物对P1和P2,其碱基序列如下所示。0021P15TGGAAATCACAGCAAACTC3（SEQIDNO1），P25AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC3（SEQIDNO2）。0022其中，引物P1在犬细小病毒VP2基因第29622980位点上，引物P2在犬细小病毒VP2基因第42094231位点上该基因在GENBANK中的登录号为M38245。00232）PCRHRM引物本发明经过对所设计的大量引物进行筛。
16、选后，发现引物对P3、P4和引物对P1、P2的联合使用对PCRHRM方法区分犬细小病毒疫苗株与野毒株的效果最好，引物对P3、P4的碱基序列如下所示。0024P35TGAAAATTATAGAAGAGTGGT3（SEQIDNO3），P45CGTTAACTGCAGTTTTATCCA3（SEQIDNO4）。0025其中，引物P3在犬细小病毒VP2基因第30143034位点上，引物P4在犬细小病毒VP2基因第30453066位点上该基因在GENBANK中的登录号为M38245。0026（2）标准样品的制备及其PCRHRM分析1）犬细小病毒DNA的提取用试剂盒MINIBESTVIRALRNA/DNAEXT。
17、RACTIONKITVER40提取病料样品中的犬细小病毒DNA。病料样品可以是全血、粪便、直肠面拭子等易于获得且对动物体无严重伤害的说明书CN104195265A4/6页7样品。00272）标准样品的制备为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的临床样品检测提供HRM阳性对照，本发明需优先制备犬细小病毒疫苗株和野毒株阳性标准样品。标准样品的制备步骤如下分别取经过测序确定为CPVPF疫苗株、CPVINT疫苗株和犬细小病毒野毒株的DNA作为模板，分别以P1和P2为引物进行PCR预扩增，其预扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P105L引物P205L模板10LDDH2。
18、O30L。0028预扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，55退火30S，72延伸30S；循环35次；72终延伸8MIN。0029通过上述方法，分别获得犬细小病毒疫苗株CPVPF、疫苗株CPVINT和野毒株的PCR预扩增产物，分别将PCR预扩增产物稀释100倍，即可分别获得疫苗株CPVPF、疫苗株CPVINT和野毒株的标准样品，作为后续研究的阳性对照样品。00303）阳性标准样品的PCRHRM操作步骤分别以上述获得的三种阳性标准样品为DNA模板，分别进行PCRHRM扩增反应和分析；PCRHRM反应体系10LDDH2O20LPREMIXEXTAQ50L引物P305L引物P405LDN。
19、A模板10LEVAGREEN染料10LTOTAL10LPCRHRM扩增反应程序95预变性5MIN；95变性30S，58退火30S，72延伸30S；循环35次；68到80以03/S的熔解速率进行熔解曲线分析。00314）阳性标准样品PCRHRM结果分析PCR扩增产物用ROTORGENEQ分析仪进行分析。犬细小病毒疫苗株与野毒株标准样品HRM（高分辨率熔解曲线，HIGHRESOLUTIONMELTINGCURVE）结果如图1、图2所示。0032图1为标准化熔解曲线图，标准化熔解曲线图显示，CPVPF、CPVINT疫苗株和野毒株3种标准样品熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。为了消除。
20、人为主观因素对判定结果的影响，利用ROTORGENETMQSOFTWAREVERSION202软件基因分型置信参数（GCP）对其结果进行分析（GCP值大于等于95判定为相同基因型）。基因分型结果表明，CPVPF、CPVINT疫苗株和野毒株标准样品（每个标准样品为3个重复）基因分型置信值（GCP）分别为9995004，9981015和9910078。0033图2为峰型化熔解曲线图，峰型化熔解曲线图显示，三种标准样品熔解曲线形状说明书CN104195265A5/6页8相似，均有1个熔解峰，表明引起GCP差值的主要原因为三种标准样品熔解温度（TM）的不同。其中，疫苗株CPVPF熔解温度较低为6765。
21、0，疫苗株CPVINT熔解温度较高为6859003，野毒株熔解温度位于两者之间为6818002。0034（3）临床样品PCRHRM分析1）从样本中提取病毒DNA方法同上述（2）中DNA提取方法；2）以提取的病毒DNA为模板，进行PCR预扩增，预扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P105L引物P205L模板10LDDH2O30L。0035预扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，55退火30S，72延伸30S；循环35次；72终延伸8MIN。00363）预扩增PCR产物稀释100后作为DNA模板，进行PCRHRM扩增反应扩增反应体系为PREMIXEXTAQ50L引物P305。
22、L引物P405L模板10LEVAGREEN染料10LDDH2O20L。0037PCRHRM扩增反应程序为95预变性5MIN；95变性30S，58退火30S，72延伸30S；循环35次；72终延伸8MIN；68到80以03/步的速率进行熔解曲线分析。00384）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的基因型。0039本发明检测了40份临床样品，PCRHRM的结果如图3、图4所示。0040从图3所示的标准化熔解曲线图上可看出，当分别以CPV野毒株，CPVPF疫苗株和CPVINT疫苗株标准样品作为对照时（GCP参数设值为其值大于等于90判定为相同基因型），40份临床样品中38份样品分型为野毒株，其GCP。
23、值为9811106；2份临床样品分型为CPVINT疫苗株，其GCP值为9961022；40份临床样品中无CPVPF疫苗株。0041图4为40份临床样品峰型化熔解曲线图，CPV野毒株，CPVINT疫苗株和CPVPF疫苗株TM值分别为6816004，6860003和67650。0042（4）特异性实验下面对本发明建立的PCRHRM法作特异性检测。0043分别提取其他常见犬病毒DNA，如提取犬瘟热（CANINEDISTEMPERVIRUS,CDV）、犬腺病毒2（CANINEADENOVIRUSTYPE2，CAV2）和犬副流感病毒（CANINEPARAINFLUENZAVIRUS,CPIV）的DNA分。
24、别作为PCR模板，以上述（3）中的PCR方法分别进行PCR反应，将PCR产物进行凝胶电泳分析，并与CPVPF、CPVINT疫苗株和野毒株阳性样品PCR产物进行对比分析，电泳结果如图5所示。0044图5中的M为MARKER（DL1000DNAMARKER），泳道17分别为1CPVPF疫苗株，说明书CN104195265A6/6页92CPVINT疫苗株，3CPV野毒株，4CDV，5CAV2，6CPIV，7阴性对照，凝胶电泳结果显示，犬细小病毒疫苗株与野毒株阳性样品在50BP左右有目的条带，而其它样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性高适合用于HRM分析。说明书CN104195265A1/2页。
25、10广东省农业科学院动物卫生研究所一种快速区分犬细小病毒野毒株与疫苗株的PCRHRM引物和方法4PATENTINVERSION35119DNA人工引物1TGGAAATCACAGCAAACTC19223DNA人工引物2AGTCTTGGTTTTAAGTCAGTATC23321DNA人工引物3TGAAAATTATAGAAGAGTGGT214序列表CN104195265A102/2页1121DNA人工引物4CGTTAACTGCAGTTTTATCCA21序列表CN104195265A111/3页12图1图2说明书附图CN104195265A122/3页13图3图4说明书附图CN104195265A133/3页14图5说明书附图CN104195265A14。