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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 200880008006.6 (22)申请日 2008.03.11 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 101646448 A (43)申请公布日 2010.02.10 (30)优先权数据 062372/2007 2007.03.12 JP (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2009.09.11 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2008/054338 2008.03.11 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2008/111573 JA 2008.。
2、09.18 (73)专利权人 雪印惠乳业株式会社 地址 日本北海道 (72)发明人 小野爱子 松山博昭 森田如一 芹泽笃 日暮聪志 (74)专利代理机构 中国国际贸易促进委员会专 利商标事务所 11038 代理人 罗菊华 (51)Int.Cl. A61K 38/00(2006.01) A61P 5/06(2006.01) (56)对比文件 US 2006040025 A1,2006.02.23,全文. US 2006247162 A1,2006.11.02,全文. EP 0786473 A2,1997.07.30,全文. EP 0704218 A2,1996.04.03,全文. WO 2006。
3、126758 A1,2006.11.30,说明书第6 页第5段-第7页第2段， 第11页第2段. 审查员 蔺娜 (54)发明名称 生长激素分泌促进剂 (57)摘要 以乳源碱性蛋白级分作为有效成分的、 由具 有促进生长激素分泌的作用的生长激素释放激 素的分泌促进介导的生长激素分泌促进剂， 及用 乳源碱性蛋白级分促进生长激素释放激素分泌 的方法。 本生长激素分泌促进剂可日常摄取， 且 经长期摄取也具有高安全性。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 101646448 B 2017.02.08 CN 101646448 B 1.乳源碱性蛋白级分用于制造促进生长激素释放激素分泌的制剂的用途， 。
4、其中所述乳 源碱性蛋白级分具有下列性质： (1)根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳， 由分子量3,00080,000的数种蛋白质 构成； (2)95重量以上是蛋白质， 其余含脂肪及灰； (3)蛋白质主要由乳铁蛋白和乳过氧化物酶组成； 及 (4)蛋白质的氨基酸组成含15重量以上的选自赖氨酸、 组氨酸和精氨酸的碱性氨基 酸。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 101646448 B 2 生长激素分泌促进剂 技术领域 0001 本发明涉及以乳源碱性蛋白级分作为有效成分的生长激素分泌促进剂。 本发明还 涉及以乳源碱性蛋白级分作为有效成分的生长激素分泌促进剂， 其中所述生长激素分泌促 进由生长。
5、激素释放激素的分泌促进介导。 另外， 本发明还涉及利用乳源碱性蛋白级分促进 生长激素释放激素分泌的方法。 背景技术 0002 生长激素具有生长相关作用和代谢控制作用。 生长相关作用包括： 增强靶器官的 细胞分裂， 伸长骨骼， 通过用骨组织替换骨端的软骨组织来伸长骨骼， 促进特定氨基酸的摄 取， 从而参与促进蛋白质合成的肌肉发育。 代谢控制作用包括： 促进碳水化合物、 蛋白质、 脂 类代谢的代谢促进作用； 由于促进肝脏的糖原分解， 且具有抗胰岛素作用(抑制胰岛素， 升 高血糖值)， 从而可保持一定的血糖值的血糖升高作用； 保持一定的钙浓度等， 从而维持体 内稳定性的稳定性维持作用； 以及在能量不。
6、足时促进由脂肪组织释放的游离脂肪酸形式的 机体脂肪募集的作用。 0003 生长激素释放激素(ghrelin)是1999年从大鼠胃部分离的新的生长激素分泌促进 肽， 主要由消化道分泌， 且是促进生长激素经过血液或传入迷走神经由垂体分泌的生理性 激素。 生长激素释放激素由28个氨基酸构成， 是具有第3个丝氨酸残基被脂肪酸(n-辛酸)酰 化的特征性结构的肽(参照非专利文献1)。 此新肽除具有强力的生长激素分泌促进活性外， 还已知具有具有下列作用： 促进摄食(参照非专利文献2)， 调节消化道运动或胃酸分泌等的 功能调节， 如脂肪蓄积等对能量代谢系统的作用， 及如血管扩张和心脏功能亢进等对循环 系统的作。
7、用。 已知生长激素释放激素的分泌受绝食， 低氨基酸摄食， 生长激素分泌低下， 对 交感/副交感神经或其受体的刺激， 及胆囊收缩素或胃泌素的促进。 近来报道了利用生长激 素释放激素或其衍生物的施用的糖尿病治疗剂(参照专利文献1)、 充血性心力衰竭(参照专 利文献2和3)， 生长激素分泌促进剂(参照专利文献4)。 这些报道仅为施用生长激素释放激 素或其衍生物本身， 并非促进生长激素释放激素的分泌。 另外， 由于生长激素或生长激素释 放激素是蛋白质， 会被消化道酶分解， 所以认为， 即便将其直接经口摄取也不会发挥效果。 0004 若要如上所述促进生长激素的分泌， 与其摄取含生长激素或生长激素释放激素。
8、的 药物， 不如开发促进具有促进生长激素分泌的作用的生长激素释放激素的分泌的分泌促进 剂。 而且优选开发可日常摄取， 且经长期摄取也具有高安全性的生长激素分泌促进剂。 专利 文献1： WO 2004/004772专利文献2： 特许公表2005-507949号公报专利文献3： 特许公表 2005-535707号公报专利文献4： 特开2005-82489号公报非专利文献1： Nature 1999， 402： 656-660 非专利文献2： Nature 2001， 409： 194-198 发明内容 发明要解决的技术课题 0005 本发明旨在提供可日常摄取， 且经长期摄取也具有高安全性的具有生长。
9、激素分泌 说 明 书 1/6 页 3 CN 101646448 B 3 促进作用的物质。 本发明还以得到生长激素分泌促进由生长激素释放激素的分泌促进介导 的生长激素分泌促进剂为课题。 解决课题的技术方案 0006 发明人为得到具有生长激素分泌促进作用的物质而持续研究了乳中存在的生长 激素分泌促进因子。 结果发现， 在乳中仅微量存在的碱性蛋白具有促进具有促进生长激素 分泌的作用的生长激素释放激素的分泌的效果。 从而发现可将所述乳源碱性蛋白级分用作 生长激素分泌促进剂的有效成分， 由此完成了本发明。 即， 本发明是以乳源碱性蛋白级分作 为有效成分的生长激素分泌促进剂， 且是生长激素分泌促进由生长激。
10、素释放激素的分泌促 进介导的生长激素分泌促进剂。 另外还涉及利用乳源碱性蛋白级分促进生长激素释放激素 分泌的方法。 发明效果 0007 由于可通过施用本发明的以乳源碱性蛋白级分作为有效成分的生长激素分泌促 进剂来促进生长激素释放激素的分泌， 从而可用于促进摄食， 如调节消化道运动和胃酸分 泌等的功能调节， 以及治疗和预防如脂肪蓄积等能量代谢系统的疾病及如血管扩张和心脏 功能亢进等循环系统的疾病。 另外， 由于可通过施用以乳源碱性蛋白级分作为有效成分的 生长激素分泌促进剂来经过生长激素释放激素的分泌促进生长激素的分泌， 从而可用于骨 骼伸长、 肌肉生长及血糖升高。 附图简述 0008 图1： 示。
11、碱性蛋白级分施用组与对照组中各大鼠血清中的生长激素释放激素浓度。 图2： 示碱性蛋白级分施用组与对照组中各实验组大鼠血清中的生长激素释放激素浓度。 图 3： 示碱性蛋白级分施用组与对照组中各大鼠血浆中的生长激素浓度。 实施方式 0009 本发明的生长激素分泌促进剂的特征在于以乳源碱性蛋白级分作为有效成分。 所 述乳源碱性蛋白级分可从牛乳、 人乳、 山羊乳、 绵羊乳等哺乳类的乳中得到。 已知如下得到 所述乳源碱性蛋白级分的方法： 使乳或乳源原料与阳离子交换体接触而吸附碱性蛋白后， 用大于pH5、 离子强度大于0.5的洗脱液洗脱所述吸附于阳离子交换体的碱性蛋白的方法 (特开平5-202098号公报。
12、)； 用藻酸盐凝胶得到的方法(特开昭61-246198号公报)； 利用无机 多孔颗粒从乳清得到的方法(特开平1-86839号公报)； 利用硫酸酯化合物从乳清得到的方 法(特开昭63-255300号公报)， 本发明可通过利用上述这些方法得到的乳源碱性蛋白级分。 0010 本发明的乳源碱性蛋白具有下列性质。 (1)根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)， 由分子量3,00080,000的数种蛋白质构成。 (2)95重量以上是蛋白质， 其余含少量脂肪、 灰等。 (3)蛋白质主要由乳铁蛋白和乳过氧化物酶组成。 (4)蛋白质的氨基 酸组成含15重量以上的赖氨酸、 组氨酸、 精氨酸等碱。
13、性氨基酸。 0011 施用本发明的生长激素分泌促进剂时， 可使用作为有效成分的乳源碱性蛋白级分 本身， 也可根据常规方法将其制成粉剂、 粒剂、 锭剂、 胶囊剂、 饮剂等制剂而使用。 另外， 也可 将所述碱性蛋白级分直接、 或制成制剂后， 将其加入营养剂或饮食品等而用于促进生长激 素分泌。 此外， 由于乳源碱性蛋白级分热稳定性较高， 还可在常规条件下对含乳源碱性蛋白 级分的原料进行加热杀菌。 说 明 书 2/6 页 4 CN 101646448 B 4 实施例 实施例1 0012 用去离子水充分洗净填充了400g阳离子交换树脂-磺化CHITO PEARL(富士纺织公 司制造)的柱(直径5cm高度。
14、30cm)后， 使40L脱脂乳(pH6.7)以25ml/分钟的流速通过所述 柱。 过液后， 将所述柱用去离子水充分洗净， 并用含0 .98M氯化钠的0 .02M碳酸缓冲液 (pH7.0)洗脱吸附于树脂上的碱性蛋白级分。 用反渗透(RO)膜对所述洗脱液进行脱盐， 经浓 缩后进行冷冻干燥而得到21g作为本发明的生长激素分泌促进剂的有效成分的乳源碱性蛋 白级分粉末。 0013 实验例1通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定了实施例1 中得到的碱性蛋白级分， 其分子量分布于3,00080,000的范围。 0014 实验例2分析了实施例1中得到的乳源碱性蛋白级分的成分组成。 结果示。
15、于表1。 如表所示， 所述级分基本上为蛋白质。 0015 表1 0016 实验例3于110下用6N的盐酸水解实施例1中得到的乳源碱性蛋白级分24小时 后， 用氨基酸分析装置(L-8500型， 日立制作所制造)分析了其氨基酸组成。 结果示于表2。 所 述乳源碱性蛋白级分在氨基酸组成中含15重量以上的碱性氨基酸。 表2 实施例2 说 明 书 3/6 页 5 CN 101646448 B 5 0017 用去离子水充分洗净填充了30kg阳离子交换树脂-SP-TOYOPEARL(TOSOH公司制 造)的柱(直径100cm高度10cm)后， 使于121加热杀菌30秒钟的干酪乳清3t(pH6.2)以 10L。
16、/分钟的流速通过所述柱。 过液后， 将所述柱用去离子水充分洗净， 并用含0.9M氯化钠的 0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.7)洗脱吸附于树脂上的碱性蛋白级分。 通过电透析(ED)法使所述 洗脱液脱盐， 经浓缩后进行冷冻干燥而得到183g作为本发明的激素分泌促进剂的有效成分 的乳源碱性蛋白级分粉末。 0018 实验例4通过动物实验分析了实施例1中得到的乳源碱性蛋白级分粉末对生长 激素释放激素的分泌促进作用。 动物实验中使用了3周龄的Fisher系雌性大鼠。 将所述大鼠 以每组10只分成两组： 对照组(A组)和施用1重量碱性蛋白级分的组(B组)， 各以表3所示 实验饲料饲养了2周。 0019 表3 。
17、0020 饲养2周后， 从各实验组的大鼠的腹部大静脉采血， 立即分离血清， 于-80冷冻保 存。 此后， 用生长激素释放激素ELISA试剂盒(SCETI#97752)测定血清中的生长激素释放激 素浓度。 各实验组大鼠血清中的生长激素释放激素浓度示于图1和图2。 如图所示， 与对照组 (A组)相比， 施用了本发明的乳源碱性蛋白级分的组(B组)血清中的生长激素释放激素浓度 呈显著高值。 由此可知， 乳源碱性蛋白级分具有升高血清中的生长激素释放激素浓度的作 用， 可促进具有促进生长激素分泌的作用的生长激素释放激素的分泌。 而且， 当以每1kg大 鼠体重最多施用900mg碱性蛋白级分时， 即可观察到所。
18、述对生长激素释放激素的分泌促进 作用。 实施例3 0021 用去离子水充分洗净填充了400g阳离子交换树脂-Macro-Prep high S(BioRad公 司制造)的柱(直径10cm高度7.5cm)后， 使于80杀菌15秒钟的40L脱脂乳(pH6.7)以 250ml/分钟的流速通过所述柱。 过液后， 将所述柱用去离子水充分洗净， 并用含1.48M氯化 钠的0.02M碳酸缓冲液(pH7.0)洗脱吸附于树脂上的碱性蛋白级分。 用反渗透(RO)膜对所述 洗脱液进行脱盐， 经浓缩后进行冷冻干燥而得到25g作为本发明的生长激素分泌促进剂的 说 明 书 4/6 页 6 CN 101646448 B 6。
19、 有效成分的乳源碱性蛋白级分粉末。 0022 实验例5研究了实施例3中得到的乳源碱性蛋白级分粉末的生长激素分泌促进 作用。 用表4所示低蛋白饲料饲养10周龄雄性SD系大鼠16只7天后， 在乙醚麻醉下， 由颈静脉 插入导管， 将所述导管推到心房附近留置。 随后将大鼠分成4组： A组(对照组)与B、 C、 D组(碱 性蛋白施用组)， 分别给予对照饲料及混合了0.1、 1、 5实施例3中得到的碱性蛋白级分粉 末的饲料(表4)。 0023 表4 0024 换饲料4天后， 每15分钟由导管采血， 并分离血清。 用生长激素ELISA试剂盒(大鼠/ 小鼠生长激素ELISA试剂盒， LincoResearch。
20、， Inc)测定所得血清样品中生长激素的浓度。 0025 各实验组的血浆中的生长激素浓度变化示于图3。 相比A组， 混合了碱性蛋白的B 组、 C组、 D组的生长激素浓度值显示出更高， 从而表明碱性蛋白级分具有促进生长激素分泌 的作用。 实施例4 0026 将实施例1中得到的乳源碱性蛋白级分粉末根据常规方法制成表5所示组成的生 长激素分泌促进用锭剂。 0027 表5 说 明 书 5/6 页 7 CN 101646448 B 7 实施例5 0028 将实施例1中得到的乳源碱性蛋白级分粉末根据常规方法制成表6所示组成的具 有促进激素分泌的作用的饮料。 0029 表6 说 明 书 6/6 页 8 CN 101646448 B 8 图1 图2 说 明 书 附 图 1/2 页 9 CN 101646448 B 9 图3 说 明 书 附 图 2/2 页 10 CN 101646448 B 10 。