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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310055065.1 (22)申请日 2013.02.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103989624 A (43)申请公布日 2014.08.20 (73)专利权人 中国科学院上海药物研究所 地址 201203 上海市浦东新区张江祖冲之 路555号 (72)发明人 李亚平 陈伶俐 樊继涛 顾王文 张志文 (74)专利代理机构 北京金信知识产权代理有限 公司 11225 代理人 朱梅 李维盈 (51)Int.Cl. A61K 9/00(2006.0。
2、1) A61K 31/4745(2006.01) A61K 47/36(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102824345 A,2012.12.19, 审查员 陈矛 (54)发明名称 一种盐酸伊立替康组合物及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种盐酸伊立替康组合物。 其包 括空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调 节溶液； 所述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康 溶液和pH调节溶液各自独立包装， 临床使用前将 三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药 纳米制剂。
3、。 本发明采用三瓶独立包装的设计， 贮 存过程中药物并未载入脂质纳米制剂中， 故该制 剂不存在现有制剂药物易泄漏的问题， 大大提高 了该制剂的稳定性； 临床使用前， 将三种成分混 合孵育制成载药纳米制剂， 临床使用简单方便。 本发明还涉及盐酸伊立替康组合物的制备方法， 该制备工艺简单， 质量易控， 适合工业化生产。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 103989624 B 2018.04.27 CN 103989624 B 1.一种盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 其包括空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶 液和pH调节溶液； 所述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液各。
4、自独立包装， 临床使用前将三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制剂； 所述空白脂质纳米 制剂包含磷脂、 胆固醇、 离子梯度调节剂和修饰材料； 所述离子梯度调节剂选自柠檬酸、 硫酸铵、 硫酸铜、 钙离子载体A23187、 磺丁基醚- -环 糊精和六磷酸肌醇中的一种或多种； 所述离子梯度调节剂的浓度范围为50-400mM， pH为3- 6； 所述修饰材料选自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 精氨酸甘氨酸天冬氨酸序列修 饰的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和叶酸修饰的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中 的一种或多种,其中聚乙二醇的分子量选自1000-5000； 所述空白脂质纳米制剂通过下述方法制。
5、备： 称取配方量的磷脂、 胆固醇、 修饰材料溶于 适量乙醇得有机相， 将其注入到含梯度调节剂的水相中高速搅拌， 经超声、 高压均质或挤 出， 形成空白脂质纳米制剂； 在制备空白脂质纳米制剂时， 在含离子梯度调节剂的水相中加 入选自蔗糖、 乳糖、 甘露醇、 海藻糖、 麦芽糖中的一种或多种作为冻干保护剂， 将所得的空白 脂质纳米制剂冷冻干燥进一步制备成其冻干粉； 其中， 所述空白脂质纳米制剂中胆固醇与磷脂的重量比为1:2-1:25； 所述修饰材料用 量按摩尔百分比计为所述磷脂用量的1-10； 冻干保护剂的用量按磷脂的重量比计算， 1份 磷脂加0.14份冻干保护剂。 2.如权利要求1所述的盐酸伊立替。
6、康组合物， 其特征在于： 临床使用时， 在空白脂质纳 米制剂中加入盐酸伊立替康溶液， 混合均匀， 再加入pH调节溶液将其pH调节到7.0-8.0， 在 高于脂质相转变温度的温度下孵育10min-1h， 即得盐酸伊立替康临床载药纳米制剂。 3.如权利要求1所述盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 所述磷脂选自二硬脂酰磷脂酰 胆碱、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰磷脂酰甘油、 二棕榈酰磷脂酰胆碱、 二棕榈酰磷脂 酰甘油、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二油酰磷脂酰胆碱、 二油酰磷脂酰乙醇胺、 二油酰磷脂酰 甘油、 鞘磷脂、 心磷脂、 大豆磷脂、 氢化大豆磷脂、 蛋黄卵磷脂和氢化卵磷脂中的一种或多 种。 。
7、4.如权利要求1所述盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 所述盐酸伊立替康与磷脂的重 量比为1:5-1:25。 5.如权利要求1所述盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 所述盐酸伊立替康与磷脂的重 量比为1:10-1:20。 6.如权利要求1所述盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 所述空白脂质纳米制剂中胆固 醇与磷脂的重量比为1:2-1:10。 7.如权利要求1所述盐酸伊立替康组合物， 其特征在于： 所述pH调节溶液为选自碳酸钠 溶液、 磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶液中的一种或多种。 8.一种权利要求1-7中任一项所述的盐酸伊立替康组合物的制备方法， 其特征在于， 包 括如下步骤： 制备所述空白脂质。
8、纳米制剂， 配制盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液， 并将三种 组分各自独立包装， 临床使用前将三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制 剂。 9.一种提供稳定的盐酸伊立替康组合物的方法， 所述盐酸伊立替康组合物包括空白脂 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 103989624 B 2 质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液， 其特征在于： 所述方法包括将权利要求1-7 中任一项所述盐酸伊立替康组合物中的空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶 液各自独立包装， 临床使用前将三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制剂。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 10。
9、3989624 B 3 一种盐酸伊立替康组合物及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于药品制剂领域， 具体涉及一种盐酸伊立替康组合物及其制备方法。 背景技术 0002 盐酸伊立替康(1rinotecan， CPT-11)是半合成水溶性喜树碱衍生物， 是DNA拓扑异 构酶I(Topo I)的抑制剂。 伊立替康与其活性代谢产物SN-38通过与DNA-Topo-1复合体的稳 定结合引起DNA单链的断裂， 使DNA产生不可逆的损伤而死亡。 伊立替康是治疗转移性结直 肠癌的有效药物， 对氟尿嘧啶耐药病例仍有效， 而且具有很广的抗肿瘤谱。 I期、 期临床研 究结果表明， 该药对化疗抗拒性肿瘤， 如非小。
10、细胞肺癌、 卵巢癌和宫颈癌有肯定疗效； 另外 它对胃癌、 恶性淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、 乳腺癌、 小细胞肺癌、 皮肤癌、 胰腺癌也有一定疗 效。 0003 目前， 国内上市的产品为盐酸伊立替康的注射剂， 该药抗癌活性强， 但不良反应亦 较多， 常见不良反应为食欲缺乏、 恶心、 呕吐、 腹泻， 白细胞和中性粒细胞减少、 贫血及血小 板减少， 脱发和乙酰胆碱能综合症， 这些不良反应大大限制了该药在临床上的使用。 0004 纳米制剂技术在药物研究中的应用正是基于它能改变药物在制剂中的存在状态 而使药物表现出缓控释性、 靶向性， 从而提高药物疗效、 降低药物的毒副作用等。 纳米制剂 技术在药物研究中。
11、的应用大致可分为二方面， 一是纳米药物粒子的制备， 例如纳米结晶技 术、 超细粉碎(纳米级)技术等， 使药物的粒径在1000nm以下； 二是纳米药物载体的制备， 纳 米载药系统(nanoparticle delivery system， NDS)， 使用于载药的载体尺寸在纳米级。 由 于肿瘤血管间隙可达到100-780nm， 正常血管内皮细胞之间的间隙通常在2nm左右。 静脉注 射给药后， 纳米制剂可有效穿透肿瘤区的血管， 聚集在肿瘤区， 更好发挥疗效， 成为国际药 剂学界研究的热点领域。 大量的研究表明它在肿瘤治疗领域具有潜在的应用价值。 0005 为使盐酸伊立替康更好发挥临床疗效， 提高其。
12、抗肿瘤活性和稳定性， 降低其毒副 作用， 国内外药学工作者致力于盐酸伊立替康新型给药系统的研究和开发。 中国专利申请 公开CN1994279A、 CN101953792A、 CN102485213A、 CN102271659A均公开了伊立替康脂质体及 其制备方法。 中国专利申请公开CN102697720A公开了盐酸伊立替康脂质纳米粒注射剂及其 制法。 发明内容 0006 技术问题 0007 本申请的发明人发现： 已公开的脂质体以混悬液形式存在时长期贮存稳定性差， 脂质体易聚集， 药物易泄漏； 若将其制成冻干粉， 在冻干过程中势必会造成包封率的下降， 故在临床应用中仍存在较大问题。 另外， 已公。
13、开的脂质体的制备方法也不适合工业化生产。 由于盐酸伊立替康为水溶性药物， 采用常规制备方法将其包封入脂质纳米粒中包封率较 低。 因此， 对于盐酸伊立替康这个特定的药物来说， 必须针对其临床应用及工业化生产的要 求， 寻找特定的制剂及制备工艺， 以实现提高疗效、 降低毒副作用的目的。 说 明 书 1/9 页 4 CN 103989624 B 4 0008 技术方案 0009 为解决现有技术中存在的上述技术问题， 本发明人进行了广泛深入的研究， 最终 得到本发明。 0010 本发明的目的之一是为临床提供一种稳定的盐酸伊立替康组合物， 所述盐酸伊立 替康组合物解决了现有制剂稳定性差、 药物易泄漏、 。
14、包封率低的问题， 而且临床使用方便， 能大大提高盐酸伊立替康的抗肿瘤作用， 降低其毒性。 0011 为了实现上述发明目的， 本发明提供了一种盐酸伊立替康组合物， 其包括空白脂 质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液， 所述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液 和pH调节溶液各自独立包装， 临床使用前将三种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药 纳米制剂。 本发明采用三种成分独立包装的设计， 贮存过程中药物并未载入脂质纳米制剂 中， 故该制剂不存在现有制剂药物易泄漏的问题， 大大提高了该制剂的稳定性； 临床使用 前， 将三种成分混合孵育制成载药纳米制剂， 临床使用简单方便。 0012 所述的。
15、空白脂质纳米制剂是指不含药物活性成分的脂质纳米制剂， 它作为用于主 动载药的药物脂质纳米制剂的载体。 对于所述空白脂质纳米制剂没 有特殊限制， 只要其可 以作为用于主动载药的药物脂质纳米制剂的载体即可， 例如可以为中国专利申请公开 CN101953792A、 CN101890170A中公开的空白载体。 0013 优选地， 所述空白脂质纳米制剂包含磷脂、 胆固醇、 离子梯度调节剂和修饰材料。 0014 所述磷脂是构成脂质纳米制剂的主要成分， 可以是能够用于制备脂质纳米制剂的 任何一种药学上可接受的磷脂， 但是优选为选自二硬脂酰磷脂酰胆碱 （DSPC） 、 二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺 （DSPE） 、。
16、 二硬脂酰磷脂酰甘油 （DSPG） 、 二棕榈酰磷脂酰胆碱 （DPPC） 、 二棕榈酰磷 脂酰甘油 （DPPG） 、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 （DPPE） 、 二油酰磷脂酰胆碱 （DOPC） 、 二油酰磷脂酰 乙醇胺 （DOPE） 、 二油酰磷脂酰甘油 （DOPG） 、 鞘磷脂、 心磷脂、 大豆磷脂、 氢化大豆磷脂 （HSPC） 、 蛋黄卵磷脂和氢化卵磷脂中的一种或多种， 更优选为选自大豆磷脂、 氢化大豆磷脂 （HSPC） 、 蛋黄卵磷脂、 氢化卵磷脂、 DSPC中的一种或多种。 0015 所述胆固醇作为脂质纳米制剂的稳定剂， 其用量对制剂的稳定性和释放行为有显 著影响。 本发明中， 胆固醇与磷。
17、脂的重量比为1:21:25， 优选1:2-1:10。 0016 所述离子梯度调节剂用以在空白脂质纳米制剂的内外水相中形成离子梯度实现 对盐酸伊立替康的主动载药， 从而提高盐酸伊立替康在脂质纳米制剂中的包封率。 本发明 中， 对离子梯度调节剂没有特殊要求， 只要其是药学上可接受的并可以在内外水相中形成 离子梯度实现对盐酸伊立替康的主动载药即可。 优选地， 所述离子梯度调节剂为选自柠檬 酸、 硫酸铵、 硫酸铜、 钙离子载体A23187、 磺丁基醚- -环糊精 （sbe-CD） 、 六磷酸肌醇 （IP-6） 中的一种或多种， 优选为柠檬酸。 离子梯度调节剂的浓度范围为50-400mM， pH为3-6。
18、。 0017 所述修饰材料用于实现脂质纳米制剂的主动靶向及长循环功能， 延长药物在血液 中的循环时间， 增加药物在肿瘤部位的蓄积， 以进一步提高药效， 降低毒性。 本发明中， 所述 修饰材料优选为基于聚乙二醇的材料， 优选为选自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 （PEG- DSPE） 、 精氨酸甘氨酸天冬氨酸序列修饰的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 （RGD-PEG- DSPE） 、 叶酸修饰的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 （FA-PEG-DSPE） 中的一种或多种,其中 PEG 的分子量选自1000-5000， 优选2000， 修饰材料用量按摩尔百分比计为磷脂用量的1- 10%。 说 明 书。
19、 2/9 页 5 CN 103989624 B 5 0018 所述空白脂质纳米制剂可采用本领域中已知的任何一种方法制备而没有特殊限 制， 但是优选以下两种方法中的任意一种制备： 0019 （1） 乙醇注入法： 称取配方量的磷脂、 胆固醇、 修饰材料溶于适量乙醇得有机相， 将 其注入到含离子梯度调节剂的水相中高速搅拌， 经超声、 高压均质或挤出工艺， 形成空白脂 质纳米制剂； 0020 进一步地， 可在含离子梯度调节剂的水相中加入选自蔗糖、 乳糖、 甘露醇、 海藻糖、 麦芽糖等中的一种或多种作为冻干保护剂， 用于将所得空白脂质纳米制剂冷冻干燥制备成 其冻干粉， 其用量按磷脂重量比计算， 1份磷脂。
20、加0.1-4份冻干保护剂。 0021 （2） 冷冻干燥法： 称取配方量的磷脂、 胆固醇和修饰材料溶于叔丁醇中， 经冷冻干 燥后， 加入含离子梯度调节剂的水相分散， 形成空白脂质纳米制剂。 0022 这里所说的超声、 高压均质或挤出工艺是为了减小空白脂质纳米制剂的粒径， 控 制产品的质量； 将空白脂质纳米制剂加入冻干保护剂制备成冻干粉， 有助于减少纳米制剂 的聚集， 延长其有效期。 0023 进一步地， 上述两种空白脂质纳米制剂的制备方法中采用选自硫酸铵、 硫酸铜、 A23187、 sbe-CD和IP-6中的一种或多种作离子梯度调节剂的空白脂质纳米制剂还需采用透 析、 超滤或分子筛分离的方法更换。
21、其外水相介质， 以建立起离子梯度。 0024 在本发明所述的盐酸伊立替康组合物中， 盐酸伊立替康和磷脂的重量比为1:5-1: 25， 优选1:10-1:20。 0025 在本发明所述的盐酸伊立替康组合物中， 所述pH调节溶液用于将外水相pH调节到 7.0-8.0， 以实现药物的主动载药。 本发明中， 对pH调节溶液没有特殊限制， 只要其是药学上 可接受的并能够用于调节pH即可， 优选为选自碳酸钠溶液、 磷酸氢二钠溶液和氢氧化钠溶 液中的一种或多种。 0026 在本发明所述的盐酸伊立替康组合物中， 所述临床载药纳米制剂如下制备： 在空 白脂质纳米制剂中加入盐酸伊立替康溶液， 混合均匀， 再加入p。
22、H调节溶液将其pH调节到 7.0-8.0， 在高于脂质相转变温度的温度下孵育10min-1h， 即得盐酸伊立替康临床载药纳米 制剂。 0027 所述相转变温度是指脂质凝胶态和液晶态之间相互转变时的温度。 在高于脂质相 转变温度的温度下孵育， 可使脂质膜通透性增强， 盐酸伊立替康在离子梯度的驱动下更易 透膜， 聚集于脂质纳米制剂的内水相中。 0028 本发明所述的盐酸伊立替康组合物中， 所述空白脂质纳米制剂及临床载药纳米制 剂的粒径范围优选为50-200nm， 以便能通过EPR效应聚集在肿瘤组织， 减少在其它正常组织 的分布， 从而提高药效， 降低毒性。 0029 本发明的另一个方面是提供所述盐。
23、酸伊立替康组合物的制备方法， 所述方法包括 制备上述空白脂质纳米制剂、 配制盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液， 并将三种组分各自独 立包装， 该方法可实现工业化规模， 高效率生产出质量稳定的产品。 临床使用前将三种组分 混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制剂， 使用简单方便易控。 0030 本发明的再一方面涉及一种提供稳定的盐酸伊立替康组合物的方法， 所述盐酸伊 立替康组合物包括空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液， 其中， 所述方法包 括将空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液和pH调节溶液各自独立包装， 临床使用前将三 说 明 书 3/9 页 6 CN 103989624 B 。
24、6 种组分混合孵育通过主动载药制成临床载药纳米制剂。 0031 相比于现有技术， 本发明具有以下优点： 0032 1.本发明的盐酸伊立替康组合物， 将空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液、 pH调 节溶液， 采用三种成分独立包装的设计， 解决了现有制剂药物易泄漏、 制剂不稳定、 包封率 低等问题， 大大提高了制剂的稳定性； 临床使用前， 将三种成分混合孵育制成载药的临床施 用制剂， 配制简单方便， 易操作。 0033 2.采用脂质纳米制剂作为盐酸伊立替康的载体， 能明显提高药物在体内的稳定 性， 保持其活性内酯环结构形式， 更好的发挥抗癌作用； 盐酸伊立替康临床载药制剂能显著 延长药物在血液中。
25、的循环时间， 改善其体内分布， 增加药物在肿瘤部位的聚集， 提高药效。 0034 3.本发明的盐酸伊立替康临床载药纳米制剂粒径为50-200nm， 能有效穿透肿瘤血 管， 通过增强渗透和滞留作用 （EPR效应） 聚集在肿瘤部位， 实现被动靶向作用。 0035 4.本发明配方中所含离子梯度调节剂如柠檬酸、 硫酸铵、 硫酸铜、 IP-6、 sbe-CD、 A23187能大大提高盐酸伊立替康的包封率， 提高制剂的稳定性， 克服现有技术包封率低的 问题； 本发明配方中还含有修饰材料如PEG-DSPE、 RGD-PEG-DSPE、 FA-PEG-DSPE等， 能通过 长循环和主动靶向功能进一步提高药效，。
26、 降低毒性。 0036 5.本发明空白脂质纳米制剂的制备采用乙醇注入法和冷冻干燥法， 较现有制备方 法更易实现工业化生产， 并能解决现有制备技术粒径大且不均匀的问题， 更好控制产品的 质量； 采用主动载药法将空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液、 pH调节溶液混合孵育， 就 能制得包封率大于80%的盐酸伊立替康临床载药制剂， 该方法操作简单且为该制剂的临床 应用提供了一个方便简单快捷的方法。 附图说明 0037 图1为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康组合物的临床载药纳米制剂的粒 径分布图。 0038 图2为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康组合物的临床载药纳米制剂体外 释放的测试结果图。。
27、 0039 图3为荧光显微镜观察细胞凋亡图:A： 空白对照， B： 盐酸伊立替康游离药物， C： 盐 酸伊立替康组合物。 0040 图4为根据本发明实施例1制备的盐酸伊立替康组合物临床载药纳米制剂的药效 测试结果图。 具体实施方式 0041 下面结合实施例对本发明加以进一步说明， 以下实施方式只以举例的方式描述本 发明。 但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。 很明显， 本领域普通技术人员可在 本发明的范围和实质内， 对本发明进行各种变通和修改。 需要了解的是， 本发明意欲涵盖在 所附权利要求书中包括的变通和修改。 0042 试剂和药品 0043 大豆磷脂 （上海太伟药业有限公司） ； 。
28、HSPC(上海艾韦特医药科技有限公司)； PEG- DSPE(上海艾韦特医药科技有限公司)； DSPC(上海艾韦特医药科技有限公司)； 胆固醇 （南京 说 明 书 4/9 页 7 CN 103989624 B 7 新百药业有限公司） ； sephadex G-50(美国GE公司)； sbe-CD （上海工硕生物技术有限公司） ； 柠檬酸 （国药集团化学试剂有限公司） ； A23187(阿拉丁试剂有限公司)； IP-6 （上海康九化工 有限公司） 。 0044 实施例1 0045 盐酸伊立替康组合物的制备： 0046 将大豆磷脂2g、 胆固醇1g、 PEG-DSPE0.5g以1.5ml无水乙醇超。
29、声溶解， 将其注入到 预热至60的20ml300mM柠檬酸缓冲液 （pH=3） ， 高速搅拌得初品， 再于20000psi下高压均质 4次， 过滤除菌后按每2ml/瓶分装于西林瓶中， 即得空白脂质纳米制剂(磷脂浓度为100mg/ ml)。 0047 称取盐酸伊立替康 （cpt-11） 200mg、 乳酸9mg、 山梨醇450mg， 加注射用水20ml超声 溶解， 以盐酸 （0.1M） 调节pH至3-4， 按2ml/瓶分装于安剖中， 再经121高压灭菌30min， 即得 盐酸伊立替康溶液。 0048 配制碳酸钠溶液 （0.5M） ,经过滤除菌后， 按8ml/瓶分装于西林瓶中， 即得pH调节溶 液。
30、。 0049 取上述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液、 碳酸钠溶液各一瓶放置于一个包 装盒中， 即得盐酸伊立替康组合物。 0050 临床使用时， 抽取所述的盐酸伊立替康溶液加入到空白脂质纳米制剂中， 混匀， 再 加入碳酸钠溶液混匀使其pH=7.4， 于60孵育30min， 即得盐酸伊立替康临床载药纳米制 剂。 0051 实施例2 0052 盐酸伊立替康组合物的制备： 0053 称取HSPC2g、 胆固醇0.2g、 PEG-DSPE0.3g、 RGD-PEG-DSPE0.3g以2ml无水乙醇溶解， 将其注入到30ml300mM的硫酸铜溶液中， 高速搅拌， 再以100nm孔径的聚碳酯膜挤出4次。
31、， 再 采用超滤法 （超滤管分子量10K） 将外水相更换为蔗糖溶液 （300mM） ， 过滤除菌后按每4ml/瓶 分装于西林瓶中， 即得空白脂质纳米制剂 （磷脂浓度为50mg/ml） 。 0054 称取盐酸伊立替康 （cpt-11） 200mg、 乳酸9mg、 山梨醇450mg， 加注射用水20ml超声 溶解， 以盐酸 （0.1M） 调节pH至3-4， 按2ml/瓶分装于安剖中， 再经121高压灭菌30min， 即得 盐酸伊立替康溶液。 0055 配制氢氧化钠溶液 （1M） ,经过滤除菌后， 按3ml/瓶分装于塑料瓶中， 即得pH调节溶 液。 0056 取上述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶。
32、液、 氢氧化钠溶液各一瓶放置于一个 包装盒中， 即得盐酸伊立替康组合物。 0057 临床使用时， 取上述空白脂质纳米制剂 （磷脂浓度为50mg/ml） 1瓶， 加入A23187溶 液 （1mg/ml） 0.1ml， 37孵育30min后， 加入cpt-11溶液混匀， 再加入氢氧化钠溶液 （1M） 使 混合液pH为7.0， 于37孵育30min， 即得盐酸伊立替康临床载药纳米制剂。 0058 实施例3 0059 盐酸伊立替康组合物的制备： 0060 称取DSPC2g、 胆固醇0.8g、 FA-PEG-DSPE0.1g、 PEG-DSPE0.2g以1.6ml无水乙醇超声 溶解， 注入到40ml s。
33、be-CD的三乙胺溶液 （250mM） ， 高速搅拌， 再以100nm孔径的聚碳酯膜挤 说 明 书 5/9 页 8 CN 103989624 B 8 出4次， 所得制剂在生理盐水中透析24h， 经过滤除菌后， 按4ml/瓶分装于西林瓶中， 即得空 白脂质纳米制剂 （磷脂浓度为50mg/ml） 。 0061 称取盐酸伊立替康 （cpt-11） 200mg、 乳酸9mg、 山梨醇450mg， 加注射用水20ml超声 溶解， 以盐酸 （0.1M） 调节pH至3-4， 按2ml/瓶分装于安剖中， 再经121高压灭菌30min， 即得 盐酸伊立替康溶液。 0062 配制氢氧化钠溶液 （1M） ,经过滤除。
34、菌后， 按3.5ml/瓶分装于塑料瓶中， 即得pH调节 溶液。 0063 取上述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液、 氢氧化钠溶液各一瓶放置于一个 包装盒中， 即得盐酸伊立替康组合物。 临床使用时， 取上述空白脂质纳米制剂1瓶 （4ml） ， 加 入cpt-11溶液混合均匀， 再加入氢氧化钠溶液使pH=8.0,于65孵育10min， 即得盐酸伊立 替康临床载药纳米制剂。 0064 实施例4 0065 盐酸伊立替康组合物的制备： 0066 称取蛋黄卵磷脂2g、 胆固醇0.1g、 PEG-DSPE0.5g以5ml叔丁醇溶解， 于冻干机上冷 冻干燥， 再加入20ml80mM IP-6溶液 （pH经。
35、三乙胺调节到6.5） 水合超声至半透明， 所得制剂 过sephadex G50凝胶柱， 以氯化钠溶液 （150mM） 洗脱， 收集脂质纳米组份， 超滤浓缩至磷脂 浓度为50mg/ml， 经过滤除菌后， 按4ml/瓶分装于西林瓶中， 即得空白脂质纳米制剂。 0067 称取盐酸伊立替康 （cpt-11） 200mg、 乳酸9mg、 山梨醇450mg， 加注射用水20ml超声 溶解， 以盐酸 （0.1M） 调节pH至3-4， 按2ml/瓶分装于安剖中， 再经121高压灭菌30min， 即得 盐酸伊立替康溶液。 0068 配制磷酸氢二钠溶液 （1M） ,经过滤除菌后， 按10ml/瓶分装于西林瓶中， 。
36、即得pH调 节溶液。 0069 取上述空白脂质纳米制剂、 盐酸伊立替康溶液、 磷酸氢二钠溶液各一瓶放置于一 个包装盒中， 即得盐酸伊立替康组合物。 0070 临床使用时， 取上述空白脂质纳米制剂1瓶， 加入cpt-11溶液混合均匀， 再加入磷 酸氢二钠溶液 （1M） 使pH=7.4,于37孵育60min， 即得盐酸伊立替康临床载药制剂。 0071 实施例5 0072 盐酸伊立替康组合物的制备： 0073 称取鞘磷脂2g、 胆固醇0.5g、 PEG-DSPE0.2g以2ml无水乙醇溶解， 注入到40ml含2g 蔗糖、 1g乳糖的柠檬酸缓冲液 （300mM,pH=4.0） 中高速搅拌， 15000。
37、psi下均质4次后， 每4ml/ 瓶分装于西林瓶中， 于冷冻干燥机中冷冻干燥得空白脂质纳米制剂的冻干粉。 0074 称取盐酸伊立替康 （cpt-11） 200mg、 乳酸9mg、 山梨醇450mg， 加注射用水40ml超声 溶解， 以盐酸 （0.1M） 调节pH至3-4， 按4ml/瓶分装于安剖中， 再经121高压灭菌30min， 即得 盐酸伊立替康溶液。 0075 配制氢氧化钠溶液 （1M） ,经无菌过滤后， 按3ml/瓶分装于塑料瓶中， 即得pH调节溶 液。 0076 取上述空白脂质纳米制剂冻干粉、 盐酸伊立替康溶液、 氢氧化钠溶液各一瓶放置 于一个包装盒中， 即得盐酸伊立替康组合物。 0。
38、077 临床使用时， 取上述冻干粉1瓶， 加入cpt-11溶液， 振摇分散， 再加入氢氧化钠溶液 说 明 书 6/9 页 9 CN 103989624 B 9 使混合液使pH为7.4， 于60孵育60min， 即得盐酸伊立替康临床载药纳米制剂。 0078 比较实施例1 0079 盐酸伊立替康现有纳米制剂的制备： 0080 按照中国专利申请公开CN101953792A公开的配方及方法制备， 具体如下： 0081 称取大豆磷脂3g、 胆固醇1g、 泊洛沙姆1880.6g、 维生素E0.1g溶解于无水乙醇 1.5ml中， 在55水浴条件下注入溶解了0.3gPEG-DSPE的硫酸铵溶液 （200mM）。
39、 30ml中， 通氮 气条件下保温搅拌1h， 所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜， 氢氧化钠调节外水 相pH为7.4， 再加入盐酸伊立替康溶液30ml （10mg/ml） ,55孵育10min， 过滤除菌后， 按4ml/ 瓶分装于西林瓶中。 0082 性能测试 0083 稳定性实验： 0084 取实施例1制得的盐酸伊立替康组合物和比较实施例1制得的盐酸伊立替康现有 纳米制剂进行稳定性试验。 0085 将实施例1制得的盐酸伊立替康组合物 （三种成分独立包装） 放置于25， 于0、 1、 2、 3、 6月取样制备临床载药纳米制剂， 并测定盐酸伊立替康总含量、 有关物质 （有关物质是 残留合成。
40、原料、 中间体、 副产物及可能降解产物的统称） 、 包封率、 粒径等质量指标； 将比较 实施例1制得的盐酸伊立替康现有纳米制剂相同条件放置后直接取样测定上述质量指标。 0086 表1现有纳米制剂与本发明的盐酸伊立替康组合物稳定性 0087 0088 从表1可以看出， 现有纳米制剂在室温放置6个月后， 盐酸伊立替康总含量下降 5.4%， 有关物质增加4.2%,包封率大大下降， 粒径大大增加， 表明药物几乎完全从纳米制剂 中泄漏； 而根据本发明的盐酸伊立替康组合物 （三种成分独立包装） 在放置6个月后， 所制备 的临床载药制剂的各项质量指标与0月相比无明显变化， 表明根据本发明的盐酸伊立替康 组合。
41、物 （三种成分独立包装的设计） 稳定性较现有制剂有极大程度提高， 更具有临床应用价 值。 0089 粒径及分布测试： 0090 取实施例1制得的盐酸伊立替康临床载药纳米制剂用水稀释后， 经粒径测定仪测 定其粒径及分布。 结果如图1， 盐酸伊立替康临床载药纳米制剂Z均粒径为65.05nm， 多分散 说 明 书 7/9 页 10 CN 103989624 B 10 指数为0.144， 粒子分布较为均匀。 0091 包封率的测定： 0092 取实施例1制得的盐酸伊立替康临床载药纳米制剂进行包封率的测定。 0093色谱条件： 色谱柱Waters C18柱 （4.6mm250mm， 5 m） ； 流动相。
42、为乙腈- 26mmol/L磷酸二氢钠溶液 （含8mmol/L辛烷基磺酸钠） （32 68） ； 流速1ml/min； 柱温40； 检 测波长254nm； 进样量20 l。 0094 取充分溶胀的Sephadex G-50葡聚糖凝胶适量， 制备凝胶柱 （30cm1cm） ， 精密量 取盐酸伊立替康临床载药纳米制剂0.5ml上柱， 以PBS （PH=7.4） 洗脱， 收集含纳米制剂的流 份共14ml， 置50ml量瓶中， 用甲醇定容， 摇匀后精密量取0.5ml置10ml量瓶中， 用酸化甲醇定 容， 采用HPLC测定纳米制剂中包裹的药量W； 另取盐酸伊立替康临床载药纳米制剂0.5ml置 于50ml量。
43、瓶中， 同法操作， 测定临床载药纳米制剂中的总药量W0。 计算得盐酸伊立替康临床 载药纳米制剂的平均包封率为91.27%。 0095 体外释放测定： 0096 取实施例1制得的盐酸伊立替康临床载药纳米制剂进行体外释放的测定。 0097 精密量取盐酸伊立替康临床载药纳米制剂1ml， 加至透析袋 （透析袋分子量8000- 14000Da） 中， 扎紧两端， 置于装有20ml释放介质 （pH7.4磷酸盐缓冲液） 的锥形瓶中， 于 （37.0 0.5） 条件下恒速振荡 （100r/min） 。 分别在0.5、 1、 2、 4、 8、 12、 24、 36、 48、 72、 96、 120h取 样， 并。
44、将其酸化后进样测定， 计算累积释放率 （%） 。 同时考查盐酸伊立替康游离药物的释放 情况。 以累积释放率 （Q） 对时间 （t） 作图， 释放曲线见图2。 0098 由图2可见， 盐酸伊立替康游离药物在8h基本释放完全， 表明透析袋对盐酸伊立替 康无吸附和截留； 相比于游离药物， 盐酸伊立替康临床载药纳米制剂中药物释放较为缓慢， 24h时累积释放率为54.6%， 120h时累积释放率为95.7%， 基本释放完全， 具有明显缓释作用。 0099 细胞凋亡测试： 0100 用Hoechst33342染色法观察盐酸伊立替康临床载药纳米制剂和盐酸伊立替康游 离药物是否诱导细胞凋亡。 将HT-29细胞。
45、以2104个/孔的密度接种到24孔板中， 置于37、 5%CO2的条件下培养24h。 弃去原培养液， 加入0.5ml DMEM培养液， 分别加入实施例1中的盐 酸伊立替康临床载药纳米制剂和盐酸伊立替康游离药物适量使药物终浓度为10 g/ml， 在 培养箱中继续培养24h后， 弃去孔中溶液， 剩余物用1ml pH6.8磷酸盐缓冲液 （PBS） 洗涤3 次， 每孔加含Hoechst33342 （10 g/ml） 的DMEM培养液200 l， 孵育20min后， 用1ml PBS冲洗， 于荧光显微镜下观察细胞形态。 0101 图3结果表明， 盐酸伊立替康临床载药纳米制剂和盐酸伊立替康游离药物均可诱 。
46、导细胞凋亡， 经Hoechst33342染色后， 正常细胞的细胞核呈现均匀的蓝色荧光， 而游离药物 组细胞核浓染， 载药纳米制剂组细胞核皱缩且碎裂， 且载药纳米制剂组细胞凋亡现象更为 明显。 0102 抗肿瘤活性测试： 0103 结肠癌细胞株Colon26， 培养于RPMI-1640培养液中， 于37、 5%CO2培养箱内培养。 细胞处于对数生长期时， 用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA消化传代， 每2-3d传代1次。 裸 鼠适应环境5d， 将对数生长期的Colon26细胞消化后制成1108/ml细胞悬液， 在Balb/c裸 鼠右前肢皮下注射0.1ml细胞悬液， 建立荷瘤模型。 待小。
47、鼠肿瘤平均体积长至50-100mm3左 说 明 书 8/9 页 11 CN 103989624 B 11 右时， 将裸鼠随机分为4组， 每组10只。 各组分别于第1、 4、 7天通过尾静脉注射给药， 给药剂 量为盐酸伊立替康 （CPT-11） 溶液20mg/kg， 实施例1中的CPT-11临床载药纳米制剂20mg/kg， 实施例1中的CPT-11临床载药纳米制剂30mg/kg和生理盐水 （对照组） ， 用卡尺测量各裸鼠肿 瘤的长径(a)及短径(b)， 按(ab2) 2公式计算肿瘤体积。 0104 由图4可以看出， 盐酸伊立替康溶液及盐酸伊立替康临床载药纳米制剂对裸鼠 Colon26结肠癌均有较好的抑制作用， 且呈现剂量相关性， 各剂量组肿瘤体积与对照组相比 均显著降低(P0.05， 0.01)， 同剂量的临床载药纳米制剂组较盐酸伊立替康溶液20mg/kg组 有更好的抑瘤效果 （P0.05） 。 说 明 书 9/9 页 12 CN 103989624 B 12 图1 图2 图3 说 明 书 附 图 1/2 页 13 CN 103989624 B 13 图4 说 明 书 附 图 2/2 页 14 CN 103989624 B 14 。