骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的制备方法。
背景技术
骨是一族生物矿物材料的总称，主要发育于脊椎动物中。虽然每一种类型的骨的结构和组成稍有变化，但都有一个共同的特点：它们主要成分都是由I型胶原纤维、碳羟磷灰石和水组成。骨是最复杂的生物矿化系统之一，也是最典型的天然有机-无机复合材料。骨中的碳羟磷灰石晶体都是板形的，平均长度和宽度分别为50nm和25nm；晶体厚度极薄，且非常一致，一般1.5nm至4.0nm。骨的主要有机相为胶原纤维，另外还有少量骨涎酸蛋白、硫酸软骨素、脂类、肽类等。胶原纤维中的原胶原分子具有三重螺旋结构，骨中的矿物相位于原胶原分子间的间隙孔内，排列成层，构成骨的基本结构。
骨损伤是目前常见的疾病。由于风湿、类风湿等各种骨关节疾病或运动创伤所造成的关节骨损伤给许多病人带来痛苦。迄今为止，临床上仍然缺少有效的方法修复大尺寸的骨缺损。组织工程和再生医学的技术和方法，能通过成骨细胞的生长或干细胞的诱导分化生长成活体骨组织，并用于骨的修复和再生，从而有望促进大范围骨缺损的修复。其中，骨修复支架在骨再生中起着十分重要的作用。
传统的骨修复材料难以获得细胞活性位点，难以促进造骨细胞的正常活性的表达。目前有希望达到临床使用的思路是，模仿人体天然骨的成分及结构特征，将生物活性陶瓷材料如羟基磷灰石等引入聚合物基体形成复合结构，以结合二者优势。聚合物赋予材料加工性和韧性，无机材料提供力学强度和生物活性，并在一定程度上调节支架的降解行为。在支架制备中，静电纺丝法制备的纳米纤维支架由于形态结构类似细胞间质，有利于细胞的粘附、生长和分化，从而广泛地用作骨组织工程支架。这种有机-无机复合型纳米纤维支架可为细胞提供与天然骨相类似的微环境，有助于骨系细胞的粘附、增殖及功能发挥，符合骨组织工程的生物学要求，有望成为骨修复用的理想支架。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种模拟人体天然骨的组成和结构，并为受损的骨组织提供良好的微环境且能有效地促进骨细胞的粘附、生长与功能表达的骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的制备方法。
本发明的骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的制备方法，包括以下步骤：
将羟基磷灰石纳米颗粒加入到体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制羟基磷灰石纳米颗粒的质量浓度为0.5～15％，超声振荡，使羟基磷灰石分散均匀，然后加入聚(乳酸-羟基乙酸)，控制其质量浓度为15％，40℃过夜溶解，超声振荡，使羟基磷灰石与聚(乳酸-羟基乙酸)混合均匀。将混合液加入到注射器中进行静电纺丝，设置流速0.5～2.0ml/h，电压12～15kV，室温下铝膜收集，收集距离10～20cm，即可获得骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。
本发明中，所说的羟基磷灰石纳米颗粒可以是市售的针状羟基磷灰石纳米晶体；或者也可以按以下方法制备：
将氯化钙和磷酸氢二铵分别溶解在50g/L聚乙二醇水溶液中，配制浓度为0.1mol/L的磷酸氢二铵的聚乙二醇水溶液和浓度为0.1mol/L的氯化钙的聚乙二醇水溶液；将磷酸氢二铵的聚乙二醇水溶液逐滴加入到氯化钙的聚乙二醇水溶液中，控制钙磷体积比为1.67，磁力搅拌，调节pH值为10，在0℃水浴中反应至少30分钟，再陈化至少48小时；用去离子水反复超声洗涤，冷冻干燥，得到非晶态的羟基磷灰石粒子，将非晶态的羟基磷灰石粒子在900℃煅烧至少4小时，在乙醇或水中超声振荡，得到分散的颗粒状羟基磷灰石纳米粒子，离心洗涤，冻干。
本发明方法制备的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架是模拟人体天然骨的组成和结构，将生物活性陶瓷材料羟基磷灰石引入可降解聚(乳酸-羟基乙酸)基体，通过静电纺丝技术获得。羟基磷灰石能均匀地分布在聚(乳酸-羟基乙酸)纤维基体的内部和表面，且保持了原有的晶态结构。
该支架具有良好的热力学、降解和矿化性能，生物相容性好、综合性能优良、使用方便，能有效地促进成骨细胞的粘附、生长和功能表达，符合骨组织工程地生物学要求。
【附图说明】
图1a)和b)分别是羟基磷灰石纳米晶体超声振荡前、后的扫描电镜照片，c)是羟基磷灰石纳米晶体的X射线能谱图；
图2a)是羟基磷灰石纳米晶体的透射电镜照片，b)是羟基磷灰石纳米晶体的粒径分布图；
图3是聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的扫描电镜照片，其中羟基磷灰石含量分别为a)0，b)0.5％，c)2.5％，d)5％，e)10％，f)15％；
图4是聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的透射电镜照片，其中羟基磷灰石含量分别为a)0.5％，b)2.5％，c)5％，d)10％，e)15％；
图5中曲线a)和b)分别是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含2.5％羟基磷灰石)的傅立叶红外光谱图，图中Δ和*分别代表与聚(乳酸-羟基乙酸)和羟基磷灰石中磷酸根相对应的峰；
图6是X射线电子衍射谱图，其中a)是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，b)是聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含2.5％羟基磷灰石)，c)是羟基磷灰石纳米晶体；
图7a)是纤维支架动态力学分析(DMA)的储能模量曲线，其中曲线1是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，曲线2～5分别是羟基磷灰石质量浓度依次为2.5％、5％、10％、15％的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架；b)是纤维支架动态力学分析(DMA)的损耗角正切曲线，其中曲线1是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，曲线2～5分别是羟基磷灰石质量浓度依次为2.5％、5％、10％、15％的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架；c)是差示扫描量热仪(DSC)第二次扫描曲线，其中曲线1是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，曲线2～4分别是羟基磷灰石质量浓度依次为5％、10％、15％的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架；
图8是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架在37℃下PBS缓冲液中的降解情况；a)图失重率随时间变化曲线；b)图面积收缩随时间变化曲线；c)图降解49天后的热失重(TGA)曲线；
图9是纤维支架在37℃的5倍浓度的模拟体液(5×SBF)中矿化后的扫描电镜照片，其中a1-a4)是矿化时间分别1天、4天、14天和28天的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，b1-b4)是矿化时间分别1天、4天、14天和28天的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)，b1h)是b1)的放大照片；
图10是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)上的MC3T3-E1成骨细胞培养情况。其中a)MTT活性随时间的变化图，b)细胞增殖随时间的变化图；
图11是纤维支架上MC3T3-E1成骨细胞培养7天后的扫描电镜照片，其中a)和c)是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架，b)和d)是聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)，其中c)和d)是a)和b)的放大照片；
图12是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)上的MC3T3-E1成骨细胞表达的碱性磷酸酶含量随培养时间的变化图。
【具体实施方式】
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1：
1)将氯化钙和磷酸氢二铵分别溶解在50g/L聚乙二醇水溶液中，配制浓度为0.1mol/L的磷酸氢二铵的聚乙二醇水溶液和浓度为0.1mol/L的氯化钙的聚乙二醇水溶液；将磷酸氢二铵的聚乙二醇水溶液逐滴加入到氯化钙的聚乙二醇水溶液中，控制钙磷体积比为1.67，磁力搅拌，调节pH值为10，在0℃水浴中反应30分钟，再陈化48小时；用去离子水超声洗涤3次，-20℃下冷冻2小时，冻干机中冷冻干燥48小时，得到非晶态的羟基磷灰石粒子。将非晶态粒子在900℃煅烧4小时，在乙醇中超声振荡20分钟后，得到分散的颗粒状羟基磷灰石纳米晶体，离心洗涤3次，冻干后即可使用。图1a)和b)分别是羟基磷灰石纳米晶体超声振荡前、后的扫描电镜照片，c)是羟基磷灰石纳米晶体的X射线能谱图；图2a)是羟基磷灰石纳米晶体的透射电镜照片，b)是羟基磷灰石纳米晶体的粒径分布图；由图可见，羟基磷灰石纳米晶体呈不规则的颗粒状(多为球形)，超声后分散更为均匀，粒径分布更窄，平均粒径为266.6±7.3nm。羟基磷灰石纳米晶体最终的钙磷比为1.634，与理论值接近。图6c)是羟基磷灰石的X射线电子衍射谱图，可见其具有高结晶性。
2)将步骤1)获得的羟基磷灰石纳米颗粒加入到10ml体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺的混合溶剂中，控制羟基磷灰石纳米颗粒的质量浓度分别为0.5％、2.5％、5％、10％、15％，超声振荡15分钟，使羟基磷灰石分散均匀。然后各加入1.5克聚(乳酸-羟基乙酸)，40℃过夜溶解，超声振荡15分钟，使羟基磷灰石与聚(乳酸-羟基乙酸)混合均匀，得到分别含0.5％、2.5％、5％、10％、15％羟基磷灰石和15％聚(乳酸-羟基乙酸)的混合溶液。将混合液加入到注射器中进行静电纺丝，每次取约5ml该混合液加入到20ml的注射器中，设置流速1.0ml/h，电压12kV，室温下铝膜收集，收集距离15cm。2小时后停止注射，即可在铝膜上收集到聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。同样方法制备纯聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜支架用于对照。图3是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和不同羟基磷灰石含量的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的扫描电镜照片；图4是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和不同羟基磷灰石含量的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的透射电镜照片；由图可见，羟基磷灰石晶体能均匀地分布在纳米纤维的内部和表面，当浓度高于5％时，其易在表面聚集。图5是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含2.5％羟基磷灰石)的傅立叶红外光谱图，磷酸根的特征峰证实了羟基磷灰石在纤维支架中的成功复合。图6a)和b)是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含2.5％羟基磷灰石)的X射线电子衍射谱图，可见羟基磷灰石在复合纤维中保持了原有的晶态结构。图7是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和不同羟基磷灰石含量的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的DMA曲线中储能模量、损耗角正切和DSC第二次扫描曲线；表1是由DMA和DSC试所得的聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和不同羟基磷灰石含量的聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架的玻璃化转变温度(Tg)；
表1
由图7和表1可见，羟基磷灰石的复合使得纤维支架的力学性能稍有下降，而玻璃化转变温度(Tg)升高，且由DMA测试得到的其变化幅度略高于由DSC测试的幅度。图8是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架在37℃下PBS缓冲液的降解过程中的失重率、面积收缩和TGA曲线；发现在9周的体外降解中，纯纤维支架和复合纤维支架失重率相近，而复合纤维支架的面积收缩要大于纯支架，这说明羟基磷灰石在纤维支架中充当了缺陷的作用，与其降低了力学性能相一致。TGA分析发现，降解49天后的复合纤维支架中，羟基磷灰石的含量与初始含量相近，证实了在降解过程中羟基磷灰石和聚(乳酸-羟基乙酸)基体几乎以相同的速率从复合纤维支架中脱离。图9是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)在37℃的5倍浓度的模拟体液中矿化1-28天后的扫描电镜照片；可见复合纤维支架比纯纤维支架具有更好的生物矿化性能，且矿化颗粒呈片状晶体结构。
3)将聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架(含5％羟基磷灰石)切成直径为7mm的圆片，用75％的酒精浸泡，紫外光照射过夜灭菌，用无菌的PBS置换去除其中的酒精后，将支架薄片放入96孔培养板中。用0.25％胰酶/PBS溶液将新生小鼠颅骨源性的成骨样细胞系(MC3T3-E1细胞)从培养盘消化，离心(1200rpm)10分钟，弃去上清夜，加入含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基，调节细胞悬液浓度为20×104/ml，每孔200μl(即种植密度为4×104/孔，也即10.4×104/cm2)，在37℃、5％CO2培养箱中培养至所需时间。每隔2天更换一次培养基，以保持细胞的营养供应。与实例1中同样方法制备的纯聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜支架进行对比。图10是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)上的MC3T3-E1成骨细胞随培养时间的MTT活性和细胞增殖情况；图11是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)上的MC3T3-E1成骨细胞培养7天后的扫描电镜照片；图12是聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架(含5％羟基磷灰石)上的MC3T3-E1成骨细胞表达的碱性磷酸酶含量随培养时间的变化图。这些结果表明，纯聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合支架都能维持成骨细胞的增殖和活性，且7天时的活性最大，但二者差别不大；复合纤维支架上粘附的细胞形态更为铺展，表面有更多的分泌物；同时，复合纤维支架能更显著地提高成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)的表达，说明其具有较强的维持细胞表型的能力，符合骨组织工程的生物学要求。
实例2：
步骤1)同实例1中的步骤1)，得到颗粒状羟基磷灰石纳米晶体。
步骤2)同实例1中的步骤2)，但设置静电纺丝流速0.5ml/h，得到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。
实例3：
步骤1)同实例1中的步骤1)，得到颗粒状羟基磷灰石纳米晶体。
步骤2)同实例1中的步骤2)，但设置静电纺丝电压为15kV，得到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。
实例4：
步骤1)同实例1中的步骤1)，得到颗粒状羟基磷灰石纳米晶体。
步骤2)同实例1中的步骤2)，但设置静电纺丝收集距离为10cm，得到聚(乳酸-羟基乙酸)纳米纤维膜支架和聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。
实例5：
将市售的针状羟基磷灰石纳米晶体加入到体积比为1/1的四氢呋喃/二甲基甲酰胺混合溶剂中，控制羟基磷灰石纳米颗粒的质量浓度为10％，超声振荡，使羟基磷灰石分散均匀。然后加入聚(乳酸-羟基乙酸)，控制其质量浓度为15％，40℃过夜溶解，超声振荡，使羟基磷灰石与聚(乳酸-羟基乙酸)混合均匀。将混合液加入到注射器中进行静电纺丝，设置流速1.0ml/h，电压12kV，室温下铝膜收集，收集距离15cm，亦可获得骨修复用聚(乳酸-羟基乙酸)/羟基磷灰石纳米纤维复合膜支架。