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1、(10)申请公布号 CN 102120028 A (43)申请公布日 2011.07.13 CN 102120028 A *CN102120028A* (21)申请号 201110055100.0 (22)申请日 2011.03.09 A61K 39/102(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C08B 37/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 河南科技大学 地址 471039 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 宫强 王帅涛 张敏 牛明福 孙军杰 秦翠丽 李爱江 (74)专利代理机构 洛阳市凯旋专利事务所 411。
2、12 代理人 符继超 (54) 发明名称 从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多 糖疫苗的方法 (57) 摘要 一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作 脂多糖疫苗的方法， 经过制备禽多杀性巴氏杆 菌培养液、 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集 禽多杀性巴氏杆菌菌体、 超声波对禽多杀性巴 氏杆菌菌体进行破碎、 从超声波破碎的禽多杀 性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液、 从粗提的 脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、 用 DNA 酶和 RNA 酶来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA、 制 备纯化的脂多糖和将纯化的脂多糖制作成禽多 杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤。经动物免 疫实验和动物攻毒实验， 本发明制。
3、备出的禽多杀 性巴氏杆菌病脂多糖疫苗给鸡进行三次免疫之后 能使被免疫鸡有效地预防禽多杀性巴氏杆菌病。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 8 页 CN 102120033 A1/3 页 2 1. 一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法， 该方法经过制备 禽多杀性巴氏杆菌培养液、 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、 超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中 粗提脂多糖溶液、 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、 用DNA酶和RNA酶来酶解 脂多糖浓缩。
4、液中的 DNA 和 RNA、 制备纯化的脂多糖和将纯化的脂多糖制作成禽多杀性 巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤， 上述八个步骤中所述的中涉及到离心机的离心转速， 所述的中涉及到超声波的功率、 辐射时间、 间歇秒数和辐射次数， 所述的中涉及到换水 次数， 所述的中涉及到酶解时间， 所述的中涉及到用浓度为 6 摩尔 / 升 NaOH 来调节溶 液的 pH 值， 所述的中涉及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手 段， 这些常规实验技术手段中的任一项作为单独实验条件或许是存在的， 但这些常规实验 技术手段综合应用在 “从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法” 则是必 需的 ； 。
5、其特征是 ： 所述的八个步骤分述如下 ： 制备禽多杀性巴氏杆菌培养液 用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌， 将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接 种环以 “Z” 字型划线接种于培养平板上， 将培养平板放置于 37培养箱内培养 24 小时， 挑 取培养 24 小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于 5 毫升的液体培养基中， 将该 5 毫 升的液体培养基放在37的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时， 再将振荡培养 的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37的摇床中以160转/分钟 的速度振荡培养 24 小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液 ； 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收。
6、集禽多杀性巴氏杆菌菌体 将上述制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到 250 毫升的离心管中， 将加入禽多 杀性巴氏杆菌培养液的该 250 毫升离心管放在离心机上并在 5000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 然后将离心 15 分钟后的 250 毫升离心管中的上清液弃掉， 留在该 250 毫升离心管 中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体 ； 超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎 在上述中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水， 然后将该250毫升离心管置于超声波破碎仪中， 设置超声波破碎仪的功率为500瓦， 每超声 波辐射 20 秒后停止辐射 20 秒为。
7、一个破碎循环过程， 所有破碎循环过程共持续 30 分钟， 30 分钟后该 250 毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体 ； 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液 从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步， 三步分述如下 ： 第一步， 提取上述中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体 10 毫升并加入到 50 毫升离心管中， 然后再向该 50 毫升离心管中加入 10 毫升其浓度为 90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次使 10 毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和 10 毫升苯酚充分混匀， 然后将充分 混匀的该 50 毫升离心管放置在 70的水浴锅中加热并用玻璃。
8、棒快速搅拌 30 分钟， 30 分钟 后从水浴锅中取出该 50 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将该 50 毫升离心管放在离 心机上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心管的上层溶 液吸取并加入到另一50毫升的三角瓶中、 该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、 最后再 向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升待用 ； 权 利 要 求 书 CN 102120028 A CN 102120033 A2/3 页 3 第二步， 向第一步中待用的该 50 毫升离心管中的下层溶液 + 蒸馏水中加入 10 毫升其 浓度为 。
9、90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次使其充分混匀， 充分混匀后将该 50 毫升离心 管放置在 70的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌 30 分钟， 30 分钟后从水浴锅中取出该 50 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将该 50 毫升离心管放在离心机上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心管的上层溶液吸取并加入到第一 步中的另一50毫升的三角瓶中存储、 该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、 最后再向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升准备再次使用 ； 第三步， 重复第二步数次直至将另一50毫升的三角。
10、瓶储满刻度为止， 存储满50毫升的 另一 50 毫升三角瓶中的所述上层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提 的脂多糖溶液 ； 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液 将粗提的 50 毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中， 将透析袋放在自来水流水中持续 冲洗 48 小时， 再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡， 每 6 小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水 8 次， 然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩， 直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被浓缩到 7.5 毫升浓缩液为止， 透析袋中所述 7.5 毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液 ； 用 DNA 酶和 RNA 酶来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 。
11、和 RNA 将上述中的所述 7.5 毫升脂多糖浓缩液倒入 10 毫升的离心管中， 再向该 10 毫升离 心管中分别加入 375 微克的 DNA 酶和 RNA 酶 ； 将该 10 毫升离心管放在 37水浴中放置 5 小时， 再将该 10 毫升离心管放在 100水浴中放置 10 分钟， 放置 10 分钟后从 100水浴中 取出该 10 毫升离心管并冷却至室温， 在室温条件下将该 10 毫升离心管放在离心机上并在 3000转/分钟的转速下离心30分钟， 离心30分钟后将该10毫升离心管中的上清液吸取并 倒入另一 100 毫升的离心管中备用 ； 制备纯化的脂多糖 向上述备用的另一100毫升离心管中加入。
12、体积是其上述所述上清液液体6倍的无 水乙醇并用 6 摩尔 / 升的 NaOH 调节 pH 值至 9.0， 再将该另一 100 毫升离心管在 4时放置 12 小时， 然后在离心机上并在 6000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 离心 15 分钟后将该另 一 100 毫升离心管中的液体倒掉、 留在该另一 100 毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化 的脂多糖 ； 将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗 在上述另一100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解 并得到高浓度的脂多糖溶液， 用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度， 缓慢加入超纯水至所 述脂多糖溶液的浓度达到 。
13、0.5 毫克 / 毫升为止 ； 向上述浓度为 0.5 毫克 / 毫升的所述脂多糖溶液中倒入 50 毫升烧杯中， 再向该 50 毫 升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1.5倍的弗氏完全佐剂， 同时在该50毫升烧杯中 放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌 1 小时， 搅拌 1 小时后在该 50 毫升烧杯中的溶液 就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗。 2. 如权利要求 1 所述从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法， 其特 征是 ： 所述培养平板上包含有 1.5% 的胰蛋白胨、 0.5% 的大豆蛋白胨、 0.5% 的氯化钠、 2% 的 琼脂和少量水。 权 利 要 求 书 CN 102。
14、120028 A CN 102120033 A3/3 页 4 3. 如权利要求 1 所述从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法， 其特 征是 ： 所述液体培养基包含有 1.5% 的胰蛋白胨、 0.5% 的大豆蛋白胨、 0.5% 的氯化钠和少量 水。 权 利 要 求 书 CN 102120028 A CN 102120033 A1/8 页 5 从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法 技术领域 0001 本发明属于动物疫苗制备技术领域， 尤其是一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖 并制作脂多糖疫苗的方法。 背景技术 0002 禽多杀性巴氏杆菌病是由禽多杀性巴氏杆菌引起的家禽接触。
15、性传染病， 呈世界分 布， 在我国也是常见的多发性传染病， 几乎所有的家禽都能感染该病， 其传染流行严重影响 着家禽业的健康发展。 0003 目前我国对于禽多杀性巴氏杆菌病的预防和治疗主要采用的是药物治疗， 如抗生 素等， 但一旦停药后容易复发， 且长期用药容易诱导禽多杀性巴氏杆菌产生耐药性， 还可能 产生副作用， 比如会引起产蛋鸡产蛋率的下降。 因此， 为了更加有效地预防禽多杀性巴氏杆 菌病的流行， 需要用有效的疫苗进行免疫。 0004 禽多杀性巴氏杆菌病的常规疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种， 但是弱毒活 疫苗存在一定的缺点， 比如免疫持续期比较短、 保护效果偏低、 副作用偏大， 应用不。
16、当时会 引起免疫失败， 甚至会造成一些家禽的死亡。 0005 而灭活疫苗在灭活过程中可能造成某些抗原物质的丢失， 只能对同血清型的菌株 感染有一定的免疫效果， 且保护效果和免疫持续期还不如弱毒活疫苗更好。 0006 脂多糖是禽多杀性巴氏杆菌内毒素的物质基础， 在禽多杀性巴氏杆菌崩裂时释放 出来， 是很强的发热原。目前人们普遍认为脂多糖在禽多杀性巴氏杆菌的致病过程中起着 重要的作用。 研究表明禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖在对嗜中性粒细胞的黏附中起着辅助作 用。从血清型为 B:2 的禽多杀性巴氏杆菌菌株中分离到的脂多糖能够引起动物产生出血性 败血症的症状。 除了具有致病性外， 禽多杀性巴氏杆菌的脂多糖。
17、还能够诱发体液免疫应答， 因此被认为是一种保护性抗原。 0007 截止目前， 从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖并制作禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫 苗的方法还未见相关报道。 发明内容 0008 为解决上述问题， 本发明提供了一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多 糖疫苗的方法， 该方法先从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖， 然后将提取的脂多糖溶液与 弗氏完全佐剂按照 1 1.5 的比例进行混合制成禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗， 经动物 实验验证表明本方法制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗可有效地为被免疫的鸡提 供抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力， 保护率为 66.7%， 能够有效地预防家禽产生禽多杀性。
18、 巴氏杆菌病。 0009 为实现上述发明目的， 本发明采用如下技术方案 ： 一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法， 该方法经过制备禽 多杀性巴氏杆菌培养液、 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体、 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A2/8 页 6 超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎、 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗 提脂多糖溶液、 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、 用DNA酶和RNA酶来酶解脂 多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA、 制备纯化的脂多糖和将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴 氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤， 。
19、上述八个步骤中所述的中涉及到离心机的离心转速， 所 述的中涉及到超声波的功率、 辐射时间、 间歇秒数和辐射次数， 所述的中涉及到换水次 数， 所述的中涉及到酶解时间， 所述的中涉及到用浓度为 6 摩尔 / 升 NaOH 来调节溶液 的 pH 值， 所述的中涉及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段， 这些常规实验技术手段中的任一项作为单独实验条件或许是存在的， 但这些常规实验技术 手段综合应用在 “从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法” 则是必需的。 0010 本发明从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法所述的八个步 骤分述如下 ： 制备禽多杀性巴氏杆。
20、菌培养液 用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌， 将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接 种环以 “Z” 字型划线接种于培养平板上， 将培养平板放置于 37培养箱内培养 24 小时， 挑 取培养 24 小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于 5 毫升的液体培养基中， 将该 5 毫 升的液体培养基放在37的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时， 再将振荡培养 的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37的摇床中以160转/分钟 的速度振荡培养 24 小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液 ； 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体 将上述制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液。
21、加入到 250 毫升的离心管中， 将加入禽多 杀性巴氏杆菌培养液的该 250 毫升离心管放在离心机上并在 5000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 然后将离心 15 分钟后的 250 毫升离心管中的上清液弃掉， 留在该 250 毫升离心管 中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体 ； 超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎 在上述中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水， 然后将该250毫升离心管置于超声波破碎仪中， 设置超声波破碎仪的功率为500瓦， 每超声 波辐射 20 秒后停止辐射 20 秒为一个破碎循环过程， 所有破碎循环过程共持续 30 分钟， 3。
22、0 分钟后该 250 毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体 ； 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液 从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步， 三步分述如下 ： 第一步， 提取上述中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体 10 毫升并加入到 50 毫升离心管中， 然后再向该 50 毫升离心管中加入 10 毫升其浓度为 90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次使 10 毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和 10 毫升苯酚充分混匀， 然后将充分 混匀的该 50 毫升离心管放置在 70的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌 30 分钟， 30 分钟 后从水浴锅中取出该 5。
23、0 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将该 50 毫升离心管放在离 心机上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心管的上层溶 液吸取并加入到另一50毫升的三角瓶中、 该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、 最后再 向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升待用 ； 第二步， 向第一步中待用的该 50 毫升离心管中的下层溶液 + 蒸馏水中加入 10 毫升其 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A3/8 页 7 浓度为 90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次使其充分混匀， 充分混。
24、匀后将该 50 毫升离心 管放置在 70的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌 30 分钟， 30 分钟后从水浴锅中取出该 50 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将该 50 毫升离心管放在离心机上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心管的上层溶液吸取并加入到第一 步中的另一50毫升的三角瓶中存储、 该50毫升离心管中的中层溶液弃掉不要、 最后再向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升准备再次使用 ； 第三步， 重复第二步数次直至将另一50毫升的三角瓶储满刻度为止， 存储满50毫升的 另一 50 毫升三角瓶中的所述上。
25、层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提 的脂多糖溶液 ； 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液 将粗提的 50 毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中， 将透析袋放在自来水流水中持续 冲洗 48 小时， 再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡， 每 6 小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水 8 次， 然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩， 直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被浓缩到 7.5 毫升浓缩液为止， 透析袋中所述 7.5 毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液 ； 用 DNA 酶和 RNA 酶来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA 将上述中的所述 7.5 毫升脂多糖浓缩液倒入 10 毫升。
26、的离心管中， 再向该 10 毫升离 心管中分别加入 375 微克的 DNA 酶和 RNA 酶 ； 将该 10 毫升离心管放在 37水浴中放置 5 小时， 再将该 10 毫升离心管放在 100水浴中放置 10 分钟， 放置 10 分钟后从 100水浴中 取出该 10 毫升离心管并冷却至室温， 在室温条件下将该 10 毫升离心管放在离心机上并在 3000转/分钟的转速下离心30分钟， 离心30分钟后将该10毫升离心管中的上清液吸取并 倒入另一 100 毫升的离心管中备用 ； 制备纯化的脂多糖 向上述备用的另一100毫升离心管中加入体积是其上述所述上清液液体6倍的无 水乙醇并用 6 摩尔 / 升的 。
27、NaOH 调节 pH 值至 9.0， 再将该另一 100 毫升离心管在 4时放置 12 小时， 然后在离心机上并在 6000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 离心 15 分钟后将该另 一 100 毫升离心管中的液体倒掉、 留在该另一 100 毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化 的脂多糖 ； 将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗 在上述另一100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解 并得到高浓度的脂多糖溶液， 用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度， 缓慢加入超纯水至所 述脂多糖溶液的浓度达到 0.5 毫克 / 毫升为止 ； 向上述浓度为 0.5 毫克 / 毫升。
28、的所述脂多糖溶液中倒入 50 毫升烧杯中， 再向该 50 毫 升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1.5倍的弗氏完全佐剂， 同时在该50毫升烧杯中 放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌 1 小时， 搅拌 1 小时后在该 50 毫升烧杯中的溶液 就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗。 0011 所述培养平板上包含有 1.5% 的胰蛋白胨、 0.5% 的大豆蛋白胨、 0.5% 的氯化钠、 2% 的琼脂和少量水。 0012 所述液体培养基包含有1.5%的胰蛋白胨、 0.5%的大豆蛋白胨、 0.5%的氯化钠和少 量水。 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A4/8 页 。
29、8 0013 由于采用如上所述的技术方案， 本发明具有如下优越性 ： 1、 本发明在用超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎时， 所用超声波破碎仪的功率 为 500 瓦， 每超声波辐射 20 秒后停止辐射 20 秒为一个破碎循环过程， 在这一个破碎循环过 程中， 辐射 20 秒后由于超声波所形成的空穴效应， 可使禽多杀性巴氏杆菌菌体破裂， 停止 辐射的 20 秒可以使超声波破碎仪得到修整。经过 30 分钟所有破碎循环过程后及在不损害 超声波破碎仪的前提下可得到最大量的经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体。 0014 2、 本发明从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液时所用苯酚 浓度为 。
30、90%， 当经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌与浓度为 90% 的苯酚混合并加热至 70 并用玻璃棒剧烈搅拌时， 苯酚和脂多糖溶液形成了单一相， 而冷却后则形成了苯酚相和水 相 ； 脂多糖大部分溶解于水相中， 而大部分蛋白质溶解于苯酚相中， 不溶性物质沉淀在两相 交界处， 经过这种方法可以得到最大量的粗提的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖溶液。 0015 3、 本发明从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液时， 将粗提的禽多杀性巴氏杆 菌脂多糖溶液全部加入到透析袋中， 将透析袋放在自来水流水中持续冲洗 48 小时， 再将透 析袋放入到蒸馏水中浸泡， 每6小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水8次， 然后将透析袋放入 装。
31、有聚乙二醇 6000 的烧杯中进行浓缩， 这种方法可得到高浓度的禽多杀性巴氏杆菌脂多 糖溶液。 0016 4、 本发明用 DNA 酶和 RNA 酶来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA 时， 可通过 DNA 酶和 RNA 酶的作用使禽多杀性巴氏杆菌脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA 得以酶解， 以除去含 在脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA， 得到更高纯度的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖溶液。 0017 5、 本发明制备纯化的脂多糖时， 向上述备用的另一 100 毫升离心管中加入体积 是其上述所述上清液液体 6 倍的无水乙醇并用 6 摩尔 / 升的 NaOH 调节 pH 值至 9.0， 再将 。
32、该另一 100 毫升离心管在 4时放置 12 小时， 用这种方法可使禽多杀性巴氏杆菌脂多糖完 全沉淀下来， 得到最大量的纯化的脂多糖。 0018 6、 本发明将将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗时， 将提取的脂 多糖溶液与弗氏完全佐剂按照11.5的比例进行混合制成禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫 苗， 弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分， 是一种油包水的乳浊液， 可以加强对抗原 的抗体反应， 能够非常有效的诱导产生高滴度的抗体， 弗氏完全佐剂活性来自于制备的脂 多糖疫苗中免疫原的持续释放并刺激局部免疫反应， 用这种方法制备的禽多杀性巴氏杆菌 脂多糖疫苗可增强免疫效果。 具体实施方式 。
33、0019 本发明是一种从禽多杀性巴氏杆菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法， 该方法 经过制备禽多杀性巴氏杆菌培养液、 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏 杆菌菌体、 超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体、 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌 菌体中粗提脂多糖溶液、 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液、 用DNA酶和RNA酶 来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA、 制备纯化的脂多糖和将纯化的脂多糖制作成禽 多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗共八个步骤。 0020 本发明方法中所涉及的禽多杀性巴氏杆菌 CVCC474（Avian Pasteurella multocida CVCC474） 由中国兽。
34、医药品监察所储存和提供。 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A5/8 页 9 0021 上述八个步骤中所述的中涉及到离心机的离心转速， 所述的中涉及到超声波 的功率、 辐射时间、 间歇秒数和辐射次数， 所述的中涉及到换水次数， 所述的中涉及到 酶解时间， 所述的中涉及到用浓度为 6 摩尔 / 升 NaOH 来调节溶液的 pH 值， 所述的中涉 及到脂多糖溶液与弗氏完全佐剂的体积比均为常规实验技术手段， 这些常规实验技术手段 中的任一项作为单独实验条件或许是存在的， 但这些常规实验技术手段综合应用在本发明 的方法之中则是必需的。 0022 本发明的八个步骤分述如。
35、下 ： 制备禽多杀性巴氏杆菌培养液 用接种环刮取一环斜面保藏的禽多杀性巴氏杆菌， 将刮有一环禽多杀性巴氏杆菌的接 种环以 “Z” 字型划线接种于培养平板上， 将培养平板放置于 37培养箱内培养 24 小时， 挑 取培养 24 小时后的培养平板上生长的一个单菌落接种于 5 毫升的液体培养基中， 将该 5 毫 升的液体培养基放在37的摇床中以160转/分钟的速度振荡培养24小时， 再将振荡培养 的5毫升液体培养基全部倒入200毫升的液体培养基中并在37的摇床中以160转/分钟 的速度振荡培养 24 小时制备出禽多杀性巴氏杆菌培养液。 0023 需要注意的是 ： 所述培养平板上包含有 1.5% 的胰。
36、蛋白胨、 0.5% 的大豆蛋白胨、 0.5% 的氯化钠、 2% 的琼 脂和少量水。 0024 所述液体培养基包含有1.5%的胰蛋白胨、 0.5%的大豆蛋白胨、 0.5%的氯化钠和少 量水。上述中两次使用的液体培养基相同。 0025 从禽多杀性巴氏杆菌培养液中收集禽多杀性巴氏杆菌菌体 将上述制备出的禽多杀性巴氏杆菌培养液加入到 250 毫升的离心管中， 将加入禽多 杀性巴氏杆菌培养液的该 250 毫升离心管放在离心机上并在 5000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 然后将离心 15 分钟后的 250 毫升离心管中的上清液弃掉， 留在该 250 毫升离心管 中的沉淀物就是所收集的禽多杀性巴。
37、氏杆菌菌体， 为下一步的超声波破碎作准备。 0026 超声波对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行破碎 在上述中250毫升离心管所收集的禽多杀性巴氏杆菌菌体中加入10毫升的蒸馏水， 10 毫升的蒸馏水能将禽多杀性巴氏杆菌菌体在该 250 毫升离心管中悬浮起来， 然后将该 250毫升离心管置于超声波破碎仪中， 设置超声波破碎仪的功率为500瓦， 每超声波辐射20 秒后停止辐射 20 秒为一个破碎循环过程， 所有破碎循环过程共持续 30 分钟， 30 分钟后该 250 毫升离心管中得到的就是经超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体， 该步骤的目的是通 过超声波破碎对禽多杀性巴氏杆菌菌体进行裂解， 使其中的脂多糖尽可。
38、能多的释放出来。 0027 从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖溶液 从禽多杀性巴氏杆菌菌体中粗提脂多糖分为三步， 三步分述如下 ： 第一步， 提取上述中经超声波破碎得到的禽多杀性巴氏杆菌菌体 10 毫升并加入到 50 毫升离心管中， 然后再向该 50 毫升离心管中加入 10 毫升其浓度为 90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次 （至少 3 次） 使 10 毫升禽多杀性巴氏杆菌菌体和 10 毫升苯酚充分混匀， 然后将充分混匀的该50毫升离心管放置在70的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌30分 钟， 30 分钟后从水浴锅中取出该 50 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将。
39、该 50 毫升离 心管放在离心机上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A6/8 页 10 管的上层溶液吸取并加入到另一 50 毫升的三角瓶中、 该 50 毫升离心管中的中层溶液弃掉 不要、 最后再向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升待用。 0028 第二步， 向第一步中待用的该 50 毫升离心管中的下层溶液 + 蒸馏水中加入 10 毫 升其浓度为 90% 的苯酚， 颠倒该 50 毫升离心管数次 （至少 3 次） 使其充分混匀， 充分混匀后 将该。
40、 50 毫升离心管放置在 70的水浴锅中加热并用玻璃棒快速搅拌 30 分钟， 30 分钟后从 水浴锅中取出该 50 毫升离心管并在室温下放置 20 分钟， 再将该 50 毫升离心管放在离心机 上并在 4000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心结束后将该 50 毫升离心管的上层溶液吸 取并加入到第一步中的另一 50 毫升的三角瓶中存储、 该 50 毫升离心管中的中层溶液弃掉 不要、 最后再向该 50 毫升离心管中的下层溶液中加入蒸馏水补足体积至 10 毫升准备再次 使用。 0029 第三步， 重复第二步数次直至将另一50毫升的三角瓶储满刻度为止， 存储满50毫 升的另一 50 毫升三。
41、角瓶中的所述上层溶液就是从超声波破碎的禽多杀性巴氏杆菌菌体中 粗提的脂多糖溶液。 0030 该步骤的第三步要不断重复进行直至将另一 50 毫升的三角瓶储满刻度为止， 可 以粗提更多的的脂多糖溶液， 也为下一步提取脂多糖浓缩液作准备。 0031 从粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖浓缩液 将粗提的 50 毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中， 将透析袋放在自来水流水中持续 冲洗 48 小时， 再将透析袋放入到蒸馏水中浸泡， 每 6 小时浸泡换一次蒸馏水共换蒸馏水 8 次， 然后将透析袋放入装有聚乙二醇6000的烧杯中进行浓缩， 直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被浓缩到7.5毫升浓缩液为止， 透析袋中所述。
42、7.5毫升浓缩液即为脂多糖浓缩液， 该 步骤通过浓缩过程可以提高脂多糖的浓缩液浓度。所述脂多糖浓缩液中含有微量 DNA 和 RNA。 0032 用 DNA 酶和 RNA 酶来酶解脂多糖浓缩液中的 DNA 和 RNA 将上述中的所述 7.5 毫升脂多糖浓缩液倒入 10 毫升的离心管中， 再向该 10 毫升离 心管中分别加入 375 微克的 DNA 酶和 RNA 酶， 可使分别加入 375 微克的 DNA 酶和 RNA 酶在 所述 7.5 毫升脂多糖浓缩液中的浓度控制在 50 微克 / 毫升左右并使所述脂多糖浓缩液中 含有的微量 DNA 和 RNA 得以酶解。将该 10 毫升离心管放在 37水浴中。
43、放置 5 小时， 再将 该 10 毫升离心管放在 100水浴中放置 10 分钟， 放置 10 分钟后从 100水浴中取出该 10 毫升离心管并冷却至室温， 在室温条件下将该 10 毫升离心管放在离心机上并在 3000 转 / 分钟的转速下离心 30 分钟， 离心 30 分钟后将该 10 毫升离心管中的上清液吸取并倒入另一 100 毫升的离心管中备用。 0033 制备纯化的脂多糖 向上述备用的另一100毫升离心管中加入体积是其上述所述上清液液体6倍的无 水乙醇并用 6 摩尔 / 升的 NaOH 调节 pH 值至 9.0， 再将该另一 100 毫升离心管在 4时放置 12 小时， 然后在离心机上并。
44、在 6000 转 / 分钟的转速下离心 15 分钟， 离心 15 分钟后将该另 一 100 毫升离心管中的液体倒掉、 留在该另一 100 毫升离心管中的沉淀物即为所制备纯化 的脂多糖。 0034 将纯化的脂多糖制作成禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗 在上述另一100毫升离心管中所制备纯化的脂多糖中加入1毫升的超纯水进行溶解 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A7/8 页 11 并得到高浓度的脂多糖溶液， 用蒽酮法测定所述脂多糖溶液的浓度， 缓慢加入超纯水至所 述脂多糖溶液的浓度达到 0.5 毫克 / 毫升为止， 此时另一 100 毫升离心管中的所述脂多糖 溶液大约为。
45、 10 毫升左右。 0035 向上述浓度为0.5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升烧杯中， 再向该50 毫升烧杯中加入体积是所述脂多糖溶液体积1.5倍的弗氏完全佐剂， 同时在该50毫升烧杯 中放入一磁力棒并在磁力搅拌器作用下搅拌 1 小时， 搅拌 1 小时后在该 50 毫升烧杯中的 溶液就是制作的禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗， 所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗约为 25 毫升， 25 毫升所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗中的脂多糖含量约为 0.2 毫克 / 毫升。由 于实验的环境、 条件、 手段以及操作方式不同， 制作的所述禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗或 25 毫升， 或 25 毫升， 所述的 。
46、25 毫升并非是确定值， 仅供参考而已。 0036 本发明八个步骤中所使用的接种环、 培养平板、 培养箱、 摇床、 离心机、 超声波破碎 仪、 水浴锅、 透析袋、 烧杯、 三角瓶、 磁力棒、 玻璃棒等均为生物学实验室普通实验仪器及材 料， 均可在生物工程公司购买到。 0037 本发明八个步骤中所使用的胰蛋白胨、 大豆蛋白胨、 蒸馏水、 苯酚、 聚乙二醇 6000、 DNA 酶、 RNA 酶、 无水乙醇、 NaOH、 超纯水、 蒽酮、 硫酸、 弗氏完全佐剂等为生物学实验室普通 试剂， 均能在化学试剂公司或生物工程公司购买到。 0038 本发明所使用的胰蛋白胨， 大豆蛋白胨， 苯酚， 聚乙二醇 6。
47、000， 氢氧化钠， 无水乙 醇， DNA 酶， RNA 酶， 弗氏完全佐剂， 蒽酮， 硫酸， 透析袋等均能在化学试剂公司或生物工程公 司购买到。 0039 有关从禽多杀性巴氏杆菌中提取脂多糖并制作禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗的 免疫预防效果参考如下 ： 动物免疫实验和动物攻毒实验的限定条件是 ： 禽多杀性巴氏杆菌脂多糖疫苗中的脂多 糖含量为 0.2 毫克 / 毫升。 0040 1、 动物免疫实验 ： 动物免疫实验所用的实验物为鸡， 取 30 只 1 日龄的未经过免疫的鸡进行饲养， 等 30 只 鸡长到 4 周龄时将它们随机分为两组， 每组 15 只鸡， 其中的一组中所有的 15 只鸡均免疫本 。
48、发明制备的禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗， 将这一组自定义为脂多糖免疫组， 该免疫组 的鸡均免疫三次， 第一次免疫的时间为 4 周龄时， 第二次免疫的时间为 6 周龄时， 第三次免 疫的时间为 8 周龄时， 每次免疫的剂量均为 1 毫升 / 每只鸡， 免疫方式为皮下注射， 另外一 组的 15 只鸡不进行任何免疫， 只是与脂多糖免疫组的鸡在相同的条件下进行饲养， 将这一 组自定义为非免疫组。 0041 2、 动物攻毒实验 ： 本实验的目的是为了检测本发明制备禽多杀性巴氏杆菌病脂多糖疫苗能否给鸡提供 抵抗禽多杀性巴氏杆菌攻击的能力， 具体操作方法如下 ： 用禽多杀性巴氏杆菌 CVCC474 菌株对上。
49、述脂多糖疫苗免疫组和非免疫组中的所有的 鸡都进行肌肉注射攻毒， 攻毒时的剂量为 1104个禽多杀性巴氏杆菌 CVCC474/ 只鸡， 攻毒 之后对脂多糖免疫组和非免疫组中的所有的鸡继续饲养 2 周， 记录 2 周后两组中仍然存活 的鸡的数目， 并计算出两组的保护率， 保护率越高说明免疫预防效果越好， 两组的保护率的 计算方法如下 ： 说 明 书 CN 102120028 A CN 102120033 A8/8 页 12 （攻毒 2 周后仍然存活的鸡的数量 15） 100% 结果如表 1 所示， 在攻毒 2 周后脂多糖免疫组的鸡仍然有 10 只存活， 说明禽多杀性巴 氏杆菌病脂多糖疫苗的保护率为 66.7%， 非免疫组的鸡在攻毒 2 周后已经全部死亡， 说明非 免疫组的保护率为 0%。 0042 上述结果表明 ： 利用本发明制备出的禽多杀性巴氏杆菌病脂。