技术领域
本发明涉及医药、生物化工等领域中的药物载体领域。
具体地说，本发明涉及一种自固化微球。
本发明还涉及上述自固化微球的制备方法。
本发明还涉及上述自固化微球作为生物活性物质载体的应用。
背景技术
在医药、生物化工、化妆品、保健品以及组织工程等领域，常常会用 到生物活性物质，如蛋白、多肽等分子量大、空间结构复杂的生物大分子 物质。这类物质在药物递送过程中极易受到复杂生理环境特别是大量酶类 物质的作用而遭到破坏。为解决这一问题，在过去一段时间里人们主要采 用注射的方式进行给药，但这类物质仍然存在体内半衰期短、血药浓度波 动大、需频繁给药等问题。基于以上原因，迫切需要对此类生物活性物质 实现长效缓释，采用微球作为长效缓释载体即为解决方法之一。
微球在药物控释体系中占有重要的地位，以其作为载体包载生物活性 物质，不仅能避免体内酶和其他多种因素对药物活性的影响，而且也能通 过载体的缓慢降解，实现药物的长效缓释。但作为生物活性物质的载体， 这类微球在制备时仍存在一些问题，会对药物的活性产生影响。如使微球 固化所采用的共价交联剂，如戊二醛等，也会与药物的活性基团反应，使 药物失活。并且对于大分子物质来说，如采用化学交联的微球作为载体， 由于化学交联的作用力较强，形成的球体结构较为致密，大分子物质从微 球中向外的扩散速度很慢，难以达到有效的血药浓度。此外，传统的搅拌 法、喷射法等所制备的微球的粒径均一性很差，粒径大小很难控制。当作 为药物载体时，这会直接影响到药物的包埋率和生物利用度。首先，在微 球制备过程中，乳液的不均一会导致大小液滴合并，造成药物外泄，降低 药物包埋率。其次，在给药时，大的微球很容易被截留，不易被体内组织 吸收，影响药物在体内的分布，同时也降低药物生物利用度。载药微球的 粒径大小难以控制，还会导致药物释放重复性差，很难对其在体外体内释 放速率做出精确量化，最终影响给药量的判断。因此，对于微球类药物载 体而言，制备方式是否温和、简单；粒径是否均一、可控，直接影响到药 物的包埋率、药物活性、用药成本、释药可控性以及在体内生物利用度等 一系列关键问题，必须加以解决。
为了解决这些问题，曾经采用传统膜乳化法将具有低临界溶解温度 (Low critical solution temperature，LCST)的温度敏感材料制备成适于生物 活性物质包埋的自固化微球。所用的温度敏感材料的LCST在37℃左右， 当环境温度从其LCST以下升高至其LCST以上时，温度敏感材料具有从 溶液向凝胶转变的温度敏感性质，并且该材料的温敏相变行为不可逆。自 固化微球的制备利用温度敏感材料随温度发生相转变的性质，先在低于其 LCST的操作温度下(优选4℃)采用传统膜乳化法制备粒径均一的乳液， 再将操作温度升高到所用温度敏感材料的LCST以上，使乳液滴发生自固 化得到粒径均一的微球。由于体系中不用加入共价交联剂，并且采用了较 为温和的传统膜乳化法制备微球，可以有效地保护活性物质的活性，控制 微球的粒径分布范围，提高药物包埋率，实现药物的长效缓释。并且所制 备的微球为具有网络结构的凝胶微球，有利于大分子物质向外扩散。所采 用的传统膜乳化法的制备原理为将分散相在气体(通常为氮气)压力作用 下缓慢压入微孔膜的膜孔(所采用的微孔膜一般具有均匀大小的膜孔，常 用的膜为Shriasu Porous Glass(SPG)膜和聚合物膜)，在膜另一侧出口 处，当所形成的乳液滴达到一定大小后便在各种力的作用下脱离膜孔表面 进入到连续相，形成液滴。所施加的过膜压力大小一般等于或略大于液滴 脱落所需的临界压力。传统膜乳化法可以通过选择不同孔径的微孔膜制备 粒径在3-50微米之间的微球，根据所用分散相和连续相的性质不同，形成 的乳液滴的粒径大小与所用膜的膜孔径大小一般呈3-10倍的线性关系。但 当制备粒径小于10微米的微球时，所用的膜孔径非常小(通常小于3微 米)，此时即使在较高的过膜压力下乳化速度还是非常慢，尤其是当所采 用的温度敏感性材料具有较高的黏度时乳化速度更为缓慢，较高的黏度会 使生成的液滴在膜表面脱落困难，需要较长的乳化过程。增大压力在一定 程度上能提高乳化速度，但太大的压力会降低微球粒径的均一性。而作为 制备药物载体的首选材料之一的多糖材料由于其分子量较大，通常具有较 高黏度。并且小粒径的微球在药物载体、免疫佐剂方面也有着广泛的应用。 有研究表明，在作为乙肝疫苗佐剂时，纳米颗粒比微米颗粒具有更好的效 果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适于作为生物活性物质载体的自固化微 球。
本发明的又一目的在于提供一种上述自固化微球的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供的自固化微球，由具有低临界溶解温度 的温敏性材料制备而成，其平均粒径范围为50nm-100μm，其粒径分布系 数小于20％，优选小于15％。所述粒径分布系数按下式计算：
C.V.＝{[∑(di-d)2/N]1/2/d}×100％
式中：
C.V.代表粒径分布系数；
di代表各个微球的直径；
d代表微球的数均平均粒径，
d＝∑di/N；
N为用于计算粒径的微球数量，且N≥200个；
通过下述方法得到
1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分 散相；
2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；
3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预 乳液；
4)将步骤3中所述预乳液在压力下使其通过微孔膜一次或多次得到 乳液；
5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以 上，使液滴固化得到微球。
本发明提供的制备上述自固化微球的方法，主要步骤如下：
1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为分 散相，生物活性物质或功能成分在分散相中的浓度为0-10g/mL，温敏性材 料在分散相中的浓度为0.1wt.％-50wt.％；
2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；
3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中所述的连续相中得到预 乳液，分散相与连续相的体积比为1∶1-1∶1000，优选为1∶2-1∶200；
4)将步骤3中所述预乳液通过孔径为0.1-100微米的微孔膜一次或多 次得到乳液；微孔膜的孔径优选为0.8-50微米；
5)将步骤4中所述乳液升温至所用温敏性材料的低临界溶解温度以 上，使液滴固化得到微球；
所述温敏性材料选自具有低临界溶解温度的一种或几种温敏材料的 混合物或共聚物，其低临界溶解温度介于25℃-60℃之间。
所述的方法，其中温敏性材料选自壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖 季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混合物、 羧甲基壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合 物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚糖-磷酸氢二钾混合物、羟丁基壳聚糖、 泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆- 壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳 聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇-聚己内酯共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、 聚乳酸-聚乙醇酸-壳聚糖共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙 醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物中的一种或者几种。
所述的方法，其中步骤4中预乳液通过微孔膜的压力为0-10.0kgf/cm2。
所述的方法，其中步骤4中预乳液通过微孔膜的速度为0.5-3m3m-2h-1。
本发明具有下列效益：
(1)本发明提供的微球除了作为药物载体外，还可用作活细胞、组 织或酶等载体，应用于细胞培养、组织工程、微反应器等领域；
(2)本发明提供的微球具有网络状结构以及亲水性环境，可为生物 活性物质的生长或增殖提供有利的微环境，保护物质的生物活性，并有利 于反应底物和产物的扩散，促进生物反应的进行；
(3)采用本发明的制备方法，制备方法简单温和，有利于生物活性 物质的活性保持；
(4)采用本发明的制备方法，对于制备纳米级的微球，可以通过热 固化使乳液滴直接发生胶凝，得到微球，因此可避免微球间的交联、仅在 微球表面交联或无法充分交联微球等情况，有利于得到粒径均一、交联均 匀以及交联度高的微球。
附图说明
图1是本发明制备微球的原理及流程示意图。
图2是用于制备微球的均一乳液的装置示意图。
图3是实施例1制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100 倍。
图4是实施例1制备的壳聚糖微球的扫描电镜照片，放大倍数3500 倍。
图5是采用不同孔径的SPG膜制备的壳聚糖微球的平均粒径与SPG 膜孔径之间的关系图。
图6是比较例1制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100 倍。
图7是比较例2制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100 倍。
图8是传统膜乳化设备的示意图。
图9是比较例3制备的壳聚糖微球的光学显微镜照片，放大倍数100 倍。
图10是比较例4制备的壳聚糖微球的扫描电镜照片，放大倍数20000 倍。
具体实施方式
本发明的自固化微球采用具有LCST的温敏性材料制备，微球的平均 粒径为50纳米-100微米，并且粒径非常均一。本发明提供的自固化微球 适于作为生物活性物质载体。
本发明的温敏性材料选自具有LCST的一种材料或几种材料的混合物 或共聚物，其LCST为25℃-60℃，对于包埋生物活性大分子的体系，其 LCST优选为25℃-40℃。温敏性材料优选自壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、 壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混 合物、羧甲基壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维 素混合物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚糖-磷酸氢二钾混合物、羟丁基 壳聚糖、泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、泊 洛沙姆-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯 酰胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇(PEG)-聚己内酯(PCL)共聚物、 聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚乳酸(PLA)-聚乙醇酸(PLGA)-壳聚糖共 聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙 醇酸-聚乙二醇共聚物中的一种或者几种。
在本发明中，温度敏感材料在低于其LCST的温度下为溶液状态，在 高于或等于其LCST的温度下发生从溶液向凝胶状态的相转变。
在本发明的一些实施方案中，温度敏感材料为可逆性温度敏感材料， 即当环境温度从材料的LCST以上降低到以下时，温度敏感材料会发生从 凝胶向溶液的相转变。此时，需再次交联，以避免所得到的微球溶解。如 泊洛沙姆体系为可逆性温度敏感材料，因此在升温固化后需要进行再次交 联。其制备方法为：称取一定量泊洛沙姆407加入到9mL去离子水中， 磁力搅拌(400rpm，10min)下使充分溶解，冷却到4℃作为分散相备用。 泊洛沙姆407在分散相中的浓度为20wt.％，其LCST为37℃。连续相为 液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60-90℃)的混合物(体积比为1∶2)中， 乳化剂为PO-310，在连续相中的浓度为0.1wt.％，分散相与连续相的体积 比为1∶50。所用疏水SPG膜的孔径为5.2微米，过膜压力为2.0kgf/cm2， 固化反应时的温度为50℃，保温1h。然后向反应体系中加入三乙胺2mL， 缓慢加入甲基丙烯酰氯5mL，反应2h后，通氮气保护，加入引发剂(NH4) 2S2O8和还原剂NaHSO3溶液，反应30min。在10000rpm下离心，依次用 石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到泊洛沙姆微球，并将其保存在去离子 水中。泊洛沙姆微球的平均粒径为3.1微米，C.V.为15.33％。本领域技术 人员可以根据需要，选择再次交联的交联剂种类、加入量及加入方式等。
本发明的自固化微球的平均粒径介于50纳米-100微米之间。其按下 式计算的粒径分布系数小于20％，在优选条件下可以控制在15％以内：
C.V.＝{[∑(di-d)2/N]1/2/d}×100％
式中，C.V.代表粒径分布系数；di代表各个微球的直径；d代表微球的 数均平均粒径，d＝∑di/N；N为用于计算粒径的微球数量，且N≥200个。
本发明的自固化微球的尺寸非常均一，微球之间无合并现象，在保存 的过程中不会出现并聚现象。
在本发明中，所述的微球为由温度敏感材料液滴通过固化形成的粒径 从纳米至微米级的微球，可以具有实心、多孔、中空、中空多孔等结构。 当需要制备具有特殊孔结构的微球时，可以在分散相中加入一定量的致孔 剂。
本发明提供的自固化微球中可包埋或吸附具有药用价值的药物、保健 品或化妆品的功能成分，功能成分可选自于蛋白质、多肽、酶、疫苗、细 胞、基因、激素、抗菌素、抗癌药物、动植物提取物及其混合物中的一种 或者几种。本发明提供的微球中，优选包埋生物活性物质。
本发明的制备上述自固化微球的方法，其包括如下步骤：
(1)提供添加有生物活性物质或功能成分的温敏性材料的溶液作为 分散相；
所述活性物质或功能成分必须完全溶解或均匀分散于步骤1中的分散 相中，所述的功能成分可选自于蛋白质、多肽、酶、疫苗、细胞、基因、 激素、抗菌素、抗癌药物、动植物提取物及其混合物中的一种或者几种， 功能成分在分散相中的浓度为0-10g/mL。所述的步骤1中功能成分的浓 度可为0g/mL，此时制备的为空白微球。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤1中的温敏性材料的溶液为壳 聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐混合物、壳聚糖季铵 盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐混合物、羧甲基壳聚糖-甘油磷酸盐混合物、壳聚 糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合物、壳聚糖-聚乙烯醇混合物、壳聚糖- 磷酸氢二钾混合物、羟丁基壳聚糖、泊洛沙姆、甲基纤维素、羟乙基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、泊洛沙姆-壳聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳 聚糖共聚物、聚异丙基丙烯酰胺-壳聚糖季铵盐共聚物、聚乙二醇(PEG) -聚己内酯(PCL)共聚物、聚乙二醇-壳聚糖共聚物、聚乳酸(PLA)-聚 乙醇酸(PLGA)-壳聚糖共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-聚 乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙醇酸-聚乙二醇共聚物的水溶液或弱酸溶液中 的一种或者几种，温敏性材料的LCST为25℃-60℃，对于包埋生物活性 大分子的体系，其LCST优选为25℃-40℃。温敏性材料在分散相中的浓 度为0.1wt.％-50wt.％。
(2)提供溶解有乳化剂且与分散相互不相溶的溶剂作为连续相；
在本发明方法的一些实施方案中，步骤2中的溶剂为在常温下呈液体 状且与水不互溶的油性物质，可使用液体石蜡和石油醚、橄榄油、棉子油、 豆油、葵花子油、硅油、烷类碳氢化合物中的一种或几种，也可使用其混 合物。
在本发明方法的一些实施方案中，当步骤2中的溶剂为油性物质时， 乳化剂为油溶性乳化剂，其亲水亲油平衡值HLB可以在3-6之间，在本发 明的具体实施方案中，优选为失水山梨醇倍半油酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻 油、失水山梨醇三油酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇三硬脂酸酯、 甘油醚的聚合物(如PO-500、PO-310)、亲油-亲水嵌段共聚物中的一种或 几种。乳化剂在连续相中的浓度为0.1-10wt.％。
(3)将步骤1中所述的分散相分散到步骤2中的连续相中得到预乳 液，其中分散相与连续相的体积比优选为1∶1-1∶1000，更优选为1∶5-1∶200；
(4)将步骤3中的预乳液在一定的压力下使其通过孔径均一的微孔 膜一次或多次得到乳液；
在本发明方法的一些实施方案中，步骤4中的乳液过膜次数可为多次， 即通过同一微孔膜至少一次以上以得到均一乳液，优选为3-5次。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤4中的预乳液通过至少一个， 优选至少两个孔径均一的微孔膜以得到所述乳液。在另一些实施方案中， 步骤4中的预乳液通过同一孔径均一的微孔膜至少一次，优选至少两次以 上以得到所述乳液。例如，所述预乳液可以连续或间歇地通过两个或更多 个孔径均一的微孔膜，先使用的微孔膜的孔径大于或等于后使用的微孔膜 的孔径。或者，所述预乳液可以通过同一孔径均一的微孔膜两次或更多次， 每次通过在相同或不同的压力条件下进行。通过选择具有合适孔径的微孔 膜，将预乳液通过所述孔径均一的微孔膜一次或多次或者通过一个或多个 微孔膜后，所得乳液中的乳液滴的粒径分布系数CV值会逐渐变小，直至 小于20％，因此在步骤5中固化后即可得到本发明的平均粒径为50纳米 -100微米和CV值小于20％的凝胶微球产品。
在本发明方法的一些实施方案中，微孔膜优选疏水性的膜，如聚乙烯 膜、聚丙烯膜、聚四氟乙烯膜或经过疏水处理的SPG膜。在制备过程中， 可通过选择不同膜孔径的膜来控制产品的粒径大小，常用的微孔膜的孔径 为0.1-100微米。由于不同膜孔径所制备的微球粒径不同，所制备的微球 的平均粒径与膜孔径存在某种线性关系。因此，对于某一特定体系，可以 选择不同孔径大小的膜来制备所需粒径的微球。
在本发明方法的一些实施方案中，所述压力为0-10.0kgf/cm2，优选压 力与所用膜材料、膜孔径、所用分散相性质、所用连续相性质和操作温度 有关。以4℃下，以平均孔径为1.4微米的疏水修饰SPG膜制备壳聚糖- 甘油磷酸钠微球(分散相为壳聚糖-甘油磷酸钠弱酸溶液，壳聚糖在分散相 中的浓度为3.5wt.％，甘油磷酸钠在分散相中的浓度为10.0wt.％，弱酸溶 液为0.1mol/L的醋酸溶液；连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为 60-90℃)的混合物(体积比为5∶7)，连续相中乳化剂为PO-500，浓度为 4wt.％，分散相与连续相的体积比为1∶25)为例，所用压力为5.0kgf/cm2， 预乳液通过微孔膜的速度为1.5m3m-2h-1，所得壳聚糖微球的平均粒径为 870纳米。同样条件下，以平均孔径为2.8微米的疏水修饰SPG膜制备壳 聚糖-甘油磷酸钠微球，所用压力为3.0kgf/cm2，预乳液通过微孔膜的速度 为2.0m3m-2h-1，所得壳聚糖微球的平均粒径为1.6微米。
(5)将步骤4中的乳液升温至所用温敏性材料的LCST以上，使液 滴固化得到微球。
上述制备方法中，步骤1至4中的操作温度低于所用温度敏感材料的 LCST，优选为4℃-25℃；步骤5中的固化温度高于所用温度敏感材料的 LCST，优选为25℃-60℃。在本发明方法的一些实施方案中，当分散相中 含有生物活性物质时，所用的温度敏感性材料为，步骤1至4中的操作温 度优选为4℃，步骤5中的固化温度优选为25℃-37℃。
上述制备方法中，步骤5中液滴的固化可以采用直接将环境温度升高 至高于所用材料的LCST以上进行固化，也可以采用逐步升高环境温度， 直至高于所用材料的相转变温度以上进行固化。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤5中可以在液滴固化后加入共 交联剂，如三聚磷酸钠、环氧氯丙烷、戊二醛、京尼平等。本领域技术人 员可以根据需要，选择合适的共交联剂、加入量及加入方式等。
在本发明方法的一些实施方案中，还可对自固化微球的表面进行修 饰，选择具有靶向作用的小分子或抗体接枝在微球的表面，使微球具有靶 向性，实现对特定部位的靶向释药。本领域技术人员可以根据需要，选择 合适的靶向分子及制备工艺，如交联剂、反应温度和时间等。
在本发明方法的一些实施方案中，自固化微球中还可加入保护剂，有 利于生物活性药物的活性保持。保护剂可选自蔗糖、甘露醇、甘氨酸、赖 氨酸、明胶、环糊精中的一种或几种的复配。本领域技术人员可以根据需 要，选择合适的保护剂种类及加入量等。
在本发明中使用的术语“均匀乳液”或“均一乳液”是指粒径均一 的微球固化前的乳液。
在本发明中使用的术语“膜孔径”是指微孔膜的体积平均孔径。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但是，应当理解，这些举 例说明仅仅是为了便于更好地理解本发明，而绝非对本发明范围的限制。
在实施例中所用的“壳聚糖”分子量为78000Da，脱乙酰度为86％； “壳聚糖季铵盐”分子量为50000Da，季铵取代度为50％；“疏水处理的 SPG膜”是经疏水修饰方法处理后的SPG玻璃膜(SPG TECHNOLOGY Co.，Ltd生产，型号为PJN06L)。例如，化学修饰的疏水SPG膜可经如下 疏水处理得到：将亲水性的SPG膜在纯净水中常温下超声30分钟，然后 放入3％(V/V)的修饰剂KP-18C(产地：日本)的水溶液中，之后减压 (真空度为0.5MPa)超声2h，再在120℃下加热4h。疏水的SPG微孔 膜也可经如下疏水处理得到：将亲水性的SPG膜置于所用油相中浸泡过夜 或超声半小时以上直至膜孔被油相充分湿润。重组人胰岛素(以下简称胰 岛素)由北京甘&李生物技术有限公司提供。
Mastersizer 2000E激光粒度仪(Malvern Instruments，United Kingdom) 用于检测微米级微球的粒径大小及其分布，Zeta电位及粒度分析仪 ZetaPlus(Brookhaven Instuments Corporation，USA)用于检测纳米级微球 的粒径大小及其分布，JEM-6700F扫描电镜(JEOL SEM Co.，Japan)用 于观察微球表面形貌结构，XSZ-H3光学显微镜(重庆光电仪器有限公司) 用于观察微球在水溶液中的粒径大小及分布。
自固化微球的制备按图1所示的步骤制备，该过程在图2所示的装置 中完成。具体方法和步骤说明如下：
1)预乳液的制备
将一定量的温敏性材料和药物加入到一定量的溶剂中，并搅拌使温敏 性材料和药物充分溶解作为分散相；将一种以上的乳化剂溶于连续相中。 将分散相与连续相均冷却到所用温敏性材料的低临界溶解温度以下，将分 散相与连续相迅速混合后通过磁力搅拌、机械搅拌、均质乳化或超声分散 制备得到预乳液。
2)乳液的制备
在图2所示的快速膜乳化装置中采用快速膜乳化法将上述步骤1所得 到的预乳液制备成粒径均一的乳液，整个快速膜乳化装置置于恒温箱内(4- 保温层)。具体过程如下：将上述所得的预乳液加入到预乳液储存器中(5- 预乳液储存器，6-排空阀)，在一定压力(1-氮气进口，2-压力表，3-排空 阀)下迅速通过微孔膜(7-微孔膜)进入到乳液收集器中(8-乳液收集器)， 得到粒径均一的乳液。
3)微球的制备
将上述步骤2所得到的乳液转入到升温装置中，在缓慢的搅拌下程序 升温至或直接使温度恒定在所用温敏性材料的LCST以上，使乳液滴发生 胶凝固化，并进行洗涤，所得微球保存于去离子水中(可添加一定浓度的 抑菌剂)。固化时搅拌速度应适中，既可以使乳液均匀分散，不发生分层， 又不致于打碎液滴。本领域技术人员可以根据需要，选择合适的搅拌速度 和搅拌工艺，如搅拌桨的形状、容器的形状等。在本发明方法的一些实施 方案中，固化时转速为50-300rpm。
自固化微球中药物包埋率的测定方法为：分别准确称量两份5mg冻干 空白微球和一份5mg载药微球，向其中一份空白微球中加入2.5mL去离 子水和2.5mL 2mol/L的HCl溶液(含1mg/mL的NaNO2)并将其标记为 “空白液”；向另一份空白微球中加入2.5mL 100μg/mL的药物溶液和 2.5mL、2mol/L的HCl溶液(含1mg/mL的NaNO2)，将其标记为“标准液”； 在载药微球中加入2.5mL去离子水和2.5mL 2mol/L的HCl溶液(含 1mg/mL的NaNO2)并将其标记为“未知液”。将上述三份微球在120℃ 下回流搅拌，使微球完全降解。以空白液做参比，将空白液和标准液分别 按一定体积混合后以Lowry法测定并制作标准曲线，并以空白液做参比采 用相同方法测定未知液吸光值。通过标准曲线计算未知液中药物含量。药 物包埋率计算公式为：药物包埋率＝(实测药物装载率/理论药物装载率) ×100％。
微球中药物活性检测方法为：精确称取20mg载药微球，将其分散在 10mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下120rpm下振荡8h，10000rpm 下离心取上清液，用Lowry法测定上清液中药物含量。并采用高效液相色 谱法测定上清液中药物活性，测定时采用线性梯度洗脱，流动相A为0.1 ％的三氟乙酸水溶液，流动相B为含0.1％三氟乙酸的乙腈，即在20min 内将80％A和20％B线性梯度变化为50％A和50％B，洗脱流速为1 mL/min。将上清液中的药物流出曲线与标准的药物溶液进行对照，根据峰 面积计算药物活性大小。药物活性保留率计算公式为：
药物活性保留率＝(实测微球中包埋药物的活性/等量标准药物的活性) ×100％
实施例1
膜的疏水修饰：将孔径为1.4μm的亲水性SPG膜置于液体石蜡与石油 醚(石油醚沸程为60-90℃，体积比5∶7)的混合油相中浸泡过夜使膜孔充 分湿润。
分散相制备：温敏性材料选用壳聚糖-甘油磷酸盐体系，其制备方法为： 准确称取一定量的壳聚糖溶于9mL醋酸溶液(0.1mol/L)中，磁力搅拌下 使其充分溶解得到壳聚糖醋酸溶液；另将一定量的甘油磷酸钠溶解于1mL 去离子水中。将壳聚糖醋酸溶液及甘油磷酸钠溶液分别在4℃下保温 10min后，将甘油磷酸钠溶液缓慢滴加至壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌 (300rpm，10min)将其混合均匀。将此溶液在20000rpm下离心除去不溶 性杂质，保留上清液作为分散相备用。壳聚糖在分散相中的浓度为 3.5wt.％，甘油磷酸钠在分散相中的浓度为10.0wt.％，其LCST为28℃。
连续相制备：将油溶性乳化剂PO-500加入到60mL的液体石蜡和石油 醚(石油醚沸程为60-90℃)的混合物(体积比为5∶7)中，其浓度为4wt.％， 搅拌至完全溶解，在4℃下保温10min作为连续相。
乳液制备：在4℃下，将2mL的分散相与50mL的连续相混合并用均 质乳化器在6000rpm下乳化1min，形成预乳液。将所得预乳液迅速倒入 快速膜乳化装置的预乳液储存器中，在5.0kgf/cm2的氮气压力下，使其快 速通过疏水的SPG微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，将所得乳 液作为预乳液在5.0kgf/cm2的氮气压力下再次通过SPG微孔膜，反复乳化 五次，最终得到粒径均一的W/O型乳液；乳化过程耗时约10min，乳化完 毕后，将W/O型乳液放入35℃的水浴中，机械搅拌(200rpm)下固化 1h。固化反应结束后，在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离 子水洗涤，得到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径 和粒径分布采用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，在水中微球的平均 直径为870纳米，C.V.值为13.8％，光学显微镜照片如图3所示，扫描电 镜照片如图4所示，结果表明所制备的壳聚糖微球粒径均一，表面疏松多 孔。
实施例2
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 用SPG膜的膜孔径为10.2微米，膜的疏水修饰步骤为：将亲水性的SPG 膜在纯净水中常温下超声30分钟，然后放入3％(V/V)的修饰剂KP-18C (产地：日本)的水溶液中，之后减压(真空度为0.5MPa)超声2h，再 在120℃下加热4h。
分散相：壳聚糖在分散相中的浓度为0.8wt.％，甘油磷酸钠在分散相 中的浓度为8.0wt.％，溶剂为0.1mol/L的盐酸溶液，其LCST为60℃，
连续相：连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为90-120℃)的混 合物(体积比为2∶1)中，乳化剂为聚氧乙烯氢化蓖麻油，在连续相中的 浓度为1wt.％。
分散相与连续相的体积比为1∶200。过膜压力为1.0kgf/cm2，过膜4次。 固化反应时的温度为60℃，固化时间为3h。所得壳聚糖微球的平均粒径 为5.11微米，C.V.为9.81％，结果表明所制备得到的壳聚糖微球粒径比较 均一。
实施例3
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，所不同的 是分散相的配方：温敏性材料选用壳聚糖季铵盐-甘油磷酸盐体系，其制备 方法为：准确称取一定量的壳聚糖季铵盐溶于9mL乳酸溶液(0.1mol/L) 中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖季铵盐乳酸溶液；另将一定量的 甘油磷酸钠溶解于1mL去离子水中。将壳聚糖季铵盐乳酸溶液及甘油磷 酸钠溶液分别在4℃下保温10min后，将甘油磷酸钠溶液缓慢滴加至壳聚 糖季铵盐乳酸溶液中，磁力搅拌(300rpm，10min)将其混合均匀。将此 溶液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为分散相备用。 壳聚糖季铵盐在分散相中的浓度为3.5wt.％，甘油磷酸钠在分散相中的浓 度为10.0wt.％，其LCST为25℃。连续相为豆油，乳化剂为失水山梨醇三 硬脂酸酯，在连续相中的浓度为10wt.％，分散相与连续相的体积比为 1∶100。所用疏水SPG膜的孔径为50.2微米，过膜压力为0.2kgf/cm2，过 膜三次。固化反应时的温度由4℃缓慢升高至40℃，升温速率为1℃/min， 当温度升至40℃时，保温30min。所得壳聚糖季铵盐微球的平均粒径为 37微米，C.V.为19.21％。
实施例4
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，所不同的 是分散相的配方：温敏性材料选用壳聚糖季铵盐-聚乙二醇-甘油磷酸盐体 系，其制备方法为：准确称取一定量的壳聚糖季铵盐溶于9mL盐酸溶液 (0.1mol/L)中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖季铵盐盐酸溶液； 另将一定量的甘油磷酸钠与聚乙二醇6000溶解于1mL去离子水中。将壳 聚糖季铵盐盐酸溶液及甘油磷酸钠与聚乙二醇6000水溶液分别在4℃下 保温10min后，将甘油磷酸钠与聚乙二醇6000水溶液缓慢滴加至壳聚糖 季铵盐盐酸溶液中，磁力搅拌(400rpm，10min)将其混合均匀。将此溶 液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液作为分散相备用。壳 聚糖季铵盐在分散相中的浓度为2.5wt.％，甘油磷酸钠在分散相中的浓度 为3.0wt.％，聚乙二醇6000在分散相中的浓度为3.0wt.％，其LCST为 28℃。连续相为橄榄油，乳化剂为失水山梨醇单油酸酯，在连续相中的浓 度为5wt.％，分散相与连续相的体积比为1∶50。所用疏水SPG膜的孔径为 29.5微米，过膜压力为0.4kgf/cm2，过膜5次。固化反应时的温度由4℃ 缓慢升高至40℃，升温速率为1℃/min，当温度升至40℃时，保温30min。 所得壳聚糖季铵盐微球的平均粒径为14.2微米，C.V.为17.58％。
实施例5
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，所不同的是分散 相的配方：温敏性材料选用聚乙二醇-壳聚糖共聚物体系，其制备方法为： 准确称取一定量的聚乙二醇-壳聚糖共聚物加入9mL去离子水中，磁力搅 拌(400rpm，10min)下使其充分溶解，冷却到4℃作为分散相备用。聚 乙二醇-壳聚糖共聚物在分散相中的浓度为3.0wt.％，其LCST为25℃。连 续相为葵花子油，乳化剂为失水山梨醇倍半油酸酯，在连续相中的浓度为 0.5wt.％，分散相与连续相的体积比为1∶1。所用疏水SPG膜的孔径为11.2 微米，过膜压力为0.8kgf/cm2，过膜4次。固化反应时的温度为30℃，保 温1h。所得壳聚糖微球的平均粒径为7.6微米，C.V.为16.24％。
实施例6
采用与实施例1相同的装置和方法制备泊洛沙姆微球，其中不同的是 温敏性材料选用泊洛沙姆体系，其制备方法为：称取一定量泊洛沙姆407 加入到9mL去离子水中，磁力搅拌(400rpm，10min)下使充分溶解，冷 却到4℃作为分散相备用。泊洛沙姆407在分散相中的浓度为20wt.％， 其LCST为37℃。连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60-90℃) 的混合物(体积比为1∶2)中，乳化剂为PO-310，在连续相中的浓度为 0.1wt.％，分散相与连续相的体积比为1∶50。所用疏水SPG膜的孔径为5.2 微米，过膜压力为2.0kgf/cm2，过膜2次。固化反应时的温度为50℃，保 温1h。由于泊洛沙姆为可逆性温度敏感材料，因此在升温固化后需要进行 再次交联。向反应体系中加入三乙胺2mL，缓慢加入甲基丙烯酰氯5mL， 反应2h后，通氮气保护，加入引发剂(NH4)2S2O8和还原剂NaHSO3溶 液，反应30min。在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水 洗涤，得到泊洛沙姆微球，并将其保存在去离子水中。泊洛沙姆微球的平 均粒径为3.1微米，C.V.为15.33％。
实施例7
采用与实施例1相同的装置和方法制备聚乙二醇-聚乙醇酸微球，其中 不同的是温敏性材料选用聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物体系，其制备方法为： 称取一定量聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物加入到9mL Tris-HCl(pH＝8.6)的缓 冲液中，磁力搅拌(400rpm，10min)下使充分溶解，冷却到4℃作为分 散相备用。聚乙二醇-聚乙醇酸共聚物在分散相中的浓度为35wt.％，其 LCST为40℃。连续相为液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60-90℃)的 混合物(体积比为3∶7)中，乳化剂为PO-500，在连续相中的浓度为8.0wt.％， 分散相与连续相的体积比为1∶20。所用膜为孔径为10.8微米的聚四氟乙烯 膜，过膜压力为0.8kgf/cm2，过膜1次。固化反应时的温度为60℃，保温 1h。所得聚乙二醇-聚乙醇酸微球的平均粒径为8.6微米，C.V.为19.42％。
实施例8
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖-纤维素微球，其中不同 的是温敏性材料选用壳聚糖-甘油磷酸盐-羟乙基纤维素混合物体系，其制 备方法为：称取一定量壳聚糖加入到9mL醋酸溶液(0.1mol/L)中，另将 一定量的甘油磷酸钠与羟乙基纤维素溶解于1mL去离子水中。将壳聚糖 酸溶液及甘油磷酸钠与羟乙基纤维素水溶液分别在4℃下保温10min后， 将甘油磷酸钠与羟乙基纤维素水溶液缓慢滴加至壳聚糖酸溶液中，磁力搅 拌(400rpm，10min)将其混合均匀。将此溶液在20000rpm下离心除去不 溶性杂质，保留上清液作为分散相备用。壳聚糖、甘油磷酸钠、羟乙基纤 维素在分散相中的浓度分别为1.2wt.％、3.6wt.％、0.5wt.％，其LCST为 40℃。所用连续相为石油醚(沸程为90-120℃)，乳化剂为失水山梨醇三 油酸酯，在连续相中的浓度为10.0wt.％，分散相与连续相的体积比为 1∶150。所用膜为孔径为1.4微米的聚丙烯膜，过膜压力为4.8kgf/cm2，过 膜3次。固化反应时的温度为60℃，保温1h。所得壳聚糖-纤维素微球的 平均粒径为902纳米，C.V.为14.68％。
实施例9
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 用连续相为液体石蜡和石油醚(沸程60-90℃)的混合物(体积比为11∶1)， 油相乳化剂为PO-310，在连续相中的浓度为5wt.％。所用膜为经过疏水处 理的孔径为0.8微米和2.8微米的SPG膜。乳液的制备方法为：在4℃下， 将2mL的分散相与50mL的连续相混合并用均质乳化器在6000rpm下乳 化1min，形成预乳液。将所得预乳液迅速倒入快速膜乳化装置的预乳液储 存器中，在3.0kgf/cm2的氮气压力下，使其快速通过2.8微米的SPG微孔 膜，将所得的乳液作为预乳液在5.0kgf/cm2的氮气压力下再次通过0.8微 米的SPG微孔膜，最终得到粒径均一的W/O型乳液，乳化完毕后，将 W/O型乳液放入37℃的水浴中，机械搅拌(200rpm)下固化1h。固化反 应结束后，在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤， 得到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。所得壳聚糖微球的平均粒径 为670纳米，C.V.值为11.2％。
实施例10
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 用膜为孔径为11.8微米的聚乙烯膜，过膜4次，操作压力为0.65kgf/cm2。 得到粒径均一的W/O型乳液后，将W/O型乳液放入37℃的水浴中，机 械搅拌(200rpm)下固化1h。然后向乳液中加入一定量的三聚磷酸钠乳 液，其中三聚磷酸钠乳液的制备方法为：将一定量的三聚磷酸钠溶于1mL 去离子水中，加入到10mL的液体石蜡和石油醚(石油醚沸程为60-90℃) 的混合物(体积比为5∶7，含有4wt.％的PO-500)，用均质乳化器在6000rpm 下乳化1min，形成三聚磷酸钠乳液。加入三聚磷酸钠的用量依据如下比例 计算得到，即三聚磷酸钠上的磷酸基与壳聚糖上氨基的摩尔比为2∶1。机 械搅拌(200rpm)下继续固化1h。固化反应结束后，在10000rpm下离心， 依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳聚糖微球，并将其保存在去 离子水中。所得壳聚糖微球的平均粒径为7.7微米，C.V.值为14.71％。
实施例11
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 使用的SPG微孔膜的孔径为0.8微米，过膜压力为7.0kgf/cm2，所得壳聚 糖微球的平均粒径为629纳米，C.V.值19.66％。
实施例12
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 使用的SPG微孔膜的孔径为2.8微米，过膜压力为3.0kgf/cm2，所得壳聚 糖微球的平均粒径为1.6微米，C.V.值18.68％。
实施例13
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 使用的SPG微孔膜的孔径为9.2微米，过膜压力为1.5kgf/cm2，所得壳聚 糖微球的平均粒径为6.8微米，C.V.值17.28％。
实施例14
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是所 使用的SPG微孔膜的孔径为50.2微米，过膜压力为0.2kgf/cm2，所得壳聚 糖微球的平均粒径为24.5微米，C.V.值19.24％。
实施例1、实施例11、实施例12、实施例13和实施例14所制备的壳 聚糖微球平均粒径与SPG膜孔径之间的关系如图5所示。由图5可以看出 壳聚糖微球平均粒径与SPG膜孔径之间基本呈线性关系。
实施例15
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是在 分散相中加入生物活性物质-胰岛素和保护剂-蔗糖，其制备方法为：准确 称取一定量的胰岛素和蔗糖，加入到壳聚糖-甘油磷酸钠混合溶液中，磁力 搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解，冷却到4℃作为分散相备用。蔗 糖在分散相中的浓度为0.5wt.％，胰岛素在分散相中的浓度为100.0mg/mL。 所得壳聚糖微球的平均粒径为966纳米，C.V.为15.4％，药物包埋率为 94.4％，活性保留率为97.3％。
实施例16
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，其中不同的是在 分散相中加入生物活性物质-胰岛素和保护剂-甘露醇，其制备方法为：准 确称取一定量的胰岛素和甘露醇，加入到壳聚糖-甘油磷酸钠混合溶液中， 磁力搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解，冷却到4℃作为分散相备用。 蔗糖在分散相中的浓度为0.5wt.％，胰岛素在分散相中的浓度为0.5mg/mL。 所得壳聚糖微球的平均粒径为921纳米，C.V.为16.7％，药物包埋率为 97.2％，活性保留率为93.9％。
实施例17
采用与实施例3相同的装置和方法制备壳聚糖季铵盐微球，其中不同 的是在分散相中加入生物活性物质-胰岛素和保护剂-甘氨酸，其制备方法 为：准确称取一定量的胰岛素和甘氨酸，加入到壳聚糖季铵盐-甘油磷酸钠 混合溶液中，磁力搅拌(150rpm，20min)使其充分溶解，冷却到4℃作 为分散相备用。甘氨酸在分散相中的浓度为1.0wt.％，胰岛素在分散相中 的浓度为5.0mg/mL。所得壳聚糖季铵盐微球的平均粒径为952纳米，C.V. 为16.2％，药物包埋率为96.7％，活性保留率为95.1％。
实施例18
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，准确称取1g制 备得到的壳聚糖微球，分散在10mL去离子水溶液中，加入10mL含有1g 甘草次酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液，磁力搅拌(200rpm)下向混合体系 中缓慢滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的水溶液，室温下 反应24h后，将反应体系倒入800mL丙酮中，静置24h，在10000rpm下 离心，依次用丙酮、乙醇、乙醚、去离子水离心洗涤，得到具有肝靶向效 果的甘草次酸修饰的壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。
实施例19
采用与实施例1相同的装置和方法制备壳聚糖微球，准确称取1g制 备得到的壳聚糖微球，加入10mL含有10mg胰岛素的磷酸盐缓冲溶液 (pH＝8.0)中，4℃下振荡(120rpm，24h)，10000rpm下离心，用去离子 水洗涤三次，得到吸附有胰岛素的壳聚糖微球。药物包埋率为82.7％，活 性保留率为97.1％。
比较例1
采用与实施例15相同的配方，采用机械搅拌法制备壳聚糖微球：
乳液制备：在4℃下，将2mL的分散相倒入50mL的连续相中， 1000rpm下磁力搅拌30min，得到W/O型乳液；乳化完毕后，将W/O型 乳液放入35℃的水浴中，机械搅拌(200rpm)下固化1h。固化反应结束 后，在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳 聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激 光粒度仪测量，在水中微球的平均直径为27.2微米，C.V.值为56.2％，光 学显微镜照片如图6所示，药物包埋率为53.1％，活性保留率为60.1％。 结果表明所制备的壳聚糖微球粒径非常不均一，大小乳液滴间的破裂和合 并造成药物包埋率较低，并且机械搅拌法中所用的剪切力较大，导致药物 活性保留率较低。
比较例2
采用与实施例15相同的配方，采用均质乳化法制备壳聚糖微球：
乳液制备：在4℃下，将2mL的分散相倒入50mL的连续相中， 3000rpm下均质乳化2min，得到W/O型乳液；乳化完毕后，将W/O型乳 液放入35℃的水浴中，机械搅拌(200rpm)下固化1h。固化反应结束后， 在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和去离子水洗涤，得到壳聚糖 微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采用激光粒 度仪测量，在水中微球的平均直径为11.2微米，C.V.值为37.1％，光学显 微镜照片如图7所示，药物包埋率为42.9％，活性保留率为37.2％。结果 表明所制备的壳聚糖微球粒径非常不均一，大小乳液滴间的破裂和合并造 成药物包埋率较低，并且均质乳化法中所用的剪切力非常大，导致药物活 性保留率较低。
比较例3
采用与实施例15相同的配方，采用传统膜乳化法制备壳聚糖微球：
乳液制备：在4℃下，将5mL分散相加入到如图8所示的传统膜乳 化装置的分散相储存器中(4’-分散相储存器)，氮气加压(1-氮气进口， 2-压力表，3-排空阀，压力为3.5kgf/cm2)，使分散相缓缓通过SPG膜被压 入到50mL连续相中(5’-连续相储存器，6-排空阀，7-微孔膜，8’-连续相， 9-磁子，10-磁力搅拌器)，得到W/O型乳液；待所有的分散相都被压完后 (约需4h)，将W/O型乳液放入35℃的水浴中，机械搅拌(200rpm)下 固化1h。固化反应结束后，在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和 去离子水洗涤，得到壳聚糖微球，并将其保存在去离子水中。微球的平均 粒径和粒径分布采用激光粒度仪测量，在水中微球的平均直径为3.4微米， C.V.值为17.9％，光学显微镜镜照片如图9所示，药物包埋率为75.9％， 活性保留率为97.4％。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径较为均一，但粒 径偏大，乳化耗时较长，所得到的壳聚糖微球较少。由于这一方法的制备 效率较低，药物在较长时间的乳化过程中容易从液滴中向外泄漏，并且得 到的微球产量较少，造成药物包埋率较低。
比较例4
采用与实施例1相同的装置和方法，采用快速膜乳化法制备戊二醛交 联的壳聚糖微球：
膜的疏水修饰：将孔径为1.4微米的亲水性SPG玻璃膜置于液体石蜡 与石油醚按体积比5∶7的混合油相中浸泡过夜或超声半小时使膜孔充分湿 润。
分散相制备：准确称取一定量的壳聚糖溶于9mL 0.1mol/L的醋酸水溶 液中，磁力搅拌下使其充分溶解得到壳聚糖醋酸水溶液，壳聚糖浓度为 0.5wt.％，将此溶液在20000rpm下离心除去不溶性杂质，保留上清液。准 确称取一定量的胰岛素和蔗糖，加入到壳聚糖醋酸溶液中，磁力搅拌 (150rpm，20min)使其充分溶解，冷却到4℃作为分散相备用。蔗糖在 分散相中的浓度为0.5wt.％，胰岛素在分散相中的浓度为5.0mg/mL。
连续相制备：将油溶性乳化剂PO-500加入到60mL的液体石蜡和石 油醚的混合物(体积比为5∶7)中，其浓度为4wt.％，搅拌至完全溶解作 为连续相。
乳液制备：将2mL的分散相与连续相混合并用均质乳化器在6000rpm 下乳化1分钟，形成预乳液。然后，将所得乳液迅速倒入如图2所示的膜 乳化装置中，在5.0kgf/cm2的氮气压力下，使其快速通过孔径均一的SPG 微孔膜，得到粒径比较均一的W/O型乳液，过膜5次，最终得到粒径均 一的W/O型乳液；乳化完毕，向乳液中加入一定量戊二醛饱和的甲苯溶 液，其中戊二醛的用量依据如下比例计算得到，即戊二醛上的醛基与壳聚 糖上氨基的摩尔比为2∶1。35℃下交联反应10h，交联反应的搅拌速率为 500rpm。交联反应结束后，在10000rpm下离心，依次用石油醚、乙醇和 去离子水洗涤，并将其保存在去离子水中。微球的平均粒径和粒径分布采 用Zeta电位及粒度分析仪ZetaPlus测量，在水中微球的平均直径为360.0 纳米，C.V.值为13.8％，扫描电镜照片如图10所示，药物包埋率为89.9％， 活性保留率为64.7％。结果表明所制备的壳聚糖微球粒径均一，由于共价 交联作用力较强，因此壳聚糖微球粒径偏小，表面非常致密光滑，不利于 生物活性大分子的扩散。并且在制备过程中，戊二醛上的醛基也可以和药 物上的氨基反应，导致药物活性降低。
通过以上的描述，本领域技术人员将想到本发明的许多改动和其它实 施方案，并根据本发明教导预知其益处。因此，应当理解，以上实施方案 和实施例并未限制本发明，并且对其进行的改动和其它的实施方案也包括 在所附权利要求的范围内。虽然本文使用特定术语，但是它们仅仅以其一 般的和描述性意义使用，并不是为了限制权利要求中定义的本发明的范 围。