本发明涉及包含由乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）组成的乙型肝炎效价（hepatitisBvalenceconsistingofthehepatitisBvirussurfaceantigen）和由其荚膜多糖——称为多聚核糖磷酸盐（PRP）组成的B型流感嗜血杆菌效价(HBsAg)）（Haemophilusinfluenzaetypebvalence,consistingofitscapsularpolysaccharide,calledpolyribosylribitolphosphate(PRP)）的疫苗组合的领域，所述荚膜多糖为了有效用于两岁以下儿童而缀合到载体蛋白例如破伤风蛋白上。
此类组合（其意在施用于幼儿）通常包含能够在单一操作中针对几种疾病接种的其它抗原，以及铝基佐剂。
因此，专利申请WO99/13906公开了一种疫苗组合物，如第13页中所述，包含针对白喉、破伤风、脊髓灰质炎、百日咳、乙型肝炎和B型流感嗜血杆菌感染的抗原。这些抗原的一部分必须吸附到铝盐上以便是免疫原性的。这尤其是具有乙型肝炎表面抗原或HBsAg的情况。
但是，如申请WO99/13906的第12页上所示，由缀合到破伤风蛋白上的荚膜多糖组成的该Hib效价当其吸附到铝盐上时倾向于经时（aucoursdutemps）丧失其免疫原性。为了避免这一缺点，现有技术中提出的解决方案是，如已经在在线申请PCT/FR96/00791中建议的那样，添加阴离子，特别是磷酸根、碳酸根或柠檬酸根离子。
但是，本发明的作者已经注意到，虽然添加阴离子特别是添加磷酸根或碳酸根实际上能够防止PRP-T吸附到羟基氧化铝（AlOOH）上，并因此经时保持其免疫原性，这种添加仍具有解吸附乙型肝炎表面抗原的缺点（当后者本身已经吸附到羟基氧化铝上时）。
因此需要寻找一种制备包含羟基氧化铝的疫苗组合的方法，其中该乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上，而Hib抗原保持未吸附。
为此，本发明的主题是用于制备液体疫苗组合的方法，所述液体疫苗组合包含至少：
-一种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（hepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)），
-一种由缀合到载体蛋白上的荚膜多糖组成的B型流感嗜血杆菌（Hib）抗原（Haemophilusinfluenzaetypeb(Hib)antigenconsistingofcapsularpolysaccharideconjugatedtoacarrierprotein），
-羟基氧化铝（AlOOH），
其中该乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上，而该Hib抗原保持未吸附，
其中：
-该乙型肝炎表面抗原吸附到AlOOH上以获得AlOOH/HBsAg复合物，
-所述AlOOH/HBsAg复合物在浓度为至少100mg/l的阳离子氨基酸和浓度为35至45mMol/l磷酸根离子的存在下与该Hib抗原混合。
借助本发明的方法，有可能在保持乙型肝炎表面抗原在羟基氧化铝上的吸附和保持Hib抗原的未吸附之间实现所需平衡。
根据本发明的一个特定实施方案，通过在搅拌下混合AlOOH的悬浮液与HBsAg的悬浮液至少4小时，优选至少12小时，优选20至24小时将该HBsAg抗原吸附到铝上。
根据本发明的一个特定实施方案，在与Hib抗原混合前将阳离子氨基酸添加到所述AlOOH/HBsAg复合物中。
根据本发明的一个替代实施方案，在与AlOOH/HBsAg复合物混合前将阳离子氨基酸添加到所述Hib抗原中。
根据本发明的一个实施方案，在与Hib抗原混合前将磷酸根离子添加到所述AlOOH/HBsAg复合物中。
根据本发明的一个实施方案，在与Hib抗原混合前将包含AlOOH/HBsAg复合物的制剂的pH值调节至7.1±0.1。
本发明的主题还是根据所要求保护的方法获得的疫苗组合，并包含至少：
-该乙型肝炎表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen），
-白喉毒素D形式的白喉抗原（diphtheriaantigenintheformofdiphtheriatoxinD），
-破伤风毒素T形式的破伤风抗原（tetanusantigenintheformoftetanustoxinT），
-纯化毒素（PTxd）和丝状血凝素（FHA）形式的百日咳抗原（whoopingcoughantigensintheformofPurifiedToxin(PTxd)andofFilamentousHemagglutinin(FHA)），
-缀合到破伤风蛋白上的多聚核糖磷酸盐（PRP-T）形式的B型流感嗜血杆菌抗原（Haemophilusinfluenzaetypebantigen,intheformofpolyribosylribitolphosphateconjugatedtothetetanusprotein(PRP-T)），
-灭活的1型、2型和3型病毒形式的脊髓灰质炎抗原（polioantigensintheformofinactivatedtype1,2and3viruses）。
此类疫苗组合物具有为液体形式的优点，由此避免了获取冻干物的操作；其已经被证实足够稳定以保持免疫原性直到使用时，即使在其制造日期后36个月。
根据本发明，该疫苗组合物包含乙型肝炎表面抗原（HBsAg）。该抗原特别是乙型肝炎表面抗原，如存在于RecombivaxHB?疫苗，或任何其它乙型肝炎疫苗中的抗原。其特别可以是通过已经根据Crucell开发的技术修饰的多形汉逊酵母（Hansenulapolymorphayeast）发酵获得的重组抗原，如存在于Hepavax-Gene?疫苗中的重组抗原。对本发明的目的而言，存在于0.5毫升剂量中的HBsAg的量有利地为5至15μg，特别是10μg。
根据本发明，该疫苗组合物包含B型流感嗜血杆菌（Hib）抗原（Haemophilusinfluenzaetypeb(Hib)antigen）。这种抗原由缀合到（conjuguéà）载体蛋白上的细菌的荚膜多糖或多聚核糖磷酸盐（PRP）组成。该载体蛋白可以是疫苗领域的这一方面中使用的任何蛋白质。其可以是例如白喉毒素D（diphtheriatoxinD）、破伤风毒素T（tetanustoxinT）、流感嗜血杆菌脂蛋白D（HaemophilusinfluenzaelipoproteinD）、CRM197或脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白（OMP）（CRM197ortheN.meningitidisoutermembraneprotein(OMP)）。优选使用破伤风蛋白以获得PRP-T缀合物。对本发明的目的而言，该PRP-T缀合物可以以每0.5ml剂量1至30μg的PRP；有利地为每剂量5至25μg的PRP；优选每剂量10至15μg的PRP；完全优选每剂量10至12μg的PRP和更特别为12μg的PRP的比例存在，缀合到22-36μg的破伤风蛋白上。
根据本发明，该疫苗组合物包含羟基氧化铝AlOOH。这种铝盐非常普遍地被误称为氢氧化铝。可用于本发明的目的的AlOOH可以是例如由BrenntagAG销售的AlOOH盐，或来自ReheisCorp.（BerkeleyHeights,NJ）的RehydragelHPA，尽管这两种佐剂各自的制造方法不同。计算所用的AlOOH的量以便能够实现令人满意的免疫反应；这尤其取决于存在于该组合物中的抗原的数量与性质以及这些抗原各自的量。
纯粹作为信息，HBsAg在AlOOH上的最大吸附为每毫克铝大约780μg蛋白质（通常，AlOOH的量以铝Al3+的量表示）。对于包含10μg的HBsAg的疫苗剂量，不含有任何其它附加抗原，13μg的铝因此是足够的，但是当添加其它抗原时该量不足以获得所需的功效。而且，取决于一种或多种附加抗原的加入，可以令10μg的HBsAg与0.01毫克至1.25毫克的铝接触，这是欧洲药典推荐的最大量。
例如，0.5毫升剂量的包含白喉、破伤风、百日咳和乙型肝炎抗原的儿科疫苗可以常规地含有0.5至0.7毫克的铝，优选大约0.6毫克的铝。
根据本发明，该乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上，这意味着该组合物中存在的这种抗原的总量的至少60%、优选至少65%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少85%、优选至少90%、优选至少95%以吸附形式存在。
根据本发明，该Hib抗原保持未吸附在AlOOH上，这意味着该组合物中存在的这种抗原的总量的至少65%、优选至少70%、优选至少75%以未吸附形式存在。
根据本发明，从组合物制造日期起，当储存温度为5±3℃时，该乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上和Hib抗原保持未吸附的持续时间为至少3个月、优选至少6个月、优选至少12个月、优选至少18个月、优选至少24个月、更优选至少36个月。优选地，吸附或未吸附抗原的量是经时稳定的，但是也会发生改变，条件是其保持在可接受限度内。由此，当组合物中存在的HBsAg总量的至少85%吸附在AlOOH上三个月，自该组合物（该组合物储存在5±3℃下）的制造日期起，在一年后并且仍在相同储存条件下，该组合物中存在的HBsAg总量的80%完全有可能保持吸附。
为了评估吸附的抗原的量，本领域技术人员可以使用任何已知方法。
关于HBsAg的吸附百分比的测定，有可能根据欧洲药典2.7.1定义的规则采用夹心ELISA法。简而言之，在96孔板的孔中，通过IgM类型的抗-HBsAg一级单克隆抗体捕获HBsAg。由此结合的HBsAg用IgG类型的抗HBsAg二级单克隆抗体涂布，该二级抗体本身可以通过过氧化物酶偶联抗IgG多克隆抗体来检测。用于过氧化物酶的发色底物四甲基联苯胺（TMB）充当显影剂。当其加入时，颜色显现，其强度与孔中捕获的HBsAg的量成正比。根据欧洲药典5.3.3中描述的平行线方法分析结果。由总HBsAg含量和未吸附HBsAg含量的测定结果获得吸附百分比。
关于未吸附的PRP-T的量，可以通过HPAEC-PAD（高性能离子交换色谱法-脉冲安培检测）进行评估。
根据本发明的方法，该乙型肝炎表面抗原吸附到AlOOH上。该步骤可以通过以下方法进行：在不存在任何其它抗原的情况下令该乙型肝炎表面抗原与该AlOOH接触并令该乙型肝炎表面抗原吸附到该AlOOH上至少4小时、优选至少12小时、完全优选20至24小时以获得含有AlOOH/HBsAg复合物的制剂。根据本发明，该吸附可以在不存在磷酸根离子的情况下进行。通过延长该乙型肝炎表面抗原与该AlOOH之间的接触时间所追求的目的包括使静电相互作用最大化并促进稳定的相互作用，这由此通过配体交换来导致吸附。这种接触有利地在搅拌下持续。
根据本发明的方法，该AlOOH/HBsAg复合物与该Hib抗原在阳离子氨基酸和磷酸根离子的存在下混合。
对本发明的目的而言，术语“阳离子氨基酸”意在指其pHi高于该疫苗组合物的pH并因此在该疫苗的pH值下为阳离子形式的氨基酸；这些特别是赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）或组氨酸（His）；这些氨基酸各自可以单独使用，以混合物形式结对使用（Lys+Arg；Lys+His；Arg+His）或所有三种一起使用（Lys+Arg+His）。根据一个特定实施方案，该阳离子氨基酸可以以二肽形式缔合。特别可以提及二肽Lys-Lys、Lys-Arg、Lys-His、Arg-Arg、Arg-Lys、Arg-His、His-His、His-Lys和His-Arg。或者，用于本发明的目的的二肽可以由阳离子氨基酸和选自Ala、Val、Leu、Iso、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asp和Gln的不带电荷的氨基酸组成。因此，在实践中，可以使用含有一种或多种游离和/或二肽形式的阳离子氨基酸的制剂。还有可能使用与其它氨基酸的混合物形式的以所需量包含阳离子氨基酸的氨基酸制剂。为了在添加氨基酸过程中不会产生过大的pH值降低，有可能设想在将其添加到该AlOOH/HBsAg复合物之前通过碱，特别是氢氧化钠提高包含该氨基酸的制剂的pH值。
根据本发明，最终存在于该疫苗组合物中的阳离子氨基酸的量必须为至少100mg/l，有利地为至少300mg/l，有利地为至少400mg/l，完全优选为至少500mg/l。没有关键的最大剂量。但是，最大量优选为至多2mg/ml，更优选至多1mg/ml，更优选至多800μg/ml，完全优选至多700μg/ml。当计算要添加的阳离子氨基酸的量时，应当考虑可以通过介质引入的阳离子氨基酸，在所述介质中存在除HBsAg与Hib抗原之外的抗原。
根据该方法的一个替代方案，有可能相对于该Hib荚膜多糖的重量确定阳离子氨基酸的量，并且有可能提供1:4至1:100、有利地为1:10至1:80、优选1:15至1:60或特别优选为1:20至1:30或40的Hib多糖/阳离子氨基酸重量比。
根据本发明的方法，在阳离子氨基酸的存在下，但也在磷酸根离子的存在下将该AlOOH/HBsAg复合物与该Hib抗原混合。根据本发明的一个实施方案，在AlOOH/HBsAg复合物与Hib抗原接触前将该磷酸根离子添加到该AlOOH/HBsAg复合物中。该磷酸根离子可能例如通过添加磷酸一氢钠或磷酸一氢钾或二者的混合物来引入。计算磷酸根离子的量以使得最大量的乙型肝炎表面抗原保持吸附在AlOOH上并同时避免Hib抗原的吸附。该量随存在的抗原的性质与数量而改变，特别是随HBsAg与Hib抗原之外的抗原而改变。
因此，对包含通常用于儿科疫苗的抗原——即除HBsAg与Hib抗原之外包含白喉、破伤风和百日咳抗原的疫苗组合，有利的是添加磷酸根离子以使得最终获得的疫苗组合物中磷酸根离子的浓度至少等于35mMol/l，更特别为35至45mMol/l，包括端点；优选38至44mMol/l，包括端点；完全优选38至42mMol/l，包括端点。根据一个优选的实施方案，最终获得的疫苗组合物中磷酸根离子的浓度为40mMol/l。
根据一个替代实施方案，磷酸根离子以使得它们以35至38mMol/l（包括端点）的最终浓度存在于该疫苗组合物中的量添加。另外，这还可以通过添加碳酸根离子（但是以有限量）来完成，因为事实上已经注意到过量的碳酸根离子是不利的。有利的是，它们可以以使得它们以小于或等于10mMol/l的最终浓度存在于该疫苗组合物中的量添加。
为了避免可能使HBsAg脱稳定化并促进其解吸的过度离子冲击，建议以几次（例如2次）不同的操作（步骤）添加磷酸根离子。由此，磷酸根离子可以以能够实现20至30mMol/l（包括端点）的最终浓度的量在第一操作中添加，；随后以能够实现上文规定的最终浓度的量在第二操作中添加。
根据本发明的方法的一个优选实施方案，在将Hib抗原与AlOOH/HBsAg复合物混合之前另外将获得的制剂的pH调节至7.1±0.1。事实上已经注意到，此类pH值对保持Hib抗原为未吸附状态具有积极效果。
根据一个特定实施方案，在混合阶段后另外将该pH值调节至7.1±0.1。
由此，通过本发明的方法可能获得疫苗组合物，其中：
（i）自组合物制造日期起，在5±3℃的温度下储存的组合物中存在的乙型肝炎表面抗原总量的至少60%或80%，优选至少85%吸附在AlOOH上至少3个月；和
（ii）组合物中存在的Hib抗原总量的至少65%、70%或75%未吸附在AlOOH上。
术语“AlOOH/HBsAg复合物”应解释为是指该复合物至少包含吸附在AlOOH上的HBsAg抗原。该复合物可以含有其它抗原，无论是否具体说明。
一种或多种附加抗原可另外用于构成该复合物。它们特别可以是白喉类毒素（D）（diphtheriatoxoid(D)）、破伤风类毒素（T）（tetanustoxoid(T)）、百日咳非细胞抗原（whoopingcoughacellularantigens）如：百日咳博代氏杆菌脱毒毒素（PTxd）（Bordetellapertussisdetoxifiedtoxin(PTxd)）、丝状血凝素（FHA）（filamentoushemagglutinin(FHA)）、百日咳杆菌粘附素（69kDa抗原）（pertactin(69kDaantigen)）和相同细菌的凝集原（菌毛）（agglutinogens(fimbriae)）。根据一种特别有利的实施方案，可以加入D、T、PTxd和FHA抗原以形成该复合物。
该附加抗原可以以各种方式加入。它们可以在预吸附的乙型肝炎表面抗原后顺序（i）添加到需要存在于该疫苗组合物中的AlOOH的总量上；（ii）添加到部分量上，随后加入以达到该总量。或者，该附加抗原可以如HBsAg那样单独吸附到部分量的AlOOH上。还可以提供混合吸附法——一部分抗原单独吸附，其它顺序吸附。
根据本发明的方法的一个特定实施方案，获得的组合物在添加各抗原后搅拌。
根据一个有利的实施方案，仅作为实例给出，该HBsAg单独地吸附到相当于最终组合物中存在的AlOOH总量的大约30%（三分之一）的部分量AlOOH上。平行地，该D和T抗原顺序吸附该AlOOH的附加部分上。该PTxd与FHA百日咳抗原随后添加到含有该AlOOH-D-T复合物的制剂中，这两种百日咳抗原各自本身单独预吸附到AlOOH上。最后，将这两种制剂（AlOOH-HBsAg复合物和AlOOH-D-T-PTxd-FHA复合物）组合以形成包含AlOOH-HBsAg-D-T-PTxd-FHA的制剂，其中选择各元素的量以获得常规包含以下成分的0.5毫升的疫苗剂量：
-5至15μg的HBsAg/剂量；优选10μg/剂量，
-20至40Lf的D/剂量；优选25至35Lf/剂量；完全优选30Lf/剂量（Lf=絮凝极限）（以其它方式表示，D的量大于或等于20IU/剂量），
-5至25Lf的T/剂量；优选10至15Lf/剂量；完全优选10Lf/剂量（以其它方式表示，T的量大于或等于40IU/剂量），
-20至30μg的FHA/剂量；优选25μg/剂量，
-20至30μg的PTxd/剂量；优选25μg/剂量。
根据本发明的一个特定实施方案，还加入脊髓灰质炎抗原（其常规由灭活病毒组成）。可以预想加入通常存在于儿科疫苗中的三种类型的脊髓灰质炎病毒，即1型、2型或3型，或者，在无需针对三种类型接种的情况下仅引入针对其寻求防护的类型。每剂量的脊髓灰质炎病毒的量特别为：
-对于1型，20至43DU（D抗原单位），特别为40，
-对于2型，5至9DU，特别为8，
-对于3型，17至36DU，特别为32。
这些抗原不必在添加到疫苗制剂中之前预吸附到铝盐上。
根据一个特定实施方案，本发明的方法是一种方法，其中：
（i）（a）在不存在任何其它抗原的情况下令HBsAg与AlOOH接触，并令HBsAg吸附到AlOOH上至少4小时、优选至少12小时、完全优选大约24小时以获得含有AlOOH/HBsAg复合物的制剂；
（i）（b）将包含预吸附到AlOOH上的D、T、PTxd和FHA抗原以及任选附加的百日咳博代氏杆菌抗原如百日咳杆菌粘附素和凝集原的制剂添加到点（i）（a）中获得的制剂中；
（ii）将磷酸根离子添加到点（i）（b）中获得的制剂中以便获得40mMol/l的在疫苗中的最终浓度；
（iii）任选向点（ii）中获得的制剂中添加脊髓灰质炎抗原；
（iv）将含有Hib抗原的制剂添加到点（ii）或（iii）中获得的制剂中；
（v）将pH值调节至7.1±0.1；并
（vi）（a）加入至少一种阳离子氨基酸以便在添加该Hib抗原之前完成点（ii）或（iii）中获得的制剂，或
（b）将至少一种阳离子氨基酸添加到该Hib抗原中；
所述阳离子氨基酸以足以获得至少100mg/l的在疫苗中的最终浓度的量添加。
根据一个特定实施方案，本发明的疫苗组合物是包含已经预先吸附到AlOOH上的HBsAg、白喉毒素D、破伤风毒素T、PTxd和FHA百日咳抗原，该Hib抗原以及任选的脊髓灰质炎效价的组合物，其中：
（i）自组合物制造日期起，在5±3℃的温度下储存的组合物中存在的HBsAg总量的至少85%、优选至少90%吸附在AlOOH上至少3个月；和
（ii）组合物中存在的Hib抗原总量的至少65%、70%或优选75%未吸附在AlOOH上，该量经时保持相对稳定。
此外，通过本发明的方法，显示出对它们有利的是吸附到羟基氧化铝上以便为免疫原性的除HBsAg之外的抗原也保持吸附。
因此，例如，可以表明，本发明的组合物可以包含：
-10至30μg的HBsAg/ml；优选20μg/ml；
-40至80Lf的D/ml，优选50至70Lf/ml；
-10至50Lf的T/ml，优选10至30Lf/ml；
-40至60μg的FHA/ml；优选50μg/ml；
-40至60μg的PTxd/ml；优选50μg/ml；
-2至60μg的PRP/ml；优选20-24μg/ml；
-1至2mg的AlOOH/ml；优选1.2mg的AlOOH/ml；
-浓度为35至45mMol/l的磷酸根离子，优选38至42mMol/l的磷酸根离子；
-100至1000μg/ml，优选400至800μg/ml的阳离子氨基酸；和任选地
-灭活形式的1型、2型和3型脊髓灰质炎病毒，各自量为80、16和64DU/ml。
如前所述，本发明的组合物还包含附加的百日咳博代氏杆菌抗原，如百日咳杆菌粘附素（69kDa）或凝集原。
附图描述：图1是其中在添加各组分后进行混合的现有技术的方法的示意图。
实施例–工业规模制备大批量（250升）的HepB-Dt-Tt-百日咳-脊髓灰质炎-HiB六价疫苗
在无菌条件并用连续搅拌进行制备。
A–吸附到AlOOH上的HBsAg的制备
将由BrenntagAG销售的羟基氧化铝（AlOOH）凝胶的均匀悬浮液以8克铝/升在无菌条件下引入到50升罐中。
在经0.22μm过滤器过滤后，将在最终疫苗中获得20μg/ml的浓度所需体积的HBsAg连续添加到已经含有该AlOOH的罐中。
令混合物在环境温度下搅拌20至24小时以获得均匀的悬浮液。
B–制备吸附到铝凝胶上的D+T+PTxd+FHA
平行地，以下列方法制备铝凝胶、白喉类毒素（D）、破伤风类毒素（T）、百日咳博代氏杆菌类毒素（PTxd）和百日咳博代氏杆菌丝状血凝素（FHA）的混合物：
将由BrenntagAG销售的AlOOH凝胶的均匀悬浮液以8克铝/升在无菌条件下引入到250升罐中。
在经0.22μm过滤器过滤后，将D的溶液引入到已经含有该AlOOH的罐中并在均化后随即连续地将T的溶液引入到该罐中以分别获得60Lf（絮凝极限）/ml和20Lf/ml的在最终疫苗中的D与T浓度。
一旦已经获得均匀混合物，将预吸附到AlOOH上的PTxd的悬浮液和随后预吸附到AlOOH上的FHA的悬浮液连续地在无菌条件下添加到该罐中以便获得25μg/ml的在最终疫苗中的PTxd和FHA浓度。
最后，在经0.22μm过滤器过滤后添加获得20至30mMol/l磷酸根离子浓度所需体积的500mM磷酸盐缓冲液。
在5±3℃的温度下将所得D-T-PTxd-FHA-AlOOH悬浮液搅拌至少14小时。
C–制备吸附到铝凝胶上的HBsAg+D+T+PTxd+FHA的混合物
将点A中获得的制剂在无菌条件下添加到点B中获得的制剂中。
搅拌该混合物以获得均匀的悬浮液。
随后在经0.22μm过滤器过滤后添加在最终组合物中获得40mMol/l的磷酸根离子浓度所需体积的500mM磷酸盐缓冲液。
D–用氨基酸溶液饱和该铝凝胶/HBsAg+D+T+PTxd+FHA复合物的静电位点
制备含有12种基本氨基酸并具有以下组成的氨基酸溶液：
-精氨酸盐酸盐……2.1g/l，即1.73g/l的精氨酸
-胱氨酸……………………1.2g/l
-组氨酸……………………0.8g/l
-异亮氨酸…………………2.6g/l
-亮氨酸……………………2.6g/l
-赖氨酸盐酸盐……………3.65g/l，即2.91g/l的赖氨酸
-蛋氨酸……………………0.75g/l
-苯丙氨酸…………………1.65g/l
-苏氨酸……………………2.4g/l
-色氨酸……………………0.4g/l
-酪氨酸……………………1.8g/l
-缬氨酸……………………2.35g/l
也就是说21.2g/l的氨基酸，包括5.44g/l的阳离子氨基酸（His-Arg-Lys）。
添加450毫升（0.5升/分钟）的2.5N氢氧化钠（NaOH）。搅拌10分钟以令其均化。
该氨基酸溶液，经0.22μm过滤器过滤，连续添加到C中获得的混合物中以便在最终组合物中获得572μg/ml的阳离子氨基酸的浓度。
E–pH调节
用2.5N的氢氧化钠过滤原料液将点D中获得的悬浮液的pH调节至pH7.1（7.0–7.2）。
F–添加脊髓灰质炎抗原
随后向含有E中获得的悬浮液的罐中引入经0.22μm过滤器过滤的含有灭活形式的脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3的制剂（分别为Mahoney、MEF-1和Saukett菌株）。
G–添加PRP-T
PRP-T的中间溶液首先以下列方式制备：将预先经0.22μm过滤器过滤的Tris-蔗糖缓冲液添加到经0.22μm过滤器过滤的PRP-T的制剂中，以便构成中间混合物。
将该混合物在无菌条件下引入到F中获得的混合物中。
H–最终调节阶段
在均化G中获得的悬浮液后，添加足以达到250升的目标体积的一定量的预先过滤的注射级水。随后，如果需要的话，通过添加预先过滤的2.5N氢氧化钠或10%乙酸溶液将该混合物的pH调节至pH7.1±0.1。
混合物在5±3℃下储存，随后以0.5毫升/剂量的比例分配到注射器或瓶中。
0.5毫升的一剂由此含有600μg的Al3+、10μg的HBsAg、不少于20IU的D、不少于40IU的T、25μg的Pt、25μg的FHA、20至43DU（D抗原单位）的1型脊髓灰质炎、5至9DU的2型脊髓灰质炎、17至36DU的3型脊髓灰质炎、12μg的PRP（PRP-T形式）、浓度为40mMol/l的磷酸根离子、浓度为2.5mMol/l的Tris和2.125%的蔗糖的Tris-蔗糖缓冲液、以及286μg的阳离子氨基酸（His–Arg–Lys）。
临床试验
在临床试验中测试了根据上面的实施例制备的疫苗组合物，与市场上目前已经存在的称为InfanrixHexa?的六价疫苗进行比较，该疫苗能够针对与根据本发明制备的疫苗相同的疾病（白喉、破伤风、百日咳、脊髓灰质炎、Hib感染和乙型肝炎）为儿童接种疫苗，但是该疫苗特别具有其一部分被冻干并因此在给药程序之前需要吸收冻干物的操作的缺点。
在临床试验过程中，以包含在2、4和6个月时施加3剂的疫苗方案将两种类型的疫苗组合物施用给儿童。根据本发明的方法制备的液体疫苗证实具有非常良好的耐受性，并具有与存在于市场上的疫苗相同的免疫原性。
实验数据
HBsAg的吸附百分比/未吸附的PRP-T的量
三批最终批量产品（PFV39-41-42）和分配到瓶中的三批（S12-13-14）——所有批次根据提供的实施例获得——储存在+5℃下并分别在9和22个月期间的不同时间进行分析。该分析涉及HBsAg的吸附百分比和未吸附的PRP-T的量。
该HBsAg的吸附百分比如前所述由总HBsAg含量和未吸附的HBsAg含量确定，该HBsAg测定根据欧洲药典2.7.1所定义的规则使用夹心ELISA方法进行。简而言之，在96孔板的孔中，通过IgM类型的抗-HBsAg一级单克隆抗体捕获HBsAg。由此结合的HBsAg用IgG类型的抗HBsAg二级单克隆抗体涂布，该二级抗体本身可以通过过氧化物酶偶联抗IgG多克隆抗体来检测。用于过氧化物酶的发色底物四甲基联苯胺（TMB）充当显影剂。当其加入时，颜色显现，其强度与孔中捕获的HBsAg的量成正比。根据欧洲药典5.3.3中描述的平行线方法分析结果。
为了测定HBsAg的吸附百分比，对该疫苗施以离心（8800g；5分钟；20℃），这能够回收含有未吸附的HBsAg的上清液。以包括在例如1/400至1/12800的范围内的2-倍（ensériede2）连续稀释将待测试的上清液样品在包含解吸缓冲液的ELISA缓冲液中进行稀释。
以包括在例如1/8至1/25600的范围内的2-倍（ensériede2）连续稀释将总疫苗和标准范围样品在包含解吸缓冲液的ELISA缓冲液中进行稀释。
涂有一级单克隆抗体的96孔板在5℃下培育12小时并随后用PBS-Tween20溶液洗涤。将总疫苗的和标准范围的稀释上清液分配到孔中。随后加入二级抗体并用过氧化物酶-缀合抗体和TMB（四甲基联苯胺）进行显色。反应通过加入1N的HCl停止。在各步骤后，将该板在25℃下培育30分钟并随后用PBS-Tween20溶液洗涤。将空白样（稀释缓冲液）加入到可用孔中并接受相同的处理。在OD450和630nm下读板。
关于未吸附的PRP-T的量，可以通过HPAEC-PAD（高性能离子交换色谱法-脉冲安培检测）以下列方式进行评估：
首先制备0.5至12.5μg/ml的标准范围的参比PRP-T。
待测试样品以及标准范围样品在5000g下在环境温度下离心5分钟。收集上清液并随后用含有葡糖胺-1-磷酸盐作为内标（standardinterne）的1.5N的NaCl溶液进行水解。加入空白样（0.9%的NaCl；1.5N的NaOH+内标）。
采用以1.2毫升/分钟的速率注入柱中的由35mM的NaOH和114mM的乙酸钠组成的流动相进行色谱法。
使用下列等式计算未吸附的PRP的浓度（μg/ml）：
(PRP峰的表面积/内标峰的表面积)=a×[PRP浓度]+b
其中，“a”是斜率，“b”是在y轴上的截距，a和b已经由回归线确定。
结果在下面4个表中给出：
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为了比较，测试在三批最终批量产品（FDN5-6-7）中和在由相同抗原组成但根据图1中描述的线性配制方法获得并因此不同于上面实施例中所述制剂的液体制剂的分配到瓶中的三个批次（S44-45-48）中所含HBsAg的经时吸附。该制剂在0.5毫升中含有：10μg的HBsAg，30Lf的Dt，10Lf的Tt，25μg的Pt，25μg的FHA，40DU的脊髓灰质炎病毒1型，8DU的脊髓灰质炎病毒2型，32DU的脊髓灰质炎病毒3型，12μg的PRP（PRP-T形式），0.6mg的Al，浓度为55mMol/l的磷酸根离子，浓度为20mMol/l的碳酸根离子，对于Tris浓度为2.5mMol/l和对于蔗糖浓度为2.125%的Tris-蔗糖缓冲液，和14μg的源于M199介质（脊髓灰质炎效价）的阳离子氨基酸（His–Arg–Lys），pH为6.8-7.2。
获得的结果如下：
。
在相同时段内测得的未吸附的PRP-T的量表明与时间0相比几乎不存在变化，因此令人满意。但是，在这种情况下，这些结果表明，这不符合通过本发明的获得的制剂，该乙型肝炎表面抗原并未保持吸附在羟基氧化铝上。
涉及阳离子氨基酸的实验数据
对直接来自于在提供的实施例中进行的实验方案的本发明的组合物和通过修改之处在于仅含有三种阳离子氨基酸（Arg–Lys–His）的组合物取代了12种基本氨基酸的组合物的方案所获得的组合物在结束时未吸附的PRP-T量方面进行比较。没有观察到未吸附的PRP-T的量方面的差异，由此表明仅阳离子氨基酸是重要的。