灵丹草油提取物、其制备方法、药物组合物及用途.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102100719 B (45)授权公告日 2012.07.18 CN 102100719 B *CN102100719B* (21)申请号 200910261202.0 (22)申请日 2009.12.17 A61K 36/28(2006.01) A61K 9/12(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61K 9/48(2006.01) A61K 9/02(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61P 11/04(2006.01) (73)专利权人 云南盘龙云海药业有限公司 地址 675000 云南省楚雄市经济技术开发区 紫。

2、溪大道 (72)发明人 刘绍兴 高茗 胡玉霞 余启荣 高柏丽 和芳 祁春艳 李馨宇 (74)专利代理机构 北京瑞恒信达知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11382 代理人 曹津燕 张伟 CN 1733040 A,2006.02.15, 梅之南等 . 灵丹草软胶囊制备工艺的研 究 .中国药师 .2007, 第 10 卷 ( 第 08 期 ), (54) 发明名称 灵丹草油提取物、 其制备方法、 药物组合物及 用途 (57) 摘要 本发明提供一种药效明确、 结构清楚的灵丹 草挥发油提取物， 制备前述的灵丹草挥发油提取 物的方法， 用于治疗急、 慢性咽炎的药物组合物以 及所述的灵丹草挥发油提取。

3、物或所述的药物组合 物的用途。本发明的提取物在制成喷雾剂时在治 疗呼吸道疾病方面具有突出的优势， 使药物直接 到达作用部位， 避免首过效应， 提高了该药物的生 物利用度， 减少药物用量， 减轻或避免药物不良反 应。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 董海鹏 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种用于治疗急、 慢性咽炎的药物组合物， 其特征在于， 所述药物组合物包含作为活 性成分的灵丹草挥发油提取物和药学上可接受的载体 ； 其中， 所。

4、述灵丹草挥发油提取物包 含 50.0重量以上的萜类， 所述萜类至少包括以下的式 (I) 和式 (II) 表示的化合物 ： 所述灵丹草挥发油提取物中式 (I) 化合物的含量高于 9.0重量， 式 (II) 化合物的含 量高于 5.0重量， 并且所述提取物通过下述制备方法进行制备 ： 取臭灵丹草药材， 切碎， 采用水蒸气蒸馏法提取至蒸馏液无挥发性成分被检出， 静置分层， 分离油层， 即得 ； 所述药物组合物的剂型为喷雾剂 ； 并且 所述组合物还包含增溶剂， 所述增溶剂选自聚乙二醇 -12 羟基硬脂酸酯、 聚山梨酯类 和泊洛沙姆类中的一种或几种 ； 其中所述聚山梨酯类选自聚山梨酯 20、 聚山梨酯 。

5、40、 聚山 梨酯 60、 聚山梨酯 80 中的一种或几种 ； 所述泊洛沙姆类选自泊洛沙姆 124、 泊洛沙姆 188、 泊洛沙姆 237、 泊洛沙姆 338、 泊洛沙姆 407 中的一种或几种 ； 并且所述聚乙二醇 -12 羟基 硬脂酸酯的用量为药物组合物总重的 0-30重量， 聚山梨酯类的总用量为药物组合物总 重的 0-5重量， 泊洛沙姆类的总用量为药物组合物总重的 0-5重量 ； 此外， 所述增溶剂 还包含醇类， 所述醇类为无水乙醇和 / 或乙醇， 并且所述醇类的用量为药物组合物总重的 0-10重量 ； 此外所述组合物还包含 pH 缓冲剂、 稳定剂、 防腐剂、 矫味剂和芳香剂中的一种 或。

6、多种， 其中 所述 pH 缓冲剂为柠檬酸缓冲盐和 / 或磷酸缓冲盐 ； 所述稳定剂为亚硫酸氢钠、 硫代甘油和焦亚硫酸钠中的一种或多种 ； 所述的防腐剂为山梨酸、 山梨酸钾、 三氯叔丁醇和苯甲酸钠中的一种或多种 ； 所述的矫味剂为阿斯巴甜和 / 或甜菊糖 ； 和 / 或 所述的芳香剂为薄荷脑和 / 或食用香精， 食用香精为苹果、 菠萝、 柠檬、 杨梅、 桃子和香 草香精中的一种或多种。 2. 根据权利要求 1 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述灵丹草挥发油提取物包含 70.0重量以上的萜类。 3.根据权利要求1所述的药物组合物， 其特征在于， 所述灵丹草挥发油提取物中式(I) 化合物的含量高。

7、于 15重量， 式 (II) 化合物的含量高于 6.0重量。 4. 根据权利要求 1 所述的药物组合物， 其特征在于， 所述醇类的用量为药物组合物总 重的 2重量。 5. 根据权利要求 1-4 中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗急、 慢性咽炎的药物 中的用途。 权 利 要 求 书 CN 102100719 B 2 1/13 页 3 灵丹草油提取物、 其制备方法、 药物组合物及用途 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域。具体地， 本发明涉及一种灵丹草油提取物、 其制备方 法、 包含该提取物的药物组合物及该提取物和药物组合物用于治疗急、 慢性咽炎的用途。 背景技术 0002 急慢性咽炎是。

8、一种常见多发病， 多发于冬春两季， 多以咽痛、 咽干、 咽痒、 异物感、 咽喉壁淋巴滤泡增生肿大为特点， 反复发作， 病程缠绵难愈。据统计， 我国慢性扁桃体炎自 然人群的患病率为 2.9 ； 咳嗽的总患病率为 10.9 ； 急性支气管炎发病率为 1 ； 慢性支 气管炎发病率为 3.82， 随着年龄的增加发病率亦增高， 50 岁以上患病率可达 10 15。 城镇人口慢性咽炎发病率占咽部疾病的 10 20， 农村人口占 5.5， 并且近年有逐渐上 升的趋势。目前我国治疗呼吸道疾病的药物主要为西药。这些药用于治疗时存在着严重的 不良反应。 0003 臭灵丹 ( 又称灵丹草 ) 为菊科植物臭灵丹 La。

9、ggera pterodonta(DC.)Benth. 的 干燥地上部分， 中国药典 (1977 年版 ) 收载， 别名狮子草、 臭叶子、 六棱菊、 野辣烟、 归经 草、 鱼富有， 始载于 滇南本草 。其基源植物为菊科 (Compositae) 六棱菊属 (Lag-gera Sch.-Bip.ex Hochst.) 植物翼齿六棱菊的全草或叶， 翼齿六棱菊主要分布于长江流域以南 及西南部， 主产于我国云南省， 是民族用药。 灵丹草性凉， 味辛、 苦， 具有清热解毒， 止咳祛痰 之功效， 对防治风热感冒， 咽喉肿痛， 肺热咳嗽有良好的疗效。 0004 国内上市的以灵丹草为药材的品种有灵丹草片、 灵。

10、丹草胶囊、 灵丹草颗粒、 灵丹草 软胶囊和灵丹草合剂， 其制备工艺均为分别提取灵丹草的水溶性成分和挥发油成分， 然后 合并成药。国内目前没有获得注册批文的喷雾剂剂型的灵丹草药品。 0005 目前对灵丹草化学成分的研究还不够系统、 准确。现有的研究结果显示灵丹 草含有 100 多种化合物， 其中主要包括桉烷型倍半萜 (eudesmanesesquiterpoids) 及 黄酮醇类 (flavonols) 化合物。倍半萜类成分主要是桉烷型 (eudesmane) 和对映桉烷 型 (enatioeudesmane)， 包括倍半萜酸 (Ilicic acid、 Costic acid)、 倍半萜及倍半。

11、萜苷 等 ( 郑群雄， 张奇军， 孙汉董等， 云南民间草药臭灵丹根部的化学成分研究， 浙江大学学 报 ( 医学版 )， 2002， 31(6) ： 406)。黄酮醇类化合物是该类植物另一大类化学成分。1993 年李顺林等首先从臭灵丹中提取分离了 4 个黄酮类化合物， 分别为喷毒素 (pendultin)， 5- 羟基 -3， 4， 6， 7- 四甲氧基黄酮 (5-hyd-roxy-3， 4， 6， 7-tetramethoxyflavone)， 金 腰素乙 (chrysosptertin B) 和洋艾素 (artemitin)( 李顺林， 丁靖垲， 臭灵丹中的黄酮醇 成分， 云南植物研究， 1。

12、994， 16(4) ： 434) ； 1995 年赵爱华又从中分离出 3， 4， 5- 三羟 基 -3， 6， 7- 三甲氧基黄酮 (3， 4， 5-trihydroxy-3， 6， 7-trimethoxyflavone) 和橙皮苷 (hesperidin)( 赵爱华， 朱焰， 魏均娴， 臭灵丹化学成分的再研究， 中国药学志， 1995， 30(5) ： 264)。 1997年赵昱等从臭灵丹中得到3， 4， 5-三羟基-3， 5， 6-三甲氧基黄酮(3， 4， 5-trihydroxy-3， 5， 6-trimethoxyflavone)(Zhao Y， Yue J M， Lin Z W，。

13、 et al， Eudesmane sesquiterpenes from Laggera pterodonta.Phytochemistry， 1997， 44(3) ： 459)。 说 明 书 CN 102100719 B 3 2/13 页 4 0006 灵丹草水提液中主要含有倍半萜和黄酮类成分 ； 挥发油中主要含有单萜类， 倍半 萜类以及芳香族酚类化合物， 以 2， 6- 双 (1， 1- 二甲基乙基 )-4- 乙基苯酚的含量为最高， 达 28.27， 其次是 2(1， 1- 二甲基乙基 )-6-(1- 甲基 -1- 甲烯乙基 )-4- 乙基苯酚， 蓝桉醇， 1， 8- 桉叶素等。但是挥。

14、发油中这些化合物的鉴定多是利用仪器数据库的质谱检索， 再对照标 准谱图分析得出， 并未对灵丹草挥发油中的成分进行分离鉴定。 发明内容 0007 除非另外说明， 本文所述的百分含量均为重量百分比含量。 0008 中药现代化对传统中药的二次开发提出了较高的要求， 现代中药要做到去粗取 精， 去除无效成分， 保留有效成分。 0009 因此， 本发明的一个目的在于， 提供一种药效明确、 结构清楚的灵丹草挥发油提取 物 ； 本发明的另一个目的在于， 提供制备前述提取物的方法 ； 本发明的另一个目的在于， 提 供一种用于治疗急、 慢性咽炎的药物组合物 ； 本发明的另一个目的在于， 提供所述灵丹草挥 发油提。

15、取物或所述药物组合物的用途。 0010 针对上述发明目的， 本发明提供以下技术方案 ： 0011 一方面， 本发明提供一种灵丹草挥发油提取物， 该提取物包含 50重量以上、 优选 70以上的萜类， 所述萜类至少包括以下式 (I) 和式 (II) 表示的化合物 ： 0012 0013 优选地， 根据前述的灵丹草挥发油提取物， 所述式 (I) 化合物的含量高于 9.0、 优选高于 15.0， 所述式 (II) 化合物的含量高于 5.0、 优选高于 6.0。 0014 另一方面， 本发明提供制备前述的灵丹草挥发油提取物的方法， 其包括 ： 取灵丹草 药材， 切碎， 采用水蒸气蒸馏法提取至蒸馏液无挥发。

16、性成分被检出， 静置分层， 分离油层， 即 得。 0015 另一方面， 本发明提供一种用于治疗急、 慢性咽炎的药物组合物， 该药物组合物包 含作为活性成分的如前所述的灵丹草挥发油提取物和药学上可接受的载体 ； 该组合物的剂 型选自 ： 针剂、 滴剂、 滴丸剂、 液体胶囊剂、 滴眼剂、 栓剂、 滴丸剂和喷雾剂。 0016 优选地， 所述药物组合物的剂型为喷雾剂。 0017 优选地， 所述药物组合物还包含增溶剂， 所述增溶剂选自聚乙二醇 -12 羟基硬脂 酸酯、 聚山梨酯类和泊洛沙姆类中的一种或几种 ； 优选地， 所述聚山梨酯类选自聚山梨酯 20、 聚山梨酯 40、 聚山梨酯 60 和聚山梨酯 8。

17、0 中的一种或几种 ； 所述泊洛沙姆类选自泊洛沙 姆 124、 泊洛沙姆 188、 泊洛沙姆 237、 泊洛沙姆 338 和泊洛沙姆 407 中的一种或几种。 0018 进一步优选地， 所述聚乙二醇 -12 羟基硬脂酸酯的用量为药物组合物总重的 0-30， 聚山梨酯类的总用量为药物组合物总重的 0-5， 泊洛沙姆类的总用量为药物组合 说 明 书 CN 102100719 B 4 3/13 页 5 物总重的 0-5。 0019 进一步优选地， 所述增溶剂还包含醇类， 所述醇类为无水乙醇和 / 或乙醇 ； 优选 地， 所述醇类的用量为药物组合物总重的 0-10， 优选为 2重量。 0020 优选地。

18、， 所述药物组合物还包含 pH 缓冲剂、 稳定剂、 防腐剂、 矫味剂和芳香剂中的 一种或几种 ； 0021 进一步优选地， 所述 pH 缓冲剂为柠檬酸缓冲盐和 / 或磷酸缓冲盐 ； 0022 进一步优选地， 所述稳定剂为抗氧化剂， 如亚硫酸氢钠、 硫代甘油和焦亚硫酸钠中 的一种或几种 ； 0023 进一步优选地， 所述防腐剂为山梨酸、 山梨酸钾、 三氯叔丁醇和苯甲酸钠中的一种 或几种 ； 0024 进一步优选地， 所述的矫味剂为阿斯巴甜和 / 或甜菊糖 ； 和 / 或 0025 进一步优选地， 所述的芳香剂为薄荷脑和 / 或食用香精， 其中食用香精选自苹果、 菠萝、 柠檬、 杨梅、 桃子和香草。

19、香精中的一种或几种。 0026 另一方面， 本发明提供所述的灵丹草挥发油提取物或所述的药物组合物在制备用 于治疗急、 慢性咽炎的药物中的用途。 0027 本发明的发明人对灵丹草挥发油化学成分进行研究， 确定其挥发油组分主要是单 萜、 倍半萜及其含氧衍生物等萜类化合物， 并从灵丹草挥发油中提取出萜类含量占 50以 上的挥发油提取物， 又进一步采用柱层析色谱法和 pH 梯度萃取法从该挥发油提取物中分 离出药效明确、 结构清楚的活性成分， 达到中药 5 类新药标准。经 IR、 GC-MS、 NMR 鉴定， 分离 出的活性成分的基本信息为 ： 0028 化合物 I ： (1) 名称 ： 1， 2， 3。

20、， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘 乙酸 (1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7-octahydro-4a， 8-dimethyl-methylene-2-Naphthaleneaceti c acid) ； (2) 化学结构式如下式 (I) 所示 ； (3) 分子式 ： C15H22O2； (4) 分子量 ： 234。 0029 化合物 II ： (1) 名称 ： - 芹子烯 (-selinene) ； (2) 化学结构式如下式 (II) 所 示 ； (3) 分子式 ： C15H24； (4) 分子量 ： 204.35。 003。

21、0 0031 此外， 本发明人还分别以 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲 基 -2- 萘乙酸和 - 芹子烯为对照， 对灵丹草油中的总萜类成分及 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八 氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸和 - 芹子烯进行测定， 建立了灵丹草油的质量 标准。 0032 与现有技术相比， 本发明具有以下明显优点 ： 0033 对中药而言， 活性成分复杂， 药材品质千差万别， 只能通过对中药化学成分的鉴别 和含量检测保证中成药的药效稳定和安全性。 因此， 明确中成药的化学成分、 提高活性成分 说。

22、 明 书 CN 102100719 B 5 4/13 页 6 的纯度已成为中药现代化的基本要求。 本发明的提取物化学成分清楚， 纯度更高， 可用化合 物I和II的含量作为药品的质量控制标准， 因而质量更可控、 更稳定， 比现有的灵丹草制剂 在疗效和安全性方面更有保障， 符合中药现代化的要求。 0034 本发明的提取物制成喷雾剂时在治疗呼吸道疾病方面具有突出的优势， 使药物直 接到达作用部位， 避免首过效应， 提高了该药物的生物利用度， 减少药物用量， 减轻或避免 药物不良反应。 同时喷雾剂具有剂量小、 分布均匀、 奏效快、 使用方便的特点， 这是其它剂型 无法比拟的， 吸入时可减少胃肠道副作用。

23、， 定量阀门控制剂量， 具有速效和定位作用。灵丹 草喷雾剂的开发为臭灵丹草的临床应用提供了一个更好更广的领域， 有广泛的应用前景。 附图说明 0035 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中 ： 0036 图 1 为测量 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸的含 量时的气相色谱 (GC) 图， 其中 1-1 为对照品的 GC 图， 1-2 为本发明的灵丹草油提取物的 GC 图 ； 0037 图 2 为测量 - 芹子烯的含量时的 GC 图， 其中 2-1 为对照品的 GC 图， 2-2 为本发 明的灵丹草油提取物的。

24、 GC 图。 具体实施方式 0038 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法， 通常按照常规条 件， 或按照厂商所建议的条件。 0039 在实施例中所用的仪器包括 ： UV-1700 紫外可见分光光度计 ( 岛津公司 ) ； Sartorius CP225D 电子天平 ( 北京赛多利斯仪器系统有限公司 ) ； KQ-250DB 型数控超声波 清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司 ) ； ThermoFinnigan Trace 2000 气相色谱仪 (FID 检测 器 ) ； GDC 500G 高纯。

25、氢气发生器 ； Xcalibur 色谱工作站 ； JB-3 定时恒温磁力搅拌器 ( 上海 悦丰仪器仪表有限公司 ) ； RCY-2 型热板测痛仪 ( 冀星实验有限公司 )。 0040 在实施例中所用的原、 辅料及试剂包括 ： 灵丹草药材 ( 云南盘龙云海药业有限公 司提供， 经鉴定为菊科植物臭灵丹 Laggera pterodonta(DC.)Benth. 的干燥地上部分 ) ； 聚 山梨酯 80( 药用辅料， 湖南尔康制药有限公司， 批号 ： 20080701) ； 洛泊沙姆 188( 药用辅料， 北京凤礼精求商贸有限公司， 原产地 ： 德国 BASF， 批号 ： WPWA544C) ； 聚。

26、乙二醇 -12 羟基硬脂 酸酯 ( 药用辅料， 北京凤礼精求商贸有限公司， 原产地 ： 德国 BASF， 批号 27927024UO) ； 山梨 酸钾 ( 湖南尔康制药有限公司， 批号 ： 20080502) ； 焦亚硫酸钠 ( 药用辅料， 湖南尔康制药 有限公司， 批号 ： 20080901) ； 乙醇 ( 药用辅料， 湖南尔康制药有限公司 ) ； 阿斯巴甜 ( 江苏 汉光甜味剂有限公司， 批号 ： 08061201) ； 苹果香精 ( 上海华宝孔雀香精香料有限公司 ) ； 薄 荷脑 ( 安徽丰乐香料有限公司 ) ； 福临门牌食用大豆油 ( 中粮食品营销有限公司 ) ； 维生素 E( 浙江华。

27、源制药科技开发有限公司， 批号 ： 20080702-3) ； - 芹子烯对照品 ( 自制， 纯度达 98以上 ) ； 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸 ( 自制， 纯度 达 98以上 ) ； 巴豆油 ( 日本和光株式会社产品， 批号 DCCL7737) ； 角叉菜胶 (Sigma 公司 产品， 批号 45F-0427) ； 甲醛溶液 ( 北京市旭东化工厂生产， 批号 ： 20061023) ； 二甲苯 ( 分 说 明 书 CN 102100719 B 6 5/13 页 7 析纯， 500ml， 上海化学试剂有限公司， 。

28、批号 ： 061031) ； 生理盐水 ( 北京双鹤药业有限公司生 产 ) ； 冰醋酸 ( 分析纯， 500ml， 北京化工厂， 批号 ： 20080508) ； 香草醛 ( 分析纯， 100g， 北京 化工厂， 批号 ： 030407) ； 无水乙醇 ( 分析纯， 2500ml， 北京化工厂， 批号 ： 20070319) ； 正己烷 (分析纯， 500ml， 北京化工厂， 批号 ： 20080518) ； 无水硫酸钠(分析纯， 500g， 北京化工厂， 批 号 ： 20081025) ； 高氯酸 ( 分析纯， 500ml， 天津大茂化学试剂厂 )。 0041 实施例 1 灵丹草油提取物的制。

29、备 0042 提取物 1 ： 0043 制备方法如下 ： 取灵丹草药材 1000g， 切碎， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取 8 小时， 将油水混合物置于分液漏斗中， 静置， 分取挥发油， 加 2.0g 无水硫酸钠， 干燥， 即得目 标提取物3.1g。 该提取物的总萜类含量为75.0， 有效成分1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7-八氢-4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸和 - 芹子烯的含量分别为 18.0和 7.0。 0044 灵丹草油提取物中有效成分的测定方法如下 ： 0045 总萜类 0046 对照品溶液的制备 精密称取 - 芹子烯对照品适量， 加无水乙醇制成。

30、每 1ml 含 0.15mg- 芹子烯的溶液， 即得。 0047 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液 0.2ml， 0.4ml， 0.6ml， 0.8ml， 1.0ml， 分 别置于 10ml 量瓶中， 准确加入乙醇 0.8ml， 0.6ml， 0.4ml， 0.2ml， 0.0ml， 摇匀， 加 5香草 醛 - 冰醋酸溶液 1.5ml， 再加高氯酸 2.0ml， 摇匀， 置于 70恒温水浴加热 20 分钟， 取出， 冷 却至室温， 通过紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)， 在555nm波长处 测定其吸光度， 以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标， 绘制标准曲线。 0048 。

31、测定法取本品约 0.1g， 精密称定， 置于 50ml 量瓶中， 加乙醇 30ml， 超声处理 5 分 钟， 取出， 放冷， 加乙醇稀释至刻度， 摇匀， 精密量取 1ml， 置于 10ml 量瓶中， 加乙醇稀释至刻 度， 摇匀， 再精密量取1ml， 置于10ml量瓶中， 按照标准曲线的制备项下的方法， 自 “加5香 草醛 - 冰醋酸溶液” 起， 依照该法测定吸光度， 从标准曲线上读出供试品溶液中总萜类的重 量， 计算， 即得。 0049 本品含总萜类以 - 芹子烯 (C15H24) 计， 为 75.0。 0050 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 。

32、- 亚甲基 -2- 萘乙酸 通过气相色谱 法 ( 中国药典 2005 年版一部附录 VIE) 测定。 0051 色谱条件与系统适应性试验 弹性石英毛细管柱 ( 柱长 30m， 内径 0.25mm， 膜厚 度 0.25m)HP-5MS ； 程序升温 ： 初始温度 80， 保持 2 分钟， 以每分钟 3的速率升温至 200， 保持 5 分钟 ； 进样口温度 250 ； 检测器温度 250 ； 分流比 10 1。理论板数按芹 子烯峰计算应不低于 20000。 0052 对照品溶液的制备 精密称取 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲 基 -2- 萘。

33、乙酸对照品适量， 加正己烷制成每 1ml 含 0.4mg 的溶液， 即得。 0053 供试品溶液的制备 取本品约 60mg， 精密称定， 置于 25ml 量瓶中， 加正己烷至刻 度， 摇匀， 即得。 0054 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 1l， 注入气相色谱仪， 测定， 即得， 气相色谱图参见附图 1-1 和 1-2。 0055 本品中1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7-八氢-4a， 8-二甲基-亚甲基-2-萘乙酸(C15H22O2) 说 明 书 CN 102100719 B 7 6/13 页 8 的含量为 18.0。 0056 芹子烯 通过气相色谱法 ( 中国药。

34、典 2005 年版一部附录 VIE) 测定。 0057 色谱条件与系统适应性试验 弹性石英毛细管柱 ( 柱长 30m， 内径 0.25mm， 膜厚 度 0.25m)HP-5MS ； 程序升温 ： 初始温度 80， 保持 2 分钟， 以每分钟 2的速率升温至 150， 再以每分钟 10的速率升温至 200， 保持 8 分钟 ； 进样口温度 250 ； 检测器温度 250 ； 分流比 10 1。理论板数按芹子烯峰计算应不低于 20000。 0058 对照品溶液的制备 精密称取 - 芹子烯对照品适量， 加正己烷制成每 1ml 含 0.2mg 的溶液， 即得。 0059 供试品溶液的制备 取本品约 6。

35、0mg， 精密称定， 置于 25ml 量瓶中， 加正己烷至刻 度， 摇匀， 即得。 0060 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 1l， 注入气相色谱仪， 测定， 即得， 气相色谱图参看附图 2-1 和 2-2。 0061 本品含 - 芹子烯 (C15H24) 为 7.0。 0062 提取物 2 ： 0063 制备方法 ： 取灵丹草药材 1000g， 切碎， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取 4 小 时， 将油水混合物置于分液漏斗中， 静置， 分取挥发油， 加 1.0g 无水硫酸钠， 干燥， 即得目标 提取物 2.2g。该提取物的总萜类含量为 56.9， 有效成分 1， 2， 3，。

36、 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸、 - 芹子烯的含量分别为 13.2和 5.8。 0064 提取物 3 ： 0065 制备方法 ： 取灵丹草药材 1000g， 切碎， 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油， 提取 1 小 时， 将油水混合物置于分液漏斗中， 静置， 分取挥发油， 加 1.0g 无水硫酸钠， 干燥， 即得目标 提取物 1.1g。该提取物的总萜类含量为 22.2， 有效成分 1， 2， 3， 4， 4a， 5， 6， 7- 八氢 -4a， 8- 二甲基 - 亚甲基 -2- 萘乙酸、 - 芹子烯的含量分别为 3.7和 4.0。 0066。

37、 实施例 2 ： 灵丹草油喷雾剂处方及制备 0067 本实施例提供制备本发明灵丹草油喷雾剂处方及制备方法的一个典型实施方案。 0068 制剂处方 ： 0069 灵丹草油 ( 实施例 1 制备 ) 10g 0070 聚山梨酯 80 25g 0071 泊洛沙姆 188 2.5g 0072 聚乙二醇 -12 羟基硬脂酸酯 20g 0073 乙醇 20g 0074 焦亚硫酸钠 2g 0075 山梨酸钾 2.5g 0076 阿斯巴甜 1g 0077 苹果香精 2ml 0078 薄荷脑 0.2g 0079 加水制成 1000ml 0080 制法 ： 取泊洛沙姆 188、 聚乙二醇 -12 羟基硬脂酸酯、 。

38、乙醇， 混合， 在 60水浴加热 使之溶解， 取出， 加入聚山梨酯 80， 搅匀 ； 加入灵丹草油， 搅匀， 缓缓加入到 800ml 水中， 边加 说 明 书 CN 102100719 B 8 7/13 页 9 边搅拌， 溶液备用 ； 另取阿斯巴甜、 焦亚硫酸钠、 山梨酸钾， 加水适量加热使之溶解， 与上述 溶液合并， 搅匀， 加入苹果香精 2ml、 薄荷脑 0.2g， 加水至 1000ml， 搅匀， 滤过， 灌装， 即得。 0081 实施例 3 ： 灵丹草油提取物的药效 0082 本实施例提供实施例 1 制备的灵丹草油提取物的药效试验操作及结果。 0083 1. 提取物 1、 2 和 3 的。

39、抗炎作用比较 0084 1) 对小鼠巴豆油性耳廓肿胀的抑制作用比较 0085 实验方法 ： 100 只 CD-1(ICR) 小鼠， 体重 202g， 随机分成 10 组。用 2巴豆油 0.05ml 涂于小鼠右耳前后两面， 左耳为对照， 致炎后半小时涂抹药物， 药物分别为提取物 1、 2 或 3( 浓度分别为 0.5、 1和 2 ) 及阴性对照 ( 生理盐水， 即 0.9 NaCl)， 每次每只 0.02ml， 致炎后 4 小时将小鼠处死， 沿耳廓基线剪下两耳， 用直径 8mm 的不锈钢冲子在同一 部位分别冲下耳片， 在电子天平上称重， 计算肿胀质量值 ( 右耳片重减去左耳片重之差 )， 按下列。

40、公式计算抑制率 ： 肿胀抑制率 ( ) ( 阴性对照组平均肿胀质量值 - 给药组平均 肿胀质量值 )/ 阴性对照组平均肿胀质量值 100， t 检验进行统计学处理。 0086 实验结果见表 1。结果表明， 提取物 1 中、 高剂量和提取物 2 高剂量对巴豆油诱发 的小鼠耳肿胀有较明显的抑制作用， 提取物 1 的作用更为明显 ； 提取物 3 无作用。 0087 表 1 灵丹草油提取物对巴豆油致小鼠耳肿胀的影响 0088 0089 注 ： 与对照组相比较 *P 0.05，*P 0.01。 0090 2) 抗二甲苯所致耳肿胀的影响比较 0091 实验方法 ： ICR 小鼠 140 只， 随机分为 7。

41、 组， 每组 20 只， 雌雄各半， 受试物分别为提 取物 1 或 2( 浓度分别为 0.5、 1和 2 ) 及阴性对照 ( 生理盐水 )。在小鼠右耳的前后 两面涂布二甲苯， 体积为 0.02ml/ 只， 左耳不作任何处理。造模后 10 分钟右耳的前后两面 分别涂布不同受试物， 1h 后， 麻醉下处死动物， 剪下双耳用 6.5mm 直径打孔器分别在同一部 位打下圆耳片。对耳片称重， 计算肿胀质量值 ( 右耳片重减去左耳片重之差 )， 对各组肿胀 说 明 书 CN 102100719 B 9 8/13 页 10 质量值数据进行统计学分析， 比较提取物1和2的抗急性炎症作用， 按下列公式计算耳肿胀。

42、 率 ： 耳肿胀率 ( ) 肿胀质量值 / 左耳片重量 100。 0092 实验结果见表 2。结果表明， 提取物 1 和 2 均具有剂量依赖性的抑制耳肿胀作用 ； 提取物1中、 高剂量组的作用均与对照组有显著性差异 ； 提取物2各剂量与对照组比较无显 著性意义， 可见， 提取物 1 的抗二甲苯所致急性炎症作用强于提取物 2。 0093 表 2 灵丹草油提取物 1 和 2 对二甲苯致小鼠耳肿胀影响 (n 20) 0094 0095 注 ： 与对照组相比较， *p 0.05。 0096 3) 对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响比较 0097 实验方法 ： 取 150-170g 健康 Wistar 大鼠 。

43、100 只， 随机分为 10 组， 每组 10 只， 实验 开始时， 用自制软尺测定大鼠左踝关节周长 (cm)， 作为基础值， 于每只大鼠左侧足垫皮下注 射 1角叉菜胶 0.1ml， 致炎后半小时分别将药物或阴性对照 ( 生理盐水 ) 涂抹于大鼠左侧 足踝关节周围， 每次0.06ml。 致炎后1、 2、 4、 6小时分别各测一次踝关节周长， 计算出肿胀值 ( 致炎后与致炎前周长之差 )， 分别比较各时间点给药组与对照组之间的差异性， 按下列公 式计算各时间点给药组的抑制率 ： 抑制率 ( ) ( 对照组平均肿胀值 - 给药组平均肿胀 值 )/ 对照组平均肿胀值 100。 0098 实验结果见表。

44、3。 结果表明， 提取物1和提取物2均有剂量依赖的抑制大鼠足肿胀 作用， 于致炎后 2、 4 小时最强 ； 提取物 2 作用强度不如提取物 1。 0099 表 3 ： 灵丹草油提取物 1 和 2 对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响 (n 10) 0100 说 明 书 CN 102100719 B 10 9/13 页 11 0101 注 ： 与对照组相比较 *P 0.05，*P 0.01。 0102 2. 提取物 1、 2 和 3 的镇痛作用比较 0103 1) 对前足皮下注射福尔马林致小鼠疼痛反应的影响比较 0104 实验方法 100 只 18-22g 健康小鼠随机分为 10 组， 每组 10 只，。

45、 小鼠右前足底皮下 注射2的福尔马林溶液20l/只致炎， 致炎前30分钟于致炎足涂抹药物或生理盐水(阴 性对照 )， 每只 0.02ml， 致炎后 30 分钟， 将小鼠置入玻璃器皿中， 观察小鼠的足部反应。以 疼痛反应分级积分进行统计。 0105 疼痛分级标准 ： 舔、 咬或抖足3分 ； 提足2分 ； 轻触底面但不负重， 行走时跛行1分 ； 正常负重， 走动自如 0 分。 0106 实验结果见表4。 结果表明， 提取物1和提取物2都剂量依赖地减少皮下注射福尔 马林致小鼠疼痛反应积分， 提取物1所有剂量和提取物2高剂量的作用具有统计学意义， 镇 痛作用强度提取物 1 提取物 2。提取物 3 无此。

46、作用。 0107 表 4 灵丹草油提取物对皮下注射福尔马林致小鼠疼痛反应的影响 0108 说 明 书 CN 102100719 B 11 10/13 页 12 0109 注 ： 与对照组相比较 *P 0.05，*P 0.01。 0110 2) 对物理刺激致小鼠疼痛反应的影响比较 ( 热板法 ) 0111 实验方法 ： 取 18-22g 雄性小鼠， 用热板测痛仪， 测定小鼠自放入热板至出现舔足 所需时间 ( 秒 ) 作为该鼠的痛阈值， 凡小鼠舔足时间小于 5 秒或大于 30 秒或跳跃者均弃之 不用， 将合格小鼠取 70 只， 随机分为 7 组， 每组 10 只， 后足涂抹药液或生理盐水 ( 阴性。

47、对 照 )， 每只 0.02ml， 测定药后 30 分钟的痛阈值。以 t 检验进行统计学处理。 0112 实验结果见表 5。结果表明， 提取物 1 高、 中剂量和提取物 2 高剂量有明显的镇痛 作用， 提取物 1 的作用更为明显。 0113 表 5 ： 提取物 1 和 2 的镇痛作用 ( 热板法 ) 0114 0115 注 ： 与对照组相比较 *P 0.05。 0116 小结 说 明 书 CN 102100719 B 12 11/13 页 13 0117 以上实验表明， 以提取物 1 和 2 直接涂抹对小鼠及大鼠炎症和疼痛各两种模型均 有不同程度的改善作用， 其中提取物 1 的抗炎、 镇痛的作。

48、用强度均优于 2。提取物 3 未见显 著抗炎或镇痛作用。 0118 表 6 ： 灵丹草油提取物抗炎、 镇痛实验结果综合比较 0119 0120 注 ： 与对照组相比较 *P 0.05，*P 0.01。 0121 实施例 4 ： 灵丹草油喷雾剂的药效 0122 喷雾剂的给药途径为经皮给药， 现有的灵丹草制剂为颗粒、 胶囊、 片剂， 为经口给 药。本实施例提供实施例 1 制备的灵丹草油提取物通过这两种不同的给药途径给予的药效 试验操作及结果。 0123 提取物 1 不同给药途径的抗炎镇痛作用比较 ： 0124 前期试验已表明 ： 提取物1和2相比， 提取物1的抗炎、 镇痛作用均较强， 且在浓度 为1和2时作用显著。 现进行2灵丹草油提取物1经皮和经口给药的抗炎镇痛作用比 较。 0125 1. 对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响比较 0126 实验方法 ： 150-170g 健康 W。