技术领域
本发明涉及肉桂提取物用于治疗淀粉样蛋白相关疾病，特别是阿耳茨海默氏 (Alzheimer’s)病的应用。
背景技术
淀粉样蛋白是共享特定结构特征的不可溶性纤维蛋白聚集体。作为淀粉样蛋白原 纤维的可溶性蛋白的异常组织沉积可能会导致淀粉样变性，而且还在各种其他神经退 行性疾病中起作用。大量的证据表明β-淀粉样蛋白(Aβ)衍生的肽(Aβ1-40和Aβ1-42) 的积聚可能在阿耳茨海默氏病、帕金森病、痴呆、朊病毒病、II型糖尿病和各种淀粉 样变性病的成因和/或发展中起着突出的作用[1-4]。
尽管在各种形成蛋白的淀粉样蛋白之间没有明确的序列同一性，但如电子显微镜 和X射线衍射所测定的，所有的淀粉样蛋白结构均享有类似的超微结构性质。淀粉 样蛋白疾病的特征在于较大蛋白质沉积物的形成可以是全身性的或是局限于特定器 官中。此外，许多淀粉样蛋白疾病的特征是在大脑中形成了原纤维。还表明的是，淀 粉样蛋白原纤维具有细胞毒性[5，6]。因此，防止淀粉样蛋白原纤维的形成可获得对淀 粉样蛋白相关疾病的创新性治疗。
一些学术和工业团体已经参与开发了试图防止淀粉样蛋白沉积物的形成或诱导 其消除的技术。这些技术包括使用特定的抗体、小肽和其他影响会导致形成有序淀粉 样蛋白原纤维的自组装过程的材料。
据报道一些天然提取物会对与β-淀粉样蛋白有关的破坏性路径提供防护。例如， 银杏叶(Ginco biloba)提取物表现出能够保护海马神经元以防止因β-淀粉样蛋白诱 发的细胞死亡。100μg的该提取物能够保护海马细胞免于与β-淀粉样蛋白的预先接 触(长达8小时)。
肉桂作为香料和药品已有悠久的历史。据认为肉桂独特的治疗能力来源于在其树 皮中所发现的多种成分。已经表明肉桂具有与血糖控制、抗凝血作用、抗氧化活性和 抗微生物活性有关的某些独特的治疗能力。
Kim等[7]报道，使用有机溶剂由包括中国肉桂的选定草药中提取的级分保护 PC12大鼠嗜铬细胞瘤和原发性神经细胞免受β-淀粉样蛋白损伤。另据报道，普通肉 桂的提取物抑制τ蛋白的聚集并分解已经形成的纤维。本发明的发明人最近证明了肉 桂水性提取物对人流感H1N1和其他病毒的抗病毒活性[8-10]。
本发明的发明人的另一国际申请第WO 05/060352号[11]公开了由肉桂 ((cinnamon bark，樟属中的种(Cinnamon sp.))获得的天然水性提取物，其具有对包括A 型流感、副流感病毒(仙台(Sendai)，新城疫(NewCastle Disease))、HIV-1和HSV-1病 毒等包膜病毒的抗病毒活性和抑制A型病毒和副流感病毒的体内活性。
参考文献：
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发明内容
如在国际公开第WO 05/060352号[参考文献11]与源于此的所有国家申请中先前 公开的，以及现今如本文经修饰和改进所公开的，如今已意外的发现，通过使肉桂皮 (Cinnamon sp.)接触水性的、不含有机溶剂的提取条件所获得的肉桂提取物，在治疗 淀粉样变性相关疾病或紊乱、抑制原纤维聚集和保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱 发的破坏活性等方面均是有益的。还重要的是，如今已经认识到水性提取物是用于治 疗诸如阿耳茨海默氏病等淀粉样变性相关疾病的独特而富有前景的天然方法。
用于分离肉桂提取物(本文中简称为“提取物”)的初步方法之前已披露于国际 公开第WO 05/060352号中，加以必要修正，通过引用将该公开或其美国同族并入本 文中。
根据该方法，水性提取物由不含有机溶剂的提取方法获得，该方法包括使研磨的 肉桂皮与水或诸如缓冲溶液等水溶液接触，从而由此获得提取物，所述提取物的特征 在于以下的一个或多个方面：
a)在280nm处的吸光度为10.O.D每mg/ml·cm～20.O.D每mg/ml·cm；
b)如图1所示的O.D/mg/ml·cm；
c)分子量大于或等于10kDa；
d)等电点(IEP)位于pH 2～4；
e)水溶解度为5mg/ml～20mg/ml，DMSO溶解度为30mg/ml～40mg/ml；
f)可因诸如KCl、NaCl、MgCl2、SrCl2、CuCl2和ZnCl2等多种氯化物盐中的一种 以上而从水中沉淀出；
g)在乙醇和丙酮等有机溶剂中稳定；
h)在苯酚-硫酸测试中有反应性；
i)货架寿命长；和
j)抗病毒活性。
本发明使用的提取物高度稳定，并且在0.1MNaOH或0.1MHCl或0.1MH2SO4溶液等酸性或碱性溶液中温育后仍然维持其大部分活性，而且可作为稳定粉末或在低 于室温的温度或室温的溶液中保存很长的时间(至少2年)；所述提取物还具有热稳定 性，因此可通过例如加湿高压灭菌器在高达至少121℃的温度进行灭菌。
因此，在一个方面中，本发明提供一种水性肉桂提取物在制备用于治疗至少一种 淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的药物组合物中的应用，所述提取物的特征在于以下的一 个或多个方面：
a)在280nm处的吸光度为10 O.D每mg/ml·cm～20O.D每mg/ml·cm；
b)分子量大于或等于10kDa；和/或
c)在不存在有机溶剂时通过使肉桂皮与水或水溶液接触能够获得(或由此来获 得)。
在一些实施方式中，所述分子量为10kDa～50kDa。在一些其他实施方式中，所 述分子量为25kDa～50kDa。在又一些其他实施方式中，所述分子量为≥25kDa。
在一些另外的实施方式中，所述提取物在280nm处的吸光度为15O.D每 mg/ml·cm～20O.D每mg/ml·cm。
可通过浸没、浸渍、与水流或蒸汽接触、通过在任意温度通常于室温(环境温度， 22℃～27℃)洗涤、在水中离心、搅拌或温育来使肉桂皮与水接触。所述水可以是自 来水、脱气水、去离子水、去矿物水、蒸馏水或二次蒸馏水或任何净化度的净化水。
作为另一种选择，研磨的肉桂皮可以与包含至少一种盐或水溶性无机化合物形式 的可溶性物质的“水性溶液”或缓冲溶液接触。该水性溶液基本不含可溶性有机溶剂， 所述可溶性有机溶剂在与肉桂皮接触之前与水预先混合(均质地或异质地)或在之后 添加，以促进物质的提取。
在某些实施方式中，不含有机溶剂的提取方法包括将肉桂皮研磨成粉末并将其拌 入水性缓冲液中，以获得例如通过加入氯化物盐等可溶性盐而使该提取物从其中沉淀 出的溶液。水性缓冲液通常是pH为7的缓冲液。可用在所述提取方法中的缓冲液的 非限制性实例是磷酸盐缓冲液，其制备过程在本领域中已知。
在另外的实施方式中，所述方法还包括例如通过离心、透析或任何其他已知的分 离方法来分离包含活性级分的上清液。例如，通过将盐导入该上清液中可由此沉淀出 提取物。
为进行提纯，所述沉淀物可进而溶解在水中或缓冲液中，并通过例如色谱分离进 行提纯。在一些实施方式中，通过将沉淀物溶解在诸如水或缓冲液等水性介质中，然 后对溶液进行色谱分离(chromatographing)来进行所述提纯，以获得纯化的提取物。
在一些其他实施方式中，提纯过程可包括：
a)使提取物沉淀物溶解在基本为中性pH的水中或缓冲液中；
b)例如通过色谱分离在例如琼脂糖凝胶或Sephadex柱上对含有溶解沉淀物的溶 液成分进行分离；和
c)用水或合适的缓冲液和不同浓度的糖，如半乳糖来洗脱所述溶液，以获得所需 的提取物。
应当注意，表现出以上特性和治疗淀粉样蛋白相关疾病或紊乱的能力的肉桂提取 物的活性级分是通过与水接触获得的。出于提纯目的，可能需要对由此获得的级分进 行进一步处理，该处理不以任何方式对提取物的生物活性产生不利影响。因此，肉桂 粗制提取物(在所讨论的提纯之前)和纯化提取物可同样且等效地应用于本发明的方 法中。
如各实例将进一步证明的，用于制造在治疗一种或多种淀粉样变性相关疾病或紊 乱中应用的提取物的提取方法不含有机溶剂。所述肉桂提取物因而称为水性提取物。 换言之，该方法的任何步骤均不涉及使用有机溶剂。这可由以下的非限制性实例加以 例证，根据该实例，来自肉桂皮的提取物可如下获得：
a)将肉桂皮研磨成粉末；
b)将所述肉桂皮搅拌入例如浓度为0.01M或0.02M的pH为7.0的水性磷酸盐缓 冲液中；
c)例如通过离心分离上清液；
d)例如，通过加入KCl或MgCl2等氯化物盐，如浓度为0.15M～0.3M的KCl 或0.08M～0.12M的MgCl2，来从上清液中沉淀出活性成分；
e)将所述沉淀物溶解在水或诸如0.01M的pH为7.0的磷酸盐缓冲液等水性缓冲 液中；
f)将所述溶液装载到琼脂糖凝胶4B柱中，接着用水性缓冲液如磷酸盐缓冲液和 水或多种浓度的半乳糖进行分阶洗脱；和
g)例如用0.15M～0.3M的半乳糖从柱中洗脱出活性级分。
应当理解，通过采用各种其他的试剂浓度和通过采用等效试剂可以改变以上方 法，条件是该方法并不背离以上给出的公开内容。另外，应当注意，提纯步骤e)～g) 是可选的，步骤d)中得到的提取物可用于本发明。
在本发明的另一方面中，提供了本文公开的肉桂皮提取物用于治疗至少一种淀粉 样蛋白相关疾病或紊乱的应用。
在本发明的又一方面中，提供了一种包含本文公开的提取物从而用于治疗淀粉样 蛋白相关疾病或紊乱的药物组合物。
本发明的药物组合物包含所述提取物作为活性成分。所述药物组合物还可包含药 学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述物质可为液体、固体或半固体状态。尽管所 述药物组合物通常有助于活性成分对有机体的施用，但本文所披露的治疗可通过单独 施用作为无载体制剂的提取物而进行。无论是通过使用预先制得的制剂还是作为无载 体的制剂，活性成分都可以根据本领域已知的多种施用技术中的任何一种进行施用， 所述施用技术包括但不限于口服施用、鼻内施用、注射施用、喷雾施用、胃肠外施用 和局部施用。
载体的选择将通过以下方式确定：部分由活性成分的特定形式确定，还由用来施 用组合物的特定方法确定。因此，存在多种适用于本发明的药物组合物的制剂。以下 制剂仅是示例性的而非限制性的。
适合于口服施用的制剂由以下制剂构成：(a)液体溶液，例如，溶解在水、盐水或 橙汁等稀释剂中的有效量的提取物；(b)胶囊、小袋、片剂、锭剂或糖锭，各制剂均 包含预定量的固体或颗粒状的活性成分；(c)粉末；(d)适宜的液体中的悬浮液；和(e) 合适的乳剂。液体制剂可包含稀释剂如水和乙醇、苄醇和聚乙烯醇等醇，并可加入或 不加入药学可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。胶囊形式可以为常见的包含例如 表面活性剂、润滑剂和诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉等惰性填料的硬壳或软壳 明胶型。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶 纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬 脂酸锌、硬脂酸和其他的赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐 剂、芳香剂以及药理学相容性载体中的一种或多种。锭剂形式可在不同的香料，通常 是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中包含活性成分，以及软锭剂在惰性基质(例如明胶和甘 油或蔗糖和阿拉伯胶、乳剂、凝胶等)中包含活性成分，并且所述基质除了所述活性 成分之外还包含本领域中已知的那些载体。
适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可包含能够使得 该制剂与预定接收者的血液进行等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及水性 和非水性的无菌悬浮液，其包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。化合物 可在药学载体中的生理学可接受的稀释剂中施用，所述载体例如无菌的液体或液体混 合物，包括水、盐水、水性葡萄糖和相关的糖溶液，如乙醇、异丙醇或十六烷基醇等 醇，如丙二醇或聚乙二醇等二醇，如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇等甘油缩酮，如 聚(乙二醇)400等醚，加入或不加入药学可接受的表面活性剂的油，脂肪酸，脂肪酸 酯或甘油酯或乙酰化的脂肪酸甘油酯(如肥皂或洗涤剂)，悬浮剂例如果胶、卡波姆、 甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素或羧基甲基纤维素，或乳化剂和其他药用辅料。
可用于胃肠外制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括 花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石油和矿物油。用于胃肠外制 剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯的实例是油酸乙酯 和肉豆蔻酸异丙酯。用于胃肠外制剂的适宜的肥皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐， 适宜的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，如二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶鎓盐，(b) 阴离子洗涤剂，如烷基、芳基和烯基的磺酸盐，烷基、烯基、醚和甘油单酯的硫酸盐， 以及磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯 -聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e) 以上物质的混合物。
该制剂中可使用适宜的防腐剂和缓冲剂。为减小或消除注射位点处的刺激，此类 组合物可包含一种或多种亲水亲油平衡(HLB)为约12～约17的非离子表面活性剂。 适宜的表面活性剂包括聚乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，例如山梨聚糖单油酸酯和氧化乙烯 与疏水基质(通过氧化丙烯与丙二醇的缩合而形成)的大分子量加合物。胃肠外制剂可 保存在单剂量或多剂量的如安瓿和小瓶等密封容器中，而且可以存储在冷冻干燥(冻 干)条件下，仅需在即将使用前加入无菌的液体载体(如水)即可用于注射。
对注射性组合物而言有效的药物载体的要求是本领域的普通技术人员公知的，参 见Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker 和Chalmers，eds.，第238～250页(1982)和ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel， 第四版，第622～630页(1986)。
本发明使用的提取物和包含所述提取物的药物组合物旨在治疗至少一种淀粉样 变性相关疾病或紊乱。本文中使用的术语“治疗”是指施用治疗学有效量的提取物或 包含该提取物的组合物，其对于下列情况是有效的：改善与淀粉样蛋白相关疾病或紊 乱有关的有害症状、在症状出现前防止其表现、减缓疾病或紊乱的发展、减缓症状的 恶化、增加缓解期的发生、减缓疾病或紊乱的慢性进展阶段中引起的不可逆损伤、延 迟所述进展阶段的开始、减轻严重程度或治愈疾病或紊乱、提高生存率或更快速的恢 复、或防止疾病或紊乱的发生，或者上述两种以上情况的组合。
术语“有效量”或其任何语言变体一般是指单独的或制剂形式的提取物的治疗量 或预防量，其在施用给受试对象(人类或非人类)时足以减少、防止、延迟和/或抑 制淀粉样变性相关疾病或紊乱的发作或发展或恶化；足以减少、缓解和/或减轻一种 或多种与所述疾病或紊乱相关的有害症状或病症的严重性、发作频率、持续时间、敏 感性或可能性和/或加快由一种或多种与所述疾病或紊乱相关的症状中的恢复。所述 有效量通常由本领域中已知的方法确定。
旨在治疗的受试对象可以是人类受试对象或非人类受试对象。有需要的受试对象 已经患有淀粉样变性相关疾病或紊乱，因此，提供所述治疗以治愈疾病、改善所述疾 病的至少一种相关症状、减少所述疾病的至少一个有害的副作用或缩短疾病的持续时 间。所述受试对象还可以是以预防方式进行治疗的个体，从而避免疾病或紊乱的发作。
本发明的“淀粉样蛋白相关疾病或病症”是在其病因和/或发展中涉及β-淀粉样 蛋白衍生的肽的积聚(特别是在大脑中)的任何疾病。一些非限制性实例包括阿耳茨海 默氏病、淀粉样变性、甲状腺髓样癌、酵母朊病毒、散发性包涵体肌炎(S-IBM)、嗜 铬细胞瘤、骨髓炎、类风湿性关节炎和肺结核，不包括糖尿病。
在一些实施方式中，所述至少一种淀粉样蛋白相关疾病是阿耳茨海默氏病。
通常，阿耳茨海默氏病的病程分为四个阶段(痴呆前兆、早期痴呆、中度痴呆和 重度痴呆)，在每个阶段表达出不同模式的认知与功能障碍。在最终确诊前该疾病可 能已发展多年。在其早期阶段，最常见的症状是记忆缺失，表现为难以记住最近获悉 的事情。稍后的症状包括精神错乱、易怒、情绪不稳、语言衰退、长期记忆缺失以及 患者随他/她的感知减退的总体退化(general withdrawal)。患者逐渐丧失了次要的和主 要的身体机能，导致死亡。
因此，有需要的受试对象可以是任何年龄并处于如上所述的任何阶段的阿耳茨海 默氏病，或者处于仅仅表现出早期疾病症状如难以记住最近获悉的事情、精神错乱和 其他症状的早期诊断阶段。因此，在本发明的某些实施方式中，所述提取物或含有该 提取物的药物组合物用于预防。
本发明也提供了所述提取物或含有所述提取物的药物组合物用于抑制原纤维聚 集和/或用于保护细胞(在一些实施方式中是PC12和/或CHO细胞)免受由淀粉样蛋 白原纤维诱发的破坏活性的应用。
本发明进而还涉及用于治疗有需要的受试对象的至少一种淀粉样蛋白相关疾病 或紊乱的方法，所述方法包括对所述受试对象施用所述提取物或含有所述提取物的组 合物。
在一些实施方式中，所述至少一种淀粉样变性相关疾病或紊乱是阿耳茨海默氏 病。
所述治疗可以单独采用本发明的组合物，或者与任何类型的现有疗法一起作为组 合疗法。现有疗法可用于控制与所述疾病有关的神经性紊乱或行为症状等。组合疗法 可同时施用或在疾病的不同阶段施用，这取决于受试对象的病症以及开业医师所要考 虑的其他参数。
本发明也提供一种用于抑制原纤维聚集(组装)和/或用于诱发解聚(分解)的 方法，所述方法包括对有需要的受试对象施用所述提取物或含有所述提取物的组合 物。
还提供一种在体内或体外保护细胞免受由淀粉样蛋白原纤维诱发的破坏活性的 方法，所述方法包括使所述细胞在体内或体外接触有效量的所述提取物或含有所述提 取物的组合物。
本发明还提供一种用于抑制原纤维形成的方法，所述方法包括对有需要的受试对 象施用所述提取物或含有所述提取物的组合物。
本发明在其另一方面中还提供一种包含本发明的提取物和使用说明书的试剂盒 或商业包装体。所述试剂盒或商业包装体还可以包括其他的要素和/或部件(例如， 小瓶、递送单元等)。
应当理解，为了清楚起见，在分开的实施方式中描述的本发明的某些特征也可以 组合在单一的实施方式中提供。相反，为简洁起见，在单一的实施方式中描述的本发 明的各种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供或适当地提供在本发明的任 何其他描述的实施方式中。在各种实施方式中描述的某些特征不被认为是那些实施方 式的必要特征，除非没有那些要素该实施方式不能操作。
如以上所描述的并如以下的权利要求部分所要求保护的本发明的多个实施方式 和方面将在下列实施例中得到实验支持。
附图说明
为了理解本发明，并揭示本发明实际上是如何得以实施，现在通过参照附图并仅 以非限定性实施例的方式对一些优选实施方式进行描述。附图中，本文中所描述的并 根据本发明应用的提取物称为“CEppt”。图中：
图1示出了肉桂提取物的光学密度曲线。
图2A～2F图示了多种量的提取物对原纤维聚集的抑制(EM观测)。图2A：只 有β-淀粉样蛋白；图2B：β-淀粉样蛋白和1μg提取物；图2C：β-淀粉样蛋白和10μg 提取物；图2D：β-淀粉样蛋白和100μg提取物；图2E：β-淀粉样蛋白和1mg提取 物；图2F：只有1mg提取物。
图3A～3B以不同的表示方法示出了多种量的提取物对原纤维聚集的抑制(ThT 荧光)。
图4A～4C显示了保护PC12(图4A)和CHO(图4B)细胞以免受淀粉样蛋白 原纤维的影响。图4C显示了肉桂提取物对PC12细胞没有毒性。
图5显示了肉桂提取物对形成β-淀粉样蛋白的有毒物种的抑制能力。
图6A～6E显示了肉桂提取物对聚集后的原纤维的分解。图6A是ThT检测结果 的图示；图6B～6E显示了在用提取物处理后时间等于0小时、24小时和72小时的 原纤维聚集。
图7A～7B显示了蝇分析。图7A：运动行为攀爬，和图7B：寿命。
图8显示了肉桂提取物对小鼠中的阿耳茨海默氏病模型的作用。
图9A～9C显示了小鼠大脑分析。图9A示出了有毒的寡聚物56*(56KD)和51KD 带的蛋白质印迹的相对强度；图9B～9C图示了脑匀浆的凝胶电泳(SDS page凝胶) 分析结果。
图10A～10H显示了多种量的肉桂提取物对α-syn原纤维聚集的抑制；图10A呈 现了ThT检测的结果；图10B呈现了波长为405nm时浊度检测的结果；图10C～10H 是在多种提取物比例下的α-syn原纤维聚集的透射电子显微镜图像。
具体实施方式
下面提供非限制性的公开内容，其例举了用于由肉桂皮制造活性级分的某些技术 并给出了结果，该结果显示了所述活性级分用于治疗和预防一种或多种如以上所公开 的疾病和紊乱的应用。正如本文中使用的，所述活性级分在本文中称为提取物。
一般方法
A.提取物的制备
采用以下三个步骤分离所述提取物：
a)在市场上购买肉桂皮，并将其研磨成粉末，然后使其在0.01M～0.02M的水性 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中搅拌过夜。通过离心分离出上清液，并将该上清液用作粗制 中和提取物；
b)采用0.15M～0.3M KCl或0.08M～0.12M MgCl2来使所述粗制提取物中的活 性物质沉淀，并将该沉淀物溶解于水或0.01M～0.02M的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中；
c)将提取物沉淀的溶液可选地装入琼脂糖凝胶4B柱中，并如下详述进行洗脱。
B.活性级分的洗脱
用0.08M～0.12M MgCl2或0.15M～0.3M KCl来使60ml的粗制提取物沉淀。 将沉淀溶解在水或0.01M～0.02M的磷酸盐缓冲液中，然后装入到预先用0.01M的 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗过的琼脂糖凝胶4B的10ml柱上。装入后，将该柱先后用缓 冲液和水洗涤，或者用0.15M、0.3M的半乳糖和多种浓度的乙腈进行分阶洗脱。发 现提取物位于用水或0.15M的半乳糖从柱中洗脱出的级分b中。图1中显示了活性 提取物的光学密度。所述活性提取物在280nm处的吸光度为10O.D每mg/ml·cm～ 20O.D每mg/ml·cm。
C.β-淀粉样蛋白的制备
将合成的冻干β-淀粉样蛋白(1-40)(Bachem，Bubendorf，Switzerland)溶解在二甲 基亚砜(DMSO)中至浓度为100μM，并进行1分钟的超声处理以避免预聚集。通过用 10mM的磷酸盐缓冲盐水(100mM NaCl，0.5mM EDTA，pH 7.4)立即稀释至最终 浓度10μM(包含10％的DMSO)而制备β-淀粉样蛋白溶液，并纳入多种浓度(1μg/ml～ 1mg/ml)的肉桂级分提取物。将肉桂溶解在DMSO中至浓度为10mg/ml，然后用 10mM PBS缓冲液(100mM NaCl，0.5mM EDTA，pH 7.4)稀释至1mg/ml、100μg/ml、 10μg/ml和1μg/ml的最终溶液。β-淀粉样蛋白的最终浓度为5μM。在随后的9天内 通过如下文所述的硫代黄素T(ThT)结合荧光和TEM(透射电子显微镜)来测定聚集。 为了分解原纤维，将β-淀粉样蛋白如上所述的溶解并稀释，然后在几个小瓶中单独老 化。在不同时间点0小时、24小时和72小时将最终浓度为100μg/ml的提取物添加 至样品中。
D.α-突触核蛋白的制备
α-syn的表达和提纯：所述蛋白在Pt7-7BL21细菌中表达，并使用如Volles和 Lansbury(Relationships between the sequence of alpha-synuclein and its membrane affinity，fibrillization propensity，and yeast toxicity，J.Mol.Biol.2007，366(5)：1510-22)所 描述的非色谱法进行提纯。在37℃以850rpm震动时对100μM的α-syn进行温育若 干天，以使在存在提取物或不存在提取物时能够生成淀粉样蛋白原纤维。
E.硫代黄素T结合荧光
在25℃对如上制备的β-淀粉样蛋白进行温育，在37℃以850rpm震动时对如上 制备的α-syn样品进行温育。采用ThT荧光检测(于450nm激发，狭缝为2.5nm， 于480nm发射，狭缝为5nm)追踪原纤维形成速率。将ThT加入到10倍稀释的样 品中，并使用Jobin Yvon Horiba Fluoromax 3荧光计进行测定。
F.透射电子显微镜法
将来自不同ThT荧光检测的样品(10μl)放在被覆有碳稳定的孚尔瓦(Formvar) 膜(SPI Supplies，West Chester，PA)的400目的铜载网上。1.5分钟后，除去过量的流体， 用10μl2％乙酸铀酰溶液对所述铜载网负染1.5分钟。最后，除去过量流体，并在80kV 时运行的JEOL 1200EX电子显微镜下观察样品。
G.细胞的细胞毒性检测
PC12嗜铬细胞瘤的细胞系常规生长在添加有8％胎牛血清、8％马血清、100U/ml 青霉素、100U/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的达氏修正依氏培养基(DMEM)中。 CHO细胞系常规生长在添加有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素和 2mML-谷氨酰胺的DMEM中。
细胞保持在37℃下包含5％CO2的湿润环境中。通过胰蛋白酶消化来获得亚融合 细胞，对其进行计数并在细胞培养基中稀释至20×104细胞/ml～30×104细胞/ml，然后 在96孔板(100μl/孔)中培养并在37℃温育过夜。为了排除血清的影响，这些孔先 用无血清的DMEM洗涤一次，然后再加入100μl的DMEM(添加有100U/ml青霉 素、100U/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺)和20μl的用或不用抑制剂(如上所述) 预先温育的5μM β-淀粉样蛋白(1-40)。各处理重复四次。在37℃温育24小时后， 使用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测根据参考文献[12]来评估细胞存活率(cell viability)。简而言之，在各孔中加入25μl的溶解有5mg/ml MTT的PBS。在37℃温 育4小时后，将100ml的提取缓冲液(20％SDS溶解在50％二甲基甲酰胺和50％DDW 溶液，pH4.7)添加至各孔中，并使板在37℃再次温育整夜。最后，使用ELISA Reader 在570nm测定颜色强度。将细胞存活率(％)计算为[存在β-淀粉样蛋白(1-40)和抑制剂 下的O.D.(570nm)*100]/[仅加入抑制剂时的O.D.(570nm)]的比例。
H.蝇(果蝇)模型
蝇维持
使果蝇(Drosophila melanogaster flies)在标准玉米粉糖蜜(corneal-molasses)培养 基上生长，并保持在25℃。由于雌性果蝇在其体内存储精子细胞，因而采用在25℃ 下羽化后不超过8小时或18℃下羽化后不超过18小时收集的处女蝇(virgin female)进 行交配。在25℃开始羽化后的至多9天内收集交配得到的成虫后代(F1)以避免收集来 自下一代(F2)的后代。
蝇交配
携带驱动子(driver)Gal4-elavcl55(在其X染色体上)的雄蝇与携带Aβ1-42转基因 (位于常染色体上)的雌蝇在UAS启动子下于纯合条件下进行交配(Crowther，D.C. 等，Intraneuronal Aβ，non-amyloid aggregates and neurodegeneration in a drosophila model of Alzheimer′s disease，Neuroscience 132，123～135，2005)。
这样得到了在其神经系统中表达Aβ1-42的第一代(F1)雌性后代，其用作阿耳茨海 默氏病的果蝇模型。携带Aβ1-42转基因但并不表达该基因(因为它们缺乏Gal4驱动 子)的雄性F1后代用作对照。
特殊蝇喂养
将提取物溶解在水中至浓度为0.75mg/ml，然后在蒸煮约10分钟后添加到标准 玉米粉糖蜜培养基中。提取物充分混入培养基中，并等分装入饲养小瓶中。小瓶在使 用前一直保持在4℃。在常规果蝇培养基上进行交配或在添加有所述提取物的培养基 上进行交配。该蝇从幼虫期开始一直在适宜的培养基上喂养。
使用的果蝇种
1.y[1]f[1]X～X elav-Gal4/Y(由Bloomington Stock center获得)。插入片段在X染 色体上。
2.w；Alz[1-42.UAS]3；β-淀粉样蛋白(1-42)肽的一个拷贝(copy)。
携带驱动子elavcl55-Gal4(在其X染色体上)的雄蝇与携带Aβ1-42转基因(位于 常染色体上)的雌蝇在UAS启动子下于纯合条件下进行交配。由此得到了在其神经 系统中表达Aβ1-42的第一代(F1)雌性后代。它们用作阿耳茨海默氏病的果蝇模型。
运动(攀爬)检测
使各自包括10只给定类别(以下提及的四种类别)的蝇的新鲜饲养小瓶在桌上 轻磕，然后使其静置18秒。随后计算随时间攀爬至测试管顶部的蝇的百分比。
寿命检测
将在具有和不具有所述提取物的培养基上于29℃饲喂的表达Aβ1-42一个拷贝的 蝇分成四类：
1.在常规培养基上表达Aβ1-42的雌性。
2.在具有所述提取物的培养基上表达Aβ1-42的雌性。
3.在常规培养基上的雄性对照(缺乏Gal4驱动子)。
4.在添加有所述提取物的培养基上的雄性对照(缺乏Gal4驱动子)。对于每种类 别，收集6个各自包括10只蝇的塑料小瓶，并每三天供给一次新鲜食物(无论是否 具有所述提取物)。羽化后每天记录具有和不具有所述提取物的存活的转基因和对照 蝇的数目。使用SPSS 11 Kaplan-Meir软件包分析存活率的差异。
I.小鼠动物模型
使用了最近开发的患有阿耳茨海默氏病(AD)转基因小鼠，其共表达由神经特异性 Thy1启动子所驱动的全部五种家族性AD(FAD)变异[13]。与具有较少FAD变异的 AD小鼠相比，这些“5XFAD”小鼠在更小的龄期就表现出显著加速的AD症状。对 两月龄的5XFAD小鼠供给正常水或包含100μg/ml所述提取物的饮用水。每周交换 两次水，以4个月为一个周期。在6月龄时，对5xfaD小鼠和未经处理的野生型非转 基因同窝对照小鼠进行标准认知测试，也就是物体识别。简言之，将小鼠放在装置中 并使其寻找物体。24小时后，使小鼠返回现包括熟悉物体和新物体的装置中。通过 与新物体交互所花费的更多时间来区分物体识别[14]。
SDS凝胶分析
在试验的最后，将动物杀死，并用生理(0.9％)盐水对其进行心脏灌注。每个处 理组的动物的一个大脑半球用来评估Aβ1-40和Aβ1-42寡聚物。简言之，使冷冻的半球 在包含蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液中进行均质化。离心后，将上清液等分并 保持在-20℃。使用12％SDS page凝胶评估匀浆的56Kd和51Kd可溶级分。使用密 度测定法对谱带强度进行定量。
结果
实施例1：通过用如本文中公开的所获得的提取物中和禽流感H9N2来测定提取 物的分子量
在搅拌下使10g肉桂粉(越南肉桂1696)的样品在200ml的0.02M、pH 7的磷酸 盐缓冲液(PB)中提取过夜。对浆液进行离心，上清液(各样品中为168ml)在具有1 KD～50KD的不同截止值(cut-off)的五个不同袋中对水透析4天。将袋外透析出的物 质经气流浓缩至袋内样品的原有体积的一半。从各袋内和袋外的流体(袋外的是两倍) 获取用于溶血检测的等分样。结果汇总于表1中。
表1：提取物分子量的测定
如结果所示，在截止值达到25KD的袋内进行透析之后，损失了约25％～30％ 的抗病毒活性。在截止值达到50KD的袋内进行透析之后，损失了约50％的抗病毒 活性，这表明提取物的分子量大于25KD。在分子量大于50kDa的级分中也可以观 察到约一半的活性。
实施例2：采用多个量的提取物抑制原纤维聚集(EM观察)
使β-淀粉样蛋白(1-40)与多个量的提取物混合或与如本文以上所述的纯化提取物 混合。9天后，如所述那样使用TEM观察各混合物。
图2A示出了不存在提取物时(w.t.仅有β-淀粉样蛋白)β-淀粉样蛋白(Aβ)衍 生的肽(Aβ1-40)积聚成原纤维。提取物浓度为1μg/ml(图2B)和10μg/ml(图2C) 时已经观察到对原纤维形成的部分抑制。更大量的提取物则足以实现对检验的β-淀粉 样蛋白的原纤维形成的完全抑制(图2D和2E)。
实施例3：采用多个量的提取物抑制原纤维聚集(ThT荧光)
使β-淀粉样蛋白(1-40)与多个量的提取物混合或与洗脱出的提取物混合。在随后 的9天内每天使用硫代黄素T(ThT)荧光检验测定原纤维形成速率。
图3A示出了抑制的动力学。在1μg/ml提取物的极低浓度下出乎意料地观察到 对原纤维形成的部分抑制。在10μg时观察到对检验的β-淀粉样蛋白的原纤维形成的 完全抑制。图3B中在216小时显示了同样的结果。
实施例4：细胞的保护
使PC12嗜铬细胞瘤和CEO细胞系在96孔板(100μl/孔)中于达氏修正依氏培 养基(DMEM)中进行培养，各细胞系具有适宜的添加物。在各孔中加入用或不用抑 制剂(如上所述)预先温育的5μM的20μlβ-淀粉样蛋白(1-40)。24小时后，使用 如上所述的溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)检测来评估细胞存活率。
如结果所示，所述提取物保护PC12(图4A)和CHO(图4B)细胞免受淀粉样 蛋白原纤维诱发的破坏活性。正如对PC12细胞的测试(图4C)，提取物本身对细胞 无毒。
实施例5：提取物抑制有毒种类的β-淀粉样蛋白的形成
图5示出了肉桂提取物能够抑制β-淀粉样蛋白的有毒、可溶性球聚体物种(在该 图中称为球聚体-有毒)的形成。这些结果显示了在β-淀粉样蛋白的原纤维形成的早 期阶段的抑制，证实并强调了以上的实施例1～4中讨论的结果(图2～4)。所述抑 制剂看起来稳定了无毒的早期低聚物，并抑制其进一步生长为有毒物种。
实施例6：利用提取物使原纤维在聚集后分解
使β-淀粉样蛋白(1-40)单独温育，或在加入肉桂提取物(100μg/ml)后温育。在 0～72小时后以不同的时间间隔加入提取物。如图6所示，在ThT检测(图6A)和 EM分析(图6B～6E)中均观察到原纤维的全部分解。因此，所述提取物显然引起 已聚集的原纤维的抑制和分解。
实施例7：蝇分析-运动行为(攀爬)和寿命
为评估所述提取物对活体的作用，使用AD的果蝇模型。使用Gal4-UAS系统在 其神经系统内表达人Aβ1-42蛋白的转基因蝇显示各种AD症状的痕迹，包括随年龄恶 化的有缺损的运动和记忆，以及显著减少的寿命。它们的大脑显示出特征性的淀粉样 蛋白斑及病理。
使携带泛神经元elav-Gal4驱动子(在其X染色体上)的雄蝇和对常染色体UAS 调节的Aβ1-42转基因纯合的雌虫交配，得到在其神经系统中表达Aβ1-42的雌性后代， 和由于缺乏Gal4驱动子而只携带Aβ1-42转基因却不表达该基因的雄性后代(用作对 照)。在常规果蝇培养基上进行或在添加有0.75mg/ml提取物的培养基上进行交配。 该动物从幼虫期开始一直在适宜的培养基上喂养。每天监测各类后代的运动(攀爬) 和生存率。
如图7A所示，表达Aβ1-42的蝇在从蛹壳羽化时行为正常，稍后发展出运动缺损。 在羽化四天后，这些蝇表现为其攀爬能力明显降低，而到第10天时则变得几乎不动 (灰色柱)，而对照组在此时极为活跃(条纹柱)。相反，在包含所述提取物的培养基 上饲养的表达Aβ1-42的蝇显示出明显的改善(黑色柱)，其行为与对照组(在无所述 化合物的培养基上饲养的雄性)几乎相同。重要的是，未观察到所述提取物对对照蝇 的运动的影响(格线柱)。
由图7B可以看出，在常规培养基上生长的表达Aβ1-42转基因的蝇(AD蝇)的 寿命(虚线)显示出比对照(雄性)组明显更短的寿命。第16天时，仅有50％的表 达Aβ1-42转基因的蝇仍然存活，而在对照组中在28天后才观察到50％的存活率。在 包含提取物的培养基上饲养的表达Aβ1-42蝇的寿命更长，与在常规培养基上生长的对 照蝇的寿命几乎相同。对于处理组，也在第28天观察到50％的存活率。所述提取物 对对照蝇的寿命没有显著影响。使用SPSS 15 Kaplan-Meier软件包进行统计分析。结 果显示，在常规培养基上生长的表达Aβ1-42转基因的雌虫与在具有提取物的培养基上 生长的雌虫存在明显差异(时序检验：x2＝3.903，d.f.＝1，P＜0.0005)。相反，对于在 具有提取物的培养基上生长的雌虫和对于在具有提取物的培养基上生长的对照雄虫 则没有观察到明显差异(时序检验：x2＝3.903，d.f.＝1，P＞0.522)。
更详细的说，图7A图示了运动攀爬行为的分析；使用攀爬检测来分析各自包括 几个测试管(每管中10只蝇)的如下四组：在常规培养基上生长的表达Aβ1-42的雌 性(灰色柱)、在包含提取物的培养基上生长的表达Aβ1-42的雌性(黑色柱)、在常规 培养基上生长的携带Aβ1-42转基因但却不表达该基因的雄性对照蝇(条纹柱)和在提 取物上生长的雄性(格线柱)。每日监测用18秒攀爬至测试管顶部的蝇的百分比。用 提取物处理的表达Aβ1-42的雌虫比未用提取物处理的表达Aβ1-42的雌虫的攀爬行为更 好。
图7B图示了寿命检测，其中评估了三组的寿命。结果显示了：在常规培养基上 生长的表达Aβ1-42的AD蝇雌性后代(虚线)、在包含提取物的培养基上生长的表达 Aβ1-42的雌性后代(实线)和在提取物上生长的雄性对照(点线)。用提取物处理的 蝇的寿命更长。
实施例8：小鼠行为-物体识别
对所述提取物对AD模型小鼠的作用进行了检验。进行检验的小鼠是AD转基因 小鼠，其共表达由神经特异性Thy1启动子所驱动的全部五种家族性AD(FAD)变异。 与具有较少FAD变异的AD小鼠相比，这些“5XFAD”小鼠在更小的龄期就表现出 显著加速的AD症状。例如，这些小鼠在2月龄就已经患有脑淀粉样蛋白斑和神经胶 质增生，造成巨大的Aβ负担。它们减少了突触标记并表现出神经元缺损，这是在大 多数AD转基因模型中缺失的AD基本特征，并且还显示出Y型迷宫中的记忆障碍。 对两月龄的5XFAD小鼠供给正常水或包含100μg/ml所述提取物的饮用水，持续4 个月。在该月龄对所述小鼠进行标准认知测试，也就是物体识别。
用所述提取物处理的5XFAD动物比用正常水处理的5XFAD动物花费明显更长 的时间(p＜0.0036)来寻找新物体，表明使用提取物的处理显著改善了认知。因此， 图8显示了通过测试3组5XFAD变异“AD”小鼠获得的结果：WT(黑柱)、安慰 剂APP-Tg(白柱)和经处理的APP-Tg(APP-淀粉样蛋白前体蛋白)小鼠(灰柱)。 安慰剂转基因小鼠饮用水；而经处理的转基因小鼠饮用包含100μg/ml的本发明提取 物的水。
进行物体识别测试时，口服使用提取物显示出对认知行为的改善。所述提取物(灰 柱)显著改善了转基因小鼠的认知表现，几乎达到非转基因小鼠的水平(黑柱)。
实施例9：使用脑匀浆的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS page凝胶) 对小鼠大脑的分析
还对与认知改善有关的经处理的小鼠大脑中β-淀粉样蛋白的可溶级分是否减少 的问题进行了检验。通过12％SDS-Page凝胶对小鼠脑匀浆的可溶级分进行分析，并 用特异性β-淀粉样蛋白抗体6E10对其进行探查。使对照的非处理AD模型的三个小 鼠大脑与经提取物处理的AD模型的3个小鼠大脑进行比较。图9A中示出了有毒寡 聚物56*(56KD)和51KD带的蛋白质印迹的相对强度。结果显示，与对照的未处理的 AD小鼠的大脑相比，用提取物处理的AD模型的大脑中的有毒56KD和51KD寡聚 物有50％～60％的减少(图9B～9C)。
实施例10：通过多个量的提取物抑制α-syn原纤维积聚(ThT检测、浊度检测和 EM观察)
使α-syn(100μM)与如上所述的多个量的提取物混合。在随后的2天内通过硫 代黄素T(ThT)荧光检测、EM和浊度检测每天检验原纤维形成的速率。在约为 256∶1(α-syn∶提取物)的低摩尔比浓度下观察到对原纤维形成的完全抑制。在图10A～ 10H中，摩尔比表示为α-syn∶提取物。
ThT检测(图10A)和透射电子显微镜(图10C)表明，所述提取物即使在 256∶1(α-syn∶提取物)的低比率下也抑制了α-syn原纤维的聚集，图10B的浊度则在16∶1 的比率下得以抑制。