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本发明提供用于治疗人中癌症的组合物和方法。本发明包括施用基因修饰的Th17细胞以表达CAR，其具有抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。

1.  编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。

2.  权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

3.  权利要求1所述的分离的核酸序列，包括SEQ ID NO:8的核酸序列。

4.  权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

5.  权利要求4所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。

6.  权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。

7.  权利要求1所述的分离的核酸序列，进一步包括包含共刺激分子的细胞内结构域的共刺激信号传导区，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体，和其任意组合。

8.  权利要求1所述的分离的核酸序列，其中所述ICOS细胞内信号传导结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。

9.  权利要求2所述的分离的核酸序列，其中所述CD3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。

10.  细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。

11.  权利要求10所述的细胞，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

12.  权利要求10所述的细胞，其中所述核酸序列包括SEQ ID NO:8的核酸序列。

13.  权利要求10所述的细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。

14.  权利要求13所述的细胞，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。

15.  权利要求10所述的细胞，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。

16.  权利要求10所述的细胞，其中所述CAR进一步包括包含共刺激分子的细胞内结构域的共刺激信号传导区，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体，和其任意组合。

17.  权利要求10所述的细胞，其中所述ICOS细胞内信号传导结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。

18.  权利要求11所述的细胞，其中所述CD3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。

19.  权利要求10所述的细胞，其中所述细胞选自Th17细胞和Tc17细胞。

20.  权利要求10所述的细胞，其中当所述抗原结合结构域结合其相应的抗原时，所述细胞展示抗肿瘤免疫性。

21.  用于哺乳动物中刺激T细胞介导的对靶细胞群体或组织的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。

22.  权利要求21所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

23.  哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，从而在所述哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。

24.  权利要求23所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

25.  治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、病症或状况的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，从而治疗所述哺乳动物。

26.  权利要求25所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

27.  权利要求25所述的方法，其中所述细胞选自自体Th17细胞和自体Tc17细胞。

28.  治疗具有癌症的人的方法，所述方法包括向所述人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中所述细胞选自Th17细胞和Tc17细胞。

29.  权利要求28所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

30.  权利要求28所述的方法，其中所述人抵抗至少一种化疗剂。

31.  在诊断有癌症的人中产生基因改造的T细胞的持续性群体的方法，所述方法包括向所述人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中所述基因改造的细胞的持续性群体在施用之后在所述人中持续至少一个月，并且其中所述细胞选自Th17细胞和Tc17细胞。

32.  权利要求31所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

33.  权利要求31所述的方法，其中所述基因改造的T细胞的持续性群体包括选自下述的至少一种细胞：施用至所述人的细胞、施用至所述人的细胞的子代，和其组合。

34.  权利要求31所述的方法，其中所述基因改造的T细胞的持续性群体包括记忆T细胞。

35.  权利要求31所述的方法，其中所述基因改造的T细胞的持续性群体在施用之后在所述人中持续至少三个月。

36.  权利要求31所述的方法，其中所述基因改造的T细胞的持续性群体在施用之后在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。

37.  权利要求31所述的方法，其中所述癌症被治疗。

38.  在诊断有癌症的人中扩张基因改造的T细胞群体的方法，所述方法包括向所述人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中所述施用的基因改造的细胞选自Th17细胞和Tc17细胞，进一步其中所述施用的基因改造的细胞在所述人中产生子代T细胞的群体。

39.  权利要求38所述的方法，其中所述CAR进一步包括CD3ζ信号传导结构域。

40.  权利要求38所述的方法，其中所述人中的所述子代T细胞包括记忆T细胞。

41.  权利要求38所述的方法，其中所述细胞是自体细胞。

42.  权利要求38所述的方法，其中所述子代T细胞的所述群体在施用之后在所述人中持续至少三个月。

43.  权利要求38所述的方法，其中所述子代T细胞的所述群体在施用之后在所述人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。

44.  权利要求38所述的方法，其中所述癌症被治疗。

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相关申请的交叉引用
本申请要求2012年2月22日提交的美国临时申请系列号61/601,910的优先权，其内容通过引用以它们的整体并入本文。
发明背景
基因修饰的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的开发已经为许多新的用于癌症和其他病症的潜在的疗法找到了出路。一般而言，CARs包括细胞外抗原识别结构域和细胞内结构域。细胞内结构域精确的组成可为CAR和表达CAR的细胞群体提供独特的特征。
CD278或可诱导的-T-细胞共刺激分子(ICOS)是一般在活化的T细胞上表达的共刺激分子。已经显示，除了CD28，经可诱导的共刺激分子(ICOS，也称为CD278)的信号传导对于最佳的细胞因子分泌是必要的，因为两种分子对于通过鼠Th17细胞的最佳的IL-17A分泌是必须的(Park等，2005Nat.Immunol.6:1133–1141)。最近鼠模型中的发现已经揭示ICOS通过诱导转录因子c-MAF表达和所以反式激活IL-21产生而放大Th17反应(Bauquet等，2009Nat.Immunol.10:167–175)。尽管已经产生了包括ICOS的嵌合受体(美国专利出版US2006/0247191)，但是不知道ICOS结构域在影响CAR介导的抗肿瘤活性，CAR介导的Treg增殖，或T细胞持久性中起什么作用。
取决于存在的微环境线索，天然CD4+T细胞可分化成数种T辅助(TH)细胞系，包括TH1、TH2、Th17、TH22之一和调节T(Treg)细胞(O’Shea等，2010Science327:1098–1102；Murphy等，2010Nat.Immunol.11:674–680)。加强宿主防御的Th17细胞在粘膜免疫性中起主要作用，增强许多自身免疫病，并且释放细胞因子，包括IL-17A和IL-17F(Korn等，2009Annu.Rev.Immunol.27:485–517)。Th17细胞对肿瘤免疫性的贡献不同，显示对抗肿瘤发生和原致癌性活性二者的潜能(Zou等，2010Nat.Rev.Immunol.10:248–256)。所以，识别控制Th17应答的机制对于理解肿瘤免疫性是至关重要的。尽管最近在用于治疗癌症的CAR基疗法中取得了进展，但是现在已经有了任何已知的使用遗传改变的Th17细胞的疗法。
因此，本领域非常需要使用增加遗传改变的Th17细胞抗肿瘤活性和持久性的CAR治疗癌症的组合物和方法。本发明解决了该需求。
发明内容
本发明提供编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。
在一个实施方式中，CAR的核酸序列进一步包括CD3ζ信号传导结构域。
在一个实施方式中，分离的CAR的核酸序列包括SEQ ID NO:8的核酸序列。
在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，抗原结合片段是Fab或scFv。
在一个实施方式中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原。在一个实施方式中，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。在一个实施方式中，肿瘤抗原与实体瘤相关。
在一个实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮蛋白、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR，和其任意组合。
在一个实施方式中，CAR的核酸序列进一步包括包含共刺激分子的细胞内结构域的共刺激信号传导区，所述共刺激分子选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体，和其任意组合。
在一个实施方式中，ICOS细胞内信号传导结构域由SEQ ID NO:6的核酸序列编码。
在一个实施方式中，CD3ζ信号传导结构域由SEQ ID NO:7的核酸序列编码。
本发明也提供载体，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。
本发明也提供细胞，其包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。
本发明也提供用于哺乳动物中刺激T细胞介导的对靶细胞群体或组织的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域。
本发明也提供哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，从而在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。
本发明也提供治疗具有与升高的肿瘤抗原表达相关的疾病、病症或状况的哺乳动物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的基因修饰以表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，从而治疗哺乳动物。
在一个实施方式中，细胞选自自体Th17细胞和自体Tc17细胞。
本发明也提供治疗具有癌症的人的方法，所述方法包括向人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中细胞选自Th17细胞和Tc17细胞。
在一个实施方式中，人抵抗至少一种化疗剂。
本发明也提供在诊断有癌症的人中产生基因改造的T细胞的持续性群体的方法，所述方法包括向人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中基因改造的细胞的持续性群体在施用之后在人中持续至少一个月，和其中细胞选自Th17细胞和Tc17细胞。
在一个实施方式中，基因改造的T细胞的持续性群体包括选自下述的至少一种细胞：施用至人的细胞、施用至人的细胞的子代，和其组合。
在一个实施方式中，基因改造的T细胞的持续性群体包括记忆T细胞。
在一个实施方式中，基因改造的T细胞的持续性群体在施用之后在人中持续至少三个月。
在一个实施方式中，基因改造的T细胞的持续性群体在施用之后在人中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、两年或三年。
本发明也提供在诊断有癌症的人中扩张基因改造的T细胞群体的方法，所述方法包括向人施用基因改造的表达CAR的细胞，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和ICOS细胞内信号传导结构域，其中施用的基因改造的细胞选自Th17细胞和Tc17细胞，进一步其中施用的基因改造的细胞在人中产生子代T细胞的群体。
附图说明
当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图显示的实施方式的精确布置和手段。
图1描绘SS1-ICOS-z的核苷酸序列。含有SS1-ICOS-z CAR的cDNA序列克隆进入第三代慢病毒载体并且在EF-1启动子(SEQ ID NO:16)的控制下表达。SS1-ICOS-z含有CD8前导序列、识别人间皮蛋白的SS1单链片段、CD8α链的铰链区、ICOS跨膜和细胞内结构域和TCR-z信号转导结构域。
图2，包括图2A和图2B，描绘改变的Th17细胞的产生。图2A描绘含有SS1单链片段和不同细胞内结构域的一组嵌合受体的示意性表示。新颖性ICOS基CAR含有与ICOS细胞内结构域串联的TCR-ζ信号转导结构域。图2B描绘评估SS1scFv融合蛋白在人初级CD4+T细胞上表达的流式细胞术试验的结果，归一化 为针对所有受体的60％嵌合受体表达。
图3描绘实施例实验的结果，表明ICOS基CAR改变的Th17细胞释放大量的IL17-A、IL-17F和CCL20但是少量的IL-2。Th17细胞(4×10⁵，60％嵌合受体阳性)与2×10⁵K562meso细胞在没有Th17极化细胞因子或IL-2的培养基中共培养。共培养24h之后获得上清液，并且通过ELISA分析细胞因子产生。误差棒指示三重样品的标准偏差(SD)。三个实验的代表。
图4描绘实施例实验的结果，表明ICOS通过人Th17细胞加强IL-17A产生。来自5个不同正常供体的T_H17细胞(4×10⁵，60％嵌合受体阳性)与2×10⁵K562meso细胞在没有Th17极化细胞因子或IL-2的培养基上共培养。共培养24h之后获得上清液，并且通过ELISA分析IL-17A产生。
图5，包括图5A至图5C，描绘实施例实验的结果，表明ICOS基CAR改变的Th17细胞在肿瘤细胞中抗原识别之后释放大量的IL17-A和IFNγ但是少量的IL-2。Th17细胞(4×10⁵，60％嵌合受体阳性)与2×10⁵K562、K562meso或指示的肿瘤细胞在没有Th17极化细胞因子或IL-2的培养基中共培养。共培养24h之后获得上清液，并且通过ELISA分析(A)IL-17A、(B)IL-2和(C)IFNγ。误差棒指示两个样品的标准偏差(SD)。
图6，包括图6A和图6B，描绘实施例实验的结果，其评估嵌合受体改变的Th17/Tc17细胞的溶细胞活性。Tc17和Th17细胞的混合物(以4:1的比)与用CFSE染色的L55靶细胞以指示的效应子-靶(E:T)比例共培养4h。图6A图解特异性细胞溶解，如使用流式细胞术基试验确定。图6B描绘ED50，如对于每个组使用四参数逻辑回归模型确定。四个实验的代表。
图7，包括图7A和图7B，描绘实施例实验的结果，表明用ICOS基CAR改变的Th17/Tc17细胞根除大的预先建立的肿瘤并且显示增强的体内持久性。在NSG小鼠的腰窝中建立人初级M108肿瘤。8周之后，当肿瘤达到体积为500mm³时，小鼠用在61和67天的2个瘤内注射10×10⁶个Th17/Tc17细胞(80％/60％嵌合受体-阳性)或PBS治疗。图7A描绘平均肿瘤体积(+/-SEM)，所有组n＝9。在通过心脏内穿刺T细胞注入之后51天获得来自用改变的Th17/Tc17细胞瘤内注射治疗的负载M108的NSG小鼠的外周血。图7B图解通过FACS Trucount试验存在的人CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量。结果表达为每μL外周血的平均绝对T-细胞计数+/-SD(所有组n＝9)。
图8，包括图8A至8D，表明用ICOSz改变的T_H17细胞显示增加CD161的表达。改变的T_H17细胞与照射的表达间皮蛋白的APC共培养。图8A和8B描绘通过流式细胞术在指示的时间点分析通过CAR⁺CD4⁺T细胞应答间皮蛋白特异性刺激的CD161表达。图8C描绘在第8天在数个不同的正常供体(n＝9)中表达CD161的CAR⁺CD4⁺T细胞的百分数被绘制。图8D描绘在第8天CAR+和CAR-细胞中的CD161表达。误差棒表示SEM(5个不同的正常供体)。
图9，包括图9A和图9B，描绘使用包括其他共刺激结构域组合的CAR的实施例实验的结果。图9A描绘ICOS基CAR，其含有TCR-ζ信号转导结构域，以及ICOS和CD137(4-1BB)共刺激结构域三者。图9B描绘下述图，其图解并入CD137信号传导结构域以及ICOS不改变用仅仅含有ICOS共刺激结构域的CAR改变的Th17细胞的细胞因子曲线。Th17细胞(4×10⁵，60％嵌合受体阳性)与2×10⁵K562、K562meso或指示的肿瘤细胞在没有外源性细胞因子的情况下共培养。共培养24h之后获得上清液，并且通过ELISA分析IL-17A、IL-2和IFNγ。误差棒指示两个样品中的标准偏差(SD)。
图10，包括图10A至10C，是一系列图像，表明ICOSz改变的T_H17细胞显示增加的T_H17相关的基因表达。改变的T_H17细胞用源自固定的酵母的重组体间皮蛋白刺激。基因表达水平在刺激之前第0天并且抗原识别后4h、8h、24h和96h测定。图10A描绘选择的差别表达的基因的归一化的Log2表达(FC>2，FDR<0.05)。误差棒表示SEM(3个不同的正常供体)。图10B描绘T辅助签名基因在4h相对于0h的表达的log2倍变化的热图。图3C描绘精巧通路富集的热图(IPA，p<0.01)。
具体实施方式
本发明涉及组合物和方法用于治疗癌症，包括但不限于血液学恶性肿瘤和实体瘤。本发明涉及转导表达嵌合抗原受体(CAR)的Th17细胞的过继细胞转移的策略。CAR是结合基于抗体的针对期望的抗原(例如，肿瘤抗原)的特异性与T细胞受体-激活细胞内结构域以产生展示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
本发明一般涉及基因修饰以表达期望的CAR的T细胞的使用。表达CAR的T细胞本文称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，细胞可被基因修饰以在其表面上表达抗体结合结构域，赋予不依赖MHC的新型抗原特异性。在一些情况下，T细胞被基因修饰以表达CAR，其将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcγRI蛋白质的细胞内结构域结合为单个嵌合蛋白。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一实施方式中，跨膜结构域可被选择或通过氨基酸取代修饰，以避免此类结构域与相同的或不同的表面膜蛋白质的跨膜结构域的结合以使得与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。在一些实施方式中，细胞外结构域也包括铰链结构域。优选地，铰链结构域包括CD8α铰链结构域。
就细胞质结构域而言，本发明的CAR可设计为本身包括ICOS信号传导结构域或与用于本发明的CAR背景的任何其他期望的细胞质结构域(一个或多个)结合。在一个实施方式中，CAR的细胞质结构域可设计为进一步包括CD3-ζ、4-1BB 和/或CD28的信号传导结构域。例如，CAR的细胞质结构域可包括但不限于ICOS、CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导组件和其组合。因此，本发明提供CAR T细胞和它们用于过继性疗法的方法。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过将包括期望的CAR的慢病毒载体引入细胞产生，所述CAR是例如包括抗间皮蛋白、CD8α铰链、ICOS跨膜结构域和人ICOS和CD3ζ信号传导结构域的CAR。在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞能够在体内复制产生可导致持续的肿瘤控制的长期持久性。
在另一实施方式中，本发明的CAR T细胞可通过将编码期望的CAR的RNA转染进入细胞产生，所述CAR是例如包括抗间皮蛋白、CD8α铰链、ICOS跨膜结构域和人ICOS和CD3ζ信号传导结构域的CAR。在一个实施方式中，CAR在基因修饰的CAR T细胞中瞬时表达。
在一个实施方式中，本发明涉及施用基因修饰的表达CAR的T细胞用于使用淋巴细胞注入治疗具有癌症或处在具有癌症风险的患者。优选地，自体淋巴细胞注入用于治疗。自体PBMCs收集自需要治疗的患者并且使用本文所述的和本领域已知的方法将T细胞活化和扩张并且然后注入回到患者。
在一个实施方式中，本发明涉及基因修饰的表达CAR的Th17细胞用于治疗具有癌症的患者。本发明基于发现ICOS信号传导结构域包括在CAR的细胞质结构域中增加Th17持久性，增加IL-17产生，增加Th17细胞的抗肿瘤活性，并且减少IL-2产生。在一个实施方式中，减少表达含有CAR的ICOS的Th17细胞产生的IL-2减少免疫抑制Treg细胞的增殖。
在仍另一实施方式中，本发明一般涉及治疗处在发展癌症风险的患者。本发明也包括治疗恶性肿瘤或自身免疫病，其中化疗和/或免疫疗法在患者中导致显著的患者的免疫抑制，从而增加患者发展癌症的风险。
本发明包括使用表达抗间皮蛋白CAR，包括CD3-ζ和ICOS共刺激结构域的Th17细胞(也称为表达CAR的Th17细胞)。在一个实施方式中，本发明表达CAR的Th17细胞可经历强劲的体内扩张并且可建立抗原特异性记忆细胞，其以高水平在血液和骨髓中持续延长的时间量。在一些情况下，注入患者的本发明表达CAR的Th17细胞可消除具有某种形式癌症的患者体内的癌细胞。但是，本发明不限于表达CAR的Th17细胞。而是，本发明包括与一个或多个细胞内结构域融合的任何抗原结合结构域，所述细胞内结构域选自ICOS信号传导结构域、CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域，和其任意组合。
定义
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等于本文描述的那些的任何方法和物质，但优选的材料和方法在本文中进行描述。 在描述和要求保护本发明中，将使用以下术语。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文使用冠词“一个(a)”和“一个(an)”，指的是该冠词语法对象的一个或多于一个(即，指的是至少一个)。以例子说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
如本文使用的“大约”，当指的是可测量的值诸如量、时间期间等时，表示包括从给定值±20％或±10％的变化，更优选±5％，甚至更优选±1％，和还要更优选±0.1％的变化，只要这种变化适于实施公开的方法。
“活化”，如本文所用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”等指的是经历细胞分裂的T细胞。
术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)₂，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等，1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
“抗体重链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较大的链。
“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以它们自然发生构象存在于所有抗体分子的两种类型的多肽链中较小的链，κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的，术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，由如本文所述的噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用的，术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解任何大分子——实际上包括所有的蛋白质或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重组或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的 蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于，多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置，以引起期望的免疫应答。此外，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这种生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
如本文所用的，术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌性状况相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置发生的能力清楚表示。
根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源(foreign)的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。
如本文所用的，术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的病症。自体免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(1型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
“同种异基因的(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用的，术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其他部分。各种癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联(cognate)共刺激分子的抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、 CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，和与CD83特异性结合的配体，所述共刺激分子诸如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此介导T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合，诸如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，和其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“病症”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该病症相比不太有利。保持不治疗，病症不必定引起动物健康状态的进一步降低。
如本文所用的，“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
“编码”指的是多核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特异性序列用作模板合成在生物学过程中的其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的编码链，和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链两者，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用的，“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的物质。
如本文所用的，术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同 一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。以例子说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
如本文所用的，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物诸如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文所用的，“指导物质”包括出版物、记录、图表或任何其他可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导物质可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导物质可与容器分开地运送，目的是指导物质和化合物由接受者配合使用。
“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，诸如宿主细胞。
在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其程度为编码该蛋白质的核苷酸序列可在某些版本中包含内含子(一个或多个)。
如本文所用的，“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以它们是基因传递载体的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平基因体内转移的工具。
如本文所用的，术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相 比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象优选人的有益的治疗性应答。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
如本文所用的，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所用的，核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸为可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段包括但不限于重组手段，即，从重组文库或细胞基因组，利用普通克隆技术和PCR^TM等等克隆核酸序列，和合成手段。
如本文所用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须包含至少两个氨基酸，和对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所用的，该术语指的是短链，其在本领域中也例如通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的，术语“启动子”被定义为开始多核苷酸序列的特异性转录需 要的，由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。
如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物表达所需的核酸序列。在一些例子中，该序列可为核心启动子序列，并且在其他例子中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
如本文所用的，关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的特异性类别。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别成为特异性的。在一些例子中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可参考抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体通常识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子，将降低结合至抗体的标记的A的量。
通过术语“刺激”指通过结合刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与它的关联配体，由此介导信号转导事件——诸如但不限于经TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的改变的表达，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文所用的，“刺激配体”指如此配体，其当存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的开始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括，特别是利用肽、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”、“患者”和“个体”在本文互换使用，并且意欲包括在其内可引起免疫应答的活有机体(例如，哺乳动物)。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
如本文所用的，“基本上纯化的”细胞为基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与以其天然发生状态与其正常相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些例子中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其他例子中，该术语简单地指的是已经与以其天然状态与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，体外培养细胞。在其他实施方式中，不在体外培养细胞细胞。
如本文所用的，术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效应通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以防止治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻治疗的病症或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或病症的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
如本文所用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如此过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经由外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括初级对象细胞和它的子代。
如本文所用的，短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
范围：在该公开中，本发明的多个方面可以以范围形式中示出。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为已具体公开了所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，范围诸如从1至6的描述应被考虑为已具体公开了 子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
描述
本发明提供组合物和方法用于治疗癌症以及其他疾病。癌症可以是血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发或转移性肿瘤。使用本发明的组合物和方法可治疗的其他疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫病。
在一个实施方式中，本发明提供工程化的表达CAR的细胞(例如，Th17细胞)，其中CAR T细胞展示抗肿瘤性质。本发明的CAR可被工程化以包括细胞外结构域，所述细胞外结构域具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如，CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原为间皮蛋白，因为该抗原在大部分癌上表达。然而，本发明不限于靶向间皮蛋白。相反地，本发明包括任何抗原结合结构域，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷(tumor burden)缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与选自ICOS信号传导结构域、CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个细胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括ICOS信号传导结构域。这是因为本发明部分基于CAR-介导的Th17细胞的T-细胞应答可通过添加共刺激结构域进一步增强的发现。例如，包括ICOS信号传导结构域，与其他相同的没有被工程化表达ICOS的CAR T细胞相比显著增加表达CAR的Th17细胞的IL-17产生、抗肿瘤活性和体内持久性。重要地，CAR中包括ICOS信号传导结构域也显著减少IL-2产生。在一个实施方式中，减少和/或消除IL-2产生是有益的，因为CAR不触发调节T细胞增殖。
在一些实施方式中，本发明涉及编码CAR的逆转录病毒或慢病毒载体，其稳定地并入Th17细胞并且稳定地在其中表达。在其他实施方式中，本发明涉及编码CAR的RNA，其转染进入Th17细胞并且在其中瞬时表达。细胞中CAR的瞬时非整合表达减轻了与CAR在细胞中永久和整合表达的考虑。
组合物
本发明提供了包括细胞外结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)。细胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合结构域。在一些实施方式中，细胞外结构域也包括铰链结构域。细胞内结构域或另外的细胞质结构域包 括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子为除抗原受体或它们的配体外淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的细胞质结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的细胞外结构域或细胞质结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
本发明包括表达CAR的逆转录病毒和慢病毒载体构建体，其可直接转导进入细胞。本发明也包括可直接转染进入细胞的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法包括用具有专用设计的引物模板的体外转录(IVT)，随后多聚腺苷酸添加，以产生构建体，其含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)、5'帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的基因和多聚腺苷酸尾，典型地长度为50-2000个碱基。如此产生的RNA可有效地转染不同类型的细胞。在一个实施方式中，模板包括CAR的序列。
优选地，CAR包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。细胞外结构域和跨膜结构域可源自此类结构域的任何期望来源。
在一些情况下，本发明CAR的铰链结构域包括CD8α铰链结构域。在一个实施方式中，CD8铰链结构域包括SEQ ID NO:4的核酸序列。在另一实施方式中，CD8铰链结构域包括由SEQ ID NO:4的核酸序列编码的氨基酸序列。
抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包括另外被称为抗原结合结构域的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域，以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的例子包括与病毒、细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
在一个实施方式中，本发明的CAR可经由工程化特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合结构域而被工程化，以便靶向兴趣肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性病症(hyperproliferative disorder)抗原”或“与过度增生性病症相关的抗原”指的是对于特定过度增生性病症诸如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
肿瘤抗原是由引起免疫应答特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合结构域的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、 β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应的AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原诸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子诸如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原诸如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原诸如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其他候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的标靶。
本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。TAA相关的抗原不是对肿瘤细胞唯一的，并且相反，其在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的状况下，也在正常细胞上进行表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够反应抗原的状况下发生。TAA可为在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能反应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可为在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。
TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原诸如MART-l/MelanA(MART-1)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原诸如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因诸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p15、p16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在优选的实施方式中，CAR的抗原结合结构域部分靶向下述抗原，其包括但不限于CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮蛋白、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGE A3TCR等等。
取决于期望的待靶向的抗原，本发明的CAR可被工程化以包括适当的对期望的抗原靶特异的抗原结合部分。例如，如果间皮蛋白是期望的待靶向的抗原，那么间皮蛋白的抗体可用作用于并入本发明的CAR的抗原结合部分。
在一个实施方式中，本发明CAR的抗原结合结构域部分靶向间皮蛋白。优选地，本发明CAR的抗原结合结构域部分是SS1scFv，其识别人间皮蛋白，其中SS1scFv的核酸序列包括SEQ ID NO:3中阐释的序列。在另一实施方式中，本发明的CAR的SS1scFv部分包括由序列SEQ ID NO:3中阐释的核酸序列编码的氨基酸序列。
跨膜结构域
对于跨膜结构域，CAR可被设计以包括融合至CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸取代进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。在天然来源中，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS(即至少包括上述中的跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端上发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
优选地，本发明CAR的跨膜结构域包括ICOS跨膜结构域。在一个实施方式中，ICOS跨膜结构域包括SEQ ID NO:5的核酸序列。在另一实施方式中，ICOS跨膜结构域包括由SEQ ID NO:5的核酸序列编码的氨基酸序列。
细胞质结构域
本发明的CAR的细胞质结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的 细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多例子中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的CAR的细胞内信号传导结构域的优选例子包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可认为由两个不同类的细胞质信号传导序列介导：通过TCR开始抗原-依赖性初级活化的那些(初级细胞质信号传导序列)和以抗原-非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
包含在本发明中具有具体用途的初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的细胞质信号传导分子包括源于CD3ζ的细胞质信号传导序列。
在优选的实施方式中，CAR的细胞质结构域可被设计以本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其他期望的细胞质结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的细胞质结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或它们的配体外的细胞表面分子。这种分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以ICOS作为共刺激信号传导元件的例子，但其他共刺激元件也位于本发明的范围内。
本发明的CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，优选长度在2和10个氨基酸，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，细胞质结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS和4-1BB的信号传导结构 域。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的细胞质结构域被设计以包括ICOS的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中ICOS的信号传导结构域包括SEQ ID NO:6中提出的核酸序列和CD3-ζ的信号传导结构域包括SEQ ID NO:7中提出的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明CAR的细胞质结构域被设计为包括ICOS的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域，其中ICOS的信号传导结构域包括由SEQ ID NO:6阐释的核酸序列编码的氨基酸序列和CD3-ζ的信号传导结构域包括由SEQ ID NO:7阐释的核酸序列编码的氨基酸序列。
载体
本发明包括DNA构建体，其包括CAR的序列，其中该序列包括抗原结合结构域的核酸序列，其可操作地连接至细胞内结构域的核酸序列。可用于本发明的CAR的示例性细胞内结构域包括但不限于CD3-ζ、ICOS、CD28、4-1BB等等的细胞内结构域。在一些情况下，CAR可包括CD3-ζ、ICOS、CD28、4-1BB等等的任何组合。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括抗间皮蛋白scFv(例如SS1scFv)、人CD8铰链、ICOS跨膜结构域和人ICOS和CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方式中，本发明的CAR包括SEQ ID NO:8阐释的核酸序列。在另一实施方式中，本发明的CAR包括由SEQ ID NO:8阐释的核酸序列编码的氨基酸序列。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如利用标准的技术，通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而不被克隆。
本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖(propagation)。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗 法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloing:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色萤光蛋白基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、显微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在 脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组成相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO中获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Beh环中获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以以具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构为特征。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等，191Glycobiology5：505-10)。然而，也包括与正常的囊泡结构相比具有溶液中的不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞，或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学手段(ELlSA和蛋白质印迹)或通过本文描述的鉴定落入本发明范围内的试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
RNA转染
在一个实施方式中，本发明基因修饰的T细胞通过引入RNA被修饰。在一个实施方式中，体外转录的RNA CAR可以瞬时转染的形式被引入细胞。通过使用聚合酶链式反应(PCR)-产生的模板的体外转录产生RNA。来自任何来源感兴趣的DNA可直接通过使用适当的引物和RNA聚合酶的PCR转化成用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适当的DNA来源。用于体外转录的期望的模板是本发明的CAR。例如，用于RNA CAR的模板包括细胞外结构域，其包括抗肿瘤抗 体的单链可变区；包括CD8a的铰链和跨膜结构域的跨膜结构域；和包括CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域的细胞质结构域。
在一个实施方式中，用于PCR的DNA包括可读框。DNA可来自天然产生的DNA序列，所述序列来自有机体基因组。在一个实施方式中，DNA为基因的一部分的全长感兴趣基因。基因可包括一些或全部的5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可包括外显子和内含子。在一个实施方式中，用于PCR的DNA为人基因。在另一个实施方式中，用于PCR的DNA为包括5'和3'UTR的人基因。DNA可可选地为通常不在天然产生的有机体中表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列为包括连接(ligate)在一起以形成编码融合蛋白的可读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA的部分可来自单一有机体或来自多于一个有机体。
可用作用于PCR的DNA的来源的基因包括编码多肽的基因，其对有机体提供治疗性或预防效果或可用于诊断有机体的疾病或状况。优选的基因为以下基因：其有助于短期治疗，或其中有关于剂量或所表达基因的安全性的关注。例如，对于治疗癌症、自体免疫状况、寄生虫的、病毒的、细菌的、真菌的或其他的感染，所表达的转基因(一个或多个)可编码担当用于免疫系统的细胞的配体或受体的多肽，或可起到刺激或抑制有机体免疫系统的作用。在一些实施方式中，不期望具有持久持续的免疫系统的刺激，也不必产生在成功治疗后延续的变化，因为这可随后引出新的问题。对于自体免疫状况的治疗，可期望骤然抑制或压制免疫系统，但不是长期的，其可导致患者变得对感染过度敏感。
PCR用于产生用于mRNA体外转录的模板，其用于转染。用于进行PCR的方法是本领域广泛已知的。设计用于PCR的引物，以具有与用作用于PCR的模板的DNA的区基本上互补的区。“基本上互补的”，如本文所用，指的是在核苷酸的序列中大多数或所有的引物序列中的碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的，或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下，用预期的DNA靶标退火或杂交。引物可被设计以与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，可设计引物以扩增通常在细胞中转录的基因的部分(可读框)，包括5'和3'UTR。也可设计引物以扩增编码特定感兴趣结构域的基因的部分。在一个实施方式中，设计引物以扩增包括全部或部分的5'和3'UTR的人cDNA的编码区。可用于PCR的引物通过本领域广泛已知的合成方法产生。“正向引物”为包括与在位于要扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸的区域的引物。本文使用的“上游”指的是对于相对于编码链扩增的DNA序列的位置5'。“反向引物”是包括与位于要扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域的引物。本文使用的“下游”指的是对于相对于编码链扩增的DNA序列的位置3'。
任何可用于PCR的DNA聚合酶可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶从很多来源商业可得。
也可使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方式中，5'UTR的长度在0和3000个核苷酸之间。添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度可通过不同的方法改变，包括但不限于，设计对UTR的不同区域退火的PCR的引物。利用该方法，本领域技术人员可在转录RNA的转染后修改实现最优翻译效率所需要的5'和3'UTR长度。
5'和3'UTR可为针对感兴趣基因的天然产生的、内源性5'和3'UTR。可选地，对感兴趣基因不是内源性的UTR序列可通过将UTR序列并入正向和反向引物或通过模板的任何其他修饰添加。对感兴趣基因不是内源性的UTR序列的使用可有助于修改RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中AU-富集的元件可降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域广泛已知的UTR性质，可选择或设计3'UTR，以增加转录RNA的稳定性。
在一个实施方式中，5'UTR可包括内源性基因的Kozak序列。可选地，当对感兴趣基因不是内源性的5'UTR如上述通过PCR添加时，共有Kozak序列可通过添加5'UTR序列重新设计。Kozak序列可增加一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有的RNA都需要以实现有效的翻译。对于很多mRNA的Kozak序列的要求是本领域已知的。在其他实施方式中，5'UTR可源于RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，不同的核苷酸类似物可用于3'或5'UTR，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
为了能够实现从DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，转录的启动子应被附接至转录的序列的DNA模板上游。当担当RNA聚合酶的启动子的序列被添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子变为并入转录的可读框的PCR产物上游。在一个优选实施方式中，启动子为T7聚合酶启动子，如本文其他地方描述的。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。对于T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选的实施方式中，mRNA具有5'末端上的帽和3'poly(A)尾两者，其确定细胞中的核糖体结合、翻译开始和mRNA的稳定性。在环形DNA模板上，例如质粒DNA，RNA聚合酶产生长的多联产物，其不适于真核细胞中的表达。在3'UTR末端上线性化的质粒DNA的转录产生正常尺寸的mRNA，其在真核转染中不是有效的，即使它在转录后多聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可延长转录物的3'末端超过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf，Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz，Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003))。
polyA/T延伸进入DNA模板的整合的常规方法为分子克隆。然而整合入质粒DNA的polyA/T序列可引起质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒DNA模板通常以缺失和其他差错被高度污染。这使克隆程序不仅是费力和耗时的，而 且经常是不可靠的。这是为何允许用polyA/T3'一段序列而不是克隆的DNA模板的构建方法是高度期望的。
转录的DNA模板的polyA/T片段可在PCR期间通过使用包括polyT尾诸如100T尾(尺寸可为50-5000T)的反向引物，或在PCR后通过任何其他方法，包括但不限于DNA连接或体外重组而产生。Poly(A)尾也提供了对RNA的稳定性并减少了它们的降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA稳定性正相关。在一个实施方式中，poly(A)尾在100和5000个腺苷之间。
RNA的Poly(A)尾可在通过使用poly(A)聚合酶诸如大肠杆菌polyA聚合酶(E-PAP)的体外转录后进一步延长。在一个实施方式中，增加poly(A)尾长度从100个核苷酸至300和400个之间的核苷酸导致RNA的翻译效率增加大约两倍。另外，不同的化学基团附接至3'末端可增加mRNA稳定性。这样的附接可包括修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，ATP类似物可利用poly(A)聚合酶并入poly(A)尾。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。
5'帽也为RNA分子提供了稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法生产的RNA包括5'帽。5'帽利用本领域已知的并在本文中描述的技术提供(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等，RNA,7:1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法生产的RNA也可包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可为任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，其起动结合至mRNA的不依赖帽的核糖体，并便于翻译的开始。可包括任何适于细胞电穿孔的溶质，所述溶质可包括促进细胞渗透性和生存力的因素，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
RNA可利用很多不同方法中的任一种引入靶细胞，所述方法例如商业可得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)),(ECM830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.),Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)，利用脂质转染法的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或生物射弹粒子递送系统诸如“基因枪”(见例如，Nishikawa等，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001))。
基因修饰的T细胞
在一些实施方式中，CAR序列利用反转录病毒或慢病毒载体传递入细胞。表达CAR的反转录病毒和慢病毒载体可利用作为运载体的转导的细胞或包封的、结合的或裸载体的无细胞局部或全身传递，传递入不同类型的真核细胞以及传递入组织和整个有机体。所用方法可用于其中稳定表达是需要的或充足的任何目的。
在其他实施方式中，CAR序列利用体外转录的mRNA传递入细胞。体外转录的mRNA CAR可利用作为运载体的转染的细胞或包封的、结合的或裸mRNA的无细胞局部或全身传递，传递入不同类型的真核细胞以及传递入组织和整个有机体。所用方法可用于其中瞬时表达是需要的或充足的任何目的。
所公开的方法可在基础研究和疗法中，在癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自体免疫疾病的领域中，调整T细胞活性，包括评估基因修饰的T细胞杀死靶癌症细胞的能力。
该方法也提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量，在宽范围中控制表达水平的能力，使其可能单独调节表达水平。此外，基于PCR的mRNA产生的技术大大促进具有不同结构和它们结构域的组合的嵌合受体mRNA的设计。例如，改变在相同细胞中的多嵌合受体上的不同细胞内效应器/共刺激因子(costimulator)结构域允许确定受体组合的结构，所述受体组合评估对抗多抗原靶标的最高水平的细胞毒性，同时对于正常细胞的最低细胞毒性。
本发明RNA转染方法的一个优点是RNA转染是基本上瞬时的和无载体的：RNA转基因可被传递至淋巴细胞并在简短的体外细胞活化之后在其中表达，作为最小表达盒，而不需要任何额外的病毒序列。在这些条件下，转基因整合入宿主细胞基因组是不可能的。细胞的克隆是不必要的，因为RNA的转染效率和它均匀修饰整个淋巴细胞群的能力。
T细胞通过体外转录的RNA(IVT-RNA)的基因修饰利用两种不同的策略，其两者已经在不同的动物模型中成功测试。细胞通过脂质转染法或电穿孔，利用体外转录的RNA进行转染。优选地，期望利用不同的修饰使IVT-RNA稳定，以便实现转移的IVT-RNA的持久表达。
一些IVT载体在文献中已知，其以标准化的方式用作体外转录的模板，并且其已经以产生稳定化的RNA转录物的方式进行基因修饰。目前用于本领域的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够实现RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，随后是通过未翻译区(UTR)位于3'和/或5'的侧翼的感兴趣基因，和包括50-70A核苷酸的3'多聚腺苷酸盒。在体外转录前，环形质粒通过II型限制酶在多聚腺苷酸盒下游线性化(识别序列对应于切割位点)。多腺苷酸盒因此对应于转录物中后面的poly(A)序列。作为该程序的结果，一些核苷酸作为酶切割位点的部分在线性化后保持，并延长或掩盖3'末端上的poly(A)序列。不清楚该非生理学悬突(overhang)是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。
RNA具有超过更多传统质粒或病毒方法的数个优点。来自RNA来源的基因表达不需要转录，并且蛋白质产物在转染后快速产生。进一步地，因为RNA不得不仅获得接近细胞质而不是细胞核的机会，并且因此通常的转染方法导致极高的转染率。另外，基于质粒的方法要求驱动感兴趣基因表达的启动子在研究的细胞中是活性的。
在另一方面，RNA构建体可通过电穿孔传递入细胞。见例如，核酸构建体进入哺乳动物细胞的电穿孔的制剂和方法，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中教导的。包括任何已知细胞类型的电穿孔需要的电场强度的各种参数通常在有关研究文献以及本领域很多专利和申请中已知。见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗性应用的装置是商业可得的，例如，MedPulser^TMDNA电穿孔疗法系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，并且在诸如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482的专利中描述；电穿孔也可用于体外转染细胞，如例如US20070128708A1中描述的。电穿孔也可用于体外传递核酸进入细胞。因此，利用本领域技术人员已知的很多可用的设备和电穿孔系统中的任一个进入包括表达构建体的核酸的细胞的电穿孔介导的给药呈现了令人兴奋的传递感兴趣RNA至靶细胞的新方法。
T细胞的来源
扩张之前，从受试者获得T细胞的来源。对象的例子包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。优选地，对象是人。T细胞可获得自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用本领域可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可获得自使用技术人员已知的任何数量的技术，比如ficoll分离从受试者收集的单位血液。在一种优选的实施方式中，通过单采血液成分术或白细胞采集获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞，其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可清洗通过单采血液成分术收集的细胞，以移除血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。在可选实施方式中，清洗溶液缺少钙并可缺少镁或可缺少很多——如果不是全部——二价阳离子。冲洗之后，细胞可重新悬浮在各种生物相容性缓冲液中，比如，例如，无Ca、无Mg PBS。可选地，可移除单采血液成分术样本的不期望成分和细胞直接重新悬浮在培养基中。
在另一实施方式中，通过溶解红细胞和耗减单核细胞从外周血分离T细胞，例如，通过利用PERCOLL^TM梯度的离心。可选地，T细胞可分离自脐带。在任何情况下，特定的T细胞亚群可通过阳性或阴性选择技术被进一步分离。
通过阴性选择的T细胞群的富集可利用涉及对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合完成。优选的方法为细胞分选和/或选择，其经阴性磁性免疫粘附或使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例如，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常 包括对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少其中珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×10⁶细胞/ml的浓度。使用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。
在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这选择表达高数量的结合至颗粒的期望抗原的细胞。例如，在稀浓度，CD4⁺T细胞比CD8⁺T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。
用于刺激的T细胞可也在冲洗步骤之后冷冻，其不需要单核细胞移除步骤。尽管不希望被理论限制，通过去除细胞群体中的粒细胞和以一些程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在移除血浆和血小板的冲洗步骤之后，细胞可悬浮在冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于该背景下，但是在非限制性例子中，一种方法包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其他适当的细胞冷冻媒介。然后细胞以每分钟1°的速度被冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在-20℃下或液氮中不受控的即刻冷冻。
Th17/Tc17细胞
在一个实施方式中，本发明涉及基因修饰的Th17细胞。已经被修饰以表达本发明的CAR的Th17细胞被朝着特异性抗原(例如间皮蛋白)改变，并且因此可用于治疗与特异性抗原相关的癌症。本发明是基于令人吃惊的发现，CAR的细胞质结构域中并入ICOS信号传导结构域增加Th17持久性、增加IL-17产生、增加抗肿瘤活性和减少IL-2产生。
T辅助细胞(也称为效应子T细胞或Th细胞)是淋巴细胞的亚组(一类白血细胞或白细胞)，其在建立和最大化免疫系统的能力和尤其激活和引导其他免疫细胞方面具有重要的作用。不同的类型的Th细胞已经认识为启动分化过程结果并且与特定表型相关。T细胞发育之后，成熟的、幼稚(意思是它们从未暴露于它们可应答的抗原)的T细胞离开胸腺并且开始遍布身体分布。幼稚T细胞已知分化成T-辅助1(Th1)、T-辅助2(Th2)、T-辅助17(Th17)或调节T细胞(Treg)表型。
这些Th细胞类型的每个分泌细胞因子、蛋白质或肽，其刺激或与其他白细胞， 包括Th细胞相互作用。但是，每个细胞类型具有特殊的表型和活性干扰并且通常与其他的冲突。
Th1、Th2和Th17(炎症T-辅助或炎症Th)，通过分泌促炎症细胞因子，比如IL-1、IL-6、TNF-α、IL-17、IL21、IL23，和/或通过活化和/或抑制其他T细胞包括其他Th细胞(例如Th1细胞抑制Th2和Th17，Th2抑制Th1和Th17)促进炎症应答。相反，Tregs是免疫系统的组分，其抑制与免疫应答相关的其他细胞的生物活性。尤其，Tregs可分泌免疫抑制细胞因子TGF-β和白细胞介素10，并且已知能够限制或抑制炎症。
Th17细胞或展示Th17细胞表型的其他细胞可具有各种特异的表型性质，这取决于使用的条件。此类表型性质包括产生IL-17A和IFNγ。而且，在它们初级扩张之后，扩张的Th17细胞继续产生IL-17A和IFNγ事件。在一些情况下，Th17细胞共表达RORγt和T-bet，转录因子，其分别调节Th17和Th1细胞发育。在一些情况下，扩张的T细胞在它们的细胞表面上共表达IL-23R和CD161，与脐带Th17细胞相关的表型标记。在一些情况下，Th17细胞表达RORγt。
在一个实施方式中，本发明提供纯化的ICOS+CD28+脐带血液Th17前体细胞群体，其当被刺激时分泌升高水平的CCL20、IL-17F和IFNγ。本发明的细胞可用于临床应用，用于设计用于具有癌症、传染病和自身免疫性的患者的免疫疗法。
Th17细胞的活化和扩张
不论在T细胞基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩张：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005。
通常地，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩张，所述表面具有附着于其的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的诸如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原-结合片段或抗CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体组合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激Th17细胞的增殖，细胞可接触抗CD3抗体和抗ICOS抗体。Th17细胞可也被表达ICOS配体(ICOSL)的人工抗原呈递细胞(aAPC)刺激。刺激可在存在Th17-极化细胞因子的情况下进行。Th17-极化细胞因子的例子包括但不限于IL-6、IL-1β和IL-23细胞因子和中和IFNγ和IL-4抗体。
T细胞可通过使试剂与T细胞上的细胞表面部分接触刺激。在本发明的一个方面中，针对CD3和ICOS的抗体被负载至aAPC。此外，刺激可包括结合TCR/CD3 复合物和启动初级刺激信号的任何配体。该配体可用作负载到aAPC上或由aAPC表达的初级活化试剂。结合ICOS和启动ICOS信号转导通路，因此造成细胞与CD3配体的共刺激和增强T细胞的群体活化的任何配体是ICOS配体和因此是共刺激试剂。
T细胞可暴露于下述珠，其包括结合TCR/CD3复合物和启动初级刺激信号的第一试剂和结合ICOS和启动ICOS信号转导通路的第二试剂，因此造成细胞与CD3配体的共刺激和增强T细胞群体的活化。
刺激的细胞被活化，如由信号转导的引导、细胞表面标记的表达和/或增殖所显示。适于Th17细胞的标记包括但不限于它们分泌升高水平的IL-17A、IL-17F和CCL20的能力。而且，与CD28共刺激的细胞相比，按照ICOS共刺激方法产生和扩张的细胞扩张不仅仅展示提高的Th17相关细胞因子的产生，而且也展示升高的IFNγ、TNFα和IL-21分泌。
在通过刺激T细胞上的ICOS产生Th17细胞的背景下，aAPC可被工程化以包括结合T细胞的TCR/CD3复合物的第一试剂和结合ICOS的第二试剂，aAPC可进一步被工程化，以包括促进Th17分化的细胞因子。示例性Th17分化细胞因子包括但不限于IL-2、IL-6、IL-23和IL-1。
因此，T细胞刺激可包括aAPC，其已经被基因修饰以表达刺激试剂、共刺激试剂和/或细胞因子以及其他多肽。aAPC可使用本文公开的方法或本领域用于基因修饰细胞的已知的方法被工程化，以表达和分泌任何期望的细胞因子，促进Th17分化。细胞因子可以是细胞因子的全长、片段、同源物、变体或突变体。细胞因子包括能够影响另一细胞的生物学功能的蛋白质。受细胞因子影响的生物学功能可包括但不限于细胞生长，细胞分化或细胞死亡。在刺激Th17细胞的刺激时，细胞因子可结合细胞表面上的特异性受体，从而促进Th17分化。优选的细胞因子包括造血生长因子、白细胞介素、干扰素、免疫球蛋白超家族分子、肿瘤坏死因子家族分子和/或趋化因子等等。细胞因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-21(IL-21)、白细胞介素-23(IL-23)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)和IGIF等等。更优选的细胞因子包括促进Th17分化的细胞因子，其包括但不限于IL-2、IL-6、IL-1(例如，IL-1β)。一旦具备本文提供的教导，本领域技术人员将认识到，本发明包括任何Th17分化促进细胞因子，比如本领域已知的那些，以及将来任何公开的那些。
除了工程化aAPC以包括Th17分化促进细胞因子，aAPC可被工程化以包括可阻碍干扰Th17分化过程的细胞因子的抑制分子。例如，aAPC可被工程化，以分泌中和抗体，其可抑制干扰Th17分化的细胞因子。干扰Th17分化过程的细胞 因子包括但不限于IFNγ和IL-4。
当aAPC已经被工程化以表达促进Th17分化的期望的细胞因子和/或干扰Th17分化的细胞因子的抑制剂时，提供了激活和/或刺激T细胞的群体，以促进Th17在没有外源性添加的细胞因子的情况下分化的方法。此外，这种Th17分化可发生在体内。
在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面和另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在一些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可处于可溶形式，随后被交联至表面，诸如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其他结合剂。在这点上，见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩张本发明的T细胞。
在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，在同一珠即“cis”上或分开的珠即“trans”上。作为例子，提供初级活化信号的试剂为抗CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗ICOS抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于Th17细胞生长的珠的每种抗体的1:1比率。在本发明的某些方面中，使用结合至珠的抗CD3:ICOS抗体的比率，以便与利用1:1比率观察到的扩张相比，观察到Th17细胞扩张的增加。在一个实施方式中，结合至珠的CD3:ICOS抗体的比率处于100:1至1:100的范围中和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗CD3抗体更多的抗ICOS抗体被结合至颗粒，即CD3:ICOS的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗ICOS抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:ICOS比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:ICOS比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:ICOS比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:ICOS比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:ICOS比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:ICOS比率。还在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3:1的CD3:ICOS比率。
从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在从1:100至100:1的范围内 和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。抗CD3-和抗ICOS-结合的颗粒与产生T细胞刺激的T细胞的比率可如以上记录的变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1颗粒每个T细胞。在一个实施方式中，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为从1:1至10:1，和额外的颗粒此后每天或每隔一天直至10天，以从1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，并在刺激的第三和第五天最终比率为1:5。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以在第一天最终比率为1:1，和在刺激的第三和第五天最终比率为1:10。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小和细胞大小和类型而变化。
在本发明的进一步的实施方式中，细胞诸如T细胞，与包被试剂的珠组合，随后分离该珠和细胞，并且随后培养该细胞。在一个可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加力诸如磁力被聚集，产生增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
作为例子，可通过允许附接抗CD3和抗ISCO的顺磁珠接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如，10⁴至10⁹个T细胞)和珠(例如，以1:1比率的顺磁珠)在缓冲液优选PBS(没有二价阳离子诸如，钙和镁)中进行联合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占0.01％的样本，或整个样本(即，100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容内。在某些实施方式中，可期望显著降低其中颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度，在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用细胞浓度10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶细胞/ml。还在另一个实施方式中，使用细胞浓度75、80、85、90、95或100×10⁶细胞/ml，在进一步的实施方式中，可使用125或150×10⁶细胞/ml的浓度。利用高浓度可产生增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。进一步地，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施 方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效选择正常具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数个小时(大约3个小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo15，(Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo20、优选的(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞的生长和扩张量的细胞因子(一个或多个)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在注入对象的细胞培养物中。靶细胞被保持在支持生长必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO₂)。
已经暴露于变化刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的(apheresed)外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(Tc，CD8⁺)更多的辅助T细胞群(Th，CD4⁺)。因此，取决于治疗目的，用主要包括Th细胞的T细胞群注入对象可为有利的。类似地，如果已经分离了Tc细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩张该亚型。
进一步地，除了CD4和CD8标记，其他表型标记在细胞扩张过程的进程期间，也显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
本领域技术人员容易认识到本文所述的细胞刺激方法可在各种环境(即，容器)中进行。例如，此类容器可以是培养瓶、培养袋，或能够容纳细胞的任何容器，优选地在无菌环境中。在本发明的一个实施方式中，生物反应器也是可用的。例如，当前数个制造商制造了可用于生长细胞的设备并且用于与本发明的方法一起使用。见例如，覆盖生物反应器的专利比如美国专利号6,096,532；5,985,653；5,888,807；5,190,878，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
治疗性应用
本发明包括被修饰以表达CAR的细胞(例如，Th17细胞)，该CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB、ICOS或任何其组合的细胞内结 构域联合。因此，在一些例子中，转导的Th17细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
本发明提供了CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定标靶相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的细胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR并且CAR T细胞被注入至需要其的受试者中。注入的细胞能够杀死受试者中的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR T细胞能够在体内复制，产生可导致持续的肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩张并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的特异性记忆T细胞。例如，料想不到的是在由基因修饰的Th17细胞中表达的CAR中包括ICOS信号传导结构域导致增加Th17持久性和增加抗肿瘤活性。不希望被任何具体理论限制，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
不希望被任何具体理论限制，由CAR-修饰T细胞引起的抗肿瘤免疫性应答可以是主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可以是过继免疫疗法的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导特异性针对CAR中抗原结合结构域的免疫应答。例如，表达抗间皮蛋白CAR的基因修饰的Th17细胞引起特异性针对表达间皮蛋白的细胞的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了慢病毒载体包括SS1scFv、人CD8α铰链、ICOS跨膜结构域、和ICOS和CD3ζ信号传导结构域，本发明应解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化，如本文其他地方所述的。即，本发明包括CAR中任何抗原结合结构域产生特异性针对抗原结合结构域的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明CAR的抗原结合结构域可靶向肿瘤抗原，用于治疗癌症的目的。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒-单核细胞性、单核细胞性和红白血病)、慢性 白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也已知为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一个实施方式中，本发明CAR的抗原结合部分部分被设计为治疗具体的癌症。例如，设计为靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和病症，包括但不限于前-BALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等。
在另一实施方式中，CAR可设计为靶向CD22，以治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，癌症和病症包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤，同种骨髓移植后的补救等等可使用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合治疗。
在一个实施方式中，CAR可设计为靶向间皮蛋白，以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向CD33/IL3Ra，以治疗急性骨髓性白血病等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向c-Met，以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等等。
在一个实施方式中，CAR可设计为靶向PSMA，以治疗前列腺癌等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向糖脂F77，以治疗前列腺癌等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向EGFRvIII，以治疗胶质母细胞瘤等等。
在一个实施方式中，CAR可设计为靶向GD-2，以治疗成神经细胞瘤，黑素瘤等等。在另一实施方式中，CAR可设计为靶向NY-ESO-1TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在进一步的实施方式中，CAR可设计为靶向MAGE A3TCR，以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原标靶和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原标靶。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩张细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩张程序，可被应用至本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩张的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩张包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩张这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子，其他因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体，也可用于培养和扩张细胞。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常地，如本文所述活化和扩张的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞用于治疗癌症。在某些实施方式中，本发明的细胞用于治疗处于形成癌症风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的状况、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗 量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取(redraw)血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明活化来自其中的T细胞，和用这些活化和扩张的T细胞再注入该患者。该过程可每几个周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可从10cc至400cc的血液抽取中进行活化。在一些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用多份血液抽取/多个再输注方案可用于选出某些T细胞群。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩张至治疗性水平的方法活化和扩张的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用试剂进行治疗，诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫烧蚀剂诸如CAM PATH、抗-CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等，Cell66:807-815,1991；Henderson等，Immun.73:316-321,1991；Bierer等，Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体诸如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患 者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法诸如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗，之后进行外周血干细胞移植的标准治疗。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩张的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩张的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗状况的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约100mg的范围中，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些例子中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)，但优选的日剂量为1至10mg每天。
实验实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开背景的剩余部分。
实施例1：用含有ICOS共刺激结构域的CAR的Th17细胞的改变增强Th17细胞的功能、抗肿瘤活性和持久性。
体外极化和扩张的大量Th17细胞的过继转移是有吸引力的用于治疗癌症的疗法。CD278，可诱导的共刺激分子(ICOS)已经显示为对于人Th17细胞在它们初级活化之后的持续的扩张是关键的。分析无论在嵌合抗原受体中是否并入ICOS细胞内结构域都可促进抗原触发之后的Th17表型并且增强抗工程化的T细胞疗法的抗肿瘤活性。
现在描述在这些实验中采用的物质和方法。
Th17和Tc17细胞的分离、极化、转导和扩张
从宾夕法尼亚大学的人免疫学中心获得血液样品。使用RosetteSep Kits(干细胞技术)阴性分离外周血CD4⁺和CD8⁺T细胞。在37℃和5％CO₂的培养箱中，在补充10％FCS、100-U/ml青霉素、100μg/ml硫酸链霉素、10mM Hepes的RPMI1640培养基中培养细胞。为了刺激，用以1:3的细胞与珠的比例包被针对CD3和ICOS抗体的激活珠，培养CD4⁺和CD8⁺T细胞。为了Th17和Tc17极化，在第0天添 加IL-1b(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、IL-23(20ng/ml)，和针对IL-4和IFN-γ的中和抗体(10mg/ml)(eBioscience)并且在整个实验中保持。所有实验用含有内源TGF-b来源的胎牛血清进行。在活化后第3天添加人IL-2(Chiron)至50IU/ml的终浓度。在活化之后约24h，以5的MOI用慢病毒载体转导T细胞。细胞计数和每2天进料并且一旦T细胞好像静止，如通过减少的生长动力学和细胞尺寸二者确定，它们用于功能试验或冷冻保存。
T细胞增殖试验
用SS1融合蛋白转导的冷冻保存的T细胞被解冻，冲洗，并且放置培养12h。T细胞(4×10⁵)与2×10⁵K562.meso共培养。在指示的时间点，通过苔酚蓝排斥对有活力的细胞计数。细胞每2天用具有外源性细胞因子的新鲜培养基进料。
再刺激的T细胞的细胞因子产生和细胞内染色
用SS1融合蛋白转导的冷冻保存的T细胞被解冻，冲洗，并且放置培养16h。然后，在T细胞中检查SS1scFv融合蛋白的表达并且归一化为对于所有的受体的60％嵌合受体表达。T细胞(4×10⁵)然后与2×10⁵K562、K562.meso、或肿瘤细胞共培养并且24h后收获上清液。使用ELISA开发系统测定IL-17A、IL17-F、IL-2、IFN-γ、TNF-α和CCL20的浓度。使用人IL-21ELISA Ready-SET-Go！Set测定IL-21的浓度。
抗体
下列缀合的抗体购买自BD Biosciences：抗CD8(FICT)、抗CD4(PerCp-Cy5.5)、抗CCR7(PE)。抗CD45RO(Alexa Fluor647)购买自Biolegend。抗CD27(V450)和抗CD4(APC-H7)购买自BD Bioscience。抗CD161PE购买自R&D。山羊抗小鼠IgG血清的生物素化的F(ab’)2片段(特异性针对鼠源的scFv)购买自Jackson ImmunoResearch。链霉抗生物素(eFluor710)购买自eBioscience，和链霉抗生物素(V450)购买自BD Biosciences。
流式细胞术基试验以量化细胞-介导的细胞溶解
靶细胞(L55)用CFSE染色并且以50,000个细胞/孔种在96孔平板中。冷冻保存的用SS1融合蛋白转导的T细胞被解冻，冲洗，并且放置培养16h。然后，效应子和CFSE-标记的靶细胞以一定的E:T范围双份共培养。培养物在37℃在5％CO₂下温育4h。然后通过胰酶消化和冲洗收集总的细胞。然后用抗CD45抗体染色T细胞30分钟。冲洗之后，DNA嵌入染料7AAD被添加至样品，以区分死的和活的细胞事件。最后，冲洗细胞并且重新悬浮在0.4ml的1％HuSA PBS中和对珠计数。染色之后，样品放置在冰上并且立即在LSRII Flow细胞计数器上收集数据。每个样品收集4000个珠子。
流式细胞术分析
为了评估表面表达，细胞在指示的时间点染色。各种SS1scFv融合蛋白在T细胞上的表达使用生物素化的山羊抗小鼠IgG检测随后用链霉抗生物素(V450)或链霉抗生物素(eFluor710)染色。在LSRII流式细胞计数器使用DiVa软件(BD Biosciences)分析样品，并且使用FlowJo软件(TreeStar)评估结果。
小鼠
宾夕法尼亚大学协会动物护理和使用委员会批准了所有动物实验。NSG小鼠购买自Jackson实验室并且在宾夕法尼亚大学的饲养室饲养。小鼠圈养在微型隔离笼中的无病原体条件下并且给予自由采食高压灭菌的食物和酸化的水的自由。
抗间皮蛋白CAR T细胞的体内评估
在存在PBS中50％Matrigel溶液(BD Biosciences)的情况下皮下注射5×10⁶M108细胞建立异种移植肿瘤。允许M108肿瘤在NSG小鼠中生长8周。
为了评估改变的Th17-Tc17的瘤内效果，用在61和67天2个瘤内注射10×10⁶T细胞(Th17:Tc17以1:1比例)或PBS治疗小鼠。
用测径器测量肿瘤维度，和使用公式V＝1/2×L×W×W计算肿瘤体积，其中L是长度(最长维度)和W是宽度(最短维度)。在治疗之后的第21和51天分别从眼球后出血或心脏内穿刺获得外周血，和染色用于人CD45、CD4和CD8T细胞的存在。在对人CD45⁺群体设门之后，使用TruCount tubes(BD Biosciences)量化CD4⁺和CD8⁺子集。
样品收集
来自三个不同的正常供体和用SS1-28z、SS1-BBz和SS1-ICOSz改变的Th17细胞被解冻和在补充10％FCS的RMPI1640培养基中培养过夜。然后，改变的Th17细胞用源自固定的酵母的重组体间皮蛋白刺激。在刺激之前的第0天，和抗原识别后的4h、8h、24h和4天收集细胞小球并且冷冻。
微阵列靶制备和杂交
通过UPenn微阵列设施提供微阵列服务，包括通过Agilent Bioanalyzer和Nanodrop分光光度法的总RNA样品的质量对照测试。如在Affymetrix GeneChip表达分析技术手册中描述进行所有的方案。简单地说，100ng的总RNA使用并入T7启动子序列的poly(T)和随机低聚物启动的逆转录酶转化成第一链cDNA。使用用于每个转录体的线性扩增的T7RNA聚合酶体外转录之后是第二链cDNA合成，并且所得cRNA转化成cDNA，片段化，由Bioanalyzer评估，并且通过末端转移酶末端标记生物素化。cRNA产量范围从36-89ug，并且cDNA添加至Affymetrix 杂交混合物，在99℃下加热5min并且在45℃下与人基因1.0ST GeneChips(Affymetrix Inc.，Santa Clara CA)杂交16h。然后在低(6X SSPE)和高(100mM MES，0.1M NaCl)严格性下冲洗微阵列并且用链霉抗生物素-藻红蛋白染色。通过添加生物素化的抗链霉抗生物素和另外的等分试样的链霉抗生物素藻红蛋白染色扩增荧光。在570nm激发之后共焦扫描仪用于收集荧光信号。
数据分析
Affymetrix命令控制台和表达控制台用于量化靶向基因的表达水平；Affymetrix提供的默认值用于所有分析参数。移除边界像素，并且对每个探针计算75％内的平均强度像素。将出现在每个16微阵列区域的平均最低2％的探针强度设置为背景并且减去该区域的所有特征。在表达控制台中检测阳性和阴性对照的探针组，并且设施质量控制参数被确认落入正常范围。平均每个靶向基因的探针并且使用RMA算法进行阵间归一化。
现在描述实验的结果。
结果
Th17极化的细胞被工程化以表达单链可变片段，其结合与CD28、CD137(41BB)或CD278(ICOS)细胞内结构域串联的融合至T细胞受体-ζ信号转导结构域的间皮蛋白(SS1)。含有SS1-ICOS-z CAR的cDNA序列被克隆进入第三代慢病毒载体并且在EF-1启动子的控制下表达。SS1-ICOS-z含有CD8前导序列、识别人间皮蛋白的SS1单链片段、CD8α链的铰链区、ICOS跨膜和细胞内结构域、和TCR-z信号转导结构域。(图1)。
序列标示符