发明领域
本发明涉及改进的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)疫苗。
发明背景
2岁以下的儿童对大多数多糖疫苗还不能产生免疫应答，因此通 过化学方法使多糖与蛋白载体缀合而具有免疫原性一直都是必要的。 将多糖(一种不依赖T的抗原)与蛋白质(一种依赖T的抗原)偶联而赋 予多糖依赖T的性质，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。
然而，重复给予多糖-蛋白质缀合物或将多糖-蛋白质缀合物组合 制成多价疫苗可能会出现问题。例如，据报导按照标准婴幼儿接种时 间表，在一定剂量范围内用(游离)TT和肺炎球菌多糖-TT缀合物疫苗 同时进行免疫，并对用破伤风类毒素(TT)作为蛋白载体的流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)b型多糖(PRP)疫苗进行了试验。当肺炎球菌 疫苗的剂量增加时，对Hib缀合物疫苗的PRP多糖部分的免疫应答降 低，这表明很可能通过使用同一载体蛋白引起了多糖的免疫干扰 (Dagan等，Infect.Immun.(1998)；66：2093-2098)。
也证明了载体-蛋白质剂量对针对蛋白质本身的体液应答的影响 是多方面的。据报导，在婴幼儿体内增加四价破伤风类毒素缀合物的 剂量导致对破伤风载体的应答降低(Dagan等，出处同上)。对于联合 疫苗，这些作用的典型分析被描述为载体诱导的表位抑制，这一点虽 然还未得到充分认识，但相信是由过量载体蛋白造成的(Fattom， Vaccine 17：126(1999))。这似乎导致针对载体蛋白的B细胞和针对多 糖的B细胞竞争Th细胞。如果针对载体蛋白的B细胞占优势，则没 有足够的Th细胞可为对多糖特异性B细胞提供必需的辅助。然而， 已经观察到的免疫效果一直不一致，载体蛋白的总量在一些情况下提 高免疫应答，而在另一些情况下则降低免疫应答。
因此，将多种多糖缀合物组合成单一、有效的疫苗制剂还存在着 技术困难。
肺炎链球菌是一种革兰氏阳性菌，可造成极高的发病率和死亡率 (特别是对年纪小的人和上年纪的人)，引起侵袭性疾病例如肺炎、菌 血症(bacteraemia)和脑膜炎，以及与定居现象有关的疾病例如急性中 耳炎。在美国，60岁以上的人群中，估计患有肺炎球菌性肺炎的比例 为3-8/100,000，其中有20％的病例导致菌血症，其他的则表现为脑膜 炎等，即便使用了抗生素治疗，死亡率也接近30％。
肺炎球菌被用化学键连接的赋予血清型特异性的多糖包裹着。有 90种已知血清型的肺炎球菌，荚膜是肺炎球菌主要的毒力决定因素， 因为荚膜不但保护细菌内表面不受补体作用，而且它本身的免疫原性 也较差。多糖是不依赖T的抗原，不能被加工或呈递到MHC分子与 T细胞相互作用。然而，它们能通过影响B细胞表面受体交联的替代 机制而刺激免疫系统。
一些实验表明，针对侵袭性肺炎球菌疾病的保护作用与荚膜特异 性抗体的相关性最为紧密，并且保护作用是血清型特异性的。
肺炎链球菌是婴儿及幼童侵袭性细菌病和中耳炎最常见的原因。 同样地，老年人对肺炎球菌疫苗的反应也较差[Roghmann等(1987)，J. Gerontol 42：265-270]，因此，细菌性肺炎的发病率在这一人群中升高 [Verghese和Berk，(1983)Medicine(Baltimore)62：271-285]。
由肺炎链球菌所引起的主要临床症候群已得到了普遍认识，有关 论述见标准医学教科书(Fedson DS，Muscher DM.载于Plotkin SA， Orenstein WA编辑，Vaccines.第4版，PhiladelphiaWB Saunders Co， 2004a：529-588)。例如，侵袭性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal disease，IPD)定义为在血液或其它正常无菌部位分离出肺炎链球菌的 任何感染(Musher DM.Streptococcus pneumoniae.载于Mandell GL， Bennett JE，Dolin R(编辑).Principles and Practice of Infectious diseases (第5版).New York，Churchill Livingstone，2001，第2128-2147页)。一 般认为慢性阻塞性肺病(COPD)包括通常同时存在的几种病况(气流阻 塞、慢性支气管炎、细支气管炎或小气道疾病(small airways disease) 及肺气肿)。患者受累于其病况的恶化，这些疾病通常与气喘加重有关， 并且常常咳出粘液或脓性痰的咳嗽加重(Wilson，Eur Respir J 2001 17：995-1007)。COPD在生理学上定义为患有慢性支气管炎和/或肺气 肿的患者存在不可逆或部分可逆的气道阻塞(Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease (慢性阻塞性肺病患者的诊断与治愈标准).American Thoracic Society. Am J Respir Crit Care Med.1995年11月；152(5Pt 2)：S77-121)。COPD 的恶化常常是由细菌(例如肺炎球菌)感染引起的(Sethi S，Murphy TF. Bacterial infection in chronic obstructive pulmonary disease in 2000：a state-of-the-art review(2000例慢性阻塞性肺病中的细菌性感染：现有 技术综述).Clin Microbiol Rev.2001年4月；14(2)：336-63)。
因此，本发明的目的是开发出改进的多种血清型肺炎链球菌多糖 缀合物疫苗的制剂。
附图简述
图1.柱状图表示老年猕猴(Rhesus monkey)的11价缀合物免疫原 性。颜色较浅的直方柱表示两次接种磷酸铝佐剂中的11价缀合物后 的GMC。颜色较深的直方柱表示两次接种C佐剂中的11价缀合物的 GMC。
图2.柱状图表示接种C佐剂或磷酸铝佐剂中的11价缀合物针对 PS3的记忆B细胞。
图3.柱状图表示Balb/C小鼠对于4价单纯多糖和4价dPly缀合 物的抗多糖19F免疫原性。
图4.柱状图表示Balb/C小鼠对于4价单纯多糖和4价PhtD缀 合物的抗多糖22F免疫原性。
图5.柱状图表示Balb/c小鼠的抗22F IgG应答。
图6.柱状图表示Balb/c小鼠的抗22F调理吞噬效价。
图7.柱状图表示对C57B1幼小鼠用不同佐剂配制的13价缀合 物疫苗进行免疫后所诱导的IgG应答进行比较。
图8.柱状图表示猴肺炎模型中不同疫苗组合的保护性功效。
图9.柱状图表示Balb/c小鼠用22F-PhtD或22F-AH-PhtD缀合物 免疫后的抗PhtD IgG应答。
图10.小鼠用22F-PhtD或22F-AH-PhtD免疫后产生的针对4型 肺炎球菌攻击的保护作用。
发明内容
本发明提供改进的肺炎链球菌疫苗，该疫苗包含10种以上(例如 11、12、13、14或15种以上)荚膜糖，这些荚膜糖得自不同的肺炎链 球菌血清型并与两种或更多种载体蛋白缀合，其中该疫苗包含与白喉 类毒素或CRM197缀合的血清型19F荚膜糖，并且其中该疫苗任选还 包含得自流感嗜血菌作为游离蛋白或作为另外的载体蛋白或既作为 游离蛋白又作为另外的载体蛋白的D蛋白。
对于本发明的目的，“针对COPD恶化对人宿主进行免疫”或“治 疗或预防COPD恶化”或“减轻COPD恶化的严重性”均是指降低 COPD恶化的发病率或比率(例如降低比率0.1％、0.5％、1％、2％、5％、 10％、20％或以上)或者在例如用本发明组合物或疫苗免疫的患者组中 减轻如上所规定的COPD恶化的严重性。
本发明的肺炎链球菌疫苗通常包含荚膜糖抗原(优选为缀合的)， 其中所述糖由至少10种肺炎链球菌血清型中获得。肺炎链球菌荚膜 糖数目的范围可为10种不同的血清型(或者“V”，价)至23种不同的 血清型(23V)。在一个实施方案中，有10、11、12、13、14或15种不 同的血清型。在本发明另一个实施方案中，疫苗可包含缀合的肺炎链 球菌糖和未缀合的肺炎链球菌糖。优选糖血清型的总数≤23种。例如， 本发明可包含10种缀合的血清型和13种未缀合的糖。按类似方式， 疫苗可分别包含11、12、13、14、15或16种缀合的糖和12、11、10、 9、8或7种未缀合的糖。
在一个实施方案中，本发明的多价肺炎球菌疫苗选自以下的血清 型：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、 15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，虽然应当理解的 是，可根据接受疫苗者的年龄和将给予疫苗的地理位置，替换成另外 的一种或两种血清型，例如血清型6A可包括在列举明细中。例如， 10价疫苗可包含得自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F 和23F的多糖。11价疫苗还可包括得自血清型3的糖。12价或13价 儿童(婴幼儿)用疫苗也可包括补充了血清型6A和19A、或6A和22F、 或19A和22F、或6A和15B、或19A和15B、或22F和15B的10 价或11价制剂，而13价老年人用疫苗可包括补充了血清型19A和 22F、8和12F、或8和15B、或8和19A、或8和22F、或12F和15B、 或12F和19A、或12F和22F、或15B和19A、或15B和22F的11 价制剂。14价儿童用疫苗可包括补充了以下血清型的上述10价制剂： 血清型3、6A、19A和22F；血清型6A、8、19A和22F；血清型6A、 12F、19A和22F；血清型6A、15B、19A和22F；血清型3、8、19A 和22F；血清型3、12F、19A和22F；血清型3、15B、19A和22F； 血清型3、6A、8和22F；血清型3、6A、12F和22F；或血清型3、 6A、15B和22F。
一个实施方案的组合物包括得自血清型1、4、5、6B、7F、9V、 14、18C、19F和23F的荚膜糖(优选是缀合的)。在本发明又一个实施 方案中，包括至少11种糖抗原(优选是缀合的)，例如得自血清型1、3、 4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的荚膜糖。在本发明又一 个实施方案中，包括至少12种或13种糖抗原，例如，疫苗可包含由 血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F 获得的荚膜糖，或者由血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、 19A、19F、22F和23F获得的荚膜糖，尽管其它糖抗原，例如23价(例 如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、 14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)也包括在本 发明中。
本发明的疫苗可包含得自流感嗜血菌的D蛋白(PD)(参见例如EP 0594610)。流感嗜血菌是中耳炎关键的致病生物，本发明的发明人提 出在肺炎链球菌疫苗中包含这一蛋白质将提供针对流感嗜血菌相关 中耳炎的保护水平(参阅POET出版物)。在一个实施方案中，疫苗组 合物包含D蛋白。一方面，PD作为一种或多种糖的载体蛋白存在。 另一方面，D蛋白可作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。再一方面， D蛋白既作为载体蛋白又作为游离蛋白存在。D蛋白可以全长蛋白或 以片段使用(WO 0056360)。再一方面，D蛋白以作为大多数糖的载体 蛋白存在，例如6、7、8、9种以上的糖可与D蛋白缀合。在这一方 面，D蛋白还可以游离蛋白存在。
本发明的疫苗包含两种以上不同类型的载体蛋白。每种类型的载 体蛋白可作为一种以上糖的载体而起作用，所述糖可以相同或不同。 例如，血清型3和4可与同一载体蛋白缀合，或与载体蛋白的同一分 子缀合，或与同一载体蛋白的不同分子缀合。在一个实施方案中，两 种以上不同的糖可与同一载体蛋白缀合，或与载体蛋白的同一分子缀 合或与同一载体蛋白的不同分子缀合。
每种肺炎链球菌荚膜糖可与独立选自以下的载体蛋白缀合：TT、 DT、CRM197、TT的C片段、PhtD、PhtDE融合物(特别是WO 01/98334 和WO 03/54007中所述的载体蛋白)、脱毒肺炎链球菌溶血素和D蛋 白、得自血清型19F以外总是与DT或CRM 197缀合(优选与DT缀 合)的糖。可用于本发明缀合物一个较完整的蛋白载体列举明细见下 文。
如果组合物中对于两种或更多种糖的蛋白载体相同，则糖可与该 蛋白载体的同一分子缀合(载体分子具有2种以上不同的糖与其缀合) [参见例如WO 04/083251]。或者，糖可各自独立与蛋白载体的不同分 子缀合(蛋白载体的每种分子仅有一种类型的糖与其缀合)。
在存在于本发明免疫原性组合物的缀合物中，与一种或多种肺炎 链球菌荚膜糖缀合的载体蛋白任选地为多聚组氨酸三联体家族 (polyhistidine triad family，Pht)蛋白成员、其片段或其融合蛋白。PhtA、 PhtB、PhtD或PhtE蛋白的氨基酸序列与WO 00/37105或WO 00/39299 中所公开的序列(例如对于PhtD与WO 00/37105的SEQ ID NO：4的氨 基酸序列1-838或21-838)可共享80％、85％、90％、95％、98％、99％ 或100％的同一性。例如，融合蛋白由全长PhtA、全长PhtB、全长PhtD、 全长PhtE中的2、3或4种组成，或者由PhtA片段、PhtB片段、PhtD 片段、PhtE片段中的2、3或4种组成。融合蛋白的实例为PhtA/B、 PhtA/D、PhtA/E、PhtB/A、PhtB/D、PhtB/E、PhtD/A、PhtD/B、PhtD/E、 PhtE/A、PhtE/B和PhtE/D，其中所述蛋白与在先提及的蛋白在N端 连接(参见例如WO 01/98334)。
如果使用Pht蛋白的片段(单独或作为融合蛋白的一部分)，则每 个片段任选含有一个或多个组氨酸三联体基序和/或这些多肽的卷曲 螺旋区。组氨酸三联体基序是具有序列HxxHxH的多肽部分，其中H 为组氨酸，x为组氨酸以外的氨基酸。卷曲螺旋区是用“Coils”算法 预测的区域(Lupus，A等(1991)Science 252；1162-1164)。在一个实施 方案中，该片段或者每个片段包括一个或多个组氨酸三联体基序以及 至少一个卷曲螺旋区。在一个实施方案中，该片段或者每个片段含有 正好或至少2、3、4或5个组氨酸三联体基序(任选在两个或更多个三 联体之间具有天然Pht序列，或者具有内三联体序列(intra-triad sequence)，其中内三联体序列与天然肺炎球菌内三联体Pht序列的同 一性超过50％、60％、70％、80％、90％或100％-例如，在WO 00/37105 的SEQ ID NO：4中所示的PhtD内三联体序列)。在一个实施方案中， 该片段或者每个片段含有正好或至少2、3或4个卷曲螺旋区。在一 个实施方案中，本文所公开的Pht蛋白包括连接了信号序列的全长蛋 白、信号肽(例如N端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、天然 存在的Pht蛋白变异体和Pht蛋白的免疫原性片段(例如上述片段或包 含得自WO 00/37105或WO 00/39299氨基酸序列的至少15或20个连 续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导对WO 00/37105或WO 00/39299中所述氨基酸序列特异性的免疫应答)。
具体地讲，本文所用术语“PhtD”包括连接了信号序列的全长蛋 白、信号肽(例如N端的20个氨基酸)已被去除的成熟全长蛋白、天然 存在的PhtD变异体和PhtD的免疫原性片段(例如上述片段或包含得自 WO 00/37105或WO 00/39299中的PhtD氨基酸序列的至少15或20 个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽能够诱导对WO 00/37105或WO 00/39299中所述PhtD氨基酸序列(例如WO 00/37105中PhtD的SEQ ID NO：4)特异性的免疫应答。
如果蛋白载体对组合物中的两种或更多种糖是相同的，则糖可与 载体蛋白的同一分子缀合(载体分子有2种以上不同的糖与之缀合) [参见例如WO 04/083251]。或者，糖可以各自单独与蛋白载体的不同 分子缀合(蛋白载体各个分子仅有一种类型的糖与之缀合)。
可用于本发明的载体蛋白的实例为DT(白喉类毒素)；TT(破伤风 类毒素)或TT的C片段；DT CRM197(一种DT突变体)；其它DT点 突变体，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等，J.Biol.Chem. 218；3838-3844，1973)；CRM 9、CRM 45、CRM 102、CRM 103和CRM 107和其它突变(参见Nicholls和Youle，载于Genetically Engineered Toxins，编辑Frankel，Maecel Dekker Inc，1992)；Glu-148缺失或突变为 Asp、Gln或Ser，和/或Ala 158缺失或突变为Gly，以及US 4709017 或US 4950740中公开的其它突变；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或 Lys 534中至少一个或多个残基的突变，以及US 5917017或US 6455673中公开的其它突变；或US 5843711中公开的片段；肺炎链球 菌溶血素(Kuo等(1995)Infect.Immun.63；2706-13)，包括以某种方式 脱毒的ply，例如dPLY-GMBS(WO 04081515、PCT/EP2005/010258) 或dPLY-甲醛；PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE，以及Pht蛋白 的融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物(WO 01/98334和WO 03/54007)(Pht A-E有关详述见下文)；OMPC(脑膜炎球菌外膜蛋白- 通常从脑膜炎奈瑟氏球菌B血清群(N.meningitidis serogroup B)中提 取-EP0372501)；PorB(得自脑膜炎奈瑟氏球菌)；PD(流感嗜血菌D 蛋白-参见例如EP 0 594 610 B)或其免疫功能等同物；合成肽 (EP0378881、EP0427347)；热激蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)； 百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)；细胞因子；淋巴因子；生长 因子或激素(WO 91/01146)；人工蛋白，包含得自各种病原体衍生抗原 的多种人CD4+T细胞表位(Falugi等(2001)Eur J Immunol 31； 3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等(2004)Infect Immun 72；4884-7)； 肺炎球菌表面蛋白PspA(WO 02/091998)；铁吸收蛋白(iron uptake protein)(WO 01/72337)；艰难梭菌(C.difficile)的A毒素或B毒素(WO 00/61761)。
Nurkka等人(Nurkka等，Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11)：1008-14，2004年11月)描述了具有所有血清型均与PD缀合的 11价肺炎球菌疫苗。然而，本发明的发明人指出，与PD缀合的19F 相比，用与DT缀合的19F缀合物诱导的抗体调理吞噬活性得到改进。 另外，本发明的发明人指出，观察到与DT缀合的19F与19A的交叉 反应性较大。因此，本发明组合物的特征在于血清型19F与DT或CRM 197缀合。一方面，血清型19F与DT缀合。免疫原性组合物余下的 糖血清型全部与一种或多种不是DT的载体蛋白缀合(即仅19F与DT 缀合)，或者可以在一种或多种不是DT的载体蛋白或是DT本身的载 体蛋白之间分摊。在一个实施方案中，19F与DT或CRM 197缀合， 余下的所有血清型都与PD缀合。在又一个实施方案中，19F与DT 或CRM 197缀合，余下的血清型在PD与TT或DT或CRM 197之间 分摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM 197缀合，并且只有 一种糖与TT缀合。在本实施方案的一个方面，所述一种糖为18C或 12F。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM 197缀合，并且不超 过2种糖与TT缀合。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM 197 缀合，余下的血清型在PD、TT与DT或CRM 197之间分摊。在又一 个实施方案中，19F与DT或CRM 197缀合，余下的血清型在PD、 TT与肺炎链球菌溶血素之间分摊。在又一个实施方案中，19F与DT 或CRM 197缀合，余下的血清型在PD、TT与CRM 197之间分摊。 在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，余下的血清型在 PD、TT、肺炎链球菌溶血素与任选PhtD或PhtD/E融合蛋白之间分 摊。在又一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎 链球菌溶血素或TT缀合，另外的一种(两种或三种)糖与TT缀合，还 有一种糖与PhtD或PhtD/E缀合，余下的所有糖都与PD缀合。在又 一个实施方案中，19F与DT或CRM197缀合，19A与肺炎链球菌溶 血素缀合，另外的一种(两种或三种)糖与TT缀合，还有一种糖与肺炎 链球菌溶血素缀合，另外的两种糖与PhtD或PhtD/E缀合，另外余下 的所有糖都与PD缀合。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含得自流感嗜血 菌的D蛋白。在该实施方案中，如果PD不是其中一种用来缀合19F 以外任何糖的载体蛋白，例如19F与DT缀合而其它血清型与一种或 多种不同的不是PD的载体蛋白缀合，则PD作为游离蛋白存在于疫 苗组合物中。如果PD是一种用于缀合19F以外的糖的载体蛋白，则 PD可任选作为游离蛋白存在于疫苗组合物中。
在本说明书全文中，术语“糖”可指多糖或寡糖并且包括多糖和 寡糖。将多糖从细菌中分离出来，可按照已知方法(参见例如EP497524 和EP497525)，优选用微流化法，将多糖的大小减小到某种程度。为 了降低多糖样品的粘度和/或改进缀合产品的滤过性，可将多糖的大小 减小。寡糖的重复单元数目较少(通常5-30个重复单元)，通常为水解 的多糖。
肺炎链球菌的荚膜多糖包含重复的寡糖单元，寡糖单元可最多含 有8个糖残基。有关重要的肺炎链球菌血清型寡糖单元的综述参见 JONES，Christopher，Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria(基于病原菌细胞表面糖类的疫苗).An.Acad. Bras.，2005年6月，第77卷，第2册，第293-324页，ISSN 0001-3765。在一个实施方案中，荚膜糖抗原可以是全长多糖，然而在 其它实施方案中，可以是1个寡糖单元，或者不超过重复寡糖单元糖 链的天然长度。在一个实施方案中，疫苗中存在的所有糖都为多糖。 全长多糖的大小可以“减小”，也就是说它们的大小可通过各种方法 减小，例如酸解处理、过氧化氢处理、通过之后用过氧化 氢处理，以产生寡糖片段；或者用微流化法将其减小。
本发明的发明人还注意到，本领域的焦点一直是利用寡糖以便于 缀合物的生产。本发明的发明人发现，采用天然多糖缀合物或其大小 略微减小的多糖缀合物，可以获得一个或多个以下优势：1)具有高免 疫原性、可滤过的缀合物，2)缀合物中多糖与蛋白质的比率可以改变， 使得缀合物中多糖与蛋白质的比率(重量/重量)可以增加(这样可对载 体抑制作用产生影响)，3)易水解的免疫原性缀合物可以通过采用较大 的糖进行缀合而达到稳定。使用较大的多糖可导致与缀合载体更多的 交联，并且可以减少从缀合物中释放出游离糖。现有技术所述的缀合 物疫苗往往是为了改进缀合而在缀合前使多糖解聚。本发明的发明人 发现糖保持较大尺寸的糖缀合物疫苗可以提供针对肺炎球菌疾病的 良好的免疫应答。
因此，本发明的免疫原性组合物可包含一种或多种糖缀合物，其 中每种糖在缀合前的平均大小(例如重均分子量：Mw)超过80kDa、 100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa或1000kDa。在一个实 施方案中，本发明的一种或多种糖缀合物在缀合之前，糖的平均大小 应为50-1600kDa、80-1400kDa、100-1000kDa、150-500kDa或 200-400kDa (注意如果平均大小为Mw，则本文单位“kDa”应当用 “x103”代之)。在一个实施方案中，缀合后的缀合物应当易通过0.2 微米滤器过滤，使得与过滤前的样品比较时，过滤后可获得的收率超 过50％、60％、70％、80％、90％或95％。
对于本发明的目的，“天然多糖”是指还未经过加工的糖(例如 纯化后的糖)，加工的目的在于减小糖的大小。在正常纯化过程中多糖 的大小可略微减小。这样的糖仍是天然糖。只有多糖经过减小技术， 该多糖才能被视作不是天然糖。
对于本发明的目的，“按高达2倍(x2)的因数减小”是指将糖进 行加工，使糖的大小减小但仍保持其大小为天然多糖大小的一半以 上。x3、x4等以此类推，也就是说将糖进行加工，使多糖的大小减小 但仍保持大小为天然多糖大小的三分之一、四分之一以上等。
在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含得自至少10种血清 型并与载体蛋白缀合的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9种或每种肺炎链球菌糖均为天然多糖。
在本发明的一个方面，免疫原性组合物包含得自至少10种血清 型并与载体蛋白缀合的肺炎链球菌糖，其中至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9种或每种肺炎链球菌糖都按高达x2、x3、x4、x5、x6、x7、 x8、x9或x10的因数减小。在这一方面的一个实施方案，多种糖，例 如6、7、8种以上的糖按高达x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9或 x10的因素减小。
糖的分子量或平均分子量(或大小)在本文是指缀合前所测得的糖 的重均分子量(Mw)，通过MALLS进行测定。
MALLS技术是本领域众所周知的，通常按照实施例2所述方法 进行。对于肺炎球菌糖的MALLS分析，可以联合使用2个柱子 (TSKG6000和5000PWx1)，用水洗脱糖。采用光散射检测器(例如安装 有10mW氩激光源的Wyatt Dawn DSP，波长为488nm)和干涉型折光 计(interferometric refractometer)(例如安装有P100室和498nm红色滤 光片的Wyatt Otilab DSP)对糖进行检测。
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖为天然多糖或为尺寸在正常提 取过程中被减小的天然多糖。
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过机械裂解(例如通过微流 化或超声处理)被减小。微流化和超声处理的优势是将较大的天然多糖 的大小减小到足以提供可滤过的缀合物。按不超过x20、x10、x8、x6、 x5、x4、x3或x2的因数减小。
在一个实施方案中，免疫原性组合物包含肺炎链球菌缀合物，该 肺炎链球菌缀合物由天然多糖和按不超过x20因数减小的糖的混合物 制备。在本实施方案的一个方面，大部分糖，例如6、7、8种以上的 糖按高达x2、x3、x4、x5或x6的因数减小。
在一个实施方案中，肺炎链球菌糖通过连接基(例如双官能连接 基)与载体蛋白缀合。连接基任选为异双官能或同双官能的，具有例如 1个反应性氨基(reactive amino group)和1个反应性羧基、2个反应性 氨基或2个反应性羧基。连接基具有例如4-20个、4-12个、5-10个 碳原子。一种可能的连接基是ADH。其它连接基包括B-丙酰胺基(WO 00/10599)、硝基苯基乙胺(Gever等(1979)Med.Microbiol.Immunol.165； 171-288)、卤代烷基卤(US4057685)、糖苷键(US4673574、US4808700)、 己二胺和6-氨基己酸(US4459286)。在一个实施方案中，ADH用作连 接基与得自血清型18C的糖缀合。在一个实施方案中，ADH用作连 接基与得自血清型22F的糖缀合。
本发明免疫原性组合物中存在的糖缀合物可通过任何已知的偶 联技术制备。缀合方法可依赖于四氟硼氟酸1-氰基-4-二甲氨基吡啶 鎓(CDAP)使糖活化以形成氰酸酯。活化的糖从而可以直接或通过间隔 基(连接基)与载体蛋白上的氨基偶联。例如，间隔基可以是胱胺或半 胱胺以得到硫醇化多糖，硫醇化多糖可以通过与马来酰亚胺活化的载 体蛋白(例如采用GMBS)反应或者与卤代乙酰化载体蛋白(例如采用碘 乙酰胺[例如乙基碘乙酰胺盐酸盐]反应或者与溴乙酸N-琥珀酰亚胺酯 (N-succinimidyl bromoacetate)或SIAB或SIA或SBAP)反应后所获得 的硫醚键而与载体偶联。优选氰酸酯(任选由CDAP化学法制备)与己 二胺或ADH偶联，氨基衍生化糖采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC) 化学法通过蛋白载体上的羧基与载体蛋白缀合。这类缀合物可参见公 布的PCT申请WO 93/15760Uniformed Services University和WO 95/08348和WO 96/29094。
其它合适的技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降莰烷(norborane)、 对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。大多数可 参见WO 98/42721。缀合可包括通过糖的游离羟基与CDI反应形成的 羰基连接基(Bethell等，J.Biol.Chem.1979，254；2572-4；Hearn等，J. Chromatogr.1981.218；509-18)，随后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯 键。这可包括端基还原为伯羟基(任选伯羟基与CDI反应以形成CDI 氨基甲酸酯中间体以使伯羟基受保护/脱保护)以及CDI氨基甲酸酯中 间体与蛋白质的氨基偶联。
缀合物也可通过直接还原性胺化法制备，参见US 4365170 (Jennings)和US 4673574(Anderson)。其它方法参见EP-0-161-188、 EP-208375和EP-0-477508。
另一种方法包括经溴化氰(或CDAP)活化的糖用己二酸二酰肼 (ADH)衍生化后，再与蛋白载体通过碳二亚胺缩合反应而偶联(Chu C 等，Infect Immunity，1983 245 256)，例如采用EDAC。
在一个实施方案中，糖上的羟基(优选活化羟基，例如使羟基活 化以制备氰酸酯[例如与CDAP反应])与蛋白质上的氨基或羧基直接或 间接(通过连接基)连接。如果存在连接基，则糖上的羟基优选与连接 基上的氨基连接，例如用CDAP缀合。连接基(例如ADH)上的另一个 氨基可与蛋白质上的羧基缀合，例如采用碳二亚胺化学法，例如采用 EDAC。在一个实施方案中，肺炎球菌荚膜糖先与连接基缀合后，连 接基再与载体蛋白缀合，或者连接基与载体缀合后再与糖缀合。
还可采用联合技术，一些糖-蛋白质缀合物通过CDAP制备，另 一些通过还原性胺化制备。
一般而言，以下类型的蛋白载体的化学基团可用于偶联/缀合：
A)羧基(例如通过天冬氨酸或谷氨酸)。在一个实施方案中，该基 团直接与糖上的氨基连接或者经碳二亚胺化学法(例如EDAC)与连接 基上的氨基连接。
B)氨基(例如通过赖氨酸)。在一个实施方案中，该基团直接与糖 上的羧基连接，或者经碳二亚胺化学法(例如EDAC)与连接基上的羧 基连接。在另一个实施方案中，氨基与糖上用CDAP或CNBr活化的 羟基直接连接或者与连接基上这种基团连接；与具有醛基的糖或连接 基连接；具有琥珀酰亚胺酯基的糖或连接基连接。
C)巯基(例如通过半胱氨酸)。在一个实施方案中，该基团与溴乙 酰化糖或氯乙酰化糖或者与马来酰亚胺化学法的连接基连接。在一个 实施方案中，该基团是用双二重氮联苯胺(bis diazobenzidine)活化/修饰 的。
D)羟基(例如通过酪氨酸)。在一个实施方案中，该基团是用双二 重氮联苯胺活化/修饰的。
E)咪唑基(例如通过组氨酸)。在一个实施方案中，该基团是用双 二重氮联苯胺活化/修饰的。
F)胍基(例如通过精氨酸)。
G)吲哚基(例如通过色氨酸)。
一般而言，在糖上的下列基团可用于偶联：OH、COOH或NH2。 可以在本领域已知的各种处理后产生醛基，例如高碘酸盐、加酸水解、 过氧化氢等。
直接偶联法：
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-蛋白质----＞缀合 物
糖-醛+NH2-蛋白质----＞席夫碱(Schiff base)+NaCNBH3----＞ 缀合物
糖-COOH+NH2-蛋白质+EDAC----＞缀合物
糖-NH2+COOH-蛋白质+EDAC----＞缀合物
通过间隔基(连接基)间接偶联法：
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-NH2----＞糖-NH2+ COOH-蛋白质+EDAC----＞缀合物
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-SH----＞糖-SH+ SH-蛋白质(半胱氨酸暴露出来的天然蛋白质或通过例如SPDP修饰蛋 白质的氨基而获得的蛋白质)----＞糖-S-S-蛋白质
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-SH----＞糖-SH+ 马来酰亚胺-蛋白质(氨基修饰)----＞缀合物
糖-OH+CNBr或CDAP----＞氰酸酯+NH2-SH----＞糖-SH+ 卤代乙酰化-蛋白质----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2-NH2----＞糖-NH2+EDAC+COOH-蛋 白质----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2-SH----＞糖-SH+SH-蛋白质(半胱氨酸 暴露出来的天然蛋白质或通过例如SPDP修饰蛋白质的氨基获得的蛋 白质)----＞糖-S-S-蛋白质
糖-COOH+EDAC+NH2-SH----＞糖-SH+马来酰亚胺-蛋白质 (氨基修饰)----＞缀合物
糖-COOH+EDAC+NH2-SH----＞糖-SH+卤代乙酰化-蛋白质 ----＞缀合物
糖-醛+NH2-NH2----＞糖-NH2+EDAC+COOH-蛋白质----＞缀 合物
注意：除了上述EDAC外，还可以使用任何合适的碳二亚胺。
总之，通常用于与糖偶联的蛋白载体化学基团的类型为氨基(例 如赖氨酸残基上的氨基)、COOH基团(例如天冬氨酸和谷氨酸残基上 的羧基)和SH基团(如可及的话)(例如半胱氨酸残基上的SH)。
优选载体蛋白与肺炎链球菌糖的比率介于1∶5和5∶1之间；例如 介于1∶0.5-4∶1、1∶1-3.5∶1、1.2∶1-3∶1、1.5∶1-2.5∶1之间；例如介于1∶2 和2.5∶1之间；介于1∶1和2∶1之间(重量/重量)。在一个实施方案中， 大部分缀合物，例如6、7、8、9个以上的缀合物中的载体蛋白与糖 的比率大于1∶1，例如1.1∶1、1.2∶1、1.3∶1、1.4∶1、1.5∶1或1.6∶1。
在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌糖用CDAP和EDAC 通过连接基与载体蛋白缀合。例如，18C或22F可按上述方法，用CDAP 和EDAC通过连接基(例如其两端有2个肼基的连接基例如ADH)与蛋 白质缀合。如果使用连接基，则CDAP可用来使糖与连接基缀合，而 EDAC可用来使连接基与蛋白质缀合，或者EDAC可先用来使连接基 与蛋白质缀合，之后可再用CDAP使连接基与糖缀合。
一般而言，本发明的免疫原性组合物可包含各种糖缀合物，其中 糖的剂量介于0.1-20μg之间、1-10μg之间或者1-3μg之间。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物含有各种肺炎链球 菌荚膜糖，其中糖的剂量介于0.1-20μg、0.5-10μg、0.5-5μg或1-3μg 之间。在一个实施方案中，荚膜糖可以不同的剂量存在，例如一些荚 膜糖存在的剂量正好为1μg，或者一些荚膜糖存在的剂量正好为3μg。 在一个实施方案中，得自血清型3、18C和19F(或血清型4、18C和 19F)的糖存在的剂量要比其它糖的剂量高。在本实施方案的一个方面， 血清型3、18C和19F(或血清型4、18C和19F)存在的剂量大约或正 好为3μg，而免疫原性组合物中其它糖存在的剂量大约或正好为1μg。
对于本发明的目的，“约”或“大约”定义为在给定值的10％左 右。
在一个实施方案中，至少一种肺炎链球菌荚膜糖与载体蛋白直接 缀合(例如采用上述化学反应之一)。优选至少一种肺炎链球菌荚膜糖 用CDAP直接缀合。在一个实施方案中，大部分荚膜糖，例如5、6、 7、8、9种以上用CDAP直接与载体蛋白连接(参见WO 95/08348和 WO 96/29094)。
免疫原性组合物可包含肺炎链球菌蛋白，本文称为本发明的肺炎 链球菌蛋白。这种蛋白质可以用作载体蛋白，或者可以作为游离蛋白 存在，或者可以既以载体蛋白又以游离蛋白存在。本发明的肺炎链球 菌蛋白或是表面暴露的(至少肺炎球菌生命周期的某一阶段)，或者是 由肺炎球菌分泌或释放的蛋白质。优选本发明的蛋白质选自以下种 类，例如具有LXXC的II型信号序列基序的蛋白(其中X为任何氨基 酸，例如多聚组氨酸三联体家族(PhtX))、胆碱结合蛋白(CbpX)、具有 I型信号序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中 X为任何氨基酸，例如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)。这些种类(或 基序)范围内的优选实例是以下蛋白质或其免疫功能等同物。
在一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含至少一种选自 以下的蛋白质：多聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族 (CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、LytX截短物、CbpX截短物-LytX 截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、 Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。在又一个实施方案中，免疫 原性组合物包含两种或更多种选自以下的蛋白质：多聚组氨酸三联体 家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、 LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎 链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128。在又一个实施方案中，免 疫原性组合物包含两种或更多种选自以下的蛋白质：多聚组氨酸三联 体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截短物、LytX家族、 LytX截短物、CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)、肺炎 链球菌溶血素(Ply)和Sp128。
Pht(多聚组氨酸三联体)家族包含蛋白质PhtA、PhtB、PhtD和 PhtE。该家族的特征是脂质化序列(lipidation sequence)，被一个富含脯 氨酸区和若干组氨酸三联体分隔成两个结构域(可能涉及金属或核苷 结合或酶活性)、(3-5个)卷曲螺旋区、保守的N端和异源C端。它存 在于所测试的所有肺炎球菌菌株中。还发现在其它链球菌属和奈瑟氏 球菌属(Neisseria)中存在同源蛋白质。在本发明一个实施方案中，本发 明的Pht蛋白是PhtD。然而，要理解的是，术语PhtA、PhtB、PhtD 和PhtE是指具有以下引用文献中所公开序列的蛋白质及其天然存在 的(和合成的)变异体，该变异体具有与参比蛋白有至少90％同一性的 序列同源物，优选有至少95％同一性，更优选有97％同一性。
至于PhtX蛋白，PhtA公开于WO 98/18930，亦称Sp36。正如上 面所注意到的一样，它是得自多聚组氨酸三联体家族的蛋白质，具有 II型LXXC信号基序。PhtD公开于WO 00/37105，亦称Sp036D。正 如上面所注意到的一样，它也是得自多聚组氨酸三联体家族的蛋白 质，具有II型LXXC信号基序。PhtB公开于WO 00/37105，亦称 Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解多肽，公开于WO 00/17370。 这一蛋白质也得自多聚组氨酸三联体家族，并具有II型LXXC信号基 序。优选的免疫功能等同物是公开于WO 98/18930的蛋白Sp42。PhtB 截短物(大约79kD)公开于WO 99/15675，也有人认为是PhtX家族的 成员。PhtE公开于WO 00/30299，亦称BVH-3。当本文提及任何Pht 蛋白时，是指可以使用Pht蛋白的免疫原性片段或其融合物。例如， 提及PhtX则包括任何Pht蛋白的免疫原性片段或其融合物。提及PhtD 或PhtB也就提及到PhtDE或PhtBE融合物，参见例如WO 0198334。
肺炎链球菌溶血素是具有独特溶细胞(溶血)活性和补体活化活性 的多功能毒素(Rubins等，Am.Respi.Cit Care Med，153：1339-1346 (1996))。该毒素不是由肺炎球菌分泌的，而是在自溶素的影响下在肺 炎球菌裂解时释放出来的，其作用包括例如刺激人单核细胞产生炎性 细胞因子，抑制人呼吸道上皮纤毛的击打，降低杀菌活性和嗜中性粒 细胞迁移。肺炎链球菌溶血素最明显的作用是溶解红细胞，这包括与 胆固醇结合。因为它是一种毒素，所以在给予体内前需要脱毒(即当以 适于保护的剂量提供时应对人体无毒性)。野生型或天然肺炎链球菌溶 血素的表达和克隆是本领域所知的。参见例如Walker等(Infect Immun，55：1184-1189(1987))、Mitchell等(Biochim Biophys Acta， 1007：67-72(1989)和Mitchell等(NAR，18：4010(1990))。可以通过化学 方法例如用福尔马林或戊二醛或这两种溶液的组合处理，对ply进行 脱毒(WO 04081515、PCT/EP2005/010258)。对于各种毒素，这些方法 是本领域众所周知的。或者，ply可以通过遗传方法脱毒。因此，本 发明包括肺炎球菌蛋白的衍生物，它可以是例如突变蛋白。本文所用 术语“突变”是指应用众所周知的定点诱变技术或任何其它常用方法， 使分子经历缺失、添加或取代一个或多个氨基酸。例如，按照上述方 法可以改变突变型ply蛋白，使之在生物学上没有活性但又保留其免 疫原性表位，参见例如WO 90/06951、Berry等(Infect Immun， 67：981-985(1999))和WO 99/03884。
要理解的是，本文所用术语“Ply”是指适于医用的经突变或脱 毒(即无毒)的肺炎链球菌溶血素。
关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被鉴定为可用 胆碱亲和色谱法纯化的肺炎球菌蛋白。所有胆碱结合蛋白与细胞壁磷 壁酸和与膜缔合的脂磷壁酸的磷酰胆碱部分非共价地结合。虽然在结 构上该蛋白质的确切性质(氨基酸序列、长度等)可以发生改变，但是 它们却都具有整个家族共有的数个区域。一般而言，胆碱结合蛋白包 括N端区(N)、保守重复区(R1和/或R2)、富含脯氨酸区(P)和保守胆 碱结合区(C)，构成了占该蛋白质大约一半的多个重复区。本申请所用 术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自WO 97/41151中所鉴定的胆碱 结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公开 于WO 97/41151。CbpD和CbpG公开于WO 00/29434。PspC公开于 WO 97/09994。PbcA公开于WO 98/21337。SpsA为WO 98/39450中 所公开的胆碱结合蛋白。优选胆碱结合蛋白选自CbpA、PbcA、SpsA 和PspC。
另一个优选的实施方案是CbpX截短物，其中“CbpX”如上定义， “截短物”是指缺少50％以上胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。优选这类 蛋白质缺少完整的胆碱结合区。更优选这类蛋白质截短物缺少(i)胆碱 结合区，也缺少(ii)蛋白质N端一半的部分，但仍保留至少1个重复区 (R1或R2)。还更优选截短物具有2个重复区(R1和R2)。该优选的实 施方案的实例是WO 99/51266或WO 99/51188所示的NR1xR2和 R1xR2，然而，缺少类似胆碱结合区的其它胆碱结合蛋白也包括在本 发明范围内。
LytX家族是与溶解细胞有关的膜缔合蛋白。N端域包括胆碱结 合域，然而LytX家族不具有上述CbpA家族存在的所有特征，因此 本发明认为，LytX家族完全不同于CbpX家族。与CbpX家族相比， C端域含有LytX蛋白家族的催化域。该家族包括LytA、LytB和LytC。 至于LytX家族，LytA公开于Ronda等，Eur J Biochem，164：621-624 (1987)。LytB公开于WO 98/18930，亦称Sp46。LytC同样公开于WO 98/18930，亦称Sp91。该家族优选的成员是LytC。
另一个优选的实施方案是LytX截短物，其中“LytX”如上定义， “截短物”是指LytX蛋白缺少50％以上的胆碱结合区。优选这类蛋 白质缺少完整的胆碱结合区。本发明的又一个优选的实施方案是 CbpX截短物-LytX截短物嵌合蛋白(或融合蛋白)。优选这一蛋白质包 含CbpX的NR1xR2(或R1xR2)和LytX的C端部分(Cterm，即缺少胆 碱结合区)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更优选CbpX选自CbpA、 PbcA、SpsA和PspC。还更优选为CbpA。优选LytX是LytC(亦称Sp91)。 本发明的另一个实施方案是缺少胆碱结合区(C)的PspA或PsaA截短 物，用与LytX的融合蛋白表示。优选LytX是LytC。
至于PsaA和PspA，两者都是本领域所知的。例如PsaA及其跨 膜缺失变异体记载于Berry和Paton，Infect Immun 1996年12月； 64(12)：5255-62。PspA及其跨膜缺失变异体公开于例如US 5804193、 WO 92/14488和WO 99/53940。
Sp128和Sp130公开于WO 00/76540。Sp125是具有LPXTG(其 中X为任何氨基酸)的细胞壁锚定基序(Cell Wall Anchored motif)的肺 炎球菌表面蛋白的实例。已经发现具有这一基序的该类肺炎球菌表面 蛋白范围内的任何蛋白质均可用于本发明的内容中，因此被认为是本 发明的另一种蛋白质。Sp125本身公开于WO 98/18930，亦称ZmpB- 一种锌金属蛋白酶。Sp101公开于WO 98/06734(其中的检索号为 y85993)。其特征是I型信号序列。Sp133公开于WO 98/06734(其中 的检索号为y85992)，其特征也是I型信号序列。
可以包括在联合疫苗(尤其是用于预防中耳炎)中的优选的粘膜炎 莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)蛋白抗原的实例是：OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO 96/34960(PMC)]；OMP21或其片段[(WO 0018910)；LbpA和/或LbpB[WO 98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB [WO 97/13785和WO 97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等(1993) Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO 93/03761 (University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ (PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB 9917977.2)； lipo10(GB 9918208.1)；lipo11(GB 9918302.2)；lipo18(GB 9918038.2)； P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmpIA1 (PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE。可以包括在联 合疫苗(尤其用于预防中耳炎)中的未分型流感嗜血菌抗原或其片段的 实例包括微丝结合蛋白(Fimbrin protein)[(US 5766608-Ohio State Research Foundation)]和包含其肽的融合物[例如LB 1(f)肽融合物；US 5843464(OSU)或WO 99/64067]；OMP26[WO 97/01638(Cortecs)]； P6[EP 281673(State University of New York)]；TbpA和/或TbpB；Hia； Hsf； Hin47；Hif； Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO 94/12641)；P2和P5(WO 94/26304)。
本发明的蛋白质还可以为了获益而组合使用。所谓组合是指免疫 原性组合物包含在以下组合范围内的所有蛋白质，或作为载体蛋白， 或作为游离蛋白，或者是两者的混合物。例如，本文下述两种蛋白质 的组合，两种蛋白质均可用作载体蛋白，或者两种蛋白质均可作为游 离蛋白存在，或者两种蛋白既可作为载体又可作为游离蛋白存在，或 者一种蛋白可作为载体蛋白和游离蛋白存在，而另一种蛋白只作为载 体蛋白或只作为游离蛋白存在，或者一种蛋白作为载体蛋白存在，另 一种蛋白作为游离蛋白存在。如果给出三种蛋白质的组合，则存在类 似的可能性。优选的组合包括但不限于PhtD+NR1xR2、PhtD+ NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、 PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NR1xR2、PhtA+ NR1xR2-Sp91Cterm嵌合蛋白或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Sp128、 PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NR1xR2+LytC、NR1xR2+PspA、NR1xR2 +PsaA、NR1xR2+Sp128、R1xR2+LytC、R1xR2+PspA、R1xR2+ PsaA、R1xR2+Sp128、R1xR2+PhtD、R1xR2+PhtA。优选NR1xR2 (或R1xR2)得自CbpA或PspC。更优选得自CbpA。其它组合包括3 种蛋白质组合，例如PhtD+NR1xR2+Ply和PhtA+NR1xR2+PhtD。 在一个实施方案中，疫苗组合物包含脱毒肺炎链球菌溶血素和PhtD 或PhtDE作为载体蛋白。在又一个实施方案中，疫苗组合物包含脱毒 肺炎链球菌溶血素和PhtD或PhtDE作为游离蛋白。
本发明另提供含有本发明的免疫原性组合物和药学上可接受的 赋形剂的疫苗。
本发明的疫苗可以加有佐剂，特别是欲用于老年人群但同样用于 婴幼儿人群时。合适的佐剂包括铝盐，例如氢氧化铝凝胶或磷酸铝或 明矾，但还可为钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可为乙酰化酪氨酸或 乙酰化糖、阳离子或阴离子衍生化糖或聚磷腈的不溶性混悬液。
优选所选用的佐剂为TH1型应答的优先诱导物。这种高水平的 Th1型细胞因子往往有利于诱导细胞介导的针对给定抗原的免疫应 答，同时高水平的Th2型细胞因子往往有利于诱导针对抗原的体液免 疫应答。
Th1型和Th2型免疫应答的区分并不是绝对的。实际上个体将支 持被认为主要是Th1或主要是Th2的免疫应答。然而，根据Mosmann 和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中所述，这种区分通常便于研究 细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties(TH1和TH2细胞：不同模式的淋巴因子分泌导致 不同的功能性质).Annual Review of Immunology，7，第145-173页。从 传统上讲，Th1型应答与由T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有 关。通常直接与Th1型免疫应答诱导有关的其它细胞因子并不是由T 细胞产生的(例如IL-12)。相比之下，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、 IL-10的分泌有关。促进主要是Th1应答的合适的佐剂系统包括：单 磷酰脂质A或其衍生物，特别是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL) (有关它的制备参见GB 2220211A)；和单磷酰脂质A、优选3-脱-O- 酰化单磷酰脂质A与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳液的组 合。在这种组合中，抗原和3D-MPL包含在同一颗粒结构中，使得更 有效地传递抗原信号和免疫刺激信号。研究显示3D-MPL能够进一步 提高明矾吸附性抗原的免疫原性[Thoelen等，Vaccine(1998)16：708-14； EP 689454-B1]。
一种强化系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合、特别是 QS21和3D-MPL的组合(参见WO 94/00153)，或者其中QS21是被胆 固醇猝灭的反应原性较弱的组分(参见WO 96/33739)。包括水包油乳 液中的QS21、3D-MPL和生育酚的一个特别有效的佐剂制剂参见WO 95/17210。在一个实施方案中，免疫原性组合物另外还包含皂苷，它 可以是QS21。该制剂还可包含水包油乳液和生育酚(WO 95/17210)。 含有未甲基化CpG的寡核苷酸(WO 96/02555)和其它免疫调节性寡核 苷酸(WO 0226757和WO 03507822)也是TH1应答的优先诱导物，并 且适用于本发明。
具体的佐剂是选自以下的佐剂：金属盐、水包油乳液、Toll样受 体激动剂(特别是Toll样受体2激动剂、Toll样受体3激动剂、Toll 样受体4激动剂、Toll样受体7激动剂、Toll样受体8激动剂和Toll 样受体9激动剂)、皂苷或其组合。
可以与本发明疫苗组合物一起使用的佐剂为bleb或得自革兰氏 阴性菌菌株外膜小泡的制备物，例如WO 02/09746中所述菌株-特 别是脑膜炎奈瑟氏球菌bleb。bleb的佐剂性质可通过将LOS(脂寡糖) 保留在其表面(例如用低浓度的洗涤剂提取[例如0-0.1％脱氧胆酸盐]) 而得到改进。可通过WO 02/09746中所述的msbB(-)或htrB(-)突变对 LOS进行脱毒。还可通过保留得自脑膜炎球菌bleb的PorB(和任选除 去PorA)来改进佐剂性质。可以通过将脑膜炎球菌bleb上LOS的外核 心糖结构截短来改进佐剂性质-例如通过WO 2004/014417所述的 IgtB(-)突变。或者，可对上述LOS(例如从msbB(-)和/或IgtB(-)菌株分 离出的LOS)进行纯化，并用作本发明组合物的佐剂。
可用于本发明组合物的另一种佐剂可选自皂苷、脂质A或其衍生 物、免疫调节性寡核苷酸、烷基氨基葡糖苷磷酸酯、水包油乳液或其 组合。另一种优选的佐剂是与其它佐剂组合的金属盐。优选佐剂为Toll 样受体激动剂，特别是Toll样受体2、3、4、7、8或9的激动剂或皂 苷，特别是Qs21。另还优选佐剂系统包含得自上述例举明细中的两种 或更多种佐剂。特别是优选含有皂苷(特别是Qs21)佐剂和/或Toll样 受体9激动剂例如含有CpG的免疫刺激寡核苷酸的组合。其它优选的 组合包含皂苷(特别是QS21)和Toll样受体4激动剂例如单磷酰脂质A 或其3-脱酰化衍生物3D-MPL或者皂苷(特别是QS21)和Toll样受体4 配体例如烷基氨基葡糖苷磷酸酯。
特别优选的佐剂是3D-MPL和QS21的组合(EP 0671948B1)、 含有3D-MPL和QS21的水包油乳液(WO 95/17210、WO 98/56414)或 者用其它载体配制的3D-MPL(EP 0689454B1)。其它优选的佐剂系 统包含3D MPL、QS21和CpG寡核苷酸的组合，参见US6558670、 US6544518。
在一个实施方案中，佐剂是(或含有)Toll样受体(TLR)4配体， 优选为激动剂，例如脂质A衍生物，特别是单磷酰脂质A或更特别是 3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)。
3D-MPL可得自北美葛兰素史克生物制品公司(GlaxoSmithKline Biologicals North America)，主要促进对IFN-g(Th1)表型的CD4+T细 胞应答。可按照GB 2220211A公开的方法制备。从化学结构看，它 是3-脱-O-酰化单磷酰脂质A与3、4、5或6条酰化链的混合物。优 选本发明组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒径 可以使之通过0.22μm过滤器进行过滤除菌。其制备可参见国际专利 申请WO 94/21292。已知并被视为TLR 4激动剂的脂质A的合成衍生 物包括但不限于：
OM 174：(2-脱氧-6-O-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰氨 基]-4-O-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]-α-D-吡 喃葡糖基二氢磷酸酯)(WO 95/14026)
OM 294 DP：1，10-双(二氢磷酸)-(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四 烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰氨基]癸-1，10-二醇 酯(WO 99/64301和WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP：1-二氢磷酸10-(6-氨基己酸)-(3S，9R)-3-[(R)- 十二烷酰氧基十四烷酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰氨 基]癸-1，10-二醇酯(WO 01/46127)
可以使用的其它TLR4配体为烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)(例 如WO 9850399或US6303347中公开的烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP) 和AGP的制备方法)，或者AGP药学上可接受的盐(参见US6764840)。 一些AGP是TLR4激动剂，另一些是TLR4拮抗剂。一般认为两种均 可用作佐剂。
用于本发明的其它优选的免疫刺激剂为Quil A及其衍生物。Quil A是从南美奎拉雅属皂树(Quillaja saponaria Molina)中分离出来的皂苷 制备物，Dalsgaard等人于1974年首次提出Quil A具有佐剂活性 (Dalsgaard等，″Saponin adjuvants(皂苷佐剂)″，Archiv für die gesamte Virusforschung，第44卷，Springer Verlag，Berlin，第243-254页)。已 经用HPLC分离出Quil A的纯化片段，它保留了佐剂活性而无与Quil A相关的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(亦称QA7和QA21)。 QS-21是从奎拉雅属皂树(Quillaja saponaria Molina)的树皮中获得的天 然皂苷，它诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)、Th1细胞和显著的IgG2a 抗体应答，是本发明范围内优选的皂苷。
文献中记载了特别优选的QS21的具体制剂，这些制剂还包含甾 醇(WO 96/33739)。可以按以下形式分离出本发明制备部分的皂苷：微 团、混合微团(最好但不必只与胆盐混合)、或者ISCOM基质(EP 0 109 942 B1)、脂质体或相关胶状结构(例如蠕虫样或环状多聚体复合物)或 者当与胆固醇和脂质制备时为脂质结构/片层结构和薄片状、或者水包 油乳液(例如参见WO 95/17210)。皂苷可优选与金属盐缔合，例如氢 氧化铝或磷酸铝(WO 98/15287)。
优选皂苷以脂质体、ISCOM或水包油乳液的形式存在。
一种强化系统包括单磷酰脂质A(或脱毒脂质A)与皂苷衍生物的 组合，特别是QS21与3D-MPL的组合(参见WO 94/00153)、或者其 中QS21被胆固醇猝灭的反应原性较弱的组分(参见WO 96/33739A)。 一种水包油乳液中含有生育酚(含有或不含QS21和/或3D-MPL)的特 别有效的佐剂制剂参见WO 95/17210。在一个实施方案中，免疫原性 组合物另外还包含皂苷，它可以是QS21。
还可采用免疫刺激寡核苷酸或任何其它Toll样受体(TLR)9激动 剂。用于本发明佐剂或疫苗的优选的寡核苷酸是含有CpG的寡核苷 酸，优选含有两个或更多个二核苷酸CpG基序，其被至少3个、更 优选至少6个以上核苷酸间隔开。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接着鸟 嘌呤核苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常为脱氧核苷酸。在一个优选 的实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸之间为二硫代磷酸酯键，或更优 选为硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯键和其它核苷酸间的化学键也在本 发明的范围内。包括在本发明范围内的还有具有混杂的核苷酸间化学 键的寡核苷酸。有关产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法 参见US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。
优选的寡核苷酸的实例具有下列序列，这些序列优选含有硫代磷 酸酯修饰的核苷酸间化学键。
OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
OLIGO 6(SEQ ID NO：6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)
替代的CpG寡核苷酸可包含上述优选的序列，其中有无关紧要 的缺失或添加。
本发明所用的CpG寡核苷酸可以用本领域已知的任何方法合成 (例如参见EP 468520)。这种寡核苷酸可方便地用自动合成仪进行合 成。
佐剂可为水包油乳液，或者可包含水包油乳液与其它佐剂组合。 乳液系统的油相优选包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域众 所周知的。可代谢可定义为“能够通过代谢被转化”(Dorland′s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。 油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，对接受者是无毒的， 并且能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是植物油的普遍来源。 合成油也是本发明的一部分，可包括市售的油，例如等。 角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是不饱 和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚油、米糠油 和酵母中，是用于本发明特别优选的油。角鲨烯为可代谢油，因为它 是胆固醇生物合成中的中间体(默克索引(Merck index)，第10版，检 索号8619)。
母育酚(例如维生素E)也常常用于油乳液佐剂中(EP 0 382 271 B1、US5667784、WO 95/17210)。本发明油乳液中所用的母育酚(优选 水包油乳液)可以按照EP 0 382 271 B1所述方法制备，其中母育酚可 以是母育酚液滴的分散体，优选直径不超过1微米，任选含有乳化剂。 或者，母育酚还与其它油联用，以形成油乳液的油相。可与母育酚联 用的油乳液的实例见本文所述，例如上述可代谢油。
有研究提出水包油乳液佐剂本身用作佐剂组分(EP 0 399 843B)， 还有研究提出水包油乳液与其它活性剂的组合用作疫苗佐剂(WO 95/17210、WO 98/56414、WO 99/12565、WO 99/11241)。有研究提出 其它油乳液佐剂，例如油包水乳液(US 5,422,109、EP 0 480 982 B2)和 水包油包水乳液(US 5,424,067、EP 0 480 981 B)。所有这些均构成形 成本发明佐剂和组合物的优选的油乳液系统(特别当掺入母育酚时)。
更优选油乳液(例如水包油乳液)另还含有乳化剂，例如吐温80 (TWEEN 80)和/或甾醇，例如胆固醇。
优选的油乳液(优选水包油乳液)含有可代谢的无毒油，例如角鲨 烷、角鲨烯或生育酚例如α生育酚(以及优选角鲨烯和α生育酚两种) 和任选乳化剂(或表面活性剂)，例如吐温80。甾醇(优选胆固醇)也可 包括在内。
水包油乳液的生产方法为本领域技术人员所熟知。一般来讲，该 方法包括将含有母育酚的油相与表面活性剂(例如PBS/TWEEN 80TM溶液)混匀，然后用匀浆器匀浆。本领域技术人员应当清楚的是，包括 将混合物两次通过注射器针头的方法可适于少量液体的匀浆。同样， 本领域技术人员可调整微乳化器(M110S微乳化机(Microfluidics machine)的乳化过程，最多为50个通道，时间2分钟，最大压力输入 6巴(输出压力约850巴))以产生较少量或较大量的乳液。可采用常规 实验进行调整，实验包括测量所得乳液，直到获得具有所需直径的油 滴的制剂。
水包油乳液中，油和乳化剂应在水性载体中。水性载体可为例如 磷酸缓冲盐溶液。
稳定的水包油乳液内的油滴大小优选不超过1微米，直径范围基 本可为30-600nm，优选直径基本约为30-500nm，更优选直径基本为 150-500nm，直径特别约为150nm，用光子相关光谱测量。在这一方 面，80％(数量)的油滴应该在优选范围内，更优选超过90％和更优选 超过95％(数量)的油滴在规定的大小范围内。存在于本发明油乳液中 各成分的含量按常规在以下范围内：0.5-20％或2-10％的油(占剂量总 体积)，例如角鲨烯；2-10％的α生育酚(如存在时)和0.3-3％的表面活 性剂，例如聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯。优选油(优选角鲨烯)与母育 酚(优选α生育酚)的比率≤1，因为这样可提供较稳定的乳液。乳化剂， 例如吐温80或斯盘85(Span 85)也可以大约1％的水平存在。本发明 的疫苗另含有稳定剂在某些情况下可能是有益的是。
优选的乳液系统的实例参见WO 95/17210、WO 99/11241和WO 99/12565，其中公开了基于角鲨烯、α-生育酚和吐温80的乳液佐剂， 任选与免疫刺激剂QS21和/或3D-MPL一起配制。因此，在本发明一 个特别优选的实施方案中，本发明的佐剂另外还包含其它免疫刺激 剂，例如LPS或其衍生物和/或皂苷。其它免疫刺激剂的实例如本文 所述，另参见″Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach(疫 苗设计-亚单位和佐剂方法)″1995，Pharmaceutical Biotechnology， 第6卷，编辑Powell，M.F.和Newman，M.J.，Plenum Press，New York and London，ISBN 0-306-44867-X。
在一个优选的方面，本发明的佐剂和免疫原性组合物含有溶于上 述油乳液中的皂苷(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL)，任选 具有甾醇(优选胆固醇)。另外，油乳液(优选水包油乳液)可含有斯盘 85和/或卵磷酯和/或三辛酸甘油酯。含有水包油乳液、甾醇和皂苷的 佐剂参见WO 99/12565。
通常对于人用皂苷(优选QS21)和/或LPS衍生物(优选3D-MPL)， 在人用剂量的免疫原性组合物中存在的范围为每剂1μg-200μg，例如 10-100μg，优选10μg-50μg。通常油乳液(优选水包油乳液)将含有2-10％ 的可代谢油，优选含有2-10％的角鲨烯、2-10％的α生育酚和0.3-3％(优 选0.4-2％)的乳化剂(优选吐温80[聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯])。如果 角鲨烯和α生育酚都存在时，优选角鲨烯与α生育酚的比率≤1，因为 这样可提供稳定的乳液。斯盘85(失水山梨醇三油酸酯)可以0.5-1％的 水平存在于本发明所用的乳液中。在某些情况下可能有益的是本发明 免疫原性组合物和疫苗另含有稳定剂，例如其它乳化剂/表面活性剂， 包括辛酸(默克索引，第10版，检索号1739)，其中三辛酸甘油酯是特 别优选的。
如果包括角鲨烯和皂苷(优选QS21)，有益的是制剂也包括甾醇 (优选胆固醇)，因为这使得乳液中油的总水平降低。这样使得制造成 本降低，接种疫苗的总体舒适度得到改善，所获得的免疫应答也得到 定性和定量的改进，例如IFN-γ产生改进。因此，本发明的佐剂系统 中，可代谢油与皂苷比率(重量/重量)的范围通常为200∶1-300∶1，本发 明还可用“低油”形式，可代谢油与皂苷比率的优选范围为1∶1-200∶1， 优选20∶1-100∶1，更优选基本上为48∶1，这种疫苗保留了所有成分有 益的佐剂性质，却具有反应原性大为降低的特征。因此，特别优选的 实施方案中角鲨烯与QS21的比率(重量/重量)范围为1∶1-250∶1，优选 的范围还可为20∶1-200∶1，优选20∶1-100∶1，更优选基本上为48∶1。优 选甾醇(更优选胆固醇)也包括在内，皂苷与甾醇的比率如本文所述。
本发明的乳液系统优选具有小的油滴，大小为亚微米范围。更优 选油滴大小的范围为120-750nm，更优选直径为120-600nm。
特别有效的佐剂制剂(在本发明的免疫原性组合物中与AlPO4的 最终组合)包括皂苷(优选QS21)、LPS衍生物(优选3D-MPL)和油乳液 (优选水包油乳液中的角鲨烯和α生育酚)，参见WO 95/17210或WO 99/12565(特别是实施例2表1的佐剂制剂11)。
TLR 2激动剂的实例包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉类，例如 咪喹莫德和瑞喹莫德是已知的TLR7激动剂。单链RNA也是已知的 TLR激动剂(在人中的TLR8和在小鼠中的TLR7)，而双链RNA和poly IC(聚肌胞苷酸--一种市售的病毒RNA的合成模拟物)是示例性的 TLR 3激动剂。3D-MPL是TLR4激动剂的实例，而CPG是TLR9激 动剂的实例。
免疫原性组合物可包含吸附在金属盐上的抗原和免疫刺激剂。其 中抗原和免疫刺激物3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)吸附在同一 颗粒上的铝型疫苗制剂可参见EP 0 576 478 B1、EP 0 689 454 B1和 EP 0 633 784 B1。然而在这些情况下，抗原首先吸附到铝盐上，免疫 刺激剂3D-MPL再吸附到同一铝盐颗粒上。该方法包括首先在水浴中 对3D-MPL的悬浮液进行超声处理直到颗粒达到80nm和500nm之间。 抗原通常在室温下搅拌1小时后被吸附到铝盐上。然后将3D-MPL悬 浮液加到吸附的抗原中，将该制剂在室温下保温1小时，然后保存于 4℃下备用。
在另一种方法中，免疫刺激剂和抗原吸附在单独的金属颗粒上， 参见EP 1126876。这种改进方法包括将免疫刺激剂吸附到金属盐颗粒 上，之后将抗原吸附到其它金属盐颗粒上，然后将不同的金属颗粒混 匀后制成疫苗。用于本发明的佐剂可以是佐剂组合物，其中含有吸附 到金属盐颗粒上的免疫刺激剂，其特征是金属盐颗粒基本上不含其它 抗原。此外，本发明提供疫苗，其特征是免疫刺激剂吸附到基本不含 其它抗原的金属盐颗粒上，以及吸附有抗原的金属盐颗粒基本不含其 它的免疫刺激剂。
因此，本发明提供包含吸附到金属盐颗粒上的免疫刺激剂的佐剂 制剂，其特征是组合物中基本不含其它抗原。而且，这一佐剂制剂可 以是制备疫苗时所需要的中间体(如果要使用该佐剂的话)。因此，本 发明提供制备疫苗的方法，该方法包括将佐剂组合物与抗原相混合， 所述佐剂组合物是一种或多种吸附到金属颗粒上的免疫刺激剂。优选 抗原已经预吸附到金属盐上。所述金属盐可与吸附免疫刺激剂的金属 盐相同或类似。优选金属盐为铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。
本发明还提供疫苗组合物，该疫苗组合物包含吸附到第一金属盐 颗粒上的免疫刺激剂，和吸附到第二金属盐颗粒上的抗原，其特征是 第一金属盐颗粒和第二金属盐颗粒是单独的颗粒。
对于本文所述该部分的任何用法，本文所述LPS或LOS衍生物 或突变或者脂质A衍生物被设计成比天然脂多糖毒性低(例如 3D-MPL)且可互换的等同物。它们可以是如上所述TLR4配体。这样 的其它衍生物可参见WO 020786737、WO 9850399、WO 0134617、 WO 0212258、WO 03065806。
在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含脂质体载体 (通过已知技术由磷脂(例如二油酰基磷脂酰胆碱[DOPC])和任选甾醇 [例如胆固醇]制备)。该脂质体载体可以携带脂质A衍生物[例如 3D-MPL-参见上文]和/或皂苷(例如QS21-参见上文)。在一个实施 方案中，佐剂含有(每0.5ml剂量)0.1-10mg、0.2-7mg、0.3-5mg、0.4-2mg 或0.5-1mg(例如0.4-0.6mg、0.9-1.1mg、0.5mg或1mg)磷脂(例如 DOPC)；0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、0.1-0.3mg或 0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或0.125mg)甾醇(例 如胆固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、 20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL)和5-60μg、 10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg 或50μg)皂苷(例如QS21)。
这一佐剂特别适于老年人用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含 这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀合物：4、 6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(和还可包含一种或多种得 自以下血清型的糖缀合物：3、6A、19A和22F)，其中在已接种疫苗 的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、 19F和23F的GMC抗体效价并不显著次于由疫苗诱导的 GMC抗体效价。
在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含由可代谢油 (例如角鲨烯)、乳化剂(例如吐温80)和任选母育酚(例如α生育酚)制成 的水包油乳液。在一个实施方案中，佐剂含有(每0.5ml剂量)0.5-15mg、 1-13mg、2-11mg、4-8mg或5-6mg(例如2-3mg、5-6mg或10-11mg) 可代谢油(例如角鲨烯)；0.1-10mg、0.3-8mg、0.6-6mg、0.9-5mg、1-4mg 或2-3mg(例如0.9-11mg、2-3mg或4-5mg)乳化剂(例如吐温80)和任 选0.5-20mg、1-15mg、2-12mg、4-10mg、5-7mg(例如11-13mg、5-6mg 或2-3mg)母育酚(例如α生育酚)。
这一佐剂可任选另含有5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、 40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如 3D-MPL)。
这些佐剂特别适于婴幼儿或老年人用疫苗制剂。在一个实施方案 中，包含这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀 合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可含有一种或 多种得自以下血清型的糖缀合物：3、6A、19A和22F)，其中在已接 种疫苗的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、 14、18C、19F和23F而诱导的GMC抗体效价并不显著次于由疫苗所诱导的GMC抗体效价。
这一佐剂可任选含有0.025-2.5mg、0.05-1.5mg、0.075-0.75mg、 0.1-0.3mg或0.125-0.25mg(例如0.2-0.3mg、0.1-0.15mg、0.25mg或 0.125mg)甾醇(例如胆固醇)；5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、 40-50μg、10μg、20μg、30μg、40μg或50μg)脂质A衍生物(例如3D-MPL) 和5-60μg、10-50μg或20-30μg(例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、 30μg、40μg或50μg)皂苷(例如QS21)。
这一佐剂特别适于老年人用疫苗制剂。在一个实施方案中，包含 这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀合物：4、 6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或多种得自 以下血清型的糖缀合物：3、6A、19A和22F)，其中在已接种疫苗的 人中，由针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、18C、 19F和23F所诱导的GMC抗体效价并不显著次于由疫苗所 诱导的GMC抗体效价。
在一个实施方案中，用于本发明组合物的佐剂包含磷酸铝和脂质 A衍生物(例如3D-MPL)。这一佐剂可包含(每0.5ml剂量)100-750μg、 200-500μg或300-400μg Al(为磷酸铝)和5-60μg、10-50μg或20-30μg (例如5-15μg、40-50μg、10μg、20μg、30μg、40或50μg)脂质A衍生 物(例如3D-MPL)。
这一佐剂特别适于老年人或婴幼儿用疫苗制剂。在一个实施方案 中，包含这一佐剂的疫苗组合物含有得自至少所有以下血清型的糖缀 合物：4、6B、9V、14、18C、19F、23F、1、5、7F(还可包含一种或 多种以下血清型的糖缀合物：3、6A、19A和22F)，其中在已接种疫 苗的人中，针对一种或多种(或所有)以下疫苗成分4、6B、9V、14、 18C、19F和23F而诱导的GMC抗体效价并不显著次于由疫苗所诱导的GMC抗体效价。
含有本发明免疫原性组合物的疫苗制品可通过系统途径或黏膜 途径给予所述疫苗，用来保护或治疗易受感染的哺乳动物。这些给药 法可包括通过肌内、腹膜内、真皮内或皮下途径注射，或通过黏膜给 予口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。鼻内给予疫苗以治疗肺炎或中 耳炎是优选的(因为可更有效地防止鼻咽携带的肺炎球菌，因此在初期 阶段削弱感染)。尽管本发明的疫苗可按单剂量给予，其成分还可以在 同一时间或在不同时间共给予(例如可以在给予疫苗的任何细菌蛋白 成分的同一时间或1-2周后，单独给予肺炎球菌糖缀合物，以便优化 协调彼此间的免疫应答)。对于共给予，任选Th1佐剂可存在于任何或 所有不同的给药成分中。除了单一给药途径外，还可采用两种不同的 给药途径。例如，可以经肌内(或真皮内)给予糖或糖缀合物，可以IN (或真皮内)给予细菌蛋白。另外，本发明的疫苗对于初次剂量可经肌 内给予，加强剂量则可以IN给予。
疫苗中蛋白抗原含量的范围通常为1-100μg，优选5-50μg，最常 见的范围为5-25μg。在最初接种疫苗后，接受者经适当时间间隔后可 接受一次或数次加强免疫。
疫苗制剂通常可参见《疫苗设计(Vaccine Design)》(″The subunit and adjuvant approach(亚单位与佐剂办法)″(编辑Powell M.F.和 Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)。脂质体内的包封可参见 Fullerton，美国专利4,235,877。
可将本发明的疫苗保存在溶液中或者冻干。优选将溶液在糖(例 如蔗糖或乳糖)存在下冻干。另还优选将其冻干，在临用前复原。冻干 处理可使组合物(疫苗)更加稳定，并且在3D-MPL存在且铝型佐剂不 存在时可能使抗体效价更高。
本发明一方面提供疫苗盒，该疫苗盒包括装有本发明免疫原性组 合物(任选为冻干形式)的小瓶，还包括装有本文所述佐剂的小瓶。预 期在本发明这一方面，佐剂将用来使冻干的免疫原性组合物复原。
尽管本发明的疫苗可以任何途径给予，但是将所述疫苗给予皮肤 (真皮内)构成本发明的一个实施方案。人的皮肤包括外层的“角状” 外皮，称为角质层，它覆盖着表皮。该表皮的下层被称为真皮，它进 而覆盖着皮下组织。研究人员指出，将疫苗注射进皮肤(特别是真皮 内)，刺激免疫应答，这还可能与多个额外的优势有关。用本文所述疫 苗进行真皮内接种构成了本发明的优选特征。
真皮内注射的常用技术“芒图法(Mantoux procedure)”包括以下 步骤：清洁皮肤，然后用一只手绷紧皮肤，使小号注射针(26-31号) 的斜面朝上，按10-15°的角度插入。一旦针头的斜面插入，则将针管 放低并进一步前推，同时施加轻微的压力使之在皮肤下抬高。然后将 液体非常缓慢地注入，从而在皮肤表面形成小疱或肿块，之后慢慢抽 出针头。
最近，文献记载了专门设计用于将液体制剂注射进入皮肤或穿透 皮肤的装置，例如记载于WO 99/34850和EP 1092444中的装置，又 例如记载于以下文献中的喷射注射装置：WO 01/13977、US 5,480,381、 US 5,599,302、US 5,334,144、US 5,993,412、US 5,649,912、US 5,569,189、US 5,704,911、US 5,383,851、US 5,893,397、US 5,466,220、 US 5,339,163、US 5,312,335、US 5,503,627、US 5,064,413、US 5,520,639、US 4,596,556、US 4,790,824、US 4,941,880、US 4,940,460、 WO 97/37705和WO 97/13537。真皮内给予疫苗制剂的替代方法可包 括常用的注射器和针头，或者设计用于射弹递送固体疫苗的装置(WO 99/27961)，或者透皮贴剂(WO 97/48440、WO 98/28037)，或者涂抹在 皮肤表面(透皮或经皮递药，WO 98/20734、WO 98/28037)。
当将本发明的疫苗给予皮肤，或者更特别是给予真皮内时，疫苗 为小体积液体，体积尤其介于约0.05ml和0.2ml之间。
本发明的皮肤或真皮内用疫苗中抗原的含量可与肌内疫苗中存 在的常用剂量类似(见上)。然而，皮肤或真皮内疫苗的特点是制剂可 为“低剂量”。因此，“低剂量”疫苗中的蛋白抗原存在的量优选每 剂只不过0.1-10μg，优选0.1-5μg；糖(优选缀合的)抗原存在的范围为 0.01-1μg糖/剂、优选介于0.01-0.5μg糖/剂。
本文所用术语“真皮内递药”是指疫苗递送至皮肤的真皮区。然 而，疫苗未必只位于真皮内。真皮是位于距人皮肤表面大约1.0mm和 约2.0mm之间的皮肤层，但是人与人之间以及在不同身体部位都有一 定的变化。一般而言，预计进入皮肤表面以下1.5mm便可达到真皮。 真皮位于表面的角质层和表皮与下面的皮下层之间。根据递药方式， 疫苗最终可只位于或者主要位于真皮内，或者可最终分布在表皮和真 皮内。
本发明另以游离或缀合的形式加入流感嗜血菌蛋白(例如D蛋 白)，以提供用于预防或改善由流感嗜血菌引起的中耳炎的改进的疫 苗。另外，本发明另通过向本发明的肺炎链球菌缀合物组合物中加入 一种或两种以游离或缀合蛋白存在的肺炎球菌蛋白，从而提供用于预 防或改善婴幼儿肺炎球菌感染(例如中耳炎)的改进的疫苗。所述肺炎 球菌游离蛋白质可与用作载体蛋白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不 同。联合疫苗中还可包括一种或多种游离或缀合形式的粘膜炎莫拉氏 菌蛋白抗原。因此，本发明提供一种诱导针对婴幼儿中耳炎的(保护性) 免疫应答的改进方法。
在另一个实施方案中，本发明通过给予安全和有效量的本发明疫 苗[儿童疫苗]，从而提供一种在婴幼儿(本发明范围限定为0-2岁)体内 诱导(保护性)免疫应答的改进方法。本发明又一个实施方案包括提供 用于医疗的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合物组合物，以及本发明的 肺炎链球菌缀合物在制备用于预防(或治疗)肺炎球菌疾病的药物中的 用途。
在又一个实施方案中，本发明通过给予安全和有效量的本发明疫 苗，优选与一种或两种以游离或缀合的蛋白质存在的肺炎链球菌蛋白 联用，从而提供一种在老年人群(在本发明范围内，如果患者50岁以 上、通常55岁以上，更常见60岁以上就被认为是老年)体内诱导(保 护性)免疫应答的改进方法，其中游离肺炎链球菌蛋白可与用作载体蛋 白的任何肺炎链球菌蛋白相同或不同。
本发明又一方面提供针对由肺炎链球菌和任选流感嗜血菌感染 引起的疾病为人宿主提供免疫的方法，该方法包括给予宿主免疫保护 剂量的本发明的免疫原性组合物或疫苗或疫苗盒。
本发明又一方面提供用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选流感 嗜血菌感染引起的疾病的本发明免疫原性组合物。
本发明又一方面提供本发明的免疫原性组合物或疫苗或疫苗盒 在制备用于治疗或预防由肺炎链球菌和任选流感嗜血菌感染引起的 疾病的药物中的用途。
在本文中，本发明的发明人认为术语“包含”、“含有”和“包 括”在所有情况下都可任选地与术语“由......组成”互换使用。
本文涉及本发明“疫苗组合物”的实施方案也适用于涉及本发明 “免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。
本发明说明书中所引用的所有参考文献或专利申请都通过引用 结合到本文。
为了可以更好地理解本发明，故给出下面的实施例。这些实施例 仅用于说明目的，不得理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：D蛋白的表达
流感嗜血菌的D蛋白
D蛋白表达的遗传构建
原料
编码D蛋白的DNA
流感嗜血菌所有血清型和未分型菌株的D蛋白均高度保守。含有 编码完整D蛋白基因的DNA序列的载体pHIC348得自A.Forsgren 博士，Department of Medical Microbiology，University of Lund，General Hospital，Sweden。D蛋白的DNA序列参见Janson等 (1991)Infect.Immun.59：119-125。
表达载体pMG1
表达载体pMG1是pBR322的衍生物(Gross等，1985)，其中导入 了噬菌体λ衍生的调控元件，用于外源插入基因的转录和翻译 (Shatzman等，1983)。另外，氨苄青霉素抗性基因用卡那霉素抗性基 因替换。
大肠杆菌(E.coll)菌株AR58
用最早生长在SA500衍生物(galE::TN10，λKil-cI857 ΔH1)上的 P1噬菌体原种转导N99，产生大肠杆菌菌株AR58。N99和SA500均 为大肠杆菌K12菌株，得自美国国立卫生研究院(the National Institute of Health)Martin Rosenberg博士实验室。
表达载体pMG 1
为了产生D蛋白，将编码该蛋白质的DNA克隆到表达载体pMG 1上。该质粒利用来自λ噬菌体DNA的信号驱动所插入的外源基因的 转录和翻译。当提供N蛋白时，载体含有启动子PL、操纵子OL和 两个有用位点(NutL和NutR)以降低转录的极性作用(Gross等，1985)。 将含有PL启动子的载体导入大肠杆菌溶原性宿主中以稳定质粒 DNA。溶原性宿主菌株含有整合到基因组的复制缺陷型λ噬菌体DNA (Shatzman等，1983)。染色体λ噬菌体DNA指导c1阻抑蛋白的合成， 该阻抑蛋白与载体OL阻抑物结合，阻止RNA聚合酶与PL启动子结 合，从而阻止了插入基因的转录。表达菌株AR58的c1基因含有温度 敏感突变基因，因此，PL指导的转录可受温度变化的调节，即培养物 温度增加使阻抑物钝化，并开始合成外源蛋白质。这一表达系统可控 制外源蛋白质、尤其是可能对细胞有毒的蛋白质的合成(Shimataka和 Rosenberg，1981)。
大肠杆菌菌株AR58
用于产生D蛋白载体的AR58溶原性大肠杆菌菌株是标准NIH 大肠杆菌K12菌株N99的衍生物(F-su-galK2、lacZ-thr-)。它含有缺 陷型溶原性λ噬菌体(galE::TN10，λKil- cI857 ΔH1)。λKil-表型防止宿 主大分子合成被阻断。cI857突变赋予c1阻抑物温度敏感性损害。ΔH1 缺失除去了λ噬菌体右侧操纵子和宿主bio、uvr3和chlA基因座。用 之前生长在SA500衍生物(galE::TN10，λKil-cI857 ΔH1)上的P1噬菌 体原种转导N99，产生AR58菌株。通过邻近galE基因存在的编码四 环素抗性的TN 10转座子，用四环素筛选将缺陷型溶原体导入N99中。
载体pMGMDPPrD的构建
用含有流感病毒非结构S1蛋白编码基因的pMG 1载体(pMGNSI) 构建pMGMDPPrD。D蛋白基因用在5’端和3’端分别含有Ncol和Xbal 限制位点的PCR引物，由pHIC348载体(Janson等，1991 Infect.，Immun. 59：119-125)通过PCR进行扩增。然后将Ncol/Xbal片段导入pMGNSl 中的Ncol和Xbal之间，从而产生含有NS1蛋白N端81个氨基酸紧 接PD蛋白的融合蛋白。这一载体被称为pMGNS1PrD。
根据上述构建体，产生最终用于D蛋白表达的构建体。从 pMGNS1PrD上除去BamHI/BamHI片段。这种DNA水解可除去NS1 编码区，但头3个N端的残基除外。当再连接载体时，就产生了具有 下列N端氨基酸序列的融合蛋白的编码基因：
----MDP SSHSSNMANT----
NS1 D蛋白
D蛋白不含前导肽或脂质链与之正常连接的N端半胱氨酸。因此 蛋白质既不分泌到周质中也不被脂质化，而是以可溶形式保留在细胞 质中。
在37℃下，通过热激将最终构建体pMG-MDPPrD导入AR58宿 主菌株。在卡那霉素存在下筛选出含有质粒的细菌。用特定的核酸内 切酶消化被分离出的质粒DNA，来证实D蛋白编码DNA插入序列的 存在。重组大肠杆菌菌株称为ECD4。
D蛋白的表达是处于λPL启动子/OL操纵子的控制之下。宿主菌 株AR58在其基因组中含有温度敏感的c1基因，它通过与OL结合而 阻断λPL在低温下进行表达。一旦温度升高，c1便从OL上释放出来， D蛋白便可进行表达。
小规模制备
在发酵结束时，将细胞浓缩并冷冻。
按照下述方法从收获的细胞中提取和纯化D蛋白。将冷冻细胞培 养物沉淀融化并重新悬浮于细胞裂解溶液(柠檬酸缓冲液，pH 6.0)中至 最终OD650＝60。将悬液以P＝1000巴通过高压匀浆器两次。通过离 心使细胞培养物匀浆澄清，经过滤除去细胞碎片。在第一纯化步骤中， 将经过滤的裂解物加到阳离子交换层析柱(SP Sepharose Fast Flow)上。 PD通过离子相互作用与凝胶基质结合，通过逐步增加洗脱缓冲液的 离子强度而被洗脱出来。
在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(Q Sepharose Fast Flow)中。PD不与凝胶结合，可从流出物中收集。
在上两个柱层析步骤中，用OD监测流分收集。阴离子交换柱层 析法的流出物中含有经纯化的D蛋白，将该流出物进行超滤浓缩。
使含有D蛋白的超滤留存物最终通过0.2μm滤膜。
大规模制备
按照下述方法从收获的细胞中提取和纯化D蛋白。将收获的液体 培养基冷却，并以大约800巴的压力直接通过高压匀浆器两次。
在第一纯化步骤中，将细胞培养物匀浆液稀释，并加到阳离子交 换层析柱(SP Sepharose Big bead)上。PD通过离子相互作用与凝胶基 质结合，通过逐步增加洗脱缓冲液的离子强度而被洗脱出来，并进行 过滤。
在第二纯化步骤中，杂质被保留在阴离子交换基质(Q Sepharose Fast Flow)中。PD不与凝胶结合，可从流出物中收集。
在上两个柱层析步骤中，用OD监测流分收集。阴离子交换柱层 析法的流出物含有经纯化的D蛋白，将该流出物进行超滤浓缩并进行 渗滤。
使含有超滤留存物的D蛋白最终通过0.2μm滤膜。
实施例1b：PhtD的表达
PhtD蛋白是肺炎球菌组氨酸三联体(Pht)蛋白质家族的成员，其特 征是存在组氨酸三联体(HXXHXH基序)。PhtD是838个氨基酸分子， 携带5个组氨酸三联体(参见MedImmune WO 00/37105，氨基酸序列 为SEQ ID NO：4，DNA序列为SEQ ID NO：5)。PhtD在中间还含有富 含脯氨酸的区域(氨基酸位置为348-380)。PhtD具有一个20个氨基酸 的N端信号序列，该序列具有LXXC基序。
基因构建体
用本公司自有的携带pλ启动子的pTCMP14载体，将成熟 MedImmune PhtD蛋白的基因序列(自氨基酸21至氨基酸838)用重组 法转移到大肠杆菌中。大肠杆菌宿主菌株为AR58，它携带cI857热敏 阻抑物，允许启动子的热诱导。
进行聚合酶链式反应，从MedImmune质粒(得自肺炎链球菌菌株 Norway 4(血清型4)-SEQ ID NO：5，携带了phtD基因，参见WO 00/37105)扩增phtD基因。采用只对phtD基因特异性的引物来扩增 phtD基因的2个片段。引物携带NdeI和KpnI或者KpnI和XbaI限制 位点。这些引物不与来自载体的任何核苷酸杂交，但只与phtD特异 性基因序列杂交。用携带NdeI限制位点的第一引物插入人工ATG起 始密码子。然后将所产生的PCR产物插入pGEM-T克隆载体(Promega) 中，确认所述DNA序列的存在。然后采用标准技术在TCMP 14表达 载体中进行该片段的亚克隆，并将载体转化至AR58大肠杆菌中。
PhtD纯化
如下进行PhtD的纯化：
□大肠杆菌细胞在卡那霉素存在下的生长：在30℃下生长30小 时，然后在39.5℃下诱导18小时。
□在EDTA 5mM和作为蛋白酶抑制剂的PMSF 2mM存在下，大 肠杆菌细胞从完整培养物中破裂(OD±115)：Rannie，2次传代，1000 巴。
□在室温(20℃)下用膨胀床方式层流Q XL层析法俘获抗原并除 去细胞碎片：柱子用NaCl 150mM+Empigen 0.25％(pH 6.5)洗涤，用 NaCl 400mM+Empigen 0.25％的25mM磷酸钾缓冲液(pH 7.4)洗脱。
□用Sartobran 150柱体(0.45μm+0.2μm)过滤。
□抗原在5mM咪唑存在下于4℃结合到Zn++螯合的琼脂糖凝胶 FF IMAC层析柱(pH 7.4)上：柱子用咪唑5mM和Empigen 1％洗涤， 用50mM咪唑洗脱，咪唑和Empigen均溶于25mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)。
□4℃下以阳离子模式(positive mode)用Fractogel EMD DEAE(pH 8.0，25mM磷酸钾)进行弱阴离子交换层析法：柱子用140mM NaCl 洗涤，用200mM NaCl洗脱，而污染物(蛋白质和DNA)保持吸附在交 换柱上。
□在50kDa滤膜上用2mM磷酸钠/磷酸钾(pH 7.15)浓缩及超滤。
□经纯化的产物用Millipak-200.2μm过滤器柱体进行过滤除菌。
实施例1c：肺炎链球菌溶血素的表达
肺炎链球菌溶血素按照WO 2004/081515和WO 2006/032499所 述方法制备和脱毒。
实施例2：
缀合物的制备
如何制备纯的肺炎球菌多糖是本领域众所周知的。对于这些实施 例的目的，多糖主要按照EP072513所述方法或用密切相关的方法制 备。多糖的大小在缀合之前可用下述微流化法减小。
活化与偶联条件对每种多糖都是独特的。这些条件见表1。将经 减小的多糖(PS5、6B和23F除外)溶于NaCl 2M、NaCl 0.2M或注射 用水(WFI)中。对所有血清型的最佳多糖浓度进行评价。除血清型18C 以外的所有血清型都直接与下述载体蛋白缀合。制备了两种替代血清 型22F缀合物：一种是直接缀合的，另一种通过ADH连接基缀合。
从100mg/ml母液的乙腈或乙腈/水50％/50％溶液中，将CDAP (CDAP/PS比率为0.5-1.5mg/mg PS)加到多糖溶液中。1.5分钟后，加 入0.2M-0.3M NaOH，得到特定的活化pH。在3分钟内，在该pH下 于25℃下使多糖进行活化。将纯的蛋白质(D蛋白、PhtD、肺炎链球 菌溶血素或DT)(用量取决于最初的PS/载体蛋白比率)加到活化的多 糖中，在pH调节下，偶联反应在特定pH下进行长达2小时(取决于 血清型)。为了猝灭未反应的氰酸酯基团，将2M甘氨酸溶液加到混合 物中。调节pH至猝灭pH(pH 9.0)。将该溶液在25℃下搅拌30分钟， 然后在2-8℃下连续缓慢地搅拌过夜。
18C的制备：
将18C通过连接基-己二酸二酰肼(ADH)与载体蛋白连接。缀 合前将多糖血清型18C微流化。
用EDAC使破伤风类毒素衍生化
对于破伤风类毒素的衍生化，将纯的TT稀释成25mg/ml的0.2M NaCl溶液，加入ADH间隔基以达到终浓度为0.2M。当间隔基完全溶 解时，调节pH至6.2。然后加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基) 碳二亚胺)以达到终浓度为0.02M，在pH调节下，搅拌混合物1小时。 在25℃下，通过增加pH至9.0至少30分钟以终止缩合反应。然后为 了除去残余ADH和EDAC试剂，衍生化TT进行渗滤(10kDa CO滤 膜)。
在偶联步骤前使TTAH产物进行最后的过滤除菌，再于-70℃保存。
TTAH与PS 18C的化学偶联
缀合参数详情可参见表1。
将2克微流化PS用水稀释至规定浓度，加入NaCl粉调节至2M NaCl。
加入CDAP溶液(100mg/ml，用乙腈/注射用水50/50(体积/体积)， 新鲜制备)以达到适合的CDAP/PS比率。
加入0.3M NaOH，使pH升至活化pH 9.0，并稳定在该pH下直 到加入TTAH。
3分钟后，加入衍生化TTAH(20mg/ml的0.2M NaCl溶液)，以达 到TTAH/PS比率为2；调节pH至偶联pH 90。在pH调节下将溶液放 置1小时。
对于猝灭，将2M甘氨酸溶液加到混合物PS/TTAH/CDAP中。
调节pH至猝灭pH(pH 90)。
将该溶液在25℃下搅拌30分钟后，然后在2-8℃下连续缓慢地 搅拌过夜。
PS22F AH -PhtD缀合物
对于该糖的第二种缀合方法(第一种为直接PS22-PhtD缀合方法 见表1)，通过连接基-己二酸二酰肼(ADH)使22F与载体蛋白连接。 缀合前使多糖血清型22F微流化。
PS 22F衍生化
在温控水浴中于25℃连续搅拌以进行活化和偶联。
将微流化PS22F稀释，得到PS终浓度为6mg/ml的0.2M NaCl 溶液，溶液用0.1N HCl调节pH至6.05±0.2。
加入CDAP溶液(100mg/ml，用乙腈/WFI 50/50，新鲜制备)，以 达到合适的CDAP/PS比率(1.5/1(重量/重量))。
加入0.5M NaOH使pH升至活化pH 9.00±0.05，并稳定在该pH 下直到加入ADH。
3分钟后，加入ADH以达到合适的ADH/PS比率(8.9/1(重量/重 量))，调节pH至偶联pH 9.0，将溶液在pH调节下放置1小时。
使PSAH衍生物浓缩并渗滤。
偶联
将PhtD(10mg/ml的0.2M NaCl溶液)加到PS22FAH衍生物中，以 达到PhtD/PS22FAH比率为4/1(重量/重量)。用HCl调节pH至5.0± 0.05。在10分钟内手动加入EDAC溶液(20mg/ml的0.1M Tris-HCl， pH 7.5)(250μl/分钟)以达到1mg EDAC/mg PS22FAH。在搅拌和pH调 节下，将所得溶液在25℃下保温150分钟(尽管也能采用60分钟)。加 入1M Tris-HCl pH 7.5(最终体积的1/10)使溶液中和后，在25℃下放 置30分钟。
在Sephacryl S400HR上洗脱前，用5μm Minisart过滤器使缀合物 澄清。
所得缀合物最终的PhtD/PS比率为4∶1(重量/重量)，游离PS含量 低于1％，抗原性(α-PS/α-PS)为36.3％，抗PhtD抗原性为7.4％。
缀合物的纯化
采用用0.15M NaCl平衡的Sephacryl S400HR凝胶过滤柱(对于 18C为S500HR)通过凝胶过滤对缀合物进行纯化，以除去小分子(包括 DMAP)和未缀合的PS和蛋白质。根据反应成分的分子大小不同，先 洗脱出PS-PD、PS-TT、PS-PhtD、PS-肺炎链球菌溶血素或PS-DT缀 合物，接着是游离PS，然后是游离PD或游离DT，最后是DMAP和 其它盐(NaCl、甘氨酸)。
用UV280nm检测含有缀合物的流分。按照它们的Kd合并流分， 过滤除菌(0.22μm)，并保存于+2-8℃。测定了缀合制品中的PS/蛋白质 比率。
肺炎链球菌PS-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/偶联/猝 灭条件
当“μfluid”出现在第一行表头时，是指糖的大小在缀合之前通 过微流化减小了。微流化后糖的大小见表2。
表1.肺炎链球菌PS-蛋白D/TT/DT/PhtD/Ply缀合物的特异性活化/ 偶联/猝灭条件
血清型 1 μfluid 4 μfluid 5 6A 6B 7F μfluid PS 浓度(mg/ml) 2.5 2.5 7.1 5.0 5.0 5.0 PS溶解于 WFI WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M PD 浓度(mg/ml) 10.0 10.0 5.0 5.0 5.0 10.0 PD/PS 最初比率 (重量/重量) 1.5/1 1.5/1 1/1 1/1 1.1/1 1.2/1 CDAP 浓度 (mg/mg PS) 0.50 0.50 0.79 0.83 0.83 0.75 pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0
血清型 9V μfluid 14 μfluid 18C μfluid 19A μfluid 19F μfluid 22F μfluid 23F PS 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 4.5 15.0 9.0 6.0 2.38 PS溶解于 NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 0.2M NaCl 2M 载体蛋白 浓度(mg/ml) 10.0 10.0 20.0 (TT) 10.0 (Ply) 20.0 (DT) 10.0 (PhtD) 5.0 载体蛋白/PS 最初比率 (重量/重量) 1.2/1 1.2/1 2/1 2.5/1 1.5/1 3/1 1/1 CDAP 浓度 (mg/mg PS) 0.50 0.75 0.75 1.5 1.5 1.5 0.79 pHa＝pHc＝pHq 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0
注意：pHa、pHc、pHq分别对应于活化pH、偶联pH和猝灭pH。
表征：
对每种缀合物进行表征，且每种都符合表2所示规格。多糖含量 (μg/ml)用间苯二酚试验测定，蛋白质含量(μg/ml)用劳里试验(Lowry test)测定。PS/PD最终比率(重量/重量)用浓度比率确定。
游离多糖含量(％)
将保存于4℃的缀合物或者在37℃下保存7天的缀合物与α-载体 蛋白抗体一起保温，用硫酸铵饱和后离心得到上清液，测定上清液中 缀合物的游离多糖含量。
α-PS/α-PS ELISA用来定量测定上清液中的游离多糖。不存在缀 合物时还可作为α-载体蛋白/α-PS ELISA的对照。
抗原性：
用夹心型ELISA对相同缀合物的抗原性进行分析，其中俘获和 检测的抗体分别为α-PS和α-蛋白质。
游离蛋白含量(％)
在纯化步骤中，可以将未缀合的载体蛋白与缀合物分离开来。采 用大小排阻层析法(TSK 5000-PWXL)后经UV检测(214nm)来测定游 离的残留蛋白质含量。洗脱条件使得游离载体蛋白与缀合物分开。然 后与标准曲线(0-50μg/ml载体蛋白)进行比较确定缀合产物中游离蛋 白质的含量。游离载体蛋白(％)如下计算：％游离载体＝(游离载体 (μg/ml)/(用劳里试验测定相应载体蛋白的总浓度(μg/ml)×100％)。
稳定性：
对于4℃下保存的缀合物和37℃下保存7天的缀合物，用 HPLC-SEC凝胶过滤(TSK 5000-PWXL)测定分子量分布(Kav)及稳定 性。
10价/11价/13价/14价缀合物的表征见表2(参见表下注释)。
蛋白质缀合物可被吸附到磷酸铝上，合并，得到最终的疫苗。
结论：
产生出免疫原性缀合物，这些缀合物是有前景的疫苗成分。
表2-缀合物的表征
缀合物 PS大小 (Dax103) 载体/PS 比率 游离PS (Elisa) 游离载体 PS抗原性 (Elisa) 缀合物大 小(kDa) PS1-PD 349-382* 1.5-1.6 1.0％-1.2％ 3.9％-4.8％ 87％-95％ 1499-1715 PS4-PD 93-100* 1.5-1.6 4.7-6.5％ 3.2％-4.0％ 90％-96％ 1303-1606 PS5-PD＊＊＊ 367-443 0.80 8.7-11.2％ 2.2％-3.8％ 93％-108％ 1998-2352 PS6A-PD 1100-1540 0.61 4.5％ 未测 45.9％ 未测 PS6B-PD＊＊＊ 1069-1391 0.7-0.8 1.3-1.6％ ＜2.0％ 68％-75％ 4778-5235 PS7F-PD 255-264* 1.1-1.2 ＜1％ ＜1.4％ 58％ 3907-4452 PS9V-PD 258-280* 1.3-1.5 ＜1％ ＜1.3％ 67％-69％ 9073-9572 PS14-PD 232-241* 1.4 ＜1％ ＜1.5％ 70％ 3430-3779 PS18C-TT 89-97* 2.2-2.4 1.5-2.2％ ＜4％ 46％-56％ 5464-6133 PS19A-Ply＊ 151 3.2 ＜1％ 29％ PS19F-DT 133-143* 1.4-1.5 4.1％-5.9％ ＜1.2％- ＜1.3％ 82％-88％ 2059-2335 PS22F-PhtD＊ 159-167 2.17 5.8 未测 37％ 未测
PS22F-AHPht D＊ 159-167 3.66- 4.34 ＜1％ 未测 28-31％ 未测 PS23F-PD＊＊＊ 914-980 0.5 1.4-1.9％ 3.7％-4.9％ 137％-154％ 2933-3152
*天然PS微流化法后的PS大小
通过将血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F缀 合物(例如剂量分别为1μg、3μg、1μg、1μg、1μg、1μg、1μg、3μg、3μg、 1μg的糖/人用剂量)混合来制备10价疫苗。通过另外加入表5中的血 清型3缀合物来制备11价疫苗(例如1μg糖/人用剂量)。通过另外加 入上述血清型19A和22F缀合物(22F直接与PhtD连接或者通过ADH 连接基连接)[例如剂量为每种糖3μg/人用剂量]来制备13价疫苗。通 过另外加入上述血清型6A缀合物(例如剂量为1μg糖/人用剂量)来制 备14价疫苗。
实施例3：在本发明免疫原性组合物中加入流感嗜血菌D蛋白可提供 针对急性中耳炎(AOM)的改进保护作用的证据。
研究设计
本研究使用了11Pn-PD疫苗-包含分别与得自流感嗜血菌D蛋 白缀合的血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F(见 实施例4中的表5)。受试者被随机分成两组，在大约3、4、5和12-15 月龄时注射11Pn-PD疫苗或Havrix共4剂。所有受试者在3、4和5 月龄时还同时接受GSK Biologicals公司的Infanrix-hexa (DTPa-HBV-IPV/Hib)疫苗。Infanrix-hexa是Pediarix和Hib的组合， 在用前混合。在给予第3次疫苗剂量后两周，开始进行“根据方案 (According-to-Protocol)”分析的功效随访，持续直到24-27月龄。选 择部分受试者，评价鼻咽携带的肺炎链球菌和流感嗜血菌。
如果这些儿童中有人生病，出现耳痛、鼓膜自发性穿孔、自发性 耳溢液时，建议家长咨询调查人员。如果调查人员怀疑是AOM发作， 则将儿童立即转送耳鼻喉(ENT)专科医师确诊。
AOM临床诊断根据的是鼓膜的视觉外观(即红、肿、光反射的丧 失)或者存在中耳积液(用单纯耳镜或气动耳镜或用显微镜证实)。另 外，还存在至少以下2种症状或征兆：耳痛、耳溢液、听觉损失、发 热、嗜眠、易怒、厌食、呕吐或腹泻。如果ENT专科医师对临床诊断 作出确诊，则通过鼓膜穿刺术采集中耳积液样本以备细菌检测。
对于重复看病的受试者，如果自前一次发作开始已经超过了30 天，则被认为是新的AOM发作。另外，不论两次连续发作之间的间 隔多久，如果所分离的细菌/血清型不同于前一次的分离物，则AOM 发作被视为新的细菌性发作。
临床实验结果
共招募了4968名婴幼儿，11Pn-PD组2489名，对照组2479名。 两组之间在人口学特征或风险因素上没有明显差异。
临床发作和AOM病例定义
在每个方案随访期间，在11Pn-PD组中记录到共333起临床AOM 发作，对照组499起。
表3表示11Pn-PD疫苗和之前在芬兰进行试验的两种7价疫苗 (Eskola等，N Engl J Med 2001；344：403-409和Kilpi等，Clin Infect Dis 200337：1155-64)针对任何AOM发作及由不同肺炎球菌血清型、流感 嗜血菌NTHi和粘膜炎莫拉氏菌引起的AOM的保护性功效。不考虑 病因，用11Pn-PD使AOM疾病总负担在统计学显著性和临床相关性 方面降低33.6％(表3)。针对由11Pn-PD疫苗含有的11种肺炎球菌血 清型的任一种所致AOM发作的总功效为57.6％(表3)。
最新研究的另一个重要发现是，由11Pn-PD疫苗提供的针对流感 嗜血菌所引起的AOM的保护为35.6％(准确地讲由NTHi提供35.3％ 的保护)。在肺炎球菌缀合物疫苗时代，已知流感嗜血菌作为AOM主 要病因的重要性增加，因此这一发现有着重大的临床意义。与针对 AOM所提供的保护一致，在2岁时给予加强剂量后，11Pn-PD疫苗 还降低鼻咽携带的流感嗜血菌。这些发现与之前在芬兰所作的观察不 同，其中对于两种7价肺炎球菌缀合物疫苗，观察到由流感嗜血菌所 致的AOM发作增加(Eskola等和Kilpi等)，以病原报告为证。
未能建立起对由Hi所致AOM发作的保护与针对载体蛋白D的 抗体水平之间的明确的相关性，因为11Pn-PD疫苗接种者(保持未发 作Hi AOM)体内初次接种后的抗PD IgG抗体浓度，与在功效随访期 间发生至少一次Hi AOM发作的11Pn-PD疫苗接种者体内可测得的初 次接种后的抗PD IgG抗体浓度基本相同。然而，虽然未能建立疫苗 的生物学影响与初次接种后IgG抗PD免疫原性之间的相关性，但是 有理由认为在流感嗜血菌菌株中高度保守的PD载体蛋白，在相当大 的程度上有助于诱导针对Hi的保护作用。
伴随对AOM疾病的作用的是对鼻咽携带的作用，这对于疫苗血 清型肺炎球菌和流感嗜血菌而言具有类似的程度(图1)。在PD-缀合物 疫苗接种者中，流感嗜血菌鼻咽携带的这种减少支持PD-缀合物疫苗 对流感嗜血菌的直接保护作用的假设，即使在用ELISA测定时，保护 性功效可能与抗PD IgG免疫应答并不相关。
在下列实验中，栗鼠(chinchilla)中耳炎模型使用得自用本实施例 的11价制剂或用实施例2的10价疫苗(也可参见表1和表2以及表下 注释)免疫的婴幼儿血清库。与免疫前血清库相比，这两种血清库都引 起患中耳炎动物的比率显著降低。10价和11价免疫血清库之间没有 显著差异。这就表明这两种疫苗都具有类似的诱导针对该模型的由未 分型流感嗜血菌引起的中耳炎的保护潜力。
实施例4：
针对血清型19F选择载体蛋白
采用的ELISA测定
22F抑制ELISA法主要根据的是2001年Concepcion和Frasch提 出的实验以及Henckaerts等人的报告(Henckaerts等，2006，Clinical and Vaccine Immunology 13-356-360)。简单地讲，将纯的肺炎球菌多糖与 甲基化人血清白蛋白相混合，并使之吸附到Nunc MaxisorpTM(Roskilde，DK)高结合微量滴定板中于4℃过夜。各板用10％胎牛血 清(FBS)的PBS溶液在室温下搅拌1小时使之封闭。血清样品用PBS 稀释，PBS含有10％FBS、10μg/ml细胞壁多糖(SSI)和2μg/ml血清型 22F(ATCC)的肺炎球菌多糖，血清样品在微量滴定板中用同一缓冲液 进一步稀释。针对标准血清89-SF标定的内部参比，用不同浓度的血 清型特异性IgG/89-SF按相同方式进行处理，并使每块板都包含内部 参比。洗涤后，用稀释于10％FBS(PBS的溶液)的过氧化物酶缀合的 抗人IgG单克隆抗体(Stratech Scientific有限公司，Soham，UK)检测 结合抗体，在室温搅拌下温育1小时。采用现成的单一成分四甲基联 苯胺过氧化物酶免疫测定底物试剂盒(BioRad，Hercules，CA，US)， 在室温下避光使之显色。用H2SO4 0.18M终止反应，于450nm读取光 密度。参照内部参比血清曲线规定范围内的光密度点，计算样品的血 清型特异性IgG浓度(单位μg/ml)，用SoftMax ProTM(Molecular Devices， Sunnyvale，CA)软件计算得出的4参数逻辑斯谛对数方程使所述曲线 模块化。鉴于检出限和定量限，对于所有血清型ELISA的截止值 (cut-off)为0.05μg/ml IgG。
调理吞噬实验
在2003年6月的WHO评议会议上，Romero-Steiner等人提出的 OPA测定受到推荐(Romero-Steiner等，Clin Diagn Lab Immunol 2003 10(6)，第1019-1024页)。在下列试验中使用该方案测定了各血清型 的OPA活性。
缀合物的制备
在研究11Pn-PD和Di-001及11Pn-PD和Di-007时，包括了3种 11价疫苗制剂(表4)，其中3μg的19F多糖与白喉类毒素缀合(19F-DT) 而不是1μg多糖与D蛋白缀合(19F-PD)。11Pn-PD、11Pn-PD和Di-001 及11Pn-PD和Di-007研究的缀合参数分别见表5、表6和表7。
初次接种这些19F-DT制剂后一个月，针对血清型19F的抗肺炎 球菌抗体应答和OPA活性分别见表8和表9。
表10表示22F-ELISA抗体浓度和23价单纯多糖加强免疫之前和 之后受试者达到0.2μg/ml阈值的百分比。
对于这些19F-DT制剂诱导的抗体，调理吞噬活性得到明显改进， 较高的血清阳性率(调理吞噬效价≥1∶8)和初次接种疫苗后一个月的 OPA GMT证实了这一点(表9)。对于先使用19F-DT制剂的儿童，23 价单纯多糖加强免疫后一个月，19F抗体的调理吞噬活性保持得更好 (表11)。
表12表示先使用19F-DT或19F-PD缀合物给初学步婴儿接种 11Pn-PD加强剂量后与第4次连续使用剂量相比的免疫原性 数据。据报导美国引进后取得了一定的突破，因此当与DT 载体蛋白缀合时针对血清型19F的调理吞噬活性得到改进，这可能有 利于备选疫苗。
表13提供了对于交叉反应血清型19A的19F-DT缀合物的ELISA 和OPA数据。我们发现19F-DT诱导针对19A的OPA活性较低但却 十分明显。
表4.临床研究中采用的肺炎球菌缀合物疫苗制剂
表5.肺炎链球菌PS-蛋白D/TT/DT缀合物的特异性活化/偶联/猝灭条 件
血清型 1 天然 3 μfluid 4 天然 5 天然 6B 天然 7F 天然 PS 浓度(mg/ml) 1.5 2 2.0 7.5 5.5 3.0 PS溶解于 NaCl 150mM NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M PD 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 PD/PS 最初比率 (重量/重量) 1/0.7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 8.8/8.8/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 偶联时间 60min 60min 45min 40min 60min 60min
血清型 9V 天然 14 天然 18C 天然 19F 天然 23F 天然 PS 浓度(mg/ml) 1.75 2.5 1.75 4.0 2.5 PS溶解于 NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M PD 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 PD/PS 最初比率 (重量/重量) 1/0.75 1/0.75 1/1.2 1/1 1/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 pHa＝pHc＝pHq 8.5/8.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0 偶联时间 60min 60min 45min 30min 60min
表6.11Pn-PD和Di-001研究中肺炎链球菌PS-蛋白D/DT缀合物的特 异性活化/偶联/猝灭条件
血清型 1 μfluid 3 μfluid 4 μfluid 5 μfluid 6B μfluid 7F 天然 PS 浓度(mg/ml) 4 2.0 2.5 7.5 10 3.0 PS溶解于 NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M PD 浓度(mg/ml) 10.0 5.0 5.0 5.0 NaCl 2M 20(DT) NaCl 2M 5.0 PD/PS 最初比率 (重量/重量) 1.2/1 1/1 1/1 1/1 1.5/1 1/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 1.50 0.75 1.5 2 1.5 0.75 pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9/9/9 偶联时间 60min 60min 60min 60min 60min 60min
血清型 9V 天然 14 天然 18C μfluid 19F μfluid 23F μfluid PS 浓度(mg/ml) 1.75 2.5 5.0 9.0 10 PS溶解于 NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M 载体蛋白 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 20(DT) 10(DT) 载体蛋白/PS 最初比率 (重量/重量) 0.75/1 0.75/1 1.2/1 1.5/1 1.5/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 0.75 0.75 1.5 1.5 0.75 pHa＝pHc＝pHq 8.5/8.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 偶联时间 60min 60min 30min 60min 60min
表7.11Pn-PD和Di-007研究中肺炎链球菌PS-蛋白D/DT缀合物的特 异性活化/偶联/猝灭条件
血清型 1 天然 3 μfluid 4 天然 5 天然 6B 天然 7F μfluid PS 浓度(mg/ml) 1.5 2.0 2 7.5 5.5 5.0 PS溶解于 NaCl 150mM NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M PD 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5 10 PD/PS (重量/重量) 0.7/1 1/1 1 1/1 1/1 1.2/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 pHa＝pHc＝pHa 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 8.8/8.8/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 9.5./9.5/9 偶联时间 60min 60min 45min 40min 60min 60min
血清型 9V μfluid 14 μfluid 18C 天然 19F μfluid 19F μfluid 23F μfluid PS 浓度(mg/ml) 5.0 5.0 1.75 9.0 10.0 9.5 PS溶解于 NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl2M 载体蛋白 浓度(mg/ml) 10 10.0 5.0 20(DT) 5.0(PD) 10 载体蛋白/PS 最初比率(重量/ 重量) 1.2/1 1.2/1 1.2/1 1.5/1 1.2/1 1/1 CDAP浓度 (mg/mg PS) 0.5 0.75 0.75 1.5 0.75 0.75 pHa＝pHc＝pHq 9.5/9.5/9.0 9.5/9.5/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.0/9.0/9.0 9.5/9.5/9.0 偶联时间 60min 60min 45min 120min 120min 60min
表8.在初次接种1μg 19F-PD、3μg19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 疫苗一个月后19F抗体浓度≥0.20μg/ml的受试者百分比以及19F抗 体几何平均抗体浓度(GMC：μg/ml，95％置信区间(CI))(总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
表9.初次接种1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 疫苗一个月后19F OPA效价≥1∶8的受试者百分比以及19F OPA GMT(总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
表10.先接种1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 的儿童在23价单纯多糖加强免疫前以及加强免疫后一个月19F抗体 浓度≥0.20μg/ml的受试者百分比以及19F抗体GMC(μg/ml)(总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
表11.先接种1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 的儿童在23价单纯多糖加强免疫前和加强免疫后一个月19F OPA效 价≥1∶8的受试者百分比以及19F OPA GMT(总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
表12.先接种1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 的儿童在11Pn-PD或Prevnar加强免疫后一个月针对19F肺炎球菌的 抗体浓度≥0.2μg/ml和OPA≥1∶8的受试者百分比以及GMC/GMT (总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
表13.初次接种1μg 19F-PD、3μg 19F-DT或Prevnar(2μg 19F-CRM) 后一个月针对19A肺炎球菌的抗体浓度≥0.2μg/ml、OPA≥1∶8的受 试者百分比以及GMC/GMT(总群组)
Γ：不同制剂的组成见表4，Prevnar：肺炎球菌7价结合疫苗。
实施例5：临床前模型中的佐剂实验：肺炎球菌11价多糖缀合物对老 年猕猴免疫原性的影响
为了使老年人群对缀合物肺炎球菌疫苗所诱导的应答最优化， GSK公司制备了含有新佐剂-C佐剂的11价多糖(PS)缀合物疫苗- 参见下文。
在第0天和第28天，用500μl吸附到315μg AlPO4的11价PS缀 合物或500μl与C佐剂混合的11价PS缀合物经肌内注射(IM)对各组 5只老年猕猴(14-28岁)进行免疫。
这两种疫苗制剂中，11价PS缀合物各自由以下缀合物组成： PS1-PD、PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、 PS18C-PD、PS19F-PD、PS23F-DT和PS6B-DT。所用疫苗剂量为表6 条件(实施例4)下缀合的疫苗人用剂量(剂量为5μg/糖/人，只是6B为 10μg除外)的1/5，只是19F按照以下CDAP方法的条件制备：经减小 的糖9mg/ml，PD 5mg/ml，PD/PS最初比率1.2/1，CDAP浓度0.75mg/mg PS，pHa＝pHc＝pHq 9.0/9.0/90，偶联时间60分钟。
在第42天，对所收集血清的抗PS ELISA IgG水平和调理吞噬效 价进行测量。对第42天收集的外周血细胞，通过Elispot测定抗PS3 记忆B细胞频率。
下面所示结果表明，在老年猴中，与11价PS缀合物加上AlPO4相比，C佐剂显著改进11价PS缀合物的免疫原性。新的佐剂提高了 对PS的IgG应答(图1)以及调理吞噬抗体效价(表14)。还为通过使用 C佐剂增加了PS3特异性记忆B细胞的频率提供了支持性证据(图2)。
表14.老年猕猴的缀合物免疫原性(两次免疫后的调理吞噬效价)
B细胞酶联免疫斑点测定
实验原理依据的事实是与CpG体外培育5天后，记忆B细胞成 熟成为浆细胞。可以容易地检测出体外产生的抗原特异性浆细胞，因 此可用B细胞酶联免疫斑点测定(elispot assay)对抗原特异性浆细胞进 行统计。特异性浆细胞的数目反映出记忆B细胞在开始培养时出现的 频率。
简单地讲，将体外产生的浆细胞放入用抗原包被的培养板中孵 育。抗原特异性浆细胞形成抗体/抗原斑点，这些斑点可用常规免疫酶 法进行检测并记录作为记忆B细胞的数目。在本项研究中，为了记录 相应的记忆B细胞，各种多糖被用来包被培养板。结果用百万记忆B 细胞内PS特异性记忆B细胞的频率表示。
研究显示，C佐剂可能减少已知的PS3强化力(boostability)的问 题(参见5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases(第五届肺炎球菌和肺炎球菌疾病国际研讨会))，2006年4月 2-6日，Alice Springs，Central Australia。
Specificities of immune responses against a serotype 3 pneumococcal conjugate(针对血清型3肺炎球菌缀合物免疫应答的特 异性).Schuerman L，Prymula R，Poolman J.文摘，第245页，PO10.06)。
实施例6.Balb/c幼小鼠中，脱毒肺炎链球菌溶血素(dPly)作为蛋白载 体提高PS 19F的免疫原性的功效
在第0天、第14天和第28天，用50μl 4价单纯PS或50μl 4价 dPly缀合的PS(两种都与C佐剂相混合)经肌内注射对各组40只雌性 Balb/c小鼠(4周龄)进行免疫。
两种疫苗制剂都由0.1μg(糖含量)以下各种PS组成：PS8、PS12F、 PS19F和PS22F。
在第42天，对所采集血清的抗PS ELISA IgG水平进行测定。
如图3中的实例所示，与用单纯PS免疫的小鼠相比，给予4价 dPly缀合物的小鼠中抗PS 19F应答得到极大的提高。对于抗PS8、12F 和22F IgG应答，也观察到相同的改进(数据未显示)。
实施例7.Balb/c幼小鼠中，肺炎球菌组氨酸三联体D蛋白(PhtD)作为 蛋白载体提高PS 22F的免疫原性的功效
在第0天、第14天和第28天，用50μl 4价单纯PS或50μl 4价 PhtD缀合的PS(两种都与C佐剂相混合)经肌内注射对各组40只雌性 Balb/c小鼠(4周龄)进行免疫。
两种疫苗制剂都由0.1μg(糖含量)以下各种PS组成：PS8、PS12F、 PS19F和PS22F。
在第42天，对所采集血清的抗PS ELISA IgG水平进行测定。
如图4中的实例所示，与用单纯PS免疫的小鼠相比，给予4价 PhtD缀合物的小鼠中抗PS22F应答得到极大的提高。对于抗PS8、12F 和19F IgG应答，也观察到相同的改进(数据未显示)。
实施例8.老年C57BI小鼠中含有19A-dPly和22F-PhtD的13价PS 缀合物的免疫原性
在第0天、第14天和第28天，用50μl 11价PS缀合物或50μl 13 价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各组 30只C57BI老年小鼠(＞69周龄)进行免疫。
11价疫苗制剂由0.1μg糖的以下各缀合物组成：PS1-PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、PS18C-TT、 PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下面对11价疫苗的注释)。 13价疫苗制剂另含有0.1μg PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表 1和表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。在第2组和 第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒，在第3组 和第5组中用甲醛进行。在第2组和第3组中，用PhtD与PS 22F缀 合，在第4组和第5组中，采用PhtD E融合物(得自WO 03/054007 的构建体VP147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D蛋 白缀合。
在第42天，对所采集的各个血清的抗PS19A和22F ELISA IgG 水平进行测量。
在合并血清中对其它PS产生的ELISA IgG应答进行测定。
13价缀合物疫苗制剂内所加入的19A-dPly和22F-PhtD在C57BI 老年小鼠中具有免疫原性(表15)。与用11价制剂免疫的小鼠相比，针 对其它PS所诱导的免疫应答对给予13价制剂的小鼠并没有负面影 响。
表15.C57BI老年小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)
实施例9.Balb/c幼小鼠中含有19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀 合物的免疫原性
在第0天、第14天和第28天，用50μl 11价PS缀合物或50μl 13 价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各组 30只Balb/c幼小鼠(4周龄)进行免疫。
11价疫苗制剂由0.1μg糖的以下各缀合物组成：PS1-PD、PS3-PD、 PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS 14-PD、PS 18C-TT、 PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1及表2下面对11价疫苗的注释)。 13价疫苗制剂另含有0.1μg PS19A-dPly和PS22F-PhtD缀合物(参见表 1及表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。在第2组和 第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒，在第3组 和第5组中，用甲醛进行。第2组和第3组中，用PhtD与PS 22F缀 合，在第4组和第5组中，采用PhtD E融合物(得自WO 03/054007 的构建体VP 147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合，22F与D 蛋白缀合。
在第42天，对所采集的各血清中的抗PS19A和22F ELISA IgG 水平进行测定。
在合并血清中对其它PS所产生的ELISA IgG应答进行测定。
Balb/c幼小鼠中，13价缀合物疫苗制剂内所加入的19A-dPly和 22F-PhtD具有免疫原性(表16)。与用11价制剂免疫的小鼠相比，针 对其它PS所诱导的免疫应答对给予13价制剂的小鼠没有负面影响。
表16.Balb/c幼小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)
实施例10.豚鼠中含有19A-dPly和22F-PhtD的13价PS缀合物的免 疫原性
在第0天、第14天和第28天，用125μl 11价PS缀合物或125μl 13价PS缀合物(两种都与C佐剂相混合)(参见下文)经肌内注射对各 组20只幼豚鼠(Hartley品系；5周龄)进行免疫。
11价疫苗制剂由0.25μg糖的以下各缀合物组成：PS1-PD、 PS3-PD、PS4-PD、PS5-PD、PS6B-PD、PS7F-PD、PS9V-PD、PS14-PD、 PS18C-TT、PS19F-DT和PS23F-PD(参见表1和表2下面对11价疫 苗的注释)。13价疫苗制剂另含有0.1μg PS 19A-dPly和PS22F-PhtD缀 合物(参见表1及表2下面对13价疫苗的注释[采用直接缀合的22F])。 在第2组和第4组中，肺炎链球菌溶血素载体用GMBS处理进行脱毒， 在第3组和第5组中用甲醛进行。在第2组和第3组中，用PhtD与 PS 22F缀合，在第4组和第5组中使用PhtD E融合物(得自WO 03/054007的构建体VP 147)。在第6组中，19A与白喉类毒素缀合， 22F与D蛋白缀合。
在第42天，对所采集的各血清中的抗PS19A和22F ELISA IgG 水平进行测定。
在合并血清中对其它PS所产生的ELISA IgG应答进行测定。
表17.Balb/c幼小鼠的PS免疫原性(三次免疫后的IgG水平)
实施例11：制剂制备与检验
a)制备以下制剂(使用得自表1的13价疫苗及得自表5的血清型 3-见表2下面对14价疫苗的注释[采用直接缀合的22F或通过ADH 连接基缀合的22F])。用磷酸铝和3D-MPL按照下述方法制备糖类。
b)在相同的糖制剂中加入下列各佐剂：
-下表中表示每500μl剂量的乳液成分浓度。
A1佐剂 A2佐剂 A3佐剂
成分 250μl水包油乳剂 125μl水包油乳剂 50μl水包油乳剂
α生育酚 11.88mg 5.94mg 2.38mg
角鲨烯 10.7mg 5.35mg 2.14mg
吐温80 4.85mg 2.43mg 0.97mg
A4佐剂 A5佐剂 A6佐剂 A7佐剂
成分 250μl水包油 250μl水包油 125μl水包油 50μl水包油
乳剂 乳剂 乳剂 乳剂
α生育酚 11.88mg 11.88mg 5.94mg 2.38mg
角鲨烯 10.7mg 10.7mg 5.35mg 2.14mg
吐温80 4.85mg 4.85mg 2.43mg 0.97mg
3D-MPL 50μg 25μg 25μg 10μg
c)糖类用两种基于脂质体的佐剂来配制：
佐剂B1的组成
定性定量(每0.5ml剂量)
脂质体：
-DOPC 1mg
-胆固醇0.25mg
3DMPL 50μg
QS21 50μg
KH2PO4 3.124mg缓冲液
Na2HPO4 0.290mg缓冲液
NaCl 2.922mg
(100mM)
注射用水适量，加至0.5ml溶剂
pH 6.1
PO4总浓度＝50mM
佐剂B2的组成
定性定量(每0.5ml剂量)
脂质体：
-DOPC 0.5mg
-胆固醇0.125mg
3DMPL 25μg
QS21 25μg
KH2PO4 3.124mg缓冲液
Na2HPO4 0.290mg缓冲液
NaCl 2.922mg
(100mM)
注射用水适量，加至0.5ml溶剂
pH 6.1
d)糖类另用C佐剂来配制(见上述使用该佐剂的其它组成)：
定性定量(每0.5ml剂量)
水包油乳液：50μl
-角鲨烯2.136mg
-α-生育酚2.372mg
-吐温80 0.97mg
-胆固醇0.1mg
3DMPL 50μg
QS21 50μg
KH2PO4 0.470mg缓冲液
Na2HPO4 0.219mg缓冲液
NaCl 4.003mg
(137mM)
KCl 0.101mg
(2.7mM)
注射用水适量，加至0.5ml溶剂
pH 6.8
实施例12.Balb/c小鼠中缀合化学反应对22F-PhtD缀合物免疫原性的 影响
在第0天、第14天和第28天，用含有PS 1、3、4、5、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量：对于 PS 4、18C、19A、19F和22F为0.3μg糖/PS，对于其它PS为0.1μg 糖/PS)通过肌内(IM)途径对各组30只雌性Balb/c小鼠进行免疫。
使PS 18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与 甲醛脱毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。
对两种制剂进行比较，这两种制剂由直接CDAP化学法或 22F-AH-PhtD(ADH衍生的PS)制备的22F-PhtD构成。参见实施例2、 表1及表2下面对于用22F直接缀合或者通过ADH间隔基缀合物制 备的13价疫苗特征的注释。该疫苗制剂中补加了C佐剂。
在第42天，对所采集的血清中的抗PS22F ELISA IgG水平和调 理吞噬效价进行测定。
就IgG水平(图5)和调理吞噬效价(图6)而言，22F-AH-PhtD具有 比22F-PhtD大得多的免疫原性。
实施例13.新佐剂对肺炎链球菌荚膜PS缀合物免疫原性的影响
在第0天、第14天和第28天，用含有PS 1、3、4、5、6B、7F、 9V、14、18C、19A、19F、22F和23F的13价PS制剂(剂量：对于 PS 4、18C、19A、19F和22F为0.3μg/PS，对于其它PS为0.1μg/PS) 通过肌内途径对各组40只雌性Balb/c小鼠进行免疫。
使PS 18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，19A与 甲醛脱毒的Ply缀合，22F与PhtD缀合，其它PS与PD缀合。参见 实施例2、表1和表2下面对于用22F直接缀合制备的13价疫苗的注 释。
对分别补充了AlPO4、A1佐剂、A4佐剂或A5佐剂的四种制剂 进行比较。
在第42天，对所采集血清中的抗PS、Ply、PhtD和PD ELISA IgG 水平进行测定并将每组血清合并。计算出各个抗原的下述比率：所测 试的新佐剂诱导的IgG水平/用AlPO4诱导的IgG水平。
与经典AlPO4制剂相比，所有所测试的新佐剂对13价缀合物的 免疫应答提高了至少2倍(图7)。
实施例14.肺炎球菌猴肺炎模型中PhtD/脱毒Ply组合的保护性功效
在第0天和第28天，用11价PS缀合物(即PS 1、3、5、6B、7F、 9V、14和23F各1μg以及PS 4、18C和19F各3μg)或PhtD(10μg)+甲 醛脱毒的Ply(10μg)或仅佐剂经肌内注射对各组6只猕猴(3-8岁)进行 免疫，所选用的猕猴为先前存在的抗19F抗体水平为最低的猕猴。
使PS 18C与破伤风类毒素缀合，19F与白喉类毒素缀合，其它 PS与PD缀合。参见实施例2、表1及表2下面有关11价疫苗特征的 注释。所有制剂均补充了C佐剂。
在第42天时，将19F型肺炎球菌(5.108cfu)接种到右肺。在受到 攻击后第1天、第3天和第7天，统计支气管肺泡灌洗物的菌落数。 结果用受到攻击后第7天每组死亡、肺定居或清除的动物数目表示。
如图8所示，与仅用佐剂组相比，用11价缀合物和PhtD+dPly 组合获得接近统计显著性的良好保护(p＜0.12，费希尔正合检验 (Fisher Exact test))，尽管所采用的动物数目较少。
实施例15.缀合化学反应对抗PhtD抗体应答和针对由22F-PhtD缀合 物诱导的4型攻击的保护性功效的影响
在第0天和第14天，用3μg 22F-PhtD(用直接CDAP化学法制备) 或22F-AH-PhtD(ADH衍生的PS)或仅用佐剂经肌内途径对各组20只 雌性OF1小鼠进行免疫。通过实施例2的方法制备两种单价22F缀合 物(同样参见表1和表2)。各种制剂均补充了C佐剂。
对第27天所采集的血清的抗PhtD ELISA IgG水平进行测定。
在第28天，用5.106 cfu的4型肺炎球菌经鼻内攻击小鼠(即肺炎 球菌血清型不会被存在于测试疫苗制剂中的PS掩蔽)。监测所引起的 死亡率直到攻击后第8天。
22F-AH-PMD比22F-PhtD引起明显较高的抗PhtD IgG应答和更 好的针对4型攻击的保护。