技术领域
本发明涉及精子功能的调节。本发明特别涉及特定蛋白质如 纤连蛋白和血管紧张素II分别用于保存非获能或非活化状态的精 子和将非获能/非活化精子转化为获能/活化状态的用途。
背景技术
诱导并保持哺乳动物精子成熟和运动性的生理因素通常仍不 清楚，尽管已知涉及多种试剂。例如来自志愿者和看生育力门诊 的病人的受刺激和非受刺激精子的运动性数据显示，血管紧张素 II既可提高运动性精子的百分比又可提高其线速度，而特定的ATI 受体拮抗剂洛沙坦(losartan)抑制血管紧张素II对运动精子的百 分比的作用。已证明血管紧张素II对特定的运动性参数，包括曲线 速度、直线速度和侧向头运动的幅度有作用。这些运动性变化在 特征上与精子获能即最终使卵子受精的能力相关。这些发现是发 明WO 95/32725“血管紧张素II促进生育力的用途”的基础。
与此同时，引起注意的是精子与细胞外基质蛋白质的相互作 用，该细胞外基质蛋白质特别包括纤连蛋白。已在精子表面上的 各个位置发现纤连蛋白，其存在于精子上可能与不育症有关。
在其它研究中，已讨论了有关精子冷冻的问题。精子冷冻是 为家畜和人类人工受精和体外受精而保藏精子的一个基本方法。 然而，取决于物种和个体，存在与精子冷冻和解冻相关的不同程 度的损害，因此与新鲜的未冷冻精子相比其生育力受到损害。部 分原因是冷冻和解冻似乎引起反映获能的变化。
发明内容
本发明基于如下发现：细胞外基质蛋白质如纤连蛋白可用作 添加剂以通过减少运动性保存非获能状态的精子，而血管紧张素 II和其类似物以及含RGD三肽的小肽可用于通过增强运动性使其 中获能已被存在的细胞外基质蛋白质抑制的样品获能。
因此，本发明提供一种精子调节方法，该方法包括提供含细 胞外基质蛋白质的精子样品以使精子处于非获能状态，和加入血 管紧张素II或相关的肽以使精子获能。
含细胞外基质蛋白质的精子样品一般通过将细胞外基质蛋白 质加入精子样品中以通过降低运动性使其处于非获能状态或保持 预先存在的非获能状态。这种基质蛋白质用于保存低运动性、非 获能状态的精子的用途是本发明的另一方面。然而，本发明的调 节方法还可用于天然含细胞外基质蛋白质的精子样品。
附图说明
在附图中：
图1为来自实施例1的操作的运动性测量值的图示；
图2为来自实施例2的操作的运动性测量值的图示；
图3为来自实施例3的操作的运动性测量值的图示；
图4为来自实施例4的操作的运动性测量值的图示；
图5为来自实施例5的操作的运动性测量值的图示；和
图6、7、8和9为来自实施例6的操作的获能测量值的图示。
具体实施方式
天然处于非获能状态的精子具有固有的最终进行获能的潜 能，无论是否刺激。然而，冷冻和解冻精子对其造成很大损害， 但是在解冻后或从冷藏(但不冷冻)贮藏中取出样品后在可成活 的条件下复原的那些精子经常很快开始获能，通常限制其解冻后 或急冷后的用途。本发明的一个特征是利用加入的细胞外基质蛋 白质和血管紧张素II提供对整个方法的一些控制，在技术人员控制 下，使用该精子例如在受精研究或治疗人类生育临床病人样本或 动物人工受精中，有效地提供“刹车和加速器”。通过使用本发明的 基质蛋白质，已发现可以将精子样品的使用寿命延长3-4倍。
在优选的方面，本发明包括将细胞外基质蛋白质加入精子样 品中以使该精子处于非获能状态或保持预先存在的非获能状态， 随后在体外受精研究或体内受精过程中在合适的时间将血管紧张 素II或相关的肽加入精子样品中以使其获能。
本发明一方面包括将一种或多种细胞外基质蛋白质用作通过 降低运动性保存非获能/非活化状态精子的试剂。可通过使用下面 用于指导的实施例的常规试验得到有效量。例如，可将基质蛋白 质以约1μg/ml至50μg/ml，通常2μg/ml至20μg/ml的标准加入样品 中。
可将细胞外基质蛋白质适宜地加入用于冷藏或作为冷冻精子 低温保存之前的在常规膨胀剂介质中的新鲜精子中。
做为选择，当样品保留待用时可将细胞外基质蛋白质加入解 冻后或急冷贮藏后的精子样品中。解冻后的样品一般可由供给者 悬浮在所有者的介质中。负责IVF操作或进行受精研究的技术人员 可发现，可方便地洗涤解冻后的精子，通过离心浓缩精子，然后 将该精子重悬于适合研究或IVF的介质中。
本发明另一方面包括：当样品已通过存在的细胞外基质蛋白 质以低运动性、非获能状态贮藏时，将血管紧张素II或相关的肽用 作通过增强运动性使精子样品获能的试剂。可通过使用下面用于 指导的实施例的常规试验得到有效量。例如，在被处理组合物中 以0.1nM至100nM、通常1nM至10nM的量提供血管紧张素II或其 类似物是适当的。
提供非获能精子的含细胞外基质蛋白质的精子样品可来自解 冻含细胞外基质蛋白质的冷冻精子、或来自以非冷冻贮藏的含细 胞外基质蛋白质的精子样品、或天然含细胞外基质蛋白质的精子 样品。
做为选择，可将细胞外基质蛋白质加入解冻后或贮藏后或新 鲜样品中，接着使用血管紧张素II或相关的肽，所以在使用血管紧 张素II诱导获能时，技术人员可以将精液保持在低运动性非获能状 态直至使用前。
细胞外基质蛋白质能够与细胞表面结合，并且据信涉及根据 本发明保持低运动性非获能状态的精子，尽管实际机理仍不清楚。 用于本发明的合适细胞外基质蛋白质包括纤连蛋白、玻连蛋白和 层粘连蛋白。
作为获能试剂，可将血管紧张素II用相关的肽例如WO 95/32725中提及的盐和类似物取代，其整个公开在这里引入作为 参考。合适的类似物是血管紧张素II酰胺。
做为选择，可将含三肽基元RGD(Arg-Gly-Asp)的肽用作 获能的试剂。该基元可由三肽RGD本身或由其它小肽如市购的四 肽RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)提供。RGD为在所有细胞外基质 蛋白质中发现的三肽基元，细胞膜中的整连蛋白与其结合。使用 游离RGD或其它含基元RGD的肽，因此与细胞外基质蛋白质竞 争，并通过该蛋白质抑制细胞结合。可通过使用下面用于指导的 实施例的常规试验得到有效量。
RGD合适地用于与血管紧张素II组合，原因在于RGD抑制细 胞外基质蛋白质结合、提高加入的血管紧张素II在刺激运动性中的 效率并因此提高获能/活化。然而，血管紧张素II在不存在RGD肽 下仍然是有效的获能试剂。
为进行贮藏，优选将新鲜精子加入精子膨胀剂介质或其它生 殖细胞介质中。
因此，本发明另一方面为含细胞外基质蛋白质如纤连蛋白、 玻连蛋白或层粘连蛋白的精子膨胀剂介质，这样加入的精子保持 非获能状态。精子膨胀剂介质可市购并且通常包括缓冲水溶液。
精子膨胀剂介质通常在使用时通过将固体的、通常为粉末状 的膨胀组合物加入水中制备。因此，本发明还提供精子膨胀剂组 合物，其通常为与水再构造的粉末，包含细胞外基质蛋白质。
再一方面，本发明提供一种或多种细胞外基质蛋白质用于制 备保存非获能状态的精子的试剂或用于制备保存非获能状态的精 子的精子膨胀剂介质的用途。
当膨胀剂介质用于精子低温保存时，膨胀剂介质还优选还包 含一种或多种低温防护试剂如甘油。
类似地，为使精子获能，可将精子样品加入含获能试剂的膨 胀剂介质中，或反之亦然。
因此，本发明还提供含血管紧张素II或其类似物和/或含RGD 的肽的精子膨胀剂介质或组合物。
再一方面，本发明提供血管紧张素II或类似物和/或含RGD的 肽用于制备使精子获能的试剂或用于制备使精子获能的精子膨胀 剂介质或组合物的用途。
精子膨胀组合物是本发明领域熟练技术人员公知的，并且通 常包含缓冲剂如柠檬酸或柠檬酸钠和碳酸氢钠和/或营养素如糖例 如葡萄糖。当精子按公知的低温贮藏时，可加入低温防护剂如甘 油或蛋或牛奶蛋白。还可加入抗生素。该介质的pH通常为约7-8。
通常，本发明的工艺将采用用于生殖细胞的介质，该介质可 以市购或是本领域公知的，例如参见WO 03/072707中列出的材 料，该文献的全部公开在这里引入作为参考。
本发明主要涉及哺乳动物精子，特别是用于生育临床的人类 精子和用于通过人工受精培育家畜的动物精子。
涉及人类和家畜动物人工受精操作的主要问题是相对于排卵 的精子获能时间。部分因此原因，成功率通常极低。通过使用本 发明的″刹车和加速器″试剂，可更精确地进行人工受精工艺。在合 适的膨胀剂介质中，可将精子在恰当的获能状态下在精确的恰当 时间移植。在某些情况下，使用细胞外基质蛋白质“刹车”可以 足够干预，并且精子可通过伴随排卵自然释放血管紧张素II而获 能。这样通过避免排卵时间的治疗干预扩展本发明的应用。
本发明的另一进展是通过在性交前不久使用包含细胞外基质 蛋白质(例如纤连蛋白)或血管紧张素II(或类似物)的内部施用 的阴道栓提供体内精子增强和抑制(生育力增强和避孕)。
因此本发明提供另一方面提供：
包括一种或多种细胞外基质蛋白质的精子抑制组合物，优选 分散在阴道栓基物中；
包括血管紧张素II或相关的肽的精子增强组合物，优选分散在 阴道栓基物中。
用于人类和动物的合适阴道栓基物是市购的并且本领域公知 的。它们通常包括内部使用时在合适温度下熔化的脂肪或石蜡。 泡沫阴道栓还可用于辅助分散活性物质。乳膏和凝胶也可用作赋 形剂。
本发明将仅借助下面的实施例进行说明。
材料：
公牛精液样品(Semex)
纤连蛋白(250μg/ml，Sigma)
玻连蛋白(250μg/ml，Sigma)
层粘连蛋白(250μg/ml，Sigma)
RGDS(150μl/ml)(作为RGD源)
血管紧张素II(10-9mol/L)
Sp-TALP(Tyrode′s Albumin Lactate Pyruvate)介质(TL， BSA，Fract V，Pyruvate，gentamicin)-生殖细胞介质
热板-加热的显微镜载物台
精子制备和分离：
将各精子样品装满0.25ml塑料管并冷冻。将冷冻的精子 (spermatozoa)塑料管(0.25ml)通过将其投入37℃的水浴中 快速解冻。当样品解冻后，将塑料管用棉纸干燥、保持水平并将 两端切开投入预热的TALP介质中。
获能：
将精子用TALP介质洗涤两次，并在600×g下离心10分钟，然 后用预热至37℃的TALP重悬。用热板在37℃下评估冷冻-解冻精 子的运动性。精子的运动性和形态通过在37℃的温热载物台上进 行显微镜观察评估。将精液(10μl)用盖玻片(18mm×18mm) 覆盖并检测至少5个显微镜视野。运动性用样品中以线性向前运动 的能动的精子的百分比表示(参见Vinson，G.P.，Puddefoot，J.R.， Ho，M.M.，Barker，S.，Mehta，J.，Saridogan，E.和 Djahanbakhch，O.(1995).“Type 1 angiotensin II (AT1) receptors in sperm”，Journal Of Endocrinology，144， 369-378)。将制备的精子样品如各实施例中的描述与添加剂一起 在37℃的水浴中培养，并如前进行运动性评估。
实施例1
将解冻的精子样品与添加剂一起按如下进行培养：
1.将精子与纤连蛋白(2μg/l)一起培养10分钟。
2.将精子与纤连蛋白(2μg/l)加上RGDS(5×10-6mol/L) 一起培养10分钟。
3.将血管紧张素II(10-9mol/L)加入纤连蛋白加上RGDS样 品中并再培养10、20、30和40分钟。
所有培养用水浴和加热的载物台在37℃下进行。
精液样品(10μl)施于预热(37℃)的载玻片上、置于显微 镜的加热载物台上并检测。数出零时刻对照样品中的和所述培养 时间后处理样品中的运动精子数。
结果在图1中给出，其中各柱状物示出如下时刻的运动性值：
1.对照 0min；
2.纤连蛋白 10min；
3.纤连蛋白+RGD 10min；
4.纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 10min；
5.纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 20min；
6.纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 30min；
7.纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 40min；
8.对照40min后；
从图中可以看出：
a)对照样品在零时刻显示70％运动性；
b)纤连蛋白浓度对精子的效果显示总精子运动性非常显著 的变化。培养5-10分钟后样品显示仅14％的精子运动性。
c)纤连蛋白加上RGDS在10分钟后的效果显示，与仅纤连蛋 白在10分钟后相比无明显差别(23％)。
d)通过将血管紧张素II加入样品中，精子运动性存在显著变 化。用血管紧张素II增加的培养显示精子运动性增加。在10、20 和30-40分钟培养后，与仅纤连蛋白相比运动性分别增加43％、 64％和71％。与RGD加纤连蛋白样品相比，分别增加为34％、55％ 和62％。
e)对照样品在水浴中培养40分钟后显示仅28％的运动性。
实施例2
将解冻的精子样品与添加剂一起按如下进行培养：
1.将精子与纤连蛋白(2μg/l)一起培养10分钟。
2.将血管紧张素II(10-9mol/L)加入纤连蛋白样品中并再 培养10、20和30分钟。
结果在图2中给出，其中各柱状物示出如下时刻的运动性值：
1)对照 0min；
2)纤连蛋白 10min；
3)纤连蛋白+血管紧张素II 10min；
4)纤连蛋白+血管紧张素II 20min；
5)纤连蛋白+血管紧张素II 30min；
6)对照30min后；
从图中可以看出：
a)对照样品在零时刻显示79％的运动性；
b)纤连蛋白浓度对精子的效果显示总精子运动性非常显著 的变化。培养5-10分钟后仅存在8％的精子运动性。
b)通过将血管紧张素II加入样品中，精子运动性存在显著变 化。在从培养开始10、20和30-40分钟培养后，与仅纤连蛋白相 比运动性分别增加64％、62％和62％。
c)对照样品在水浴中培养30分钟后显示仅20％的运动性。
实施例3
将解冻的精子样品与添加剂一起按如下进行培养：
1.将精子与RGDS(5×10-6mol/L)一起培养5分钟。
2.将纤连蛋白(2μg/l)加入RGD S样品中并再培养5min。
3.将血管紧张素II(10-9mol/L)加入纤连蛋白+RGDS样品 中并再培养10、20和30分钟。
结果在图3中给出，其中各柱状物示出如下时刻的运动性值：
1)对照 0min；
2)与RGD一起预培养 5min；
3)RGD+纤连蛋白 5min；
4)纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 10min；
5)纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 20min；
6)纤连蛋白+RGD+血管紧张素II 30min；
7)对照 30min；
从图中可以看出：
a)对照样品在零时刻显示62％的运动性；
b)RGDS与精子预培养显示精子运动性降低19％。
c)纤连蛋白浓度对预培养的RGDS和精子的效果显示总精 子运动性非常显著的变化。培养5-10分钟后与对照样品和RGD处 理的样品相比分别存在47％和28％的运动性降低。
d)通过将血管紧张素II加入样品中，精子运动性存在显著变 化。与血管紧张素II一起培养越长显示精子运动性增加。在10、 20和30-40分钟培养后，与20％纤连蛋白和RGDS相比运动性分别 增加43％、54％和54％。
e)对照样品在水浴中培养30分钟后显示仅38％的运动性。
重复实施例1至3
用基质蛋白质纤连蛋白在2μg/l下进行实施例1至3的操作。用 20μg/l纤连蛋白进行的操作达到类似的结果。
实施例4
将解冻的精子样品与添加剂一起按如下进行培养：
1.将精子与玻连蛋白(2μg/l)一起在37℃的水浴中培养5分 钟。
2.将血管紧张素II(10-9mol/L)加入玻连蛋白样品中并再培 养5、15、15和35分钟。
结果在图4中给出，其中各柱状物示出如下时刻的运动性值：
1)对照 0min；
2)玻连蛋白 5min；
3)玻连蛋白+血管紧张素II 5min；
4)玻连蛋白+血管紧张素II 15min；
5)玻连蛋白+血管紧张素II 15min；
6)玻连蛋白+血管紧张素II 35min；
从图中可以看出：
玻连蛋白浓度对精子的效果显示总精子运动性非常显著的降 低；通过将血管紧张素II加入样品中，精子运动性存在显著增加。
实施例5
将解冻的精子样品与添加剂一起按如下进行培养：
1.将精子与层粘连蛋白(2μg/l)一起在37℃的水浴中培养 10min。
2.将血管紧张素II(10-9mol/L)加入层粘连蛋白样品中并再 培养10、20、30和40分钟。
结果在图5中给出，其中各柱状物示出如下时刻的运动性值：
1)对照 0min；
2)层粘连蛋白 5min；
3)层粘连蛋白+血管紧张素II 10min；
4)层粘连蛋白+血管紧张素II 20min；
5)层粘连蛋白+血管紧张素II 30min；
6)层粘连蛋白+血管紧张素II 40min；
从图中可以看出：层粘连蛋白浓度对精子的效果显示总精子 运动性非常显著的降低；通过将血管紧张素II加入样品中，精子运 动性存在显著增加。
运动性和获能：
获能本质上是精子使卵受精的能力。不运动的精子不能使卵 受精，通常过动现象(hyperactivation)的开始被认为与获能相 符。上面的实施例中数据都给出运动性百分比。血管紧张素II的 刺激效果增加精子的运动性以及曲线速度、侧向头位移和与过动 现象相关的鞭打(beat cross)频率(Vinson，GP，Mehta，J，Evans， S，Matthews，S，Puddefoot，JR，Saridogan，E，Holt，WV，和 Djahanbakhch，O(1996).Angiotensin ii stimulates sperm motility.Regulator Peptides 67131-135.)。
评估获能的另一方法是使用CTC测定(DasGupta S，Mills CL，Fraser LR.Ca(2+)-related changes in the capacitation state of human spermatozoa assessed by a chlortetracycline fluorescence assay.J Reprod Fertil.1993 Sep；99(1)：135-43.； Fraser LR，Herod JE.Expression of capacitation-dependent changes in chlortetracycline fluorescence patterns in mouse spermatozoa requires a suitable glycolysable substrate.J Reprod Fertil.1990 Mar；88(2)：611-21)。在下面实施例6中使 用的该方法中，染色图案区别非获能、获能和顶体反应的精子。
实施例6
材料：
金霉素(CTC)溶液：CTC(在Tris(20mM)-NaCl(130mM) 中的750μM CTC、DL-半胱氨酸(5mM)、缓冲剂(20mM Tris/130mM NaCl，pH 7.8)。
血管紧张素II(10-9)mol/L
纤连蛋白(5-50μg/ml)
精子样品由健康公牛获得(Semex，UK)。本研究中使用的所 有精液样品已进行冷冻和解冻。将各样品装满0.25ml塑料管。
精子获能和分离：
将冷冻的精子塑料管(0.25ml)通过将其投入37℃的水浴中 快速解冻。当样品解冻后，将塑料管用棉纸干燥、保持水平并将 两端切开投入预温热的TALP介质中。
获能：
将精子用TALP介质洗涤两次，并在600g下离心10分钟，然 后用预热至37℃的TALP重悬。将精子在无添加剂下培养，或与血 管紧张素II(10-9mol/L)、纤连蛋白(5-50μg/ml)之一或与此两 者一起培养。将已处理的样品(45μl)等分入装有CTC溶液(45μl) 的箔包裹的eppendorf管中，并用12.5％多聚甲醛固定，然后通过 光学显微镜法观察。
对公牛精子可观察到三个金霉素荧光染色图案：
F(未获能)图案，检测到明亮荧光遍布整个精子头区域；B (获能)图案，在精子头上而不是顶体后区域上检测到荧光；AR (顶体反应)图案，检测到弱荧光遍布精子头，并且在赤道区域 观察到明亮谱带。
结果：
在对照(未处理)组中，约60％的精子显示未获能图案，经 30分钟后该百分比降至55％。获能和顶体反应的精子无明显变化 (参见图6)。纤连蛋白(5μg/ml)处理样品显示精子染色图案非 常类似于未处理的对照组(比较图6和图7)。相反，仅与血管紧张 素II一起进行60min培养后，获能精子增加(45％)，非获能精子 降至约(18％)(见图8)。这些数据表明血管紧张素II促进非获能 (F图案)向获能(B图案)转变。接着是快速顶体胞吐作用。在 同时用纤连蛋白(5μg/ml)和血管紧张素II(10-9)处理的样品 中还存在非获能精子显著降低，并且在30min内仅25％的细胞显示 未非获能图案，60min后该百分比降至15％。这伴随在整个过程中 获能和顶体反应精子增加(参见图9)。
该结果表明即使在纤连蛋白存在下，AngII(10-9)将增加获 能，同时通过比较前面实施例中给出的数据，血管紧张素II刺激运 动性和获能是同步的。
实施例7：纤连蛋白对精子活力的作用
原液：羧基荧光素二乙酸酯(0.46mg/ml，在二甲亚砜中)、 碘化丙锭(0.5mg/ml等渗盐水)、甲醛(10μl福尔马林加入150μl 蒸馏水中)。荧光染料：50μl羧基荧光素和50μl碘化丙锭加入2ml 精子膨胀剂中，加上100μl甲醛。
将精液用染料(1∶1)稀释并在室温下在37℃下培养15min。 将样品用膨胀剂洗涤并检测存活和死亡的精子。
在对照样品中，当在室温下贮藏3天时显示存活的精子百分比 从75％降至18％。精子保持在相同的条件下，但在另外存在纤连蛋 白(5μg/ml)下，3天后显示48％保持存活。