技术领域
本发明涉及一种新型温敏纳米药物载体的制备方法，尤其是一种 具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，以及通过 该制备方法获得的温敏纳米药物载体及其用途。
背景技术
根据大量的研究表明，叶酸受体是一种在多种癌细胞中广泛过量 存在并且能和叶酸分子发生特殊相互作用的物质。利用叶酸与叶酸受 体特有的相互作用，人们通常将叶酸作为特殊的靶向分子来修饰各种 纳米尺寸的抗癌药物载体，起到对癌细胞的靶向识别作用，从而提高 药物的传递效率，同时可以降低药物的副作用。
在各种载体中，具有空腔结构的载体因其特有的性质，例如较大 的内部空间尺寸和壳层可调节的渗透性，在装载DNA，蛋白质以及各 种药物分子的领域中得到了广泛的研究和应用。在实际应用中，控制 调节载体对于外来分子的渗透能力一直是人们研究的一个热点，因为 载体对外来分子的渗透能力关系到外来分子的装载以及释放，是非常 重要的。为了进一步改善载体的渗透性，一种比较可行的方法就是设 计制备一种能对外界的刺激，例如温度，pH值和磁场，做出特殊响应 的载体。从而通过外界刺激的调节来控制载体对于外来分子的渗透能 力。
基于四氧化三铁纳米粒子的磁性，其功能微球材料在细胞分离， 固定化酶，磁靶向载药，磁共振成像等生物领域都有着广泛的应用。 并且四氧化三铁纳米粒子被证明就有很好的生物相容性。聚N-异丙 基丙烯酰胺(PNIPAM)是一种具有温度响应性的聚合物，它在32℃ 左右有一个最低临界溶解温度(LCST)。当温度小于32℃的时候， PNIPAM表现出亲水性；当温度大于32℃的时候，它表现出憎水性。 并且PNIPAM的LCST在较大范围内是可调节的，加入亲水性共聚单体 会升高LCST，反之加入憎水性共聚单体会降低LCST。PNIPAM的这种 特殊的温敏性质使它在药物传递以及药物的可控释放领域都得到了 广泛的研究报道。
基于以上信息，设计制备一种兼具磁靶向和叶酸靶向，同时具有 温敏特性的具有空腔结构的纳米药物载体将会是对药物传递领域的 一次很好探索。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有磁性和叶酸双重 靶向的温敏纳米药物载体的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种上述制备方法获 得的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体。
本发明所要解决的再一技术问题在于提供一种上述温敏纳米药 物载体的用途。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种具有磁性和 叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤：
第一步：将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性；
第二步：在四氧化三铁纳米粒子表面通过细乳液聚合方法包覆聚N- 异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，制成具空腔结构的复合种子微 球；
第三步：在复合种子微球表面通过沉淀聚合方法包覆N-异丙基丙烯 酰胺(NIPAM)和甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)的共聚物， 制得纳米复合微球；
第四步：将纳米复合微球表面带上氨基；
第五步：将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载 体。
本发明首先用经油酸等改性的四氧化三铁纳米粒子作为磁性材 料，通过改进的细乳液聚合方法得到内部具有空腔结构的，以四氧化 三铁纳米粒子为核，以PNIPAM为壳层的复合种子微球；再通过沉淀 聚合方法在种子微球外包覆NIPAM和GMA的共聚物，进一步以NIPAM 和GMA的共聚物为壳，得到表面带有环氧基团的复合微球；然后，微 球表面的环氧基团可以在常温下用过量的氨基试剂开环，得到表面带 有氨基的纳米复合微球；最后，用叶酸和复合微球表面的氨基反应， 叶酸分子上的羧基和氨基反应生成酰胺键，从而将叶酸分子接到微球 表面，最终得到具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体。
所述的四氧化三铁纳米粒子为超顺磁性的四氧化三铁纳米粒子， 通过化学共沉淀法制得。
在上述方案的基础上，第一步中，采用超顺磁性的四氧化三铁纳 米粒子，亲油改性为将四氧化三铁纳米粒子表面通过亲油剂改性得到 磁流体，所述的亲油剂为油酸、油胺或三正辛基氧磷(TOPO)等。
在上述方案的基础上，第二步中，所述的复合种子微球中四氧化 三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体的质量比为1：5～ 15，获得的复合种子微球的粒径在80～120nm。
其中，四氧化三铁纳米粒子与N-异丙基丙烯酰胺单体的质量比 可以具体为1：5，6，8，10，12，13或15；粒径分布可以在80，90， 100，110，120nm。
复合种子微球的细乳液聚合制备方法具体可以为：
将第一步四氧化三铁纳米粒子改性中获得的磁流体洗涤后，加入 溶剂乙酸丁酯和偶氮二异丁腈(AIBN)，分散均匀后，和十二烷基苯 磺酸钠(SDBS)溶液混合，超声形成稳定乳液；
再将N-异丙基丙烯酰胺单体(NIPAM)和N，N’-亚甲基双丙烯酰 胺(MBA)溶解，与所述稳定溶液混合，进行四氧化三铁纳米粒子与 NIPAM单体的聚合；
反应过程条件为：先通氮气20～50分钟，再在反应温度70～80 ℃下反应3～6小时。
具体的，通氮气的时间可以为20，30，40或50分钟；反应温度 可以为70，72，75，78或80℃，反应时间可以为3，4，5或6小时。
在上述方案的基础上，第三步中，所述的纳米复合微球的粒径在 180～220nm。具体的粒径分布可以在180，190，200，210，220nm。
通过沉淀聚合方法在种子微球外包覆N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM) 和甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)的共聚物获得纳米复合微球的具体 可以为：
在第二步中获得的复合种子微球分散液中加入N-异丙基丙烯酰 胺单体(NIPAM)，甲基丙烯酸脱水甘油酯(GMA)，N，N’-亚甲基双丙 烯酰胺(MBA)交联剂，先通氮气20～50分钟，加入过硫酸钾引发剂， 再在反应温度70～80℃下反应3～6小时。
通氮气的时间具体可以为20，30，40或50分钟；反应温度可以 为70，72，75，78或80℃，反应时间可以为3，4，5或6小时。
在上述方案的基础上，第四步中，使纳米复合微球表面带上氨基 的方法为：纳米复合微球与氨基试剂反应，所述的氨基试剂为己二胺、 乙二胺、丁二胺或巯基乙胺等。加入氨基试剂后常温下搅拌过夜，产 物用磁分离，并用水洗涤多次后待用。
在上述方案的基础上，第五步中，先将叶酸、1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 在溶剂中混合，如二甲基亚砜(DMSO)中混合进行活化反应，再与带 氨基的纳米复合微球上的反应。
将叶酸与EDC.HCl和NHS混合搅拌活化0.5～2小时，一般情况 下，叶酸与EDC.HCl、NHS的混合摩尔比为1：1.5～2.5：1.5～2.5， 具体可以为1：1.5，1.8，2，2.2或2.5：1.5，1.8，2，2.2或2.5， 优选1：2：2。事先对叶酸进行活化更有利于之后叶酸分子上的羧基 与纳米复合微球上的氨基反应生成酰胺键，从而将叶酸分子接到微球 表面。
针对上述的制备方法获得的具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳 米药物载体，所述的温敏纳米药物载体具有空腔结构，以四氧化三铁 为核，以聚N-异丙基丙烯酰胺、聚N-异丙基丙烯酰胺与甲基丙烯酸 脱水甘油酯的共聚物为壳，表面修饰有叶酸靶向分子，粒径在180～ 220nm。具体的粒径分布可以在180，190，200，210，220nm。这种 纳米药物载体具有较快的磁响应速度，在一定温度下会发生体积相转 变，并且在水中可以稳定分散。
在上述方案的基础上，温敏纳米药物载体的磁饱和强度范围为 5emu/g～40emu/g；相转变温度为32～42℃。
具体的，温敏纳米药物载体的磁饱和强度范围可以为5，10，15， 20，25，30，35或40emu/g；相转变温度可以为32，35，38，40或 42℃。
针对上述的温敏纳米药物载体的用途，用于装载抗癌药物阿霉 素。温敏纳米药物载体可以在水溶液中通过氢键作用或者物理吸附作 用，装载阿霉素药物分子，其包封率以及载药率可以方便地用pH值 加以控制。阿霉素的释放过程可以通过调节环境的温度和pH值加以 控制，在高温和低pH值条件下展现出较快的释放速度。通过将载有 药物的上述纳米药物载体和带有叶酸受体的癌细胞一起培养进行细 胞实验，纳米药物载体体现出了很好的靶向特性。
在上述方案的基础上，所述抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分 比为3～60％。具体的，载药率可以为：3，5，10，15，20，25，30， 35，40，45，50，55或60％。
本发明的优异效果是：
本发明制备工艺清晰全面，得到的纳米药物载体具有磁靶向性， 叶酸靶向性，温度敏感性以及空腔结构等多种功能。载体的磁靶向性 使得载体能在磁场的控制下在特定的部位聚集；叶酸靶向性使得载体 对癌细胞具有特异的目标识别功能；载体的温度敏感性可以用来实现 所装载的药物的可控释放，能通过温度刺激对于药物分子的释放加以 控制；而载体的空腔结构则使载体能够装载更多的药物分子从而提高 药物传递的效率和降低副作用；本发明在细胞实验中表现出了很好的 应用效果，是一种较为理想的药物载体。
以上设计思路基本覆盖了药物传递领域所关心的一些基本问题， 因此产品具有较好的全面性。
具体实施方法
一下通过实施例对本发明作进一步的说明，但这些实施实例不限 制本文的保护范围。
一种具有磁性和叶酸双重靶向的温敏纳米药物载体的制备方法，
包括下述步骤：
第一步：将四氧化三铁纳米粒子表面亲油改性：
将一定量的氯化铁和氯化亚铁(摩尔比2：1)溶解在水中，通 氮气半小时，升温到60℃，加入适量的氢氧化钠溶液，制成四氧化 三铁纳米粒子；
然后缓慢的向反应体系中滴加适量油酸，所得到的反应体系稳定 10分钟之后，加热到90℃反应半个小时，反应自然冷却到常温后， 用1mol/L的盐酸溶液调节反应体系pH到4。然后用磁铁吸引分离， 产物用水洗涤5次，接着再分别用无水乙醇和丙酮各洗涤三次，最终 得到的产物用环己烷分散保存，得到稳定的磁流体。
第二步：在四氧化三铁纳米粒子表面包覆聚N-异丙基丙烯酰胺，制 成具空腔结构的复合种子微球：
四氧化三铁纳米粒子和NIPAM单体投料质量比为1：10。
将0.625g磁流体(固含量5.6％)经丙酮和无水乙醇洗涤后，加 入0.5g溶剂乙酸丁酯和10mg AIBN，分散均匀后，和SDBS溶液 (75mg/30ml)混合，超声形成稳定乳液；
取0.35g NIPAM，0.047g MBA溶解在30ml水中，和上述乳液混 合均匀，放入100ml四颈瓶，通氮30min后，在76℃下反应4小时 停止，产物复合种子微球用水洗涤后再次分散保存。
第三步：在Fe3O4@PNIPAM复合种子微球表面包覆N-异丙基丙烯酰胺 和甲基丙烯酸脱水甘油酯的共聚物，制得纳米复合微球：
将25g复合种子微球分散液中加入0.064g NIPAM，0.02 GMA， 0.01g MBA，通氮30min后，加入4mg过硫酸钾引发剂，在76℃下反 应4个小时，产物用磁分离，用水洗涤后待用。
第四步：使纳米复合微球表面带上氨基：
制备好的Fe3O4@PNIPAM-co-PGMA纳米复合微球分散液中，加入过 量的己二胺常温下搅拌过夜，产物用磁分离，并用水洗涤多次后待用；
第五步：将带氨基的纳米复合微球与叶酸结合，得到温敏纳米药物载 体：
摩尔比为1：2：2的叶酸，NHS，EDC溶于一定量的二甲基亚砜 (DMSO)中，搅拌活化1小时，然后将上述溶液加入到事先准备好的 微球分散液中，加入三乙胺催化剂，避光反应过夜，产物用磁分离， 用水洗涤后，并透析除去未反应的分子。
应用例
取实施例中制得的温敏纳米药物载体5mg，加入5mg的阿霉素， 配成10ml的溶液，将溶液调节到一定pH5～10后，常温下搅拌过夜， 产物用离心分离，冷冻干燥，制成装载有抗癌阿霉素的温敏纳米药物 载体，抗癌药物阿霉素的载药率的重量百分比为5～50％。