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1、(10)授权公告号 CN 1981872 B (45)授权公告日 2012.01.25 CN 1981872 B *CN1981872B* (21)申请号 200510130277.7 (22)申请日 2005.12.12 A61K 48/00(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/7068(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 中国医学科学院肿瘤研究所 地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里 17 号 (72)发明人 林晨 詹启敏 王海娟 张林 余健 (74)专利代理机构 北。
2、京戈程知识产权代理有限 公司 11314 代理人 程伟 曹冬炎等 . 耐药性卵巢癌的治疗 . 中国医刊 11.2005,(11),23-25. 赵小平等.Bcl-2家族中唯BH3域蛋白的研究 进展 . 生命科学 17 5.2005,17(5),413 页， 第 1 栏， 33-43 行 . 代文杰等 . 肝细胞基因转导载体系 统应用进展 . 中国普外基础与临床杂志 9 1.2002,9(1),58-60. 郝延璋等 .Puma/ Bbc3 在细胞凋亡中 的作用及其机制 . 医学分子生物学杂志 1 6.2004,1(6),366-369. (54) 发明名称 PUMA 在肿瘤放化疗增敏中的新用途。
3、 (57) 摘要 本发明涉及 PUMA 基因的新用途， 特别是外源 PUMA 基因或包含有 PUMABH3 结构域的 cDNA 及蛋 白的导入在制备增加肿瘤细胞对化疗药物和放射 治疗的敏感性药物中的用途。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 岑喆鑫 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 11 页 CN 1981872 B1/1 页 2 1. 含有 BH3 结构域的 cDNA 的 PUMA 基因及其表达的蛋白在制备增加食管癌细胞对化 疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途， 其中所述化疗药物和放射治疗包括 ： 顺铂、 紫杉 。
4、醇、 五氟尿嘧啶、 奥沙利铂、 鬼臼乙叉甙、 阿霉素及放射治疗 射线， 所述的药物是 PUMA 基 因导入载体形成的药物或包含有 PUMA BH3 结构域 LRRMADDLN 的 cDNA 及蛋白形成的药物。 2. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于所述的载体包括可有效转导基因的表达质 粒、 增殖型及复制缺陷型腺病毒、 单纯疱疹病毒、 逆转录病毒、 腺相关病毒、 痘苗病毒载体。 3. 根据权利要求 1 所述的用途， 其特征在于所述的药物是 Ad-PUMA。 权 利 要 求 书 CN 1981872 B1/9 页 3 PUMA 在肿瘤放化疗增敏中的新用途 技术领域 0001 本发明涉及 。
5、PUMA 基因的新用途， 特别是外源 PUMA 基因或包含有 PUMABH3 结构域 (LRRMADDLN) 的 cDNA 及蛋白的导入在制备增加肿瘤对化疗药物和放射治疗的敏感性药物 中的用途。 背景技术 0002 肿瘤化疗是恶性肿瘤综合治疗中不可缺少的重要手段， 已成为某些肿瘤根治的主 要方法， 手术后(辅助性化疗)和手术前(新辅助化疗)化疗能使部分癌症的治愈率有所提 高， 可增加局部晚期多种实体瘤的手术切除机会。但是不同作用机制的各种化疗药物 ( 烷 化剂、 抗代谢类药物、 抗肿瘤抗生素类、 抗肿瘤的植物类药物、 铂类等 ) 均有不同程度的毒 副作用， 如 ： 骨髓抑制、 胃肠道反应、 心。
6、、 肺、 肝、 肾、 膀胱、 神经毒性等。放射治疗是除手术和 化疗以外的最主要的治疗肿瘤的方法， 但它对增殖较慢的或失去增殖能力的组织有较大的 毒副作用， 如肺放射性纤维化、 脑和脊髓的放射性坏死。这些毒副作用严重影响了放、 化疗 在临床中的应用， 寻找一种可以增强放、 化疗疗效、 减低其治疗剂量， 从而减轻其毒副作用 的物质是医务工作者孜孜以求的目标。 0003 现在， 人们已知放疗和大多数化疗药物主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细 胞的。 外源促凋亡相关基因的导入有可能起到增加放、 化疗敏感性的作用， 这在人们以往的 对 p53 的研究中已得到证实。 0004 PUMA(p53 up-r。
7、egulated modulator of apoptosis) 是 2001 年报道的新发现的 Bcl-2蛋白家族一员， 因其可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用而得名。 它通过BH3结 构域与其它Bcl-2家族蛋白相互作用， 诱导细胞色素c释放， 引起凋亡。 PUMA蛋白定位于线 粒体膜上， BH3 结构域 (141-149 位氨基酸， LRRMADDLN) 是诱导凋亡所必不可少的， 而 C 端 43 个氨基酸残基 (151-193 位 ) 是其在线粒体定位和诱导凋亡所必需的。仅含 C 端 93 个氨 基酸残基的PUMA表达结构诱导凋亡的水平与全长PUMA蛋白的接近。 PUMA诱导凋亡的。
8、能力 是快速强大的， 表达 p53 的人大肠癌 DLD1 细胞比表达 PUMA 的 DLD1 细胞凋亡形态学改变出 现晚 9 小时 ( 如染色质聚集， 核片断化 )。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种 PUMA 基因或包含有 PUMA BH3 结构域的 cDNA 及蛋白 在制备增加放、 化疗敏感性药物中的新用途。换言之， 本发明在于提供一种肿瘤放、 化疗增 敏剂。 0006 本发明所述的化疗药物包括， 但不限于 ： 0007 铂类 ： cDDP(cisplatin 顺铂 )、 CBP(carboplatin 卡铂 )、 L-OHP(Oxaliplatin 奥沙 利铂 )、 NDP(。
9、Nedaplatin 奈达铂 ) 等。 0008 微管抑制剂 ： PTX(Taxol 紫杉醇 )、 TXT(Taxotere 泰索帝 )、 VLB(Vinblastine 长春 碱 )、 VCR(Vincristione 长春新碱 )、 VNR(Vinorelbine 长春瑞宾 ) 等。 说 明 书 CN 1981872 B2/9 页 4 0009 抗代谢类 ： 5-Fu(5-Fluorouracil 五氟尿嘧啶 )、 6-TG(Thioguanine 硫鸟嘌呤 )、 AG337(Nolatrexed 洛 拉 曲 克 )、 FT-207(Tegafur 替 加 氟 )、 HCFU(Carmof。
10、ur 卡 莫 氟 )、 5-DFUR(Doxifluridine 氟铁龙 )、 UFT( 优福定 )、 Ara-C(Cytarabine 阿糖胞苷 ) 等。 0010 拓扑异构酶 II 抑制剂 ： VP16-213(etoposide 鬼臼乙叉甙 )、 VM-26(teniposide 鬼 臼噻吩甙 ) 等。 0011 蒽环类抗肿瘤抗生素 ： ADR(adriamycin 阿霉素 )、 DAM(daunomycin 柔红霉素 )、 阿 克拉霉素 (aclacinomycin)、 表阿霉素 (epirubicin)、 去甲柔红霉素 (idarubiein)、 米托蒽 醌 (mitoxatrone。
11、) 等。 0012 优选的是顺铂cDDP、 紫杉醇taxol、 五氟尿嘧啶5-Fu、 奥沙利铂Oxaliplatin、 鬼臼 乙叉甙 etoposide、 阿霉素 adriamycin。 0013 本发明所述的放射治疗包括但不限于 射线。 0014 本发明所述的药物是 PUMA 基因导入载体或包含有 PUMA BH3 结构域的 cDNA 及蛋 白形成的药物。 0015 本发明可以采用本领域技术人员公知的各种基因导入载体， 可以采用腺病毒介导 将外源 PUMA 基因 (Ad-PUMA) 及缺失 BH3 结构域的 PUMA 基因 (Ad-BH3) 导入的系统， 经过 体外细胞系、 体内人癌裸鼠肿瘤。
12、模型， 证实 Ad-PUMA 的协同化疗药物和放射治疗、 增强抗肿 瘤疗效的作用， 而由缺失BH3结构域的PUMA基因构建的Ad-BH3则不具备上述功能。 所述 的载体并不局限于复制缺陷型腺病毒载体， 还可以包括其他各种外源基因导入的方法， 如 基因枪、 脂质体法、 受体介导的转导等， 以及其它病毒载体系统， 所述的其它病毒载体包括， 增殖型腺病毒、 单纯疱疹病毒、 逆转录病毒、 腺相关病毒、 痘苗病毒等。 成功导入包含有PUMA BH3 结构域的 cDNA 及蛋白也可起到增加放、 化疗敏感性的作用。 0016 PUMA 或其 BH3 结构域能增敏的化疗药物也不局限于下面实验中所列举的几种。 。
13、0017 通常 Ad-PUMA 的使用包括 ： 0018 对于小鼠的治疗实验可根据不同情况(肿瘤大小、 治疗次数、 间隔时间等)采用不 等剂量 ： 一般 5108PFU 5109PFU/ 次， 可每天一次连续给药 5 次， 也可每两天或三天给 药一次共三次。 0019 本领域技术人员熟知 Ad-p53 对于人体的治疗用药剂量， 治疗组给药剂量、 间隔时 间不等， 按其产品说明书描述为 ： 每周一次， 每次1012VP(相当于3.31010PFU)， 瘤组织局部 多点注射。 0020 本发明的 Ad-PUMA 可参考 Ad-p53 的使用剂量与用药方式。 0021 本发明通过一系列体外、 体内实。
14、验证实 ： 导入外源 PUMA 基因， 在多种不同组织类 型的包括乳腺癌、 宫颈癌、 肺癌、 肝癌、 胰腺癌和食管癌等实体肿瘤中， 可增强多种不同作用 机制的化疗药物和放射治疗的抗肿瘤作用， 外源PUMA基因缺失BH3结构域后则不具备该功 能， 而且 PUMA 的导入与化疗药物的协同增效比 p53 基因的导入更显著。外源 PUMA 的导入 并不改变各种化疗药物本身对肿瘤细胞的细胞周期的影响， 这种协同作用是由于诱导凋亡 的协同引起的。 附图说明 0022 图 1A 显示 Ad-PUMA 联合放化疗显著抑制 A549 细胞生长。 说 明 书 CN 1981872 B3/9 页 5 0023 图 。
15、1B 显示不同剂量的化疗药单独或与 Ad-PUMA 联合处理 A549 细胞后的细胞生长 率。 0024 图 2A 显示 Ad-PUMA 显著增强阿霉素诱导的 A549 细胞凋亡。 0025 图 2B 显示 Ad-PUMA 显著增强 射线诱导的 A549 细胞凋亡。 0026 图 3 显示不同病毒感染食管癌细胞 72h 后细胞存活率。 0027 图 4 显示 KYSE150 细胞平板集落形成情况。 0028 图 5 显示不同因素处理 48h 后 KYSE-150 细胞周期的变化。 0029 图 6A 显示 DAPI 染色后的细胞核形态。 0030 图 6B 显示 50MOIAd-PUMA 感染。
16、 KYSE150 不同时间点凋亡细胞百分比。 0031 图 6C 显示 200MOIAd-p53 感染 KYSE150 不同时间点凋亡细胞百分比。 0032 图 6D 显示 Ad-PUMA 与化疗药联合作用 36hr 各组凋亡细胞百分比。 0033 图 7 表示采用 PUMA 的特异性引物 ( 上游 5 GTCCTCAGCCCTCGCTCT 3 下游 5 CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC 3 ) 检测 PUMA 在 mRNA 水平的改变电泳图。 0034 图 8 显示 KYSE150 裸鼠移植瘤生长曲线图。 0035 图 9 显示剥离的 KYSE150 裸鼠移植瘤组织。 0036 图 。
17、10A 显示 Ad-PUMA 显著抑制肺癌细胞生长。 0037 图 10B 显示 PI 染色法检测 Ad-PUMA 感染 H1299 肺癌细胞后细胞的形态改变。 0038 图 10C 显示流式细胞仪检测 Ad-PUMA 感染 H1299 肺癌细胞后凋亡细胞百分比。 0039 图 11 显示 Ad-PUMA 比 Ad-p53 抑制细胞生长更显著。 0040 图 12A 显示 A549 裸鼠移植瘤生长曲线图。 0041 图 12B 显示 Ad-PUMA 抑制 A549 裸鼠移植瘤生长。 0042 图 12C 显示 H1299 裸鼠移植瘤生长曲线图。 0043 图 12D 显示 Ad-PUMA 显著。
18、诱导 H1299 裸鼠移植瘤组织凋亡。 具体实施方式 0044 实施例一 各种肿瘤细胞系中 Ad-PUMA 与化疗药物联合作用的研究 0045 方法 ： 0046 采用本领域技术人员公知手段获得 PUMA 基因， 并将其导入腺病毒， 得到 Ad-PUMA( 腺病毒 -PUMA)。然后将对数生长期的以下各种肿瘤 ( 乳腺癌、 宫颈癌、 肝癌、 肺 癌、 胰腺癌 ) 细胞系细胞接种于 96 孔板， 根据不同细胞系间细胞体积的差异调整接种的细 胞数， 培养过夜。所述的 Ad-PUMA( 腺病毒 -PUMA) 感染细胞前， 弃去原培养基， 用 PBS 轻轻 洗 3 遍， 加入 100l 含一定量 Ad。
19、-PUMA 的无血清 RPMI1640 培养基， 使其达到一定感染复数 (multiplicity of infection)， 即平均每个细胞中有一定数目的有感染能力的Ad-PUMA病 毒颗粒。由于每种细胞系对 Ad-PUMA 的敏感度存在差异， 各细胞系间的感染复数有所不同。 将 96 孔板放置于 37、 5 CO2孵箱培养 90min， 期间每隔 15min 十字型轻轻晃动培养皿一 次， 使病毒液分布均匀。然后不同孔中分别加入含一定浓度化疗药物的 RPMI1640 完全培养 基 ( 含 10 FBS、 100U/ml 青霉素、 0.1mg/ml 链霉素 )。所加入化疗药物的浓度的确定原则。
20、 是该化疗药物单独作用时对细胞的生长抑制率 60。其中 HeLa、 SiHa、 MGC803、 A549、 P3 细胞系中 cDDP、 taxol、 5-Fu 的浓度分别为 5M、 5nM、 10M ； BEL7402 细胞系中 5-Fu 的浓 说 明 书 CN 1981872 B4/9 页 6 度为 20M， 余同前 ； MCF-7 细胞系中 cDDP、 taxol、 5-Fu 的浓度分别为 2M、 2nM、 10M. 药 物处理72hr后采用MTT法用酶标仪检测各孔细胞的吸光度， 计算各处理组细胞生长的抑制 率。每一处理组设 3 个平行孔， 重复实验 2-3 次。 0047 结果 ： 见表。
21、 1。 0048 在不同组织类型的肿瘤细胞系中 ( 乳腺癌、 宫颈癌、 肝癌、 肺癌和胰腺癌 )， 外源 导入 PUMA 基因 (Ad-PUMA) 可增强多种不同作用机制的化疗药物 ( 如 ： 顺铂 cDDP、 紫杉醇 taxol、 五氟尿嘧啶 5-Fu 等 ) 的细胞毒作用。与低剂量的 Ad-PUMA 联用后， 化疗药物对细胞 的生长抑制率分别增长了 10.39 54.51， 其中宫颈癌细胞系 SiHa 对 Ad-PUMA 最为敏 感， 只要外源导入 2MOI 的 Ad-PUMA， 即平均每个 SiHa 细胞中有 2 个有感染能力的重组 PUMA 腺病毒颗粒， 便可显著增强各种化疗药物的细胞。
22、毒作用。 0049 表 1 0050 不同处理组细胞生长抑制率 ( ) 0051 0052 实施例二肺癌细胞系中 Ad-PUMA 与化疗药物协同作用及其机制的研究 0053 1.Ad-PUMA 显著降低 A549 肺癌细胞中不同化疗药的 IC50 0054 Ad-PUMA10MOI 感染 A549 细胞， 24hr 后用不同浓度的 Taxol、 Cisplatin、 5-FU、 Etoposide 和 Adriamycin 处理细胞， 继续培养 48hr 后采用 MTS 法检测各孔细胞的吸光度， 同时检测各化疗药单独作用的吸光度值， 以未处理细胞作为对照， 计算各处理组细胞生长 率， 计算各化。
23、疗药单独及联合 Ad-PUMA 的 IC50。每一处理组设 3 个平行孔， 重复实验 3 次。 0055 结果在 A549 肺癌细胞系中 Ad-PUMA 可显著降低各种化疗药的 IC50， 最少可将其 降至原来的 1/3(Adriamycin0.76g/ml 降至 0.22g/ml)， 最高可使 IC50 低于原来的 1/10(Taxol 和 5-FU)( 表 2)。这说明 Ad-PUMA 在各肺癌细胞系中均具有显著的化疗增敏作 用。 0056 表 2 0057 A549 细胞中化疗药单独及与 Ad-PUMA 联合作用的 IC50 说 明 书 CN 1981872 B5/9 页 7 0058 。
24、0059 2.Ad-PUMA 增强肺癌细胞系 A549 对化疗敏感性的研究 0060 采用与实施例一相同的方法获得 Ad-PUMA， 以 10MOI 的感染强度感染 A549 细胞， 24hr 后进行不同处理 Taxol ： 5nM ； 5-FU ： 5-Fluorouracil， 25g/ml ； Oxa ： Oxaliplatin， 25M ； Cis ： Cisplatin， 25M ； Etp ： Etoposide， 2M ； Adr ： Adriamycin， 0.2g/ml。 继 续 培养 48hr 后采用 MTS 法检测各孔细胞的吸光度， 以各化疗药单独作用时对细胞生长的抑 制。
25、率为参照， 计算 Ad-PUMA 与各化疗药联用后相对的细胞生长抑制倍数。并将各化疗药单 独及与 Ad-PUMA 联合作用的剂量效应趋势进行显著性检验。每一处理组设 3 个平行孔， 重 复实验 3 次。结果见附图 1A、 B， Ad-PUMA 与各化疗药联用后细胞生长抑制率是单独给予化 疗药的 2-8 倍不等。采用 GraphPadPrism IV 统计软件对剂量效应趋势图进行检验， 可见 Ad-PUMA 与各化疗药合用对细胞的生长抑制显著强于各化疗药单独作用 (P 0.05)。这表 明 Ad-PUMA 具有增强肺癌细胞系 A549 对化疗药物敏感性的作用。 0061 3. 肺癌细胞系中 Ad。
26、-PUMA 增强其化疗敏感性的机制的研究 0062 A549细胞经10MOI Ad-PUMA或感染24小时后， 加Adriamycin 0.2g/ml 后在指定时间点收集悬浮和贴壁细胞， 通过 PI 染色检测核片段化计数凋亡细胞百分比。每 次计数至少 300 个细胞， 重复试验 3 次， 取均值。如图 2A 所示， 单独用 Ad-PUMA(10 MOI) 或 Adriamycin(0.2g/ml) 处理 A549 细胞 72 小时未诱导显著的凋亡， 而二者联合处理 A549 细胞 72 小时则近 90的细胞发生凋亡。相同剂量的 Ad-BH3 联合化疗药 Adriamycin 则 未对后者诱导凋。
27、亡的能力产生影响。由此可见， BH3 结构域是 PUMA 发挥其化疗增敏作用所 必需的， 细胞中成功表达 BH3 结构域便可显著增强化疗诱导凋亡的能力。 0063 实施例三食管癌细胞系中 Ad-PUMA 与化疗药物协同作用及其机制的研究 0064 1.Ad-PUMA 抑制不同食管癌细胞系生长增殖作用的研究 0065 采用与实施例一相同的方法获得Ad-PUMA， 分别以不同感染强度(500MOI5MOI) 的 Ad-PUMA、 Ad-p53( 商品名 ：“今又生” ， 为重组人 p53 腺病毒注射液深圳市赛百诺基 因技术有限公司生产， 阳性对照 )、 Ad-GFP( 带绿色荧光蛋白基因 GFP 。
28、的腺病毒， 阴性对照 ) 感染各种食管癌细胞， 72hr 后采用 MTT 检测各孔细胞的吸光度， 计算各处理组细胞生长率。 每一处理组设 3 个平行孔， 重复实验 3 4 次。 0066 结果见附图 3。可见， 在食管癌细胞系 KYSE150、 KYSE410、 YES2、 KYSE510 中感染强 度相同， 作用时间相同时， Ad-PUMA 对细胞的生长抑制率显著高于 Ad-p53， 其中 KYSE150 细 胞对 Ad-PUMA 最为敏感， 50MOI 的 Ad-PUMA 感染细胞 72 小时便可抑制 63.73的细胞生长， 而在相同的感染时间 200MOI 的 Ad-p53 对细胞的生长。
29、抑制率只有 51.37。 0067 2. 食管癌细胞系中 Ad-PUMA 与化疗药物抑制增殖的协同作用 说 明 书 CN 1981872 B6/9 页 8 0068 采用如前所述的 MTT 法检测各种化疗药单独作用各食管癌细胞系 72hr 的 50抑 制剂量 IC50(inhibitory concentration of 50 )。然后用固定剂量的 Ad-PUMA 与各化 疗药联合作用， 计算作用72hr后在各食管癌细胞系中达到50生长抑制时的药物浓度。 固 定的 Ad-PUMA 剂量选取原则为该剂量 Ad-PUMA 单独作用 72hr 细胞生长抑制率 10。根 据公式 (combinati。
30、on index Ac/Ae+Bc/Be， Ae和 Be分别为两因素各自单独作用达到 50 生长抑制时的浓度， Ac和Bc则分别为两因素合用达到50生长抑制时的各自浓度)计算合 用指数， 该指数 1 为协同， 1 为相加， 1 为拮抗。结果见下表 3 ： 0069 表 3 0070 食管癌细胞系中 Ad-PUMA 与化疗药抑制增殖的协同作用 (IC50) 0071 0072 由此可见， 较低感染复数的 Ad-PUMA 即可显著增强各种化疗药物的敏感性， 在各 细胞系中化疗药物与 Ad-PUMA 合用后， IC50 均有不同程度的降低 (KYSE-510 中的 taxol 除 外 )。根据计算出。
31、的合用指数可以看出， Ad-PUMA 与各种化疗药均存在一定的协同作用， 并 且其中 50的合用指数 0.5， 表明协同作用十分显著。 0073 3.Ad-PUMA 与化疗药物联合抑制 KYSE-150 细胞平板集落形成 0074 采用平板集落形成实验验证Ad-PUMA与各种化疗药的协同作用， 结果见附图4。 可 见 2MOI Ad-PUMA 与小剂量化疗药 (1M cDDP、 0.5nM taxol、 2M 5-Fu) 联合作用便可显 著降低 KYSE-150 细胞的集落形成。 0075 4. 外源导入 PUMA 对细胞周期的影响 0076 收集不同处理因素作用 48hr 后的 KYSE15。
32、0 细胞， 应用 BD 公司的 FACSCalibur 流 式机， 采用 Cell Quest Mod Fit LT for Mac V3.0 分析软件检测细胞周期， 结果见附图 5， 5MOIAd-PUMA 感染细胞 48 小时细胞周期的分布与对照的相同， 2nM taxol 和 10M 5-Fu 单 说 明 书 CN 1981872 B7/9 页 9 独作用 48 小时细胞周期分别特异性的阻滞在 G2/M 期和 S 期， 而 5MOI 的 Ad-PUMA 与上述 化疗药物联合应用 48 小时， 细胞周期的分布基本与各化疗药单独作用时一致。可见， 外源 PUMA 的导入并不改变各种化疗药本身。
33、对肿瘤细胞细胞周期的影响。 0077 5.DAPI 染色法检测 Ad-PUMA 与化疗药物单独及联合作用的凋亡细胞百分比 0078 收集不同处理因素各相应时间点的细胞， 采用DAPI(4-6-Diamidino-2-phenyli ndole)染色法检测凋亡细胞百分比。 如附图6A所示， 荧光显微镜下观测DAPI染色后正常的 细胞核核膜光滑， 染色质分布均匀 ； 而凋亡的细胞染色质浓缩、 边缘化， 核膜裂解、 染色质分 割成块状、 出现凋亡小体。 根据DAPI染色后计数的凋亡细胞率曲线来看50MOIAd-PUMA感染 KYSE150 细胞 18 小时即有 50.44的细胞出现凋亡的细胞核的改变。
34、， 而 200MOI Ad-p53 感 染细胞 48 小时仅有 47.98的细胞呈现明显的凋亡的细胞核的改变 ( 见附图 6B、 C)。5MOI Ad-PUMA、 4McDDP、 2nM taxol、 10M 5-Fu单独作用细胞36小时分别有19.46、 9.62、 9.94、 13.71的细胞出现凋亡， 而当上述三种化疗药仍以相同的浓度与5MOI Ad-PUMA联 合作用36小时， 凋亡的细胞百分比则分别达到32.99、 34.72、 39.30(见附图6D)。 这 表明低感染强度的 Ad-PUMA 与化疗药联合应用便可显著增强化疗药物诱导细胞凋亡的效 果。 0079 6.RT-PCR 检。
35、测 Ad-PUMA 与小剂量化疗药物联合作用后 PUMA 的表达水平 0080 收集 5MOI Ad-PUMA 单独、 及与小剂量化疗药 (4M cDDP、 2nM taxol、 10M5-Fu) 联合作用 36hr 后的 KYSE-150 细胞， 提取总 RNA， 经逆转录后， 采用 PUMA 的特异性引物 ( 上 游 5 GTCCTCAGCCCTCGCTCT 3 下游 5 CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC 3 ) 检测 PUMA 在 mRNA 水平的改变， 结果见附图 7。可以看出， Ad-PUMA 和小剂量各种化疗药均能使细胞 PUMA mRNA 表达， 而联合作用后 PUMA 。
36、在 mRNA 水平表达增高得更加明显。 0081 实施例四 KYSE-150 裸鼠移植瘤模型证实 Ad-PUMA 与化疗药物协同作用 0082 1.KYSE-150 裸鼠移植瘤模型的建立 0083 将对数生长期的 KYSE-150 细胞消化后离心去除消化液， 用含双抗的 Hank s 液洗 2 次， 离心、 计数， 调整细胞浓度为 1107/ml， 取 200l 细胞悬液接种于裸鼠右腋下。裸鼠 共 35 只， 4 5 周鼠龄， 体重 14g 16g， 雌性。 0084 2. 移植瘤生长曲线 0085 待肿瘤长径达 5mm 7mm 时， 随机将裸鼠分为 7 组。调整 Ad-PUMA、 Ad-p5。
37、3 滴度， 使其达 21010PFU/ml， 每 3 天瘤体内注射一次， 每次 50l， 共三次。cDDP 采用腹腔注射， 按 3mg/kg 体重给药， 给药时间同腺病毒。从治疗前一天开始， 每 3 天用游标卡尺测量皮下 移植瘤的长径 (a) 和短径 (b)， 按公式计算瘤体积 V ab2/2， 绘制移植瘤的生长曲线， 见 附图 8。可见， Ad-PUMA 单独给药即可显著抑制移植瘤的生长， 联合 cDDP 后肿瘤生长更为缓 慢， 相同剂量的 Ad-p53 单独及联合 cDDP 给药抑瘤效果均不如 Ad-PUMA 明显。 0086 3. 移植瘤重量的测定 0087 在用药的第18天处死裸鼠， 。
38、剥取肿瘤组织(见附图9)， 称取瘤重， 计算抑瘤率。 详 细资料见下表 ： 0088 表 4 0089 不同处理组的瘤重及抑瘤率 说 明 书 CN 1981872 B8/9 页 10 0090 0091 从各组移植瘤的重量仍可以看出， Ad-PUMA 单独给药即可达到 48.24的抑瘤 率， 联合 cDDP 后抑瘤率可达 56.24， 与对照组相比差异十分显著， P 值分别为 0.001 和 0.001。尽管相同剂量的 Ad-p53 与 cDDP 联合给药抑瘤效果也显著 (P 0.014)， 但其抑 瘤率只有 32.68。Ad-PUMA 或 Ad-p53 与 cDDP 联合给药组与单独注射腺病。
39、毒组相比， 瘤重 差异均不显著(P值分别为0.223、 0.606)， 这可能是本研究采用的cDDP剂量低， 导致联合作 用后的效果不甚明显。 0092 实施例五肺癌细胞系中 Ad-PUMA 与放射治疗协同作用及其机制的研究 0093 1. 肺癌细胞系中 Ad-PUMA 增强其放疗敏感性的研究 0094 采用与实施例一相同的方法获得 Ad-PUMA， 以 10MOI 的感染强度感染 A549 细胞， 24hr 后接受 8Gy 的 射线照射， 。继续培养 48hr 后采用 MTS 法检测各孔细胞的吸光度， 以单独射线照射对细胞生长的抑制率为参照， 计算Ad-PUMA与放射治疗合用后相对的细 胞生。
40、长抑制倍数。每一处理组设 3 个平行孔， 重复实验 3 次。结果见附图 1A， Ad-PUMA 与放 疗联用后细胞生长抑制率是单独放疗处理 8 倍以上。这表明 Ad-PUMA 具有增强肺癌细胞系 A549 对放疗敏感性的作用。 0095 2. 肺癌细胞系中 Ad-PUMA 增强其放疗敏感性的机制的研究 0096 A549细胞经10MOI Ad-PUMA或感染24小时后， 经8Gy射线照射后在指 定时间点收集悬浮和贴壁细胞， 通过 PI 染色检测核片段化计数凋亡细胞百分比。每次计数 至少 300 个细胞， 重复试验 3 次， 取均值。如图 2B 所示， 单独用 Ad-PUMA(10 MOI) 或。
41、 射 线 (8Gy) 处理 A549 细胞 48 小时未诱导显著的凋亡， 而二者联合处理 A549 细胞 48 小时则 近70的细胞发生凋亡。 但相同剂量的Ad-BH3联合射线则未对后者诱导凋亡的能力 产生影响。由此可见， BH3 结构域是 PUMA 发挥其放疗增敏作用所必需的， 细胞中成功表达 BH3 结构域便可显著增强放疗诱导凋亡的能力。 0097 实施例六体内、 外实验证实 BH3 结构域是 PUMA 发挥其功能所必需的 0098 1.Ad-PUMA 通过诱导凋亡显著抑制各种肺癌细胞生长， 而 Ad-BH3 无效 0099 采用与实施例一相同的方法获得 Ad-PUMA， Ad-BH3( 。
42、缺少氨基酸序列为 LRRMADDLN 的 BH3 结构域， 余与 PUMA 相同 )， 分别以 100MOI 的感染强度感染 A549、 Calu 1、 128.88T、 H1299、 H1752、 DMS53 肺癌细胞。感染后 48 小时， 采用 MTS 方法检测细胞生长。以 未处理的细胞为对照， 视其生长率为 100。为阐明 Ad-PUMA、 Ad-BH3 对细胞生长抑制效 果的差异的机制， 我们在病毒感染 H1299 细胞后 48 小时用 PI( 碘化丙锭 ) 对其进行核染， 在相差显微镜和荧光显微镜下进行观察。并且于 Ad-PUMA、 Ad-BH3(100MOI) 感染 H1299 细。
43、胞 24 小时后， 进行 PI 和 Annexin V/DAPI 染色， 利用流式细胞仪检测亚 G1 期细胞百分比 说 明 书 CN 1981872 B9/9 页 11 和早期凋亡细胞百分比 (R4， 右下区 )。 0100 结果在所检测的 6 种肺癌细胞系中， 与未处理的细胞相比 Ad-PUMA 均可引起显著 的生长抑制 (60 -100 )， 而对细胞生长均无显著影响 ( 附图 10A)。Ad-PUMA 感染的细胞呈现出明显的细胞膜发泡， 染色质凝集， 核片断化等凋亡特征 ( 附图 10B)， 而 感染的细胞则不出现上述特征。细胞周期分析和 Annexin V 染色均证实 Ad-PUMA 。
44、诱导的凋亡显著， 分别为 43和 56， 相同情况下感染的细胞则分别只有 2.4 和 8的细胞出现凋亡 ( 附图 10C)。这说明外源导入 PUMA 通过诱导凋亡可显著抑制肺癌 细胞的生长， 位于 PUMA( 全长 193 个氨基酸 ) 氨基酸序列 141 至 149 位的 BH3 结构域具有 强大的促凋亡作用， 是 PUMA 发挥其促凋亡作用所必需的。 0101 2.Ad-PUMA、 Ad-p53 对 H1299 和 A549 细胞生长抑制的比较 0102 H1299和A549细胞被指定感染复数的Ad-PUMA， Ad-p53或感染(H1299细胞0、 2、 5、 10MOI ； A549细。
45、胞0、 20、 50、 100MOI)48hrs， 以未处理细胞作为对照， 采用MTS方法进行检测， 计算 Ad-PUMA、 Ad-p53、 Ad-BH3 在不同感染复数下的相对生长率。由附图 11 可见， 10MOI Ad-PUMA感染H1299后48小时， 约15的细胞存活 ； 100MOIAd-PUMA感染A549细胞后48小 时， 约 40的细胞存活。各相应剂量的 Ad-p53 对细胞生长均无显著影响， Ad-BH3 则对细 胞生长基本无影响。这表明相同剂量的 Ad-PUMA 比 Ad-p53 的疗效更显著， 而缺失 BH3 结构 域则使其功能丧失。 0103 3. 体内实验证实 BH。
46、3 结构域是 PUMA 发挥其功能所必需的 0104 为检验外源导入的 PUMA(Ad-PUMA) 及缺失 BH3 的 PUMA(Ad-BH3) 在体内是否 有抗肿瘤活性， 我们将 4106个 A549 或 H1299 肺癌细胞注射入 5-6 周龄胸腺缺失的雌性 裸鼠两侧部皮下， 当肿瘤长至 50-100mm3时开始治疗实验， 每次瘤内注射含有 5108pfu Ad-PUMA 或 Ad-BH3 的 100l PBS 溶液， 每隔一天治疗一次， 共三次。为避免不同动物间 潜在的个体差异对病毒疗效的影响， Ad-PUMA 和 Ad-BH3 被分别注射至同一只裸鼠不同侧 部的肿瘤。将第一次治疗时记为。
47、 0 天， 每 2 天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径 (a) 和短 径 (b)， 按公式计算瘤体积 V ab2/2， 绘制移植瘤的生长曲线， 见附图 12A。与单独注射 PBS 相比 Ad-BH3 对肿瘤生长无显著影响， 在治疗后的 22 天肿瘤体积达到初始体积的 8 倍。给予 Ad-PUMA 治疗的肿瘤生长缓慢， 与 Ad-BH3 相比 Ad-PUMA 抑制肿瘤生长至少达到 80 (P 0.01)。在用药的第 22 天处死裸鼠， 剥取肿瘤组织 ( 见附图 12B)， 图 12B 上半部 分显示 A549 荷瘤小鼠 Ad-PUMA 及 Ad-BH3 治疗前和治疗后 22 天的状况。 0105 。
48、我们也对 H1299 细胞建立的裸鼠移植瘤进行治疗实验， 每隔 2 天注射一次含有 5108pfu Ad-PUMA或Ad-BH3的100l PBS溶液， 共三次。 每3天测量瘤子大小， 绘制移 植瘤生长曲线， 可见 Ad-PUMA 抑制肿瘤生长达 80以上 ( 附图 12C)。在第二次注射后的 48 小时剖取肿瘤， 在荧光显微镜下观察肿瘤的冰冻切片以确定腺病毒感染效率 (GFP， 200)。 可见治疗后的肿瘤组织中GFP高表达， 提示腺病毒转导的目的基因高效表达(附图12D)。 但 高效表达 PUMA 的细胞会快速凋亡， 致使 Ad-PUMA 治疗后的肿瘤组织经 H&E 染色 (400) 显 示有大量的细胞缺失， 而在 Ad-BH3 或 PBS 处理的组织中则细胞完好 ( 附图 14D)。TUNEL 染色(TUNEL， 红色， 200 ； DAPI复染， 蓝色)表明给予Ad-PUMA治疗的肿瘤大量细胞发生凋 亡， 而用Ad-BH3或PBS处理的肿瘤组织中几乎不存在凋亡细胞(附图12D)。 这表明PUMA 能通过诱导凋亡有效抑制肿瘤的生长， 而缺失 BH3 后 PUMA 的抑瘤作用不复存在。 说 明 书 CN。