相关申请的交叉参考
根据35美国C.§119(e)本申请要求以下每个美国临时申请的优 先权权益，其中每个的公开内容在此全部引入作为参考：美国临时申 请系列No.60/616,705，发明名称为“细菌表达盒，细菌疫苗组合物 及其使用的方法”，Thomas W.Dubensky，Jr等，2004年10月6日 申请(Docket No.282173003923)；美国临时申请系列No.60/615,287， 发明名称为“细菌表达盒，细菌疫苗组合物及其使用方法”，Thomas W. Dubensky，Jr等，2004年10月1日申请(Docket No.282173003922)； 美国临时申请系列No.60/599,377，2004年8月5日申请；美国临时 申请系列No.60/556,744，2004年3月26日申请；美国临时申请系列 No.60/541,515，2004年2月2日申请；和美国临时申请系列 No.60/532,598，2003年12月24日申请。此外，该申请是以下每个 在先申请的部分继续申请，其中每个的公开内容在此全部引入作为参 考：国际申请No.PCT/US2004/23881，2004年7月23日申请；美国专 利申请系列No.10/883,599，2004年6月30日申请；美国专利申请系 列No.10/773,618，2004年2月6日申请；和美国专利申请系列 No.10/773,792，2004年2月6日申请。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明部分是在国家健康研究所给予的SBIR拨款号No.1R43 CA101421-01的政府支持下完成的。政府在本发明中可能享有一定的 权利。
发明领域
本发明总地涉及用于在重组细菌中表达多肽包括异源多肽的新的 多核苷酸和表达盒。特别地，本发明涉及用于疫苗组合物中的包括新 的表达盒和/或核酸分子的重组细菌。
发明背景
已经开始将微生物开发用作递送异源抗原的疫苗。通过已经改变 而含有编码来源于不同物种的蛋白质或抗原的核酸序列的微生物来提 供异源抗原递送。异源抗原递送对于治疗或预防尤其是由毒性或致命 来源如癌症或病原体(例如，HIV或乙型肝炎)引起的疾病或病症是 特别有利的，其中天然传感物或癌细胞的注射对受体生物体是潜在有 害的，且已经证明减毒或灭活病原体或细胞的给予在引发有效的免疫 应答中是不成功的，或其中不能肯定地保证传感物或癌细胞的充分减 毒。最近，已经将某些细菌菌株开发为重组疫苗。例如，经改变可表 达伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)环子孢子抗原的减毒的沙门氏 菌(Salmonella)的口服疫苗已经显示出能保护小鼠来对抗疟疾 (Aggarwal等，1990，J.Exp.Med.172：1083)。
单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(利斯特 氏菌属)是革兰氏阳性兼性胞内细菌，由于其通过I类和II类MHC 抗原呈递途径引发有效的CD4+/CD8+T-细胞介导的响应的能力，将其 开发用于抗原特异性疫苗中。参见，例如，美国专利No.6,051,237， 6,565,852和5,830,702。
作为刺激先天和适应性T细胞依赖性抗菌免疫性的模型已经将利 斯特氏菌研究了许多年。利斯特氏菌有效刺激细胞免疫性的能力是基 于它的胞内生活周期。一旦感染宿主，该细菌快速地被包括巨噬细胞 和树突细胞(DC)的吞噬细胞摄入吞噬溶酶体区室中。随后大部分细 菌被降解。由感染APC的吞噬体内的病原体的蛋白水解降解形成的肽 直接装载于II类MHC分子上，加工的抗原通过II类内体途径在抗原 呈递细胞表面上表达，且这些MHC II-肽复合物激活刺激抗体产生的 CD4+“辅助”T细胞。在酸性区室内，激活某些细菌基因，包括胆固 醇依赖性细胞溶素，LLO，其可以降解吞噬溶酶体，将细菌释放至宿主 细胞的胞质区室中，存活的利斯特氏菌在其中增殖。异源抗原通过I 类MHC途径的有效呈递需要由利斯特氏菌进行从头内源性蛋白质表 达。抗原呈递细胞(APC)的细胞质内，由利斯特氏菌合成和分泌的蛋 白质通过蛋白体取样并降解。通过TAP蛋白质使所得到的肽穿梭进入 内质网并装载于I类MHC分子上。将MHC I-肽复合物递送至细胞表面， 其与充分共刺激(信号2)结合激活并刺激具有关连T细胞受体的细 胞毒性T淋巴细胞(CTL)来扩充并随后识别呈现于例如肿瘤细胞上的 MHC I-肽复合物。在合适的微环境中，激活的T细胞靶向并杀灭癌细 胞。
已知利斯特氏菌通过MHC I类途径呈递异源抗原的机理，异源基 因的表达和新合成蛋白质从细菌到感染(抗原呈递)细胞细胞质中的 分泌的效率与CD8+T细胞引发和/或激活的效能直接相关。因为Ag-特 异性T细胞引发的水平与疫苗功效直接相关，所以异源蛋白质表达和 分泌的效率与疫苗功效直接相关。
因此，本领域需要新的方法来最佳化异源蛋白质表达和分泌的效 率以最大化基于利斯特氏菌的疫苗和基于其他细菌的疫苗的功效。最 佳化异源蛋白质在其中需要大量异源蛋白表达和分泌的细菌宿主表达 系统中的表达和分泌的效率也是有益的。
发明概述
本发明总地提供了新的多核苷酸，包括用于在细菌尤其是利斯特 氏菌中表达和/或分泌多肽(例如，异源多肽)的新的重组核酸分子， 表达盒，和载体。一些实施方案中，这些多核苷酸提供了多肽在细菌 中提高的表达和/或分泌。本发明总地还提供了包括重组核酸分子，表 达盒，或载体的细菌，以及包括该细菌的药物组合物，免疫原性组合 物和疫苗组合物。这些细菌和组合物可用于诱导免疫应答和治疗和/ 或预防多种疾病或其他病症，包括癌症，感染和自体免疫。
一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括编码信号肽的第一 个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳 化的，和编码多肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸，其中第二个多 核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，且其中该重组核酸 分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，第二个多 核苷酸对于在细菌如利斯特氏菌中的表达也是密码子最佳化的。本发 明还提供了包括该重组核酸分子且进一步包括可操作地连接该重组核 酸分子的启动子的表达盒。还提供了包括该重组核酸分子和/或表达盒 的载体和细菌，以及包括该细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫 苗。还提供了使用该细菌或包括该细菌的组合物来诱导免疫应答和/ 或预防或治疗宿主病症如疾病的方法。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌固 有的信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在该细菌中 的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中 第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中该重 组核酸分子编码包括该信号肽和该多肽的融合蛋白。一些实施方案中， 由第二个多核苷酸编码的多肽对信号肽是异源的。一些实施方案中， 由第二个多核苷酸编码的多肽对细菌是外源的。本发明还提供了包括 该重组核酸分子和进一步包括可操作地连接该重组核酸分子的启动子 的表达盒。还提供了包括该重组核酸分子和/或表达盒的载体和细菌， 以及包括细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了使用 该细菌或包括该细菌的组合物来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主 病症(例如，疾病)的方法。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属的细菌，其中重组核酸分子包括(a)编码信号肽的第一个多核苷酸， 其中第一个多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的， 和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一 个多核苷酸相同的翻译读框中，其中该重组核酸分子编码包括该信号 肽和该多肽的融合蛋白。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的 多肽对信号肽是异源的。一些实施方案中，该多肽对利斯特氏菌属的 细菌是外源的。一些实施方案中，该信号肽是利斯特氏菌固有的。还 提供了包括利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提 供了使用该利斯特氏菌(或包括该利斯特氏菌的组合物)来诱导免疫 应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括编码非secA1细 菌信号肽的第一个多核苷酸，和编码多肽(如抗原)的第二个多核苷 酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中， 且其中该重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施 方案中，多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，第一个和/或第二 个多核苷酸对于在细菌如利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。本 发明还提供了包括该重组核酸分子和进一步包括可操作地连接该重组 核酸分子的启动子的表达盒。还提供了包括该重组核酸分子和/或表达 盒的载体和细菌，以及包括该细菌的药物组合物，免疫原性组合物和 疫苗。还提供了使用该细菌或包括该细菌的组合物来诱导免疫应答和/ 或治疗宿主病症如疾病的方法。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属细菌，其中该重组核酸分子包括(a)编码非-secA1细菌信号肽的 第一个多核苷酸，和(b)编码与信号肽异源的或对细菌外源的多肽的 第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的 翻译读框中，其中该重组核酸分子编码包括该信号肽和该多肽的融合 蛋白。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异 源的或对细菌是外源的(即，对细菌是异源的)，或两者。还提供了 包括该利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了 使用该利斯特氏菌(或包括该利斯特氏菌的组合物)来诱导免疫应答 和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，其中该重组核酸分子 包括编码利斯特氏菌外源多肽(例如，癌症或非利斯特氏菌传染病抗 原)的多核苷酸，其中编码外源多肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌中 的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，该重组核酸分子进一步 包括位于和编码利斯特氏菌外源多肽的多核苷酸相同的翻译读框中的 编码信号肽的多核苷酸。一些实施方案中，该信号肽是利斯特氏菌细 菌固有的。其他实施方案中，该信号肽对利斯特氏菌细菌是外源的。 一些实施方案中，该编码信号肽的多核苷酸对于在该利斯特氏菌中的 表达也是密码子最佳化的。还提供了包括该重组核酸分子的利斯特氏 菌。还提供了包括该利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫 苗。此外，本发明提供了使用该重组利斯特氏菌属细菌来诱导免疫应 答和/或预防或治疗宿主病症(如，但不限于，疾病)的方法。
另一方面中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌， 其中该表达盒包括编码利斯特氏菌外源多肽(例如，癌症或非利斯特 氏菌传染病抗原)的多核苷酸和可操作地连接编码外源多肽的多核苷 酸的启动子，其中该编码外源多肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌中的 表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，该表达盒进一步包括位于 和编码利斯特氏菌外源多肽的多核苷酸相同的翻译读框中的编码信号 肽(对利斯特氏菌是天然的或外源的信号肽)的并可操作地连接启动 子的多核苷酸，使得该表达盒表达包括该信号肽和该外源多肽的融合 蛋白。一些实施方案中，该编码信号肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌 中的表达也是密码子最佳化的。还提供了包括该利斯特氏菌的药物组 合物，免疫原性组合物和疫苗。此外，本发明提供了使用该重组利斯 特氏菌属细菌来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病) 的方法。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，其中该重组核酸分子 包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b)位于 和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸， 其中该重组核酸分子编码包括该非利斯特氏菌信号肽和该多肽的融合 蛋白。本发明还提供了包括该重组核酸分子的表达盒，其中该表达盒 进一步包括可操作地连接该重组核酸分子的第一个和第二个多核苷酸 的启动子。还提供了包括该重组核酸分子和/或该表达盒的载体。此外， 还提供了包括该重组核酸分子和/或该表达盒的利斯特氏菌属细菌。还 提供了包括该利斯特氏菌属细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫 苗。还提供了使用该利斯特氏菌(或包括该利斯特氏菌的组合物)来 诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。
进一步的方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特 氏菌属细菌，其中该重组核酸分子包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽 的第一个多核苷酸，和(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中 的编码多肽的第二个多核苷酸，其中该重组核酸分子编码包括该非利 斯特氏菌信号肽和该多肽的融合蛋白。还提供了包括该利斯特氏菌的 药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了使用该利斯特氏菌(或 包括该利斯特氏菌的组合物)来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病 症(例如，疾病)的方法。
再一方面中，本发明提供了包括表达盒的利斯特氏菌属细菌(例 如，来自单核细胞增生利斯特氏菌种)，该表达盒包括编码非利斯特 氏菌信号肽的第一个多核苷酸，位于和第一个多核苷酸相同的翻译读 框中的编码多肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸，和可操作地连接 第一个和第二个多核苷酸的启动子。该表达盒编码包括该非利斯特氏 菌信号肽和该多肽的融合蛋白。一些实施方案中，第一个和/或第二个 多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。还提供了包 括该利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。此外，本发 明提供了使用该重组利斯特氏菌属细菌来诱导免疫应答和/或预防或 治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。
本发明还提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌自溶素或其催 化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第 二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻 译读框中，其中该重组核酸分子编码包括由第二个多核苷酸编码的多 肽和自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其中， 在蛋白质嵌合体中，多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 融合或位于自溶素或其催化活性片段或催化活性变体内。还提供了包 括该重组核酸分子和/或表达盒的载体和细菌，以及包括该细菌的药物 组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了使用该细菌或包括该细菌 的组合物来诱导免疫应答和/或治疗宿主病症如疾病的方法。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，其中该核酸分子编码 至少两个离散非利斯特氏菌多肽。本发明进一步提供了包括该重组核 酸并进一步包括启动子的表达盒，其中启动子可操作地连接该重组核 酸分子。进一步提供了包括该重组核酸分子和/或表达盒的载体。此外， 还提供了包括该重组核酸分子(和/或该表达盒)的重组利斯特氏菌属 细菌。还提供了包括该利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和 疫苗。此外，还提供了使用该利斯特氏菌(或包括该利斯特氏菌的组 合物)来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方 法。
另一方面中，本发明提供了包括多顺反子表达盒的重组利斯特氏 菌属细菌，其中该多顺反子表达盒编码至少两个离散非利斯特氏菌多 肽。还提供了包括该利斯特氏菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫 苗。此外，还提供了使用该利斯特氏菌(或包括该利斯特氏菌的组合 物)来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。
其他方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码信号肽 的第一个多核苷酸，(b)编码分泌蛋白或其片段的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，和(c) 编码分泌蛋白或其片段的异源多肽的第三个多核苷酸，其中第三个多 核苷酸位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框中，其中该 重组核酸分子编码包括信号肽，由第三个多核苷酸编码的多肽，和分 泌蛋白或其片段的蛋白质嵌合体，且其中，在蛋白质嵌合体中，由第 三个多核苷酸编码的多肽与分泌蛋白或其片段融合，或位于分泌蛋白 或其片段内。还提供了包括该重组核酸分子并进一步包括可操作地连 接该重组核酸分子的第一个，第二个和第三个多核苷酸的启动子的表 达盒。还提供了包括该重组核酸分子和/或表达盒的载体和细菌，以及 包括该细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了使用该 细菌或包括该细菌的组合物来诱导免疫应答和/或预防或治疗宿主病 症的方法。
一些实施方案中，诱导宿主对抗原的免疫应答的方法包括将有效 量的包括在此(例如，在上述任一方面中，或在以下发明详述或实施 例中)所述的重组细菌的组合物给予宿主，其中由该细菌中重组核酸 分子，表达盒和/或载体编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，预防 或治疗宿主病症如疾病的方法包括将有效量的包括在此所述的重组细 菌的组合物给予宿主。
本发明进一步提供了在此(例如，在上述任一方面中，或在以下 发明详述或实施例中)所述的重组细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫 应答的药物中的用途，其中由该细菌中重组核酸分子，表达盒和/或载 体编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，该抗原是异源抗原。本发 明还提供了在此所述的重组细菌在制造预防或治疗宿主病症(例如， 疾病如癌症或传染病)的药物中的用途。本发明进一步提供了在此所 述的重组细菌用于诱导宿主对抗原的免疫应答，其中由该细菌中重组 核酸分子，表达盒和/或载体编码的多肽包括抗原。本发明进一步提供 了在此所述的重组细菌用于预防或治疗宿主病症(如疾病)。
另外的方面中，本发明提供了在宿主细菌中表达和分泌异源蛋白 质的改良方法。
还提供了制备包括上述每个重组核酸分子和表达盒的细菌的方 法。还提供了使用该细菌来生产疫苗的方法。
本发明进一步提供了编码信号肽和/或抗原的多种多核苷酸，包括 对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的多核 苷酸。
附图
图1显示了单核细胞增生利斯特氏菌DP-L4056(SEQ ID NO：1)(底 部序列)和EGD菌株(SEQ ID NO：2)(顶部序列)的hly启动子比对。
图2显示了编码包括LLO信号肽，LLO PEST序列和全长人EphA2 抗原的融合蛋白的多核苷酸的序列(SEQ ID NO：3)。
图3显示了由图2所示的多核苷酸编码的融合蛋白的序列(SEQ ID NO：4)。
图4显示了编码人EphA2胞外结构域(EX2)的天然核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图5显示了对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密码 子最佳化的编码人EphA2胞外结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图6显示了人EphA2胞外结构域(EX2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。
图7显示了编码包括LLO信号肽，LLO PEST序列和人EphA2胞外 结构域的融合蛋白的非密码子最佳化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图8显示了由图7中所示的编码序列编码的融合蛋白的序列(SEQ ID NO：9)。
图9显示了包括hly启动子和编码包括LLO信号肽，LLO PEST序 列和人EphA2胞外结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：10)。该 序列中，编码人EphA2胞外结构域的序列对于在单核细胞增生利斯特 氏菌中的表达是密码子最佳化的。
图10显示了由图9的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。
图11显示了包括hly启动子和编码包括LLO信号肽，LLO PEST 序列和人EphA2胞外结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：12)。 该序列中，编码LLO信号肽，LLO PEST序列和人EphA2胞外结构域的 序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经全部是密码子最佳 化的。
图12显示了由图11的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。
图13显示了包括hly启动子和编码包括phoD Tat信号肽和人 EphA2胞外结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：14)。该序列中， 编码phoD Tat信号肽和人EphA2胞外结构域的序列对于在单核细胞增 生利斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。
图14显示了由图13的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
图15显示了编码人EphA2胞内结构域(CO)的天然核苷酸序列(SEQ ID NO：16)。
图16显示了对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密 码子最佳化的编码人EphA2胞内结构域的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。
图17显示了人EphA2胞内结构域(EX2)的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。
图18显示了编码包括LLO信号肽，LLO PEST序列和人EphA2胞 内结构域的融合蛋白的非密码子最佳化的多核苷酸序列(SEQ ID NO：19)。
图19显示了由图18中所示的编码序列编码的融合蛋白的序列 (SEQ ID NO：20)。
图20显示了包括hly启动子和编码包括LLO信号肽，LLO PEST 序列和人EphA2胞内结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：21)。 该序列中，编码人EphA2胞内结构域的序列对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达是密码子最佳化的。
图21显示了由图20的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。
图22显示了包括hly启动子和编码包括LLO信号肽，LLO PEST 序列和人EphA2胞内结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：23)。 该序列中，编码LLO信号肽，LLO PEST序列和人EphA2胞内结构域的 序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经全部是密码子最佳 化的。
图23显示了由图22的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。
图24显示了包括hly启动子和编码包括phoD Tat信号肽和人 EphA2胞内结构域的融合蛋白的表达盒(SEQ ID NO：25)。该序列中， 编码phoD Tat信号肽和人Eph2A胞内结构域的序列对于在单核细胞利 斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。
图25显示了由图24的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图26显示了包括hly启动子和编码包括LLO信号肽和NY-ESO-1 抗原的融合蛋白的密码子最佳化的表达盒(SEQ ID NO：27)。编码信 号肽和抗原的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子 最佳化的。
图27显示了由图26的表达盒编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。
图28显示了包括可操作地连接密码子最佳化的Usp45信号肽编码 序列的hly启动子的多核苷酸(SEQ ID NO：29)。
图29显示了包括可操作地连接p60信号肽天然编码序列的hly 启动子的多核苷酸(SEQ ID NO：30)。
图30显示了包括可操作地连接密码子最佳化的p60信号肽编码序 列的hly启动子的多核苷酸(SEQ ID NO：31)。
图31显示了hlyP-p60基因片段的序列(SEQ ID NO：32)。
图32(包括图32A，32B和32C)显示了pAM401-MCS的序列(SEQ ID NO：33)，pAM401-MCS是来自pPL2载体的包含多克隆位点(MCS) 的pAM401质粒。
图33显示了对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密 码子最佳化的人间皮素(间皮素)的编码序列(SEQ ID NO：34)。
图34显示了人间皮素的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)。
图36显示了鼠间皮素的编码序列(SEQ ID NO：36)，其对于在单 核细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。
图37显示了来自编码天然Eph2A CO结构域序列的重组利斯特氏 菌的分泌蛋白的蛋白质印迹分析。
图38显示了来自编码与密码子最佳化EphA2 EX2结构域序列融合 的天然或密码子最佳化LLO secA1信号肽的重组利斯特氏菌的分泌蛋 白的蛋白质印迹分析。
图39显示了来自编码与密码子最佳化EphA2 CO结构域序列融合 的天然或密码子最佳化LLO secA1信号肽或密码子最佳化Tat信号肽 的重组利斯特氏菌的分泌蛋白的蛋白质印迹分析。
图40显示了用编码全长天然EphA2序列的pCDNA4质粒DNA转染 后48小时293细胞的裂解物的蛋白质印迹分析。
图41是显示了用编码OVA.AH1或OVA.AH1-A5的重组利斯特氏菌 免疫带有CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小鼠能够长期存活的 图解。
图42是显示了用编码与密码子最佳化EphA2 EX2结构域序列融合 的密码子最佳化secA1信号肽的重组利斯特氏菌免疫时提高了带有 CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小鼠存活的图解。
图43是显示了用编码EphA2 CO结构域的重组利斯特氏菌免疫带 有CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小鼠能够长期存活的图解。
图44是显示了用编码EphA2 CO结构域的重组利斯特氏菌但没有 用编码全长EphA2的质粒DNA免疫带有CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤 的Balb/C小鼠能够长期存活的图解。
图45是显示了表达hEphA2的利斯特氏菌引发EphA2特异性CD8+T 细胞响应的图解。
图46是显示了CD4+和CD8+T细胞响应有助于表达hEphA2的利斯 特氏菌的hEphA2定向的抗肿瘤功效的图解。
图47显示了单核细胞增生利斯特氏菌菌株10403S的可操作地连 接炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原信号肽的hly启动子的 序列(SEQ ID NO：38)，对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的分泌是 密码子最佳化的。在信号肽序列的羧基端包括对应于Bam HI限制酶识 别位点的六个另外的核苷酸(5’-GGATCC-3’)，有助于在框内可操作 地连接任何选定的编码序列。hly启动子的5’端包含单一Kpn I限制 酶识别位点。
图48显示了来自重组利斯特氏菌的全长人肿瘤抗原的有效表达 和分泌。图48A显示了间皮素表达/分泌，使用包括与使用天然密码子 的人间皮素融合的LLO信号肽的构建体。图48B显示了间皮素表达/ 分泌，使用包括与对于在利斯特氏菌中表达是密码子最佳化的人间皮 素融合的各种信号肽的构建体。图48C显示了NY-ESO-1的表达/分泌， 使用包括与人间皮素密码子最佳化的NY-ESO-1融合的密码子最佳化 LLO信号肽的构建体。
图49显示了phEphA2 KD的编码序列(SEQ ID NO：39)。
图50显示了包含actA-plcB基因间隔区的密码子最佳化的人 EphA2的Mlu I子片段(SEQ ID NO：40)。
图51显示了hly启动子-70N-末端p60氨基酸的序列(SEQ ID NO：41)。
图52显示了质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)的KpnI-BamHI子 片段(SEQ ID NO：42)。
图53显示了质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素的 KpnI-BamHI子片段(SEQ ID NO：43)。
图54显示了质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素 ΔSP/ΔGPI的KpnI-BamHI子片段(SEQ ID NO：44)。
图55显示了来自包括抗原-细菌蛋白嵌合体的重组利斯特氏菌的 抗原的表达和分泌的蛋白质印迹分析。
图56显示了来自双顺反子信息的EphA2胞内结构域(ICD)的表 达的蛋白质印迹分析。
图57显示了在不同细菌部分中证明的作为与各种密码子最佳化 信号肽的N-端融合的函数基于质粒的鼠间皮素表达和分泌的蛋白质 印迹分析：分泌的蛋白质(图57A)；细胞壁(图57B)；和细胞裂解 物(图57C)。
图58显示了单核细胞增生利斯特氏菌中基于染色体的人间皮素 的表达和分泌的蛋白质印迹分析。显示了各种细菌细胞部分中间皮素 表达的蛋白质印迹分析，和来自对照利斯特氏菌(不编码间皮素)和 编码所示信号序列表达的间皮素的利斯特氏菌的结果。
图59A和59B是显示了异源抗原(AH1-A5)通过利斯特氏菌疫苗 递送至MHC I类途径的图解。利斯特氏菌疫苗包括表达p60-AH1-A5 蛋白质嵌合体(包埋于p60中的AH1-A5)的利斯特氏菌(图59A)或 表达包括LLO信号肽和AH1-A5的融合蛋白的利斯特氏菌(图59B)。
图60A和60B是显示了利斯特氏菌疫苗介导的细菌特异性抗原至 MHC I类途径的递送的图解，其中该疫苗包括表达p60-AH1-A5蛋白质 嵌合体(包埋于p60中的AH1-A5)的利斯特氏菌(图60A)或表达包 括LLO信号肽和AH1-A5的融合蛋白的利斯特氏菌(图60B)，且其中 加入基于细胞的测定中的测试肽为无测试肽(未刺激的)(图60A)， LLO91-99(图60A)，无测试肽(图60B)或p60217-225(图60B)。
图61是显示了表达人间皮素的利斯特氏菌在接种疫苗的带有肿 瘤的动物中的治疗功效的图解，其中将肿瘤细胞工程化以表达人间皮 素。
图62是显示了在接种了表达人间皮素的利斯特氏菌的带有肿瘤 的小鼠中肺肿瘤结节水平降低的图解，其中将肿瘤细胞工程化以表达 人间皮素。
图63是显示了使用CT.26亲本靶细胞的对照研究的图解，即，细 胞没有工程化以表达人间皮素，证明了Lm-Meso疫苗接种的抗肿瘤功 效是间皮素特异性的。
图64是显示了接种了表达密码子最佳化人间皮素的利斯特氏菌 减小了肿瘤体积的图解。
图65显示了表明利斯特氏菌ΔactA/ΔinlB-h间皮素菌株的免疫 原性的ELISPOT实验的结果，其中编码人间皮素的核酸已被整合至利 斯特氏菌的基因组中。
发明详述
I.导言
本发明提供了多种多核苷酸，包括用于在细菌如利斯特氏菌中表 达和/或分泌多肽包括异源多肽(例如，抗原和/或哺乳动物蛋白)的 重组核酸分子，表达盒和表达载体。一些实施方案中，这些多核苷酸 可以用于提高细菌中多肽的表达和/或分泌。一些表达盒包括密码子最 佳化的多肽和/或信号肽的编码序列。此外，一些用于细菌中的表达盒 包含源自其他细菌来源的和/或来自多种不同分泌途径的信号肽序列。 还提供了包括表达盒的细菌，以及包括该细菌的组合物，如疫苗。还 提供了使用该多核苷酸，细菌和组合物来诱导免疫应答和/或预防或治 疗宿主病症如疾病(例如，癌症)的方法。
本发明部分地基于以下的发现：表达盒中信号肽序列的密码子最 佳化可提高异源多肽(如抗原)在重组细菌中的表达和/或分泌(尤其 是与该异源多肽的密码子最佳化结合)，甚至在信号肽序列是细菌固 有的时候(参见，例如，以下的实施例19和27)。此外，已经发现 来自非-secA1分泌途径的信号肽序列和/或来自非利斯特氏菌来源的 信号肽序列也可以用于实现异源多肽在利斯特氏菌中的有效表达和/ 或分泌(参见，例如，以下的实施例19，27和30)。本发明还部分 基于以下另外的发现：异源多肽编码序列的密码子最佳化可提高利斯 特氏菌中异源多肽的表达和/或分泌(参见，例如，以下的实施例19)。 也已经表明通过表达盒的最佳化获得的异源蛋白质提高的表达和/或 分泌导致包括最佳化表达盒的细菌的提高的免疫原性(参见，例如， 以下的实施例20)。此外，已经表明编码包括包埋于自溶素内的异源 抗原的蛋白质嵌合体的表达盒可用于实现利斯特氏菌中异源抗原的有 效表达和分泌(参见，例如，以下的实施例29)。还已经表明了自溶 素蛋白质嵌合体是免疫原性的(参见，例如，以下的实施例31A)。 此外，也已经表明了包括密码子最佳化的表达盒的利斯特氏菌和/或包 括非利斯特氏菌信号肽的表达盒在小鼠模型中是免疫原性的，减小了 肿瘤体积并提高了存活(参见，例如，以下的实施例31B-E)。
因此，一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括编码信号肽 的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码 子最佳化的，和编码多肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸，其中第 二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，且其中重组 核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，第二 个多核苷酸也是密码子最佳化的(通常用于在和第一个多核苷酸相同 类型的细菌中表达)。一些实施方案中，第一个多核苷酸或第一个和 第二个多核苷酸对于在利斯特氏菌属，芽孢杆菌属(Bacillus)，鼠 疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)，沙门氏菌属(Salmonella)，志 贺氏菌属(Shigella)，布鲁氏菌属(Brucella)，分枝杆菌或大肠 杆菌(E.coli)中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，多核 苷酸对于在利斯特氏菌属如单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码 子最佳化的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽是(或 包括)抗原，在一些情况中，其可以是非细菌的抗原。例如，在一些 实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自这样的肿瘤相关抗原。例如， 一些实施方案中，抗原是K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素， PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。例如，一些实施方案中，抗原 是间皮素，或间皮素的抗原片段或抗原变体。一些其他实施方案中， 抗原是NY-ESO-1，或NY-ESO-1的抗原片段或抗原变体。一些实施方 案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方案中，信号 肽是细菌的(利斯特氏菌的或非利斯特氏菌的)。一些实施方案中， 由密码子最佳化的第一个多核苷酸编码的信号肽是细菌固有的。其他 实施方案中，由密码子最佳化的第一个多核苷酸编码的信号肽对细菌 是外源的。一些实施方案中，信号肽是secA1信号肽，如来自单核细 胞增生利斯特氏菌的LLO信号肽，来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Usp45信号肽，或来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽。 一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽。例如，信号肽可以是来自 单核细胞增生利斯特氏菌的p60信号肽。此外，重组核酸分子任选地 包括编码p60或其片段的多核苷酸序列，位于和第一个以及第二个多 核苷酸相同的翻译读框中，其中第二个多核苷酸位于第三个多核苷酸 内或第一个和第三个多核苷酸之间。另外的实施方案中，信号肽是Tat 信号肽，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)Tat信号肽(例如，PhoD)。 本发明还提供了包括重组核酸分子且进一步包括可操作地连接重组核 酸分子(例如，连接第一个和第二个多核苷酸(以及第三个多核苷酸， 如果存在的话))的启动子的表达盒。还提供了包括该表达盒的表达 载体和重组细菌(例如，利斯特氏菌)，以及包括该细菌的药物组合 物，免疫原性组合物和疫苗。还提供了使用该细菌或包括该细菌的组 合物来诱导免疫应答和/或预防或治疗病症如疾病的方法。还提供了该 细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由第二 个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
第二方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌固 有的信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在该细菌中 的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中 第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组 核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，第二 个多核苷酸与第一个多核苷酸是异源的。一些实施方案中，多肽对信 号肽是其所固有的细菌是外源的。一些实施方案中，由第二个多核苷 酸编码的多肽与信号肽是异源的，对细菌是外源的，或两者。一些实 施方案中，产生信号肽的细菌是胞内细菌。一些实施方案中，细菌选 自利斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺 氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌和大肠杆菌。一些实施方案中，细菌 是利斯特氏菌属细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)。一些实施 方案中，第二个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的。一 些实施方案中，第一个和/或第二个多核苷酸的密码子最佳化提高了所 编码融合蛋白在细菌中的表达和/或从细菌中的分泌(相对于非密码 子最佳化的序列)。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽 包括抗原。由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。一些实施方案中， 抗原是非细菌抗原。一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或包括源 自肿瘤相关抗原的抗原。一些实施方案中，抗原选自K-Ras，H-Ras， N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100， PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自选自 K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1， 存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或 CEA的抗原。例如，一些实施方案中，抗原是间皮素，或其抗原片段 或变体，或是NY-ESO-1，或其抗原片段或变体。一些备选的实施方案 中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方案中，信号肽 是secA1信号肽(例如，来自单核细胞增生利斯特氏菌的LLO信号肽)。 一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽(例如，单核细胞增生利斯 特氏菌的p60信号肽)。还提供了包括该重组核酸分子且进一步包括 可操作地连接重组核酸分子的第一个和第二个多核苷酸的启动子的表 达盒。还提供了包括该表达盒的表达载体。还提供了包括该重组核酸 分子的重组细菌，其中第一个多核苷酸对于在重组细菌中的表达是密 码子最佳化的。一些实施方案中，重组细菌是胞内细菌。一些实施方 案中，重组细菌选自利斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶尔森氏菌， 沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌和大肠杆菌。一些 实施方案中，细菌是重组利斯特氏菌属细菌(例如，重组的单核细胞 增生利斯特氏菌)。还提供了包括该重组细菌的免疫原性组合物，其 中由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。还提供了诱导宿主对抗原的 免疫应答的方法，包括将有效量的包括重组细菌的组合物给予患者， 其中由第二个多核苷酸编码的多肽是(或包括)抗原。还提供了该细 菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由第二个 多核苷酸编码的多肽包括抗原。
第三方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的利斯特氏菌属细 菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)，其中该重组核酸分子包括(a) 编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在利斯特氏 菌属细菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核 苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中， 其中该重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方 案中，由第二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方 案中，重组核酸分子是进一步包括可操作地连接第一个和第二个多核 苷酸的启动子的表达盒的一部分。换句话说，一些实施方案中，该重 组利斯特氏菌属细菌包括含有该重组核酸分子的表达盒，其中该表达 盒进一步包括可操作地连接重组核酸分子的第一个和第二个多核苷酸 的启动子。一些实施方案中，表达盒是多顺反子表达盒。一些实施方 案中，第二个多核苷酸对于在利斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最 佳化的。一些实施方案中，第一个和/或第二个多核苷酸的密码子最佳 化提高了所编码的融合蛋白在利斯特氏菌属细菌中的表达和/或从利 斯特氏菌属细菌中的分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。一些实 施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外源 的(即，与利斯特氏菌属细菌是异源的)。一些实施方案中，由第二 个多核苷酸编码的多肽包括抗原(例如，非利斯特氏菌抗原或非细菌 抗原)。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。一 些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。一些实施 方案中，抗原选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA的抗原。例如，一些实施方案 中，抗原是间皮素，或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗 原是人间皮素。一些实施方案中，抗原是缺失其信号肽和GPI连接域 的人间皮素。一些备选的实施方案中，抗原是NY-SEO-1，或其抗原片 段或抗原变体。一些备选的实施方案中，抗原是传染病抗原或是源自 传染病抗原的抗原。一些实施方案中，信号肽是非利斯特氏菌的。一 些实施方案中，信号肽是细菌的。一些实施方案中，信号肽对利斯特 氏菌属细菌是外源的。其他实施方案中，信号肽是利斯特氏菌固有的。 一些实施方案中，信号肽是secA1信号肽(例如，来自单核细胞增生 利斯特氏菌的LLO信号肽，来自乳酸乳球菌的Usp45信号肽，和来自 炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽)。一些实施方案中，信号肽是 secA2信号肽(例如，来自单核细胞增生利斯特氏菌的p60信号肽)。 一些实施方案中，信号肽是Tat信号肽(例如，来自枯草芽孢杆菌的 PhoD信号肽)。一些实施方案中，利斯特氏菌属细菌是减毒的。例如， 可以将利斯特氏菌减毒用于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞或 增殖。一些实施方案中，重组利斯特氏菌属细菌是缺乏ActA， Internalin B，或ActA和Internalin B两者的(例如，ΔactAΔinlB 双缺失突变体)。一些实施方案中，重组利斯特氏菌属细菌缺乏功能 性ActA，Internalin B，或ActA和Internalin B两者。一些实施方 案中，重组细菌的核酸已经通过与核酸靶向化合物(例如，补骨脂素 化合物)反应被修饰。本发明还提供了包括重组利斯特氏菌属细菌和 药物学可接受载体的药物组合物，以及包括重组利斯特氏菌属细菌的 免疫原性组合物，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。本发明 还提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的疫苗。还提供了诱导宿主对抗 原的免疫应答的方法，包括将有效量的包括该重组细菌的组合物给予 宿主，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是(或包括)抗原。还提供 了预防或治疗宿主病症(例如，疾病如癌症或传染病)的方法，包括 将有效量的包括该重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主。还提供 了该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由 第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
第四方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括编码非secA1细 菌信号肽的第一个多核苷酸和编码多肽(例如，抗原)的第二个多核 苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中， 且其中该重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施 方案中，第一个多核苷酸和/或第二个多核苷酸对于在特定类型细菌中 的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一个和/或第二个多核 苷酸的密码子最佳化提高了融合蛋白在细菌中的表达和/或从细菌中 的分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。一些实施方案中，第一个 多核苷酸和/或第二个多核苷酸对于在利斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠 疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌或 大肠杆菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，多核苷酸对 于在利斯特氏菌属如单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳 化的。一些实施方案中，由密码子最佳化的第一个多核苷酸编码的信 号肽是密码子最佳化的细菌固有的。一些实施方案中，编码信号肽的 第一个多核苷酸与第二个多核苷酸是异源的。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，由第二个多核 苷酸编码的多肽是抗原，在一些情况中，其可以是非细菌抗原。一些 实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自这样的肿瘤相关抗原。例如， 在一些情况中，抗原是K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素， PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。例如，一些实施方案中，抗原 是间皮素，或间皮素的抗原片段或抗原变体。一些其他实施方案中， 抗原是NY-ESO-1，或NY-SEO-1的抗原片段或抗原变体。一些实施方 案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方案中，由重 组核酸分子的第一个多核苷酸编码的信号肽是利斯特氏菌的。其他实 施方案中，信号肽是非利斯特氏菌的。一些实施方案中，信号肽源自 革兰氏阳性细菌。一些实施方案中，信号肽源自属于芽孢杆菌属，葡 萄球菌属(Staphylococcus)或乳球菌属的细菌。一些实施方案中， 信号肽是secA2信号肽。例如，信号肽可以是来自单核细胞增生利斯 特氏菌的p60信号肽。此外，重组核酸分子任选地包括编码p60或其 片段的第三个多核苷酸，位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻 译读框中，其中第二个多核苷酸位于第三个多核苷酸内或在第一个和 第三个多核苷酸之间。另外的实施方案中，信号肽是Tat信号肽，如 枯草芽孢杆菌Tat信号肽(例如，枯草芽孢杆菌PhoD信号肽)。本发 明还提供了包括重组核酸分子且进一步包括可操作地连接重组核酸分 子的第一个和第二个多核苷酸的启动子的表达盒。还提供了包括该表 达盒和/或重组核酸分子的表达载体和细菌，以及包括该细菌的药物组 合物，免疫原性组合物和疫苗。一些实施方案中，包括该表达盒或重 组核酸分子的重组细菌是胞内细菌。一些实施方案中，细菌是选自利 斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌 属，布鲁氏菌属，分枝杆菌或大肠杆菌的细菌。一些实施方案中，细 菌是利斯特氏菌属细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌种的成员)。 一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽对细菌是外源的(即， 与细菌是异源的)。还提供了使用该细菌或包括该细菌的组合物来诱 导免疫应答和/或预防或治疗宿主病症(例如，疾病)的方法。一些实 施方案中，病症是癌症。其他实施方案中，病症是传染病。还提供了 该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由第 二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属细菌，其中重组核酸分子包括(a)编码非secA1细菌信号肽的第一 个多核苷酸，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷 酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸分子编码 包括信号肽和多肽的融合蛋白，一些实施方案中，由第二个多核苷酸 编码的多肽与信号肽是异源的或对细菌是外源的，或两者。一些实施 方案中，利斯特氏菌属细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。一些实 施方案中，重组核酸分子是表达盒的一部分，该表达盒进一步包括可 操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子。换句话说，一些实施 方案中，重组利斯特氏菌属细菌包括含有重组核酸分子的表达盒，其 中该表达盒进一步包括可操作地连接重组核酸分子的第一个和第二个 多核苷酸的启动子。一些实施方案中，表达盒是多顺反子表达盒。一 些实施方案中，第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个和第二 个多核苷酸两者对于在利斯特氏菌属细菌(例如，单核细胞增生利斯 特氏菌)中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一个和/ 或第二个多核苷酸的密码子最佳化提高了融合蛋白在该细菌中的表达 和/或从该细菌中的分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。一些实施 方案中，由第一个和第二个多核苷酸是彼此异源的。一些实施方案中， 由第二个多核苷酸编码的多肽和信号肽是彼此异源的。一些实施方案 中，由第二个多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外源的(即， 与利斯特氏菌属细菌是异源的)。一些实施方案中，由第二个多核苷 酸编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的 多肽是抗原(例如，非利斯特氏菌或非细菌抗原)。一些实施方案中， 抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。一些实施方案中，抗原选 自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1， 存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或 CEA，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA的抗原。例如，一些实施方案中，抗原是间皮素， 或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗原是人间皮素。一些 实施方案中，抗原是缺失其信号肽和GPI连接域的人间皮素。一些备 选的实施方案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方 案中，信号肽是非利斯特氏菌的。一些实施方案中，非secA1信号肽 是利斯特氏菌信号肽。其他实施方案中，非secA1信号肽是非利斯特 氏菌信号肽。一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽(例如，来自 单核细胞增生利斯特氏菌的p60信号肽)。一些实施方案中，包括secA2 信号肽的重组核酸分子进一步包括编码secA2自溶素(例如，p60或 N-乙酰胞壁酸酶)或其片段(例如，催化活性片段)的第三个多核苷 酸，位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框中，其中第二 个多核苷酸位于重组核酸分子的第三个多核苷酸内或第一个和第三个 多核苷酸之间。一些实施方案中，第二个多核苷酸位于第三个多核苷 酸内。一些实施方案中，信号肽是Tat信号肽。一些实施方案中，信 号肽是源自枯草芽孢杆菌的Tat信号肽(例如，来自枯草芽孢杆菌的 PhoD信号肽)。一些实施方案中，利斯特氏菌是减毒的。例如，可以 将利斯特氏菌减毒用于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞中或增 殖。一些实施方案中，重组利斯特氏菌是缺乏ActA，Internalin B， 或ActA和Internalin B两者的(例如，ΔactΔAin1B双缺失突变体)。 一些实施方案中，重组利斯特氏菌属细菌是缺乏ActA，Internalin B， 或ActA和Interfalin B两者的(例如，ΔactAΔin1B双缺失突变体)。 一些实施方案中，重组细菌的核酸已经通过与核酸靶向化合物(例如， 补骨脂素化合物)反应被修饰。本发明还提供了包括重组利斯特氏菌 属细菌和药物学上可接受载体的药物组合物。本发明还提供了包括重 组细菌的免疫原性组合物，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。 本发明还提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的疫苗。还提供了诱导宿 主对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的含有重组细菌的组合物 给予宿主，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是(或包括)抗原。还 提供了预防或治疗宿主病症(例如，疾病如癌症或传染病)的方法， 包括将有效量的含有重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主。还提 供了细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由 第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括编码利斯特氏菌属细菌外源多肽 (如抗原，如癌症抗原或非利斯特氏菌抗原)的多核苷酸的重组核酸 分子，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。 一些实施方案中，多核苷酸的密码子最佳化提高了多肽在利斯特氏菌 属细菌中的表达和/或从利斯特氏菌属细菌中的分泌(相对于非密码子 最佳化的序列)。一些实施方案中，外源多肽包括抗原。一些实施方 案中，外源多肽是抗原。一些实施方案中，抗原是非细菌抗原。例如， 一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自这样的肿瘤相关抗原。 一些实施方案中，多肽是K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素， PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。一些实施方案中，抗原是间皮 素，或间皮素的抗原片段或抗原变体。一些其他实施方案中，抗原是 NY-ESO-1，或NY-ESO-1的抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗 原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方案中，重组核酸分子 进一步包括编码位于和外源多肽相同的翻译读框中的信号肽的多核苷 酸，使得重组核酸分子编码包括信号肽和外源多肽的融合蛋白。一些 实施方案中，编码信号肽(其对利斯特氏菌可以是或不是天然的)的 多核苷酸对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化 的。本发明进一步提供了包括重组核酸分子且进一步包括可操作地连 接重组核酸分子的第一个和第二个多核苷酸的启动子的表达盒。还提 供了包括重组核酸分子和/或表达盒的载体(例如，表达载体)。本发 明还提供了包括重组核酸分子和/或表达盒的重组利斯特氏菌属细菌。 一些实施方案中，利斯特氏菌属细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。 还提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的药物组合物，免疫原性组合物 和疫苗。本发明进一步提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包 括将有效量的含有重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予患者，其中多 肽是(或包括)抗原。此外，本发明提供了使用重组利斯特氏菌属细 菌来诱导免疫应答和/或预防或治疗病症(例如，疾病)的方法。还提 供了该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中 外源多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌， 其中表达盒包括编码利斯特氏菌属细菌外源多肽(如抗原，如癌症抗 原或非利斯特氏菌抗原)的多核苷酸和可操作地连接编码外源多肽的 多核苷酸的启动子，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码 子最佳化的。一些实施方案中，利斯特氏菌属细菌属于单核细胞增生 利斯特氏菌种。一些实施方案中，多核苷酸的密码子最佳化提高了多 肽在利斯特氏菌属细菌中的表达和/或多肽从利斯特氏菌属细菌中的 分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。一些实施方案中，外源多肽 包括抗原。一些实施方案中，外源多肽是抗原，在一些情况中，其可 以是非细菌抗原。例如，一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源 自这样的肿瘤相关抗原。例如，一些实施方案中，多肽是K-Ras，H-Ras， N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100， PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras， H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素， gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。一些 实施方案中，抗原是间皮素，或间皮素的抗原片段或抗原变体。一些 其他实施方案中，抗原是NY-ESO-1，或NY-ESO-1的抗原片段或抗原 变体。一些实施方案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些 实施方案中，表达盒进一步包括可操作地连接启动子的且位于和外源 多肽相同的翻译读框中的编码信号肽的多核苷酸，使得表达盒编码包 括信号肽和外源多肽的融合蛋白。一些实施方案中，编码信号肽(其 对于利斯特氏菌可以是或不是天然的)的多核苷酸对于在单核细胞增 生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。还提供了包括重组利斯特 氏菌属细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。本发明进一步提 供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的含有重组利 斯特氏菌属细菌的组合物给予患者。此外，本发明提供了使用该重组 利斯特氏菌属细菌来诱导免疫应答和/或预防或治疗病症(例如，疾病) 的方法。还提供了该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中 的用途，其中外源多肽包括抗原。
另外的方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏 菌属细菌(例如单核细胞增生利斯特氏菌)，其中重组核酸分子包括 (a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸；和(b)位于和第 一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸，其中 重组核酸分子编码包括非利斯特氏菌信号肽和多肽的重组蛋白。一些 实施方案中，重组核酸分子位于进一步包括可操作地连接第一个和第 二个多核苷酸的启动子的表达盒内。因此，一些实施方案中，重组利 斯特氏菌属细菌包括含有重组核酸分子的表达盒，其中表达盒进一步 包括可操作地连接重组核酸分子的第一个和第二个多核苷酸的启动 子。一些实施方案中，该表达盒是多顺反子表达盒(例如，双顺反子 表达盒)。一些实施方案中，第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或 第一个和第二个多核苷酸两者对于在利斯特氏菌(例如，单核细胞增 生利斯特氏菌)中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一 个和/或第二个多核苷酸的密码子最佳化提高了融合蛋白在细菌中的 表达和/或融合蛋白从细菌中的分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。 一些实施方案中，第一个和第二个多核苷酸是彼此异源的。一些实施 方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽和信号肽是彼此异源的。一些 实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外 源的(即，与利斯特氏菌属细菌是异源的)。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸编码的多肽包括抗原(例如，非利斯特氏菌抗原)。一 些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。一些实施方案 中，抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。一些实施方案中，抗 原选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1， WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP 或CEA，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA的抗原。例如，一些实施方案中，抗原是间皮素， 或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗原是人间皮素。一些 实施方案中，抗原是缺失其信号肽和GPI连接域的人间皮素。一些备 选的实施方案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方 案中，信号肽是细菌的。一些实施方案中，信号肽源自胞内细菌。一 些实施方案中，信号肽源自革兰氏阳性细菌。一些实施方案中，信号 肽来自属于芽孢杆菌属，葡萄球菌属或乳球菌属的细菌(例如，炭疽 芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或乳酸乳球菌)。一些实 施方案中，信号肽是seaA1信号肽(例如，来自乳酸乳球菌的Usp45 信号肽或来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽)。一些实施方案中， 信号肽是secA2信号肽。一些实施方案中，信号肽是Tat信号肽(例 如，来自枯草芽孢杆菌的PhoD信号肽)。一些实施方案中，利斯特氏 菌属细菌是减毒的。例如，一些实施方案中，将利斯特氏菌减毒用于 细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞中或增殖。一些实施方案中， 重组利斯特氏菌属细菌是缺乏ActA，Internalin B，或ActA和 Internalin B两者的(例如，ΔactaΔin1B双缺失突变体)。一些实 施方案中，重组利斯特氏菌是缺乏功能性ActA，Internalin B，或ActA 和Internalin B两者。一些实施方案中，重组细菌的核酸已经通过与 核酸靶向化合物(例如，补骨脂素化合物)反应被修饰。本发明还提 供了包括重组利斯特氏菌属细菌和药物学上可接受载体的药物组合 物。本发明还提供了包括该重组细菌的免疫原性组合物，其中由第二 个多核苷酸编码的多肽是抗原。本发明还提供了包括重组利斯特氏菌 属细菌的疫苗。还提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括将 有效量的含有重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主，其中由第二 个多核苷酸编码的多肽是(或包括)抗原。还提供了预防或治疗宿主 病症(例如疾病，如癌症或传染病)的方法，包括将有效量的含有重 组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主。还提供了该细菌在制造诱导 宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由第二个多核苷酸编码 的多肽包括抗原。
再一方面中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌 (例如，来自单核细胞增生利斯特氏菌种)，该表达盒包括编码非利 斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸，位于和第一个多核苷酸相同的翻 译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸，和可操作地连接第一个和第 二个多核苷酸的启动子。该表达盒编码包括非利斯特氏菌信号肽和多 肽的融合蛋白。一些实施方案中，将利斯特氏菌属细菌减毒用于细胞 与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞中或增殖。一些实施方案中，第一 个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个和第二个多核苷酸对于在利 斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一个和/ 或第二个多核苷酸的密码子最佳化提高了所编码的融合蛋白在该细菌 中的表达和/或从该细菌中的分泌(相对于非密码子最佳化的序列)。 一些实施方案中，第一个多核苷酸和/或第二个多核苷酸对于在单核细 胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，由 第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，由第二个多 核苷酸编码的多肽是抗原，在一些情况中，其是非细菌抗原。例如， 一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自这样的肿瘤相关抗原。 例如，一些实施方案中，抗原是K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras，H-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。例如，一些实施方案中，抗原 是间皮素，或间皮素抗原片段或抗原变体。一些其他实施方案中，抗 原是NY-ESO-1，或NY-ESO-1的抗原片段或抗原变体。一些实施方案 中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。优选实施方案中，信号肽 是细菌的。一些实施方案中，信号肽来自属于芽孢杆菌属，葡萄球菌 属或乳球菌属的细菌。例如，一些实施方案中，信号肽来自炭疽芽孢 杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或乳酸乳球菌。一些实施方案 中，信号肽是secA1信号肽，如来自乳酸乳球菌的Usp45信号肽，或 来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽。一些实施方案中，信号肽是 secA2信号肽。另外的实施方案中，信号肽是Tat信号肽，如枯草芽 孢杆菌Tat信号肽(例如，PhoD)。还提供了包括在此所述的重组利 斯特氏菌属细菌的药物组合物，免疫原性组合物和疫苗。此外，本发 明提供了使用重组利斯特氏菌属细菌来诱导免疫应答和/或预防或治 疗病症如疾病的方法。还提供了该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫 应答的药物中的用途，其中由第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
本发明进一步提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌自溶素或 其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸；和(b)编码多肽 的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同 的翻译读框内，其中重组核酸分子编码包括由第二个多核苷酸编码的 多肽和自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其 中在蛋白质嵌合体中，多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变 体融合，或位于自溶素或其催化活性片段或催化活性变体内。一些实 施方案中，第一个多核苷酸编码细菌自溶素。一些实施方案中，蛋白 质嵌合体具有和自溶素一样的催化活性。一些实施方案中，细菌自溶 素来自胞内细菌(例如，利斯特氏菌)。一些实施方案中，细菌自溶 素是利斯特氏菌自溶素。一些实施方案中，编码多肽的第二个多核苷 酸位于编码自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷 酸内，且重组核酸分子编码其中多肽位于自溶素或其催化活性片段或 催化活性变体内的蛋白质嵌合体(即，多肽包埋于自溶素或其催化活 性片段或变体内)。一些备选的实施方案中，第二个多核苷酸位于编 码自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸之外， 且重组核酸分子编码其中多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性 变体融合的蛋白质嵌合体。一些实施方案中，多肽与自溶素是异源的。 一些实施方案中，第一个多核苷酸和第二个多核苷酸是彼此异源的。 一些实施方案中，重组核酸分子进一步包括(c)位于和第一个以及第 二个多核苷酸相同的翻译读框中的编码信号肽的第三个多核苷酸，其 中重组核酸分子编码包括信号肽，由第二个多核苷酸编码的多肽，和 自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体。一些实施 方案中，信号肽是secA2信号肽(如p60)。一些实施方案中，信号 肽实际上是与自溶素相关的信号肽(例如，信号肽是p60且自溶素是 p60)。一些实施方案中，自溶素是secA2依赖性自溶素。一些实施方 案中，自溶素是肽聚糖水解酶(例如，N-乙酰胞壁酸酶或p60)。一 些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。一些实施方 案中，多肽是抗原(例如，肿瘤相关抗原，源自肿瘤相关抗原的抗原， 传染病抗原，或源自传染病抗原的抗原)。一些实施方案中，抗原选 自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1， 存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或 CEA，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA的抗原。例如，一些实施方案中，抗原是间皮素， 或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗原是人间皮素。一些 实施方案中，抗原是缺失其信号肽和GPI锚的人间皮素。本发明还提 供了包括重组核酸分子且进一步包括可操作地连接重组核酸分子的第 一个和第二个多核苷酸的启动子的表达盒，以及包括该表达盒的表达 载体。本发明进一步提供了包括重组核酸分子的重组细菌。一些实施 方案中，重组细菌是胞内细菌，如利斯特氏菌属细菌(例如，单核细 胞增生利斯特氏菌)。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多 肽对重组细菌是外源的。还提供了包括(a)重组细菌和(b)药物学 上可接受载体的药物组合物。此外，还提供了包括重组细菌的免疫原 性组合物，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。还提供了包括 重组细菌的疫苗，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。本发明 还提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括将有效量的含有重 组细菌的组合物给予宿主，其中由第二个多核苷酸编码的多肽是(或 包括)抗原。还提供了预防或治疗宿主病症的方法，包括将有效量的 含有重组细菌的组合物给予宿主。还提供了该细菌在制造诱导宿主对 抗原的免疫应答的药物中的用途，其中由第二个多核苷酸编码的多肽 包括抗原。
再一方面中，本发明提供了包括多顺反子表达盒的重组利斯特氏 菌属细菌，其中多顺反子表达盒编码至少两个离散非利斯特氏菌多肽。 例如，一些实施方案中，表达盒包括编码第一个非利斯特氏菌多肽的 第一个多核苷酸，编码第二个非利斯特氏菌多肽的第二个多核苷酸， 和可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子。一些实施方案中， 表达盒进一步包括第一个和第二个多核苷酸之间的基因间序列。一些 实施方案中，多顺反子表达盒是双顺反子表达盒，其编码两个离散非 利斯特氏菌多肽。一些实施方案中，重组利斯特氏菌属细菌属于单核 细胞增生利斯特氏菌种。一些实施方案中，由多顺反子表达盒编码的 至少一个非利斯特氏菌多肽包括抗原。一些实施方案中，至少两个非 利斯特氏菌多肽各自包括相同抗原的片段。一些实施方案中，抗原是 肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。例如，一些实施方案中，抗原是 选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1， WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP 或CEA的抗原，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮 素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA的抗原。一些实施方案中，抗原是间皮 素，或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案中，抗原是人间皮素。 一些实施方案中，抗原是缺失其信号肽和GPI锚的人间皮素。一些实 施方案中，抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。一些实施方案中， 由多顺反子表达盒编码的至少一个非利斯特氏菌多肽包括信号肽(利 斯特氏菌信号肽或非利斯特氏菌信号肽)。一些实施方案中，信号肽 是secA1信号肽。一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽。其他实 施方案中，信号肽是Tat信号肽。一些实施方案中，表达盒包括编码 信号肽的多核苷酸，其中编码信号肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌中 的表达是密码子最佳化的。本发明还提供了包括(a)重组利斯特氏菌 属细菌和(b)药物学上可接受载体的药物组合物。还提供了包括重组 利斯特氏菌属细菌的免疫原性组合物。还提供了包括重组利斯特氏菌 属细菌的疫苗。还提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括将 有效量的含有重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主，其中至少一 个非利斯特氏菌多肽包括抗原。还提供了预防或治疗宿主病症的方法， 包括将有效量的含有重组利斯特氏菌属细菌的组合物给予宿主。还提 供了该细菌在制造诱导宿主对抗原的免疫应答的药物中的用途，其中 由多顺反子表达盒编码的至少一个非利斯特氏菌多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码信号肽 的第一个多核酸分子，(b)编码分泌蛋白或其片段的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框内，和(c) 编码与分泌蛋白或其片段异源的多肽的第三个多核苷酸，其中第三个 多核苷酸位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框内，其中 重组核酸分子编码包括信号肽，由第三个多核苷酸编码的多肽和分泌 蛋白或其片段的蛋白质嵌合体，且其中在蛋白质嵌合体中，由第三个 多核苷酸编码的多肽与分泌蛋白或其片段融合，或位于分泌蛋白或其 片段内。一些实施方案中，分泌蛋白是天然分泌蛋白(即，从其天然 细胞中分泌的蛋白质)。一些实施方案中，在重组核酸分子中，第三 个多核苷酸位于第二个多核苷酸内，且在由重组核酸分子编码的蛋白 质嵌合体中，由第三个多核苷酸编码的多肽位于分泌蛋白或其片段内。 一些实施方案中，在重组核酸分子中，第三个多核苷酸位于第二个多 核苷酸之外，且在蛋白质嵌合体中，由第三个多核苷酸编码的多肽与 分泌蛋白或其片段融合。还提供了包括重组核酸分子且进一步包括可 操作地连接重组核酸分子的第一个，第二个和第三个多核苷酸的启动 子的表达盒。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽包括抗 原。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽是抗原。例如， 一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原(例如， 选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1， WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP 或CEA的抗原，或源自选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮 素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA的抗原)。一些实施方案中，抗原是间 皮素，或其抗原片段或抗原变体。例如，一些实施方案中，抗原是人 间皮素或缺失了其信号肽和GPI锚的人间皮素。备选的实施方案中， 抗原是传染病抗原或源自传染病抗原。还提供了包括表达盒的表达载 体。还提供了包括重组核酸分子的重组细菌。还提供了重组利斯特氏 菌属细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)，且在一些实施方案中， 由第三个核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外源的。本发明还 提供了包括该重组细菌的免疫原性组合物，其中由第三个多核苷酸编 码的多肽是抗原。还提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括 将有效量的含有该重组细菌的组合物给予宿主，其中由第三个多核苷 酸编码的多肽是(或包括)抗原。还提供了包括该细菌的药物组合物 和疫苗，以及使用该重组细菌或包括该细菌的组合物来预防或治疗宿 主病症的方法。还提供了该细菌在制备诱导宿主对抗原的免疫应答的 药物中的用途，其中由第三个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
另外的方面中，本发明提供了在宿主细菌中表达和分泌异源蛋白 的改进方法。本发明还提供了提高异种蛋白在细菌中的表达和分泌的 方法。本发明进一步提供了制备在此所述的重组核酸分子，表达盒， 表达载体和重组细菌的方法。
本发明还提供了用于最佳化异源多核苷酸在细菌如利斯特氏菌中 的表达的多种多核苷酸。
应当理解马库什组，马库什权利要求或通过“或符号组”中所述 的实施方案，包括每个分开的实施方案，每个分开的实施方案的组合， 以及由所有的每个分开的实施方案组成的或包括它们的发明，除非另 外明确地或通过上下文规定。
以下提供了本发明上述方面和实施方案的进一步描述以及本发明 的其他实施方案和方面。
II.重组核酸分子
本发明提供了用于在细菌如利斯特氏菌中表达多核苷酸如异源多 核苷酸的多种多核苷酸。例如，提供了包括信号肽(或包括信号肽的 多肽)编码序列和多肽如异源抗原编码序列新组合的重组核酸分子。 提供了包括密码子最佳化多核苷酸序列的重组核酸分子。一些实施方 案中，这些重组核酸分子是异源的，因为它们包括不是天然发现的多 核苷酸(即，多核苷酸序列)，其彼此结合作为相同核酸分子的一部 分。一些实施方案中，重组核酸分子是分离的。一些实施方案中，重 组核酸分子位于细菌内的表达盒，表达载体，质粒DNA，和/或甚至细 菌的基因组DNA(插入后)的序列中。一些实施方案中，重组核酸分 子提供了多肽(例如，异源多肽)在细菌内提高的表达和/或分泌。
一些实施方案中，重组核酸分子是DNA。一些实施方案中，重组 核酸分子是RNA。一些实施方案中，重组核酸是单链的。其他实施方 案中，重组核酸是双链的。
一些实施方案中，在此所述的重组核酸分子编码融合蛋白如包括 信号肽和另一个多肽如与信号肽异源的多肽的融合蛋白。一些实施方 案中，信号肽是细菌信号肽。应当理解所述融合蛋白的多肽组分可以， 但无需必定直接彼此融合。一些实施方案中，融合蛋白的多肽组分可 以由一个或多个间插氨基酸序列在多肽序列上隔开。一些实施方案中， 另一个多肽是非细菌的，例如，哺乳动物的或病毒的。
例如，一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码信 号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是 密码子最佳化的；和(b)编码多肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中 重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。另外的实施方案中， 第二个多核苷酸(编码多肽如抗原的多核苷酸)对于在细菌中的表达 也是密码子最佳化的。其中第一个和/或第二个多核苷酸是密码子最佳 化的细菌应当是其中预期放置重组核酸分子类型的细菌。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌所 固有的信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中 的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中 第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组 核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，由第 二个多核苷酸与第一个多核苷酸是异源的。一些实施方案中，多肽与 信号肽是其所固有的细菌是异源的(即，对细菌是外源的)。一些实 施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的，对细菌 是外源的，或两者。一些实施方案中，产生信号肽的细菌是胞内细菌。 一些实施方案中，细菌选自利斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶尔森 氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌和大肠杆菌。 一些实施方案中，信号肽是利斯特氏菌属细菌固有的。一些实施方案 中，信号肽是属于单核细胞增生利斯特氏菌种的利斯特氏菌属细菌固 有的。一些实施方案中，第二个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码 子最佳化的。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，其中重组核酸分子包 括(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在利 斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二 个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译 读框中，其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些 实施方案中，信号肽是利斯特氏菌属细菌固有的。另一些实施方案中， 信号肽对利斯特氏菌属细菌是外源的。一些实施方案中，信号肽与由 第二个多核苷酸编码的多肽是异源的。一些实施方案中，由第二个多 核苷酸编码的多肽与利斯特氏菌是异源的。一些实施方案中，利斯特 氏菌属细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。
本发明还提供了重组核酸分子，包括编码利斯特氏菌属细菌外源 多肽(例如，癌症或非利斯特氏菌传染病抗原)的多核苷酸，其中编 码外源多肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最 佳化的。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，包括(a)编码非secA1 细菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽如抗原的第二个多核 苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框内， 其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案 中，非secA1细菌信号肽是secA2信号肽或Tat信号肽。一些实施方 案中，编码非secA1信号肽的第一个多核苷酸对于在其中预期放置重 组核酸分子的细菌(例如，利斯特氏菌)中的表达是密码子最佳化的。 一些实施方案中，编码多肽如抗原的第二个多核苷酸对于在其中预期 放置重组核酸分子的细菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案 中，由第二个多核苷酸编码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案 中，由第二个多核苷酸编码的多肽对其中待掺入或已经掺入重组核酸 分子的细菌是外源的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多 肽对其中待掺入或已经掺入重组核酸分子的细菌是外源的且由第二个 多核苷酸编码的多肽与信号肽也是异源的。
本发明进一步提供了重组核酸分子，包括编码非secA1细菌信号 肽的第一个多核苷酸，编码多肽(例如，异源蛋白质和/或抗原)的第 二个多核苷酸，和编码SecA2自溶素或其片段的第三个多核苷酸，其 位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框内，其中第二个多 核苷酸位于第三个多核苷酸内或在第一个和第三个多核苷酸之间。一 些实施方案中，重组核酸分子编码包括信号肽，多肽和自溶素的融合 蛋白。一些实施方案中，自溶素的片段具有和自溶素一样的催化活性。 一些实施方案中，自溶素来自胞内细菌。一些实施方案中，自溶素是 肽聚糖水解酶。一些实施方案中，细菌自溶素是利斯特氏菌自溶素。 一些实施方案中，自溶素是p60。一些实施方案中，自溶素是N-乙酰 胞壁酸酶。
本发明还提供了重组核酸分子，其中重组核酸分子包括(a)编码 非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸；和(b)编码多肽的第二个多 核苷酸，其位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸 分子编码包括非利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案 中，非利斯特氏菌信号肽与由第二个多核苷酸编码的多肽是异源的。 一些实施方案中，第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个和第 二个多核苷酸两者对于在利斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化 的。
本发明还提供了重组核酸分子，包括(a)编码细菌自溶素或其催 化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第 二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻 译读框中，其中重组核酸分子编码包括由第二个多核苷酸编码的多肽 和自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其中， 在蛋白质嵌合体中，多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 融合，或位于自溶素或其催化活性片段或催化活性变体内。一些实施 方案中，第二个多核苷酸位于第一个多核苷酸内，且重组核酸分子编 码其中由第二个多核苷酸编码的多肽位于自溶素或其催化活性片段或 催化活性变体内的蛋白质嵌合体。一些实施方案中，第二个多核苷酸 位于第一个多核苷酸之外，且重组核酸分子编码其中由第二个多核苷 酸编码的多肽与自溶素或其催化活性片段或其催化活性变体融合的蛋 白质嵌合体。一些实施方案中，第一个多核苷酸编码自溶素。一些实 施方案中，重组核酸分子进一步包括(c)编码信号肽的第三个多核苷 酸，其位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重 组核酸分子编码包括信号肽，由第二个多核苷酸编码的多肽和自溶素 或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体。一些实施方案中， 由第二个多核苷酸编码的多肽与自溶素是异源的。一些实施方案中， 自溶素的片段为至少约30，至少约40，至少约50，或至少约100个 氨基酸长。一些实施方案中，自溶素来自胞内细菌。一些实施方案中， 细菌自溶素是利斯特氏菌自溶素。自溶素的催化活性变体包括因一个 或多个替换，缺失，添加，和/或插入而不同于原始自溶素的变体。一 些实施方案中，自溶素是肽聚糖水解酶。一些实施方案中，自溶素是 p60。一些实施方案，自溶素是N-乙酰胞壁酸酶。
可以通过信号识别蛋白体的受体来鉴定并表征其他的自溶素，这 是本领域技术人员已知的技术(参见，例如，Lenz等(2003)Proc.Nat1. Acad.Sci.USA 100：12432-12437)。信号识别蛋白体的受体还可以 用于测定给定的自溶素片段和/或变体是否具有和自溶素一样的活性。 还可以使用该技术来评定特定蛋白质嵌合体是否具有和自溶素一样的 催化活性。
一些实施方案中，自溶素的催化活性片段和/或变体作为自溶素具 有至少约10％，至少约30％，至少约50％，至少约75％，至少约90％， 或至少约95％的天然自溶素的催化活性。
一些实施方案中，蛋白质嵌合体具有和自溶素一样的催化活性。 一些实施方案中，蛋白质嵌合体作为自溶素具有至少约10％，至少约 30％，至少约50％，至少约75％，至少约90％，或至少约95％的天然自溶 素的催化活性。
用于异源蛋白质表达的另一个选项是使用其中“框内”功能性插 入异源蛋白质的蛋白“支架”。该组合物中，将整个基因或对应于例 如I类MHC或II类MHC抗原决定部位的基因组分插入支架蛋白内并贯 穿支架蛋白。支架蛋白可以是高度表达的细菌蛋白(如利斯特氏菌蛋 白，如LLO或p60)，但另一实施方案中，可以是针对其高度表达， 稳定性，分泌，和/或(缺乏)免疫原性选择的异源蛋白质。支架蛋白 的代表性实例是鸡卵清蛋白，或其他人蛋白质，如β-球蛋白或清蛋白。
本发明还提供了重组核酸分子，包括(a)编码信号肽的第一个多 核苷酸，(b)编码分泌蛋白或其片段的第二个多核苷酸，其中第二个 多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，和(c)编码与分 泌蛋白或其片段异源的多肽的第三个多核苷酸，其中第三个多核苷酸 位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸 分子编码包括信号肽，由第二个多核苷酸编码的多肽，和分泌蛋白或 其片段的蛋白质嵌合体，且其中在蛋白质嵌合体中，多肽与分泌蛋白 或其片段融合，或位于分泌蛋白或其片段内。一些实施方案中，第二 个多核苷酸编码分泌蛋白。一些实施方案中，分泌蛋白是从其天然细 胞分泌的蛋白。一些实施方案中，第三个多核苷酸位于重组核酸分子 中的第二个多核苷酸内，且在由重组核酸分子编码的蛋白质嵌合体中， 由第三个多核苷酸编码的多肽位于分泌蛋白或其片段内。一些实施方 案中，第三个多核苷酸位于核酸分子中的第二个多核苷酸之外，且在 蛋白质嵌合体中，由第三个多核苷酸编码的多肽与分泌蛋白或其片段 融合。一些实施方案中，分泌蛋白是卵清蛋白。一些实施方案中，使 用截短形式的卵清蛋白。一些实施方案中，分泌蛋白是p60。一些实 施方案中，分泌蛋白是N-乙酰胞壁酸酶。一些实施方案中，信号肽是 通常与分泌蛋白相关的信号肽。一些实施方案中，信号肽与分泌蛋白 是异源的。一些实施方案中，分泌蛋白的片段是至少约30，至少约40， 至少约50，或至少约100个氨基酸长。
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒或表达载体包括细菌外 源多肽的编码序列，其包埋于在细菌内高度表达的蛋白质的部分或整 个编码序列中。一些实施方案中，高度表达的序列是其中待表达该序 列的细菌固有的。其他实施方案中，高度表达的序列不是其中待表达 该序列的细菌固有的，但是仍然提供了足够的表达。
另一方面中，本发明提供了重组核酸分子，其中该核酸分子编码 至少两个离散非利斯特氏菌多肽。一些实施方案中，编码非利斯特氏 菌多肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化 的。
制备包括上述那些的重组核酸分子的方法是本领域普通技术人员 公知的。例如，可以通过在使其彼此重叠的DNA合成仪上合成长寡核 苷酸且然后进行延伸反应和/或PCR来产生所需量的双链DNA来制备重 组核酸分子。可以用限制酶来切割双链DNA并将其插入所需的表达或 克隆载体中。可以进行测序来核实已经获得了正确的序列。另外，作 为非限制性实例，重组核酸分子的一个或多个部分可以从含有该部分 的质粒获得。可以进行质粒相关部分的PCR和/或质粒相关部分的限制 酶切除，接着进行连接和/或PCR使相关的多核苷酸结合以产生所需的 重组核酸分子。这样的技术是本领域中标准的。也可以使用标准克隆 技术将重组核酸序列插入质粒中并在宿主细胞如细菌中复制该重组核 酸。然后可以从宿主细胞分离该重组核酸。
本发明还提供了使用在此所述的任何重组核酸分子来产生重组细 菌(例如，重组利斯特氏菌属细菌)的方法。一些实施方案中，使用 在此所述的重组核酸分子制造重组细菌的方法包括将重组核酸分子引 入细菌中。一些实施方案中，将重组核酸分子整合至细菌的基因组中。 一些其他实施方案中，重组核酸分子在掺入细菌中的质粒上。一些实 施方案，通过接合将重组核酸分子掺入细菌中。可以通过本领域中已 知的任何标准技术来实现进入细菌的引入。例如，可以通过接合，转 导(转染)或转化来将重组核酸分子并入细菌中。
III.信号肽
一些实施方案中，本发明的重组核酸分子，表达盒和/或载体编码 包括信号肽并适于在宿主细胞如细菌中表达或从宿主细胞如细菌中分 泌的融合蛋白或蛋白质嵌合体。因此，一些实施方案中，本发明的重 组核酸分子，表达盒和/或载体包括编码信号肽的多核苷酸。
术语“信号肽”和“信号序列”在此可交替使用。一些实施方案 中，信号肽有助于促进与信号肽融合的多肽穿过细胞(例如，细菌细 胞)的细胞膜的运送，使得多肽从细胞中分泌出来。因此，一些实施 方案中，信号肽是“分泌信号肽”或“分泌序列”。一些实施方案中， 信号肽位于待分泌多肽的N-末端。
一些实施方案中，重组核酸分子或表达盒中编码信号肽的序列位 于重组核酸分子或表达盒内，使得编码的信号肽实现与其融合的多肽 从所需的宿主细胞(例如，细菌)中的分泌。一些实施方案中，在重 组核酸分子或表达盒中，编码信号肽的多核苷酸位于编码待分泌多肽 (例如，包括抗原的多肽)的多核苷酸的5’端框内(直接或由间插 多核苷酸来隔开)。
一些实施方案中，作为由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体编 码的融合蛋白和/或蛋白质嵌合体一部分的信号肽与融合蛋白和/或蛋 白质嵌合体中的至少一种其他的多肽序列是异源的。一些实施方案中， 由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体编码的信号肽对其中待引入或 已经引入重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的细菌是异源的(即， 外源的)。一些实施方案中，信号肽是其中待引入重组核酸分子，表 达盒和/或表达载体的细菌固有的。
一些实施方案中，编码信号肽的多核苷酸对于在细菌(例如，利 斯特氏菌，如单核细胞增生利斯特氏菌)中的表达是密码子最佳化的。 一些实施方案中，对于特定细菌是密码子最佳化的多核苷酸对细菌是 外源的。其他实施方案中，对于特定细菌是密码子最佳化的多核苷酸 是细菌固有的。
多种信号肽是本领域中已知的。此外，可以用来预测信号肽序列 的各种算法和软件程序，如“SignalP”算法，是本领域可获得的。例 如，参见：Antelmann等，Genome Res.，11：1484-502(2001)；Menne 等，Bioinformatics，16：741-2(2000)；Nielsen等，Protein Eng.， 10：1-6(1997)；Zhang等，Protein Sci.，13：2819-24(2004)； Bendtsen等，J.Mol.Biol.，340：783-95(2004)(关于Signal P3.0)； Hiller等，Nucleic Acids Res.，32：W375-9(2004)；Schneider 等，Proteomics 4：1571-80(2004)；Chou，Curr.Protein Pept.Sci.， 3：615-22(2002)；Shah等，Bioinformatics，19：1985-96(2003)； 和Yuan等，Biochem.Biophys.Res.Commun.312：1278-83(2003)。
一些实施方案中，信号肽是原核生物的。一些实施方案中，信号 肽是真核生物的。真核生物信号肽用于在大肠杆菌中表达蛋白质的用 途描述于Humphreys等，Protein Expression and Purification(蛋 白质表达和纯化)，20：252-264(2000)。
一些实施方案中，信号肽是细菌信号肽，一些实施方案中，信号 肽是非利斯特氏菌信号肽。一些实施方案中，信号肽是利斯特氏菌信 号肽。一些实施方案中，信号肽源自革兰氏阳性细菌。一些实施方案 中，信号肽源自胞内细菌。
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒或表达载体中所用的信 号肽(例如，非secA1细菌信号肽)源自利斯特氏菌。一些实施方案 中，该信号肽源自单核细胞增生利斯特氏菌。一些实施方案中，信号 肽是来自单核细胞增生利斯特氏菌的信号肽。一些实施方案中，信号 肽不是源自利斯特氏菌，而是源自属于利斯特氏菌属细菌以外的细菌。 一些实施方案中，细菌信号肽源自芽孢杆菌属细菌。一些实施方案中， 细菌信号肽源自枯草芽孢杆菌。一些实施方案中，细菌信号肽源自属 于葡萄球菌属的细菌。一些实施方案中，细菌信号肽源自乳球菌属细 菌。一些实施方案中，细菌信号肽源自芽孢杆菌属，葡萄球菌属或乳 球菌属细菌。一些实施方案中，细菌信号肽是源自炭疽芽孢杆菌，枯 草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或乳酸乳球菌的信号肽。一些实施方案 中，细菌信号肽是源自炭疽芽孢杆菌的信号肽。一些实施方案中，细 菌信号肽是源自枯草芽孢杆菌的信号肽。一些实施方案中，细菌信号 肽是源自乳酸乳球菌的信号肽。一些实施方案中，细菌信号肽是来自 金黄色葡萄球菌的信号肽。
在此所述的多核苷酸的一些实施方案中，源自生物体如细菌的信 号肽，与从生物体获得的天然产生的信号肽序列是相同的。其他实施 方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体编码的信号肽序列源 自天然产生的信号肽序列，即天然产生的信号肽序列的片段和/或变 体，其中该片段或变体仍然起信号肽的作用。变体包括因一个或多个 替换，缺失，添加和/或插入而不同于原始序列的多肽。例如，一些实 施方案中，由多核苷酸编码的信号肽包含一个或多个保守突变。可能 的保守氨基酸改变是本领域普通技术人员公知的。关于保守氨基酸改 变的附加信息，参见，例如，以下详述的第IV部分。
源自另一种信号肽的信号肽(即，另一种信号肽的片段和/或变体) 优选基本上等同于原始信号肽。例如，源自另一种信号肽的信号肽超 信号肽作用的能力应当基本上没有受到对原始信号肽序列进行的改变 (缺失，突变等)的影响。一些实施方案中，衍生的信号肽至少约70％， 至少约80％，至少约90％，或至少约95％能和天然信号肽序列一样起信 号肽的作用。一些实施方案中，该信号肽与原始信号肽具有至少约 70％，至少约80％，至少约90％，或至少约95％的氨基酸同一性。一些 实施方案中，在信号肽序列中进行的最适当的改变是保守氨基酸替换。 信号肽的片段优选是原始信号肽长度的至少约80％或至少约90％。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或表达载体中的多核 苷酸编码的信号肽是secA1信号肽，secA2信号肽或双精氨酸转运 (Tat)信号肽。一些实施方案中，信号肽是secA1信号肽。一些实施 方案中，信号肽是非secA1信号肽。一些实施方案中，信号肽是secA2 信号肽。一些实施方案中，信号肽是双精氨酸转运(Tat)信号肽。一 些实施方案中，这些secA1，secA2或Tat信号肽源自利斯特氏菌。一 些实施方案中，这些secA1，secA2或Tat信号肽是非利斯特氏菌的。 例如，一些实施方案中，secA1，secA2或Tat信号肽源自属于以下属 之一的细菌：芽孢杆菌属，葡萄球菌属或乳球菌属。
细菌利用不同的蛋白质分泌途径，包括secA1，secA2或双-精氨 酸转运(Tat)。利用哪种途径主要是由位于前蛋白N-末端的信号肽 序列的类型来决定的。大部分分泌蛋白利用Sec途径，其中蛋白质以 未折叠的构象通过包埋于细菌膜的蛋白质Sec孔转运。相反，利用Tat 途径的蛋白质以折叠的构象分泌。编码对应于这些蛋白质分泌途径中 任一种的信号肽的核苷酸序列可以遗传上编码与所需异源蛋白编码序 列框内融合。信号肽最好在其羧基末端包含信号肽酶切割位点用于将 真空的所需蛋白质释放至胞外环境中(Sha rkov和Cai.2002 J. Biol.Chem.277：5796-5803；Nielsen等，1997 Protein Engineering 10：1-6；和，www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。
本发明多核苷酸中所用的信号肽不仅可以源自不同的分泌途径， 而且可以源自不同的细菌属。信号肽通常具有共同的结构构造，具有 带电荷的N-端(N-结构域)，疏水核心区域(H-结构域)和多极性C- 末端区域(C-结构域)，然而，它们没有显示出序列保守性。一些实 施方案中，信号肽的C-结构域携带I型信号肽酶(SpaseI)切割位点， 具有共有序列A-X-A，在相对于切割位点-1和-3的位置。通过sec途 径分泌的蛋白质具有平均28个残基的信号肽。SecA2蛋白质分泌途径 首先发现于单核细胞增生利斯特氏菌；secA2形似物(paralogue)中 突变体的特征为在琼脂培养基上粗糙的菌落表型，和在小鼠中减毒的 毒力表型(Lenz和Portnoy，2002 Mol.Microbiol.45：1043-1056； 和Lenz等，2003 PNAS 100：1432-12437)。与通过Tat途径分泌的 蛋白质有关的信号肽具有与Sec信号肽相似的分成三部分的构造，但 其特征在于具有RR-基序(R-R-X-#-#，其中#是疏水性残基)，位于 N-结构域/H-结构域边界。细菌Tat信号肽平均比sec信号肽长14个 氨基酸。枯草芽孢杆菌分泌蛋白组(secretome)可以包含多达69个 利用Tat分泌途径的推定蛋白质，其中14个包含Spase I切割位点 (Jongbloed等，2002 J Biol.Chem.277：44068-44078；Thalsma 等，2000 Microbiol.Mol.Biol.Rev.64：515-547)。
以下表1中所示的是信号肽的非限制性实例，这些信号肽可以用 于具有选定的其他多肽如异源多肽的融合组合物(包括蛋白质嵌合体 组合物)中，导致所编码的蛋白质从细菌中分泌出来。
表1.一些示例信号肽
分泌 途径 信号肽氨基酸序列 (NH2-CO2) 信号肽酶位点 (用’表示切割 位点) 基因 属/种 secA1 MKKIMLVFITLILVSLPIAQQ TEAKD(SEQ ID NO：45) TEA’KD (SEQ ID NO：54) hly(LLO) 单核细胞增生 利斯特氏菌 MKKKIISAILMSTVILSAAAP LSGVYADT (SEQ ID NO：46) VYA’DT (SEQ ID NO：55) Usp45 乳酸乳球菌 MKKRKVLIPLMALSTILVSST GNLEVIQAEV (SEQ ID NO：47) IQA’EV (SEQ ID NO：56) pag(保护 性抗原) 炭疽芽孢杆菌 secA2 MNMKKATIAATAGIAVTAFAA PTIASAST ASA’ST (SEQ ID NO：57) iap 侵入相关 单核细胞增生 利斯特氏菌
(SEQ ID NO：48) 蛋白p60 MQKTRKERILEALQEEKKNKK SKKFKTGATIAGVTAIATSI TVPGIEVIVSADE(SEQ ID NO：49) VSA’DE (SEQ ID NO：58) NamA lmo2691 (自溶素) 单核细胞增生 利斯特氏菌 MKKLKMASCALVAGLMFSGLT PNAFAED (SEQ ID NO：50) AFA’ED (SEQ ID NO：59) *BA_0281 (NLP/P60 家族) 炭疽芽孢杆菌 MAKKFNYKLPSMVALTLVGSA VTAHQVQAAE (SEQ ID NO：51) VQA’AE (SEQ ID NO：60) *atl (自溶素) 金黄色葡萄球 菌 Tat MTDKKSENQTEKTETKENKGM TRREMLKLSAVAGTGIAVGA TGLGTILNVVDQVDKALT (SEQ ID NO：52) DKA’LT (SEQ ID NO：61) lmo0367 单核细胞增生 利斯特氏菌 MAYDSRFDEWVQKLKEESFQN NTFDRRKFIQGAGKIAGLSL GLTIAQSVGAFG(SEQ ID NO：53) VGA’FG (SEQ ID NO：62) PhoD (碱性磷酸 酶) 枯草芽孢杆菌
*通过sec途径分泌的细菌自溶素(未确定是secA1还是secA2)。
因此，一些实施方案中，编码信号肽的序列编码secA1信号肽。 SecA1信号肽的实例是来自单核细胞增生利斯特氏菌的利斯特氏菌溶 素O(LLO)信号肽。一些实施方案中，包括编码LLO信号肽的多核苷 酸的重组核酸分子或表达盒进一步包括编码LLO PEST序列的多核苷酸 序列。适用于本发明的secA1信号肽的其他实例包括来自乳酸乳球菌 中Usp45基因(参见以上的表1，和以下的实施例12)和来自炭疽芽 孢杆菌的Pag(保护性抗原)基因的信号肽。因此，一些实施方案中， 信号肽是来自炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽。一些其他的实施方 案中，信号肽是除了来自炭疽芽孢杆菌的保护性信号肽以外的secA1 信号肽。secA1信号肽的另一实例是来自金黄色葡萄球菌的SpsB信号 肽(Sharkov等，J.of Biological Chemistry，277：5796-5803(2002))。
一些备选的实施方案中，将异源编码序列与由secA2途径蛋白分 泌复合物识别的信号肽遗传上融合。已经在九种导致严重或致命的人 传染的革兰氏阳性细菌中鉴定出辅助性SecA形似物(SecA2)。SecA2 是利斯特氏菌属，分枝杆菌属和链球菌属的排出的蛋白质组(分泌蛋 白组)亚类的分泌所需的(Braunstein等，Mol. Microbiol.48：453-64(2003)；Bensing等，Mol.Microbiol.， 44：1081-94(2002)；Lenz等，Mol.Microbil.，45：1043-1056(2002)； 和Braunstein等，J.Bacteriology，183：6979-6990(2001))。 单核细胞增生利斯特氏菌SecA2通过与细菌光滑-粗糙变异的相关性 来鉴定，且secA2中的突变降低了单核细胞增生利斯特氏菌和结核分 枝杆菌的毒力。
例如，利斯特氏菌蛋白质p60是通过secA2途径分泌的肽聚糖自 溶素。例如，来自p60的secA2信号肽和信号肽酶切割位点可以遗传 上与所需蛋白(例如，抗原)编码基因的氨基末端连接。一实施方案 中，由secA2信号肽和信号肽酶-抗原融合体组成的前蛋白质从细菌 内的表达盒翻译，通过革兰氏阳性细胞壁运送，其中真空的异源蛋白 质释放至胞外环境中。
或者，异源序列可以“框内”掺入p60内，使得异源蛋白质以嵌 合p60-异源蛋白质的形式分泌出来。例如，可以在信号肽酶切割位点 和成熟p60蛋白质之间的接合点，将框内异源蛋白质编码序列插入p60 中。该实施方案中，嵌合蛋白质保留合适的secA2分泌信号，以及保 持其自溶素活性，这意味着异源蛋白质作为p60的免费乘客来分泌。 可以在保持p60蛋白质的分泌和自溶素活性的p60内的任何点将异源 抗原进入p60的框内掺入工程化。适于插入所需抗原或其他异源多肽 编码序列的部分表达盒的实例描述于以下的实施例13中。
一些实施方案中，由重组核酸分子编码的融合蛋白是包括具有特 定理想特性的细菌蛋白质(除了所需的异源蛋白质如抗原以外)的嵌 合体。一些实施方案中，嵌合体包括水解酶。一些实施方案中，重组 核酸分子编码包括内肽酶p60(降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶)的 p60嵌合体。一些实施方案中，由重组核酸分子编码的融合蛋白包括 单核细胞增生利斯特氏菌水解酶，例如，p60(参见，例如，Genbank 登录号no.NP_464110)或N-乙酰胞壁酸酶(NamA)(Genbank登录号 no.NP_466213)，这两者都是降解细胞壁的secA2依赖性分泌的蛋白 质。这样的特定蛋白质嵌合体组合物不仅利用细菌蛋白质分泌所需要 的陪伴分子，而且利用可有助于其分泌的细菌蛋白质的活性。特定的 蛋白质嵌合体由异源蛋白质编码序列和单核细胞增生利斯特氏菌水解 酶的精确布置组成，导致异源蛋白质的有效表达和分泌(参见，例如， 以下的具体实施例，实施例29)。因此，一些实施方案中，由重组核 酸分子编码的作为融合蛋白一部分的信号肽是p60信号肽。一些实施 方案中，由重组核酸分子编码的作为融合蛋白质一部分的信号肽是 NamA信号肽。
一些实施方案中，重组核酸分子包括编码p60蛋白或其片段的第 三个多核苷酸序列，其位于和编码p60信号肽的第一个多核苷酸以及 编码另一种多肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸相同的翻译读框中。 因而重组核酸分子编码包括信号肽，由第二个多核苷酸编码的多肽(例 如，抗原)和p60蛋白质或其片段的融合蛋白。这样的实施方案中， 第二个多核苷酸优选位于第三个核苷酸内或在第一个和第三个多核苷 酸之间。
一些实施方案中，secA2信号肽是源自利斯特氏菌的secA2信号 肽。例如，一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽如来自单核细胞 增生利斯特氏菌的p60信号肽或N-乙酰胞壁酸酶(NamA)信号肽。此 外，在secA2不存在下，已经鉴定没有分泌其他的单核细胞增生利斯 特氏菌蛋白质(Lenz等，Mol.Microbiology 45：1043-1056(2002))， 且在一些实施方案中，可以使用编码来自这些蛋白质的信号肽的多核 苷酸。此外，来自除利斯特氏菌以外的细菌的secA2信号肽可以用于 异源蛋白质从重组利斯特氏菌或其他细菌的表达和分泌。例如，作为 说明性的但非限制性的实例，来自炭疽芽孢杆菌的secA2信号肽可以 用于重组核酸分子和/或表达盒中。其他实施方案中，使用来自金黄色 葡萄球菌的secA2信号肽。参见表1。还在其他细菌中鉴定了通过SecA2 途径分泌的蛋白质(参见，例如，Braunstein等，Mol.Microbiol.， 48：453-64(2003)和Bensing等，Mol.Microbiol.44：1081-94 (2002))。
可以鉴定通过secA2途径分泌的其他蛋白质。在多种细菌种中鉴 定出SecA2同源物(参见，例如，Lenz等，Mol.Microbiology 45：1043-1056(2002)和Braunstein等，J.Bacteriology， 183：6979-6990(2001))。使用本领域技术人员公知的技术通过进一 步的序列比较可以鉴定其他的secA2同源物。一旦鉴定出同源物，可 以从细菌生物体中缺失该同源物来产生ΔsecA2突变体。野生型和突 变细菌培养物的上清液蛋白质可以进行TCA-沉淀并通过本领域已知 的任何蛋白质组学技术分析以确定哪些蛋白质是由野生型细菌而不是 ΔsecA2突变体分泌的。例如，可以通过SDS-PAGE和银染色来分析分 泌的蛋白质。可以比较所得到的条带来鉴定在SecA2不存在下没有发 生分泌的那些蛋白质(参见，例如，Lenz等，Mol.Microbiology 45：1043-1056(2002))。然后可以分析这些蛋白质的N-端序列(例 如，使用预测信号肽切割位点的算法)来确定该蛋白质所用的secA2 信号肽序列。也可以进行通过自动化Edman降解的N-端测序来鉴定信 号肽的序列。
备选的实施方案中，多核苷酸编码遗传上与由Tat途径蛋白质分 泌复合物识别的信号肽融合的多肽(例如，异源多肽序列)。细菌包 括利斯特氏菌属数种利用Tat分泌途径，用于分泌在细菌内折叠的蛋 白质。例如，无害利斯特氏菌(Listeria innocua)蛋白YwbN在其氨 基末端具有推定的Tat基序，且因此利用Tat途径用于分泌(Genbank 登录号No.NP_469731[gi|16799463|ref|NP_469731.1|，与枯草 芽孢杆菌YwbN蛋白相似的保守的假定蛋白质(无害利斯特氏菌)]， 在此引入作为参考)。另一种含有Tat信号肽的蛋白是来自单核细胞 增生利斯特氏菌菌株EGD(e)的YwbN蛋白(Genbank登录号 No.NP_463897[gi|16802412|ref|NP_463897.1|，与枯草芽孢杆 菌YwbN蛋白相似的保守的假定蛋白质(单核细胞增生利斯特氏菌 EGD(e)])。例如，YwbN信号肽和来自YwbN的信号肽酶切割位点可 以遗传上连接所需蛋白(例如，抗原)编码基因的氨基末端。该组合 物中，从细菌内的表达盒翻译由Tat信号肽和信号肽酶-抗原融合体组 成的前蛋白，通过革兰氏阳性细胞壁运送，其中真实的异源蛋白质释 放至胞外环境中。预测将通过Tat途径从无害利斯特氏菌中分泌出来 的另一种蛋白质是3-氧代酰基-酰基载体蛋白合成酶(Genbank登录 号No.NP_471636[gi|16801368|ref|NP_471636.1，与3-氧代酰基 -酰基-载体蛋白合成酶相似(无害利斯特氏菌)])。编码来自这些预 测通过Tat分泌途径从利斯特氏菌中分泌出来的任何蛋白质中的信号 序列的多核苷酸可以用于在此所述的多核苷酸，表达盒和/或表达载体 中。
来自其他细菌的Tat信号序列也可以用作信号肽，包括，但不限 于，来自枯草芽孢杆菌的phoD。来自枯草芽孢杆菌的Tat信号肽的实 例，如phoD，描述于Jongbloed等，J.of Biological Chemistry， 277：44068-44078(2002)；Jongbloed等，J.of Biological Chemistry， 275：41350-41357(2000)，Pop等，J.of Biological Chemistry， 277：3268-3273(2002)；van Dij1等，J.of Biotechnology 98：243-254 (2002)；和Tjalsma等，Microbiology and Molecular Biology Reviews，64：515-547(2000)，所有这些在此以其整体引入作为参考。 已经预测将通过Tat途径分泌的在枯草芽孢杆菌中鉴定的其他蛋白质 包括具有以下Genbank/Emb1登录号的那些序列：CAB15017[gi| 2635523|emb|CAB15017.1|，与双组分感受器组氨酸激酶)(YtsA) (枯草芽孢杆菌)相似]；CAB12056[gi|2632548|emb|CAB12056.1 |磷酸二酯酶/碱性磷酸酶D(枯草芽孢杆菌)]；CAB12081[gi12632573 |emb|CAB12081.1，与假定的蛋白质(枯草芽孢杆菌)相似]；CAB13278 [gi12633776|emb| CAB13278.1，与假定的蛋白质(枯草芽孢杆菌) 相似]；CAB14172[gi|2634674|emb|CAB14172.1|甲基奈醌：细胞 色素C氧化还原酶(铁-硫亚单位))(枯草芽孢杆菌)]；CAB15089[gi |2635595|emb|CAB15089.11yubF(枯草芽孢杆菌)]；和 CAB15852[gi|2636361|emb|CAB15852.1|备选的基因名称：ipa (29d～与假定的蛋白质(枯草芽孢杆菌)相似，其中所有的序列在此 引入作为参考。因此，一些实施方案中，由重组核酸分子和/或表达盒 中的多核苷酸编码的信号肽是源自枯草芽孢杆菌的Tat信号肽。 Ochsner等，PNAS，99：8312-8317(2002)中提供了有关来自铜绿假 单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的Tat信号肽的信息。以及，来 自多种其他细菌的Tat信号肽描述于Dilks等，J.of Bacteriology， 185：1478-1483(2003)和Berks等，Molecular Microbiology， 35：260-274(2000)，两者在此以其整体引入作为参考。
通过其“双-精氨酸”共有基序可以从Sec型信号肽中鉴定并区分 其他的Tat信号肽。如上所述，与通过Tat途径分泌的蛋白质相关的 信号肽具有与Sec信号肽相似的分成三个部分的构造，但是其特征在 于具有位于N-结构域/H-结构域边界的RR-基序(R-R-X-#-#，其中# 是疏水性残基)。通常Tat信号肽还长于Sec型信号肽且疏水性小于 Sec型信号肽。参见，例如Berks等，Adv.Microb.Physiol.， 47：187-254(2003)和Berks等，Mol.Microbiol.35：260-74(2000)。
此外，类似于上述那些用于鉴定通过SecA2途径分泌的新蛋白质 及其相应SecA2信号肽的技术也可以用于鉴定通过Tat途径分泌的新 蛋白质及其信号肽。参考文献Jongbloed等，J.Biological Chem.， 277：44068-44078(2002)提供了可用于鉴定由通过双-精氨酸转运途 径分泌的蛋白质相同细菌类型表达的蛋白质的技术的实例。
IV.多肽
在此所述的重组核酸分子，以及在此所述的表达盒或表达载体， 可以用于编码任何所需的多肽。特别是，重组核酸分子，表达盒和表 达载体可用于在细菌中表达异源多肽。
一些实施方案中(取决于所用的重组核酸分子，表达盒或表达载 体)，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核苷酸编码的多肽 作为具有信号肽的融合蛋白的一部分来表达。其他实施方案中，由重 组核酸分子，表达盒或表达载体编码的多肽作为离散的多肽来表达。 仍然其他实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或表达载体的多核苷 酸编码的多肽作为不包括信号肽的融合蛋白的一部分来表达。仍然其 他实施方案中，由本发明的重组核酸分子，表达盒或表达载体的多核 苷酸编码的多肽作为其中多肽包埋于另一个多肽序列内的融合蛋白 (在此也称为蛋白质嵌合体)的一部分来表达。
因此，应当理解由本发明的重组核酸分子，表达盒或表达载体的 多核苷酸编码的在此(以下和别处)所列的每个多肽都可以通过重组 核酸分子，表达盒或表达载体作为融合蛋白(与信号肽和/或其他多肽 融合，或在其他多肽中)或离散的多肽来表达，这取决于所用的特定 重组核酸分子，表达盒或表达载体。例如，一些实施方案中，包括编 码抗原CEA的多核苷酸的重组核酸分子将编码CEA作为具有信号肽的 融合蛋白。
一些实施方案中，多肽是重组核酸分子，表达盒或表达载体编码 的融合蛋白的一部分，且与融合蛋白的信号肽是异源的。一些实施方 案中，多肽位于另一个与其异源的多肽序列(例如，分泌蛋白或自溶 素或其片段或变体)内。
一些实施方案中，多肽是细菌的(利斯特氏菌或非利斯特氏菌的)。 一些实施方案中，多肽是非细菌的。一些实施方案中，由多核苷酸编 码的多肽是哺乳动物多肽。例如，多肽可以对应于人中发现的多肽序 列(即，人多肽)。一些实施方案中，多肽是利斯特氏菌的。一些实 施方案中，多肽是非利斯特氏菌的。一些实施方案中，多肽对其中待 引入或引入重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的细菌不是天然的 (即，外源的)。
一些实施方案中，编码多肽的多核苷酸对于在细菌中的表达是密 码子最佳化的。一些实施方案中，编码多肽的多核苷酸对于在细菌中 的表达是完全密码子最佳化的。一些实施方案中，由密码子最佳化多 核苷酸编码的多肽对细菌是外源的(即，与细菌是异源的)。
术语“多肽”在此可与“肽”和“蛋白质”交替使用，且对于其 中所含的氨基酸序列的长度或大小没有限制。然而，通常，多肽包括 至少约6个氨基酸。一些实施方案中，多肽包括至少约9，至少约12， 至少约20，至少约30，或至少约50个氨基酸。一些实施方案中，多 肽包括至少约100个氨基酸。一些实施方案中，多肽是蛋白质的一个 特定结构域(例如，胞外结构域，胞内结构域，催化结构域或结合结 构域)。一些实施方案中，多肽包括完整的(即，全长)蛋白质。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核 苷酸编码的多肽包括抗原或蛋白质，提供了对疾病的减轻性治疗。一 些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核苷酸编 码的多肽是提供了对疾病的减轻性治疗的抗原或蛋白质。一些实施方 案中，所编码的多肽是治疗性蛋白质(或包括治疗性蛋白质)。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体的多核苷酸 编码的多肽包括抗原(例如，在此所述的任何抗原)。一些实施方案 中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体的多核苷酸编码的多肽是抗原。 一些实施方案中，抗原是细菌抗原。一些实施方案中，抗原是非利斯 特氏菌细菌的抗原。然而，一些实施方案中，抗原是非利斯特氏菌的 抗原。其他实施方案中，抗原是非细菌抗原。一些实施方案中，抗原 是哺乳动物的抗原。一些实施方案中，抗原是人的抗原。一些实施方 案中，多肽是(或包括)含有一个或多个免疫原性抗原决定部位的抗 原。一些实施方案中，抗原包括一个或多个MHC I类抗原决定部位。 其他实施方案中，抗原包括MHC II类抗原决定部位。一些实施方案中， 抗原决定部位是CD4+T-细胞抗原决定部位。其他实施方案中，抗原决 定部位是CD8+T-细胞抗原决定部位。
编码抗原的多核苷酸不限于任何精确的核酸序列(例如，编码天 然产生的，全长抗原的核酸序列)，而可以是编码在本发明的细菌或 组合物内当给予个体时足以引发所需免疫应答的多肽的任何序列。如 在此所用的术语“抗原”也理解为包括较大抗原蛋白的片段，只要该 片段是抗原性的(即，免疫原性的)。此外，一些实施方案中，由重 组核酸分子，表达盒或表达载体的多核苷酸编码的抗原可以是天然产 生的抗原序列的变体。(同样，对于编码其他的，非抗原蛋白的多核 苷酸，编码给定蛋白的多核苷酸序列可以改变，只要表达的所需蛋白 质当给予个体时提供了所需的效果(例如，缓解效果))。
源自另一种抗原的抗原包括作为另一种抗原的抗原性(即，免疫 原性)片段的抗原，另一种抗原的抗原性变体，或另一种抗原片段的 抗原性变体。抗原变体包括因一个或多个替换，缺失，添加和/或插入 而不同于原始抗原的抗原。
抗原片段可以具有任何长度，但最常见的是至少约6个氨基酸， 至少约9个氨基酸，至少约12个氨基酸，至少约20个氨基酸，至少 约30个氨基酸，至少约50个氨基酸，或至少约100个氨基酸。抗原 的抗原性片段包括至少一个来自抗原的抗原决定部位。一些实施方案 中，抗原决定部位是MHC I类抗原决定部位。其他实施方案中，抗原 决定部位是MHC II类抗原决定部位。一些实施方案中，抗原决定部位 是CD4+T-细胞抗原决定部位。其他实施方案中，抗原决定部位是CD8+ T-细胞抗原决定部位。
多种用于预测蛋白质内抗原区域(包括抗原决定部位)的算法和 软件包是本领域技术人员可获得的。例如，可以用于选择结合MHC I 类和II类分子的抗原决定部位的算法是公众可获得的。例如，公众 可获得的“SYFPEITHI”算法可以用于预测MHC-结合肽(Rammensee 等(1999)Immunogenetics 50：213-9)。对于公众可获得的算法的 其他实例，参见以下的参考文献：Parker等，(1994)J.Immunol 152： 163-75；Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17：1236-1237； Singh和Raghava(2003)Bioinformatics 19：1009-1014；Mallios (2001)Bioinformatics 17：942-8；Nielsen等(2004)Bioinformatics 20：1388-97；Donnes等(2002)BMC Bioinformatics 3：25；Bhasin 等(2004)Vaccine 22：3195-204；Guan等(2003)Nucleic Acids Res 31：3621-4；Reche等(2002)Hum.Immunol.63：701-9；Schirle等 (2001)J.Immunol Methods 257：1-16；Nussbaum等(2001) Immunogenetics(2001)53：87-94；Lu等(2000)Cancer Res.60： 5223-7。还可以参见，例如，Vector NTISuite(Informax，Inc， Bethesda，MD)，GCG Wiscons in Package(Accelrys，Inc.，San Diego， CA)，Welling等(1985)FEBS Lett.188：215-218，Parker等(1986) Biochemistry 25：5425-5432，Van Regenmortel和Pellequer(1994) Pept.Res.7：224-228，Hopp和Woods(1981)PNAS 78：3824-3828， 和Hopp(1993)Pept.Res.6：183-190。该段落中以上所列参考文献 中所讨论的一些算法或软件包涉及MHC I类和/或II类结合肽或抗原 决定部位的预测，另一些涉及蛋白体的切割位点的鉴定，还有一些涉 及基于亲水性的抗原性的预测。
一旦已经鉴定出认为含有至少一个所需性质的抗原决定部位的候 选抗原片段，可以将编码该序列的多核苷酸序列引入表达盒中和引入 利斯特氏菌疫苗载体或其他细菌疫苗载体中。然后通过评定表达该抗 原片段的利斯特氏菌或其他细菌所产生的免疫应答可以证实该抗原片 段的免疫原性。标准免疫测定如ELISPOT测定，胞内细胞因子染色 (ICS)测定，细胞毒性T-细胞活性测定等，可以用于核实选定的抗 原片段保持所需的免疫原性。以下的实施例提供了这些类型测定的实 例(参见，例如，实施例21)。此外，也可以使用以下实施例中所述 的方法来评定利斯特氏菌和/或细菌疫苗的抗肿瘤功效(例如，在小鼠 中植入表达抗原片段的CT26鼠结肠细胞，接着用候选疫苗接种小鼠并 观察相对于对照和/或全长抗原的对肿瘤大小、转移、存活等的效果)。
此外，用于鉴定抗原片段的含有抗原决定部位和/或MHC配体信息 的大数据库是公众可获得的。参见，例如，Brusic等(1998)Nucleic Acid Res.26：368-371；Schonbach等(2002)Nucleic Acids Research 30：226-9；和Bhasin等(2003)Bioinformatics 19：665-666；和 Rammensee等(1999)Immunogenetics 50：213-9。
抗原变体的氨基酸序列与原始抗原具有至少约60％，至少约70％， 至少约80％，至少约90％，至少约95％或至少约98％的同一性。
一些实施方案中，抗原变体是具有至少约80％与原始抗原的同一 性的保守变体，抗原变体和原始抗原序列之间的替换是保守氨基酸替 换。认为以下替换是保守氨基酸替换：缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸替 代丙氨酸；赖氨酸，谷氨酰胺或天冬酰胺替代精氨酸；谷氨酰胺，组 氨酸，赖氨酸或精氨酸替代天冬酰胺；谷氨酸替代天冬氨酸；丝氨酸 替代半胱氨酸；天冬酰胺替代谷氨酰胺；天冬氨酸替代谷氨酸；脯氨 酸或丙氨酸替代甘氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸或精氨酸替代 组氨酸；亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸或正亮氨酸 替代异亮氨酸；正亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸或 苯丙氨酸替代亮氨酸；精氨酸，谷氨酰胺或天冬酰胺替换赖氨酸；亮 氨酸，苯丙氨酸或异亮氨酸替代甲硫氨酸；亮氨酸，缬氨酸，异亮氨 酸，丙氨酸或酪氨酸替代苯丙氨酸；丙氨酸替代脯氨酸；苏氨酸替代 丝氨酸；丝氨酸替代苏氨酸；酪氨酸或苯丙氨酸替代色氨酸；色氨酸， 苯丙氨酸，苏氨酸或丝氨酸替代酪氨酸；异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨 酸，苯丙氨酸，丙氨酸或正亮氨酸替代缬氨酸。一些实施方案中，抗 原变体是具有至少约90％与原始抗原的同一性的保守变体。
一些实施方案中，源自另一抗原的抗原基本上等同于另一抗原。 如果源自另一抗原的抗原与原始抗原具有至少约70％的氨基酸序列同 一性且维持至少约70％原始抗原的免疫原性，那么该抗原基本上等同 于其所源自的原始抗原。一些实施方案中，基本上等同的抗原与原始 抗原具有至少约80％，至少约90％，至少约95％，或至少约98％的氨基 酸序列同一性。一些实施方案中，基本上等同的抗原相对于原始抗原 只包括保守替换。一些实施方案中，基本上等同的抗原维持至少约 80％，至少约90％，或至少约95％原始抗原的免疫原性。为了确定特定 衍生抗原的免疫原性并和原始抗原的免疫原性相比较来确定衍生的抗 原是否与原始抗原基本上等同，人们可以在本领域技术人员已知的多 种免疫原性测定法的任一种中同时测试衍生的和原始的抗原。例如， 如在此所述的可以制备表达原始抗原或衍生抗原的利斯特氏菌。可以 如下测量那些表达不同抗原的利斯特氏菌产生免疫应答的能力，即， 用利斯特氏菌接种小鼠，然后使用ELISPOT测定，胞内细胞因子染色 (UCS)测定，细胞毒性T-细胞活性测定等的标准技术来评定免疫原 应答。以下的实施例提供了这些类型测定法的实例(参见，例如，实 施例21)。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体的多核苷酸 编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，抗原选自肿瘤相关抗原，源 自肿瘤相关抗原的多肽，传染病抗原和源自传染病抗原的多肽。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体的多核苷酸 编码的多肽包括肿瘤相关抗原或包括源自肿瘤相关抗原的抗原。一些 实施方案中，多肽包括肿瘤相关抗原。一些实施方案中，编码的多肽 包括多于一种的抗原，该抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原的 抗原。例如，一些实施方案中，编码的多肽包括间皮素(或其抗原片 段或抗原变体)和K-Ras，12-K-Ras或PSCA(或K-Ras，12-K-Ras或 PSCA的抗原片段或抗原变体)。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核 苷酸编码的抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原的抗原。一些实 施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒和/或表达载体中的多核 苷酸编码抗原(或编码包括抗原的多肽)，该抗原不同于肿瘤相关抗 原，而是源自肿瘤相关抗原的抗原。例如，一些实施方案中，由重组 核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核苷酸编码的抗原可以包括肿瘤 相关抗原的片段，肿瘤相关抗原的变体，或肿瘤相关抗原片段的变体。 一些情况中，抗原，如肿瘤抗原，当其氨基酸序列略微不同于宿主内 源的氨基酸序列时，能够诱导疫苗中更显著的免疫应答。另一些情况 中，衍生的抗原诱导的免疫应答不如原始抗原诱导的免疫应答显著， 但是，例如，由于较小的尺寸衍生的抗原在利斯特氏菌疫苗载体中的 异源表达更方便。一些实施方案中，肿瘤相关抗原变体，或肿瘤相关 抗原片段变体的氨基酸序列有一个或多个氨基酸不同于肿瘤相关抗原 或其相应的片段的氨基酸序列。源自肿瘤相关抗原的抗原包括至少一 个在编码该抗原的多核苷酸在宿主内表达时能够诱导所需免疫应答的 抗原决定部位序列。
因此，一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒或载体中的多核 苷酸编码多肽，该多肽包括源自肿瘤相关抗原的抗原，其中该抗原包 括至少一个肿瘤相关抗原的抗原片段。一些实施方案中，重组核酸分 子，表达盒或载体中的多核苷酸编码源自肿瘤相关抗原的抗原，其中 该抗原包括至少一个肿瘤相关抗原的抗原片段。抗原片段包括至少一 个肿瘤相关抗原的抗原决定部位。一些实施方案中，源自另一抗原的 抗原是另一抗原的抗原性(即，免疫原性)片段或抗原变体。一些实 施方案中，抗原是另一抗原的片段。一些实施方案中，抗原是另一抗 原的抗原变体。
已经鉴定出由T细胞识别的大量肿瘤相关抗原(Renkvist等， Cancer Immunol Innumother 50：3-15(2001))。这些肿瘤相关抗 原可以是分化抗原(例如，PSMA，酪氨酸酶，gp100)，组织特异性抗 原(例如，PAP，PSA)，发育抗原，肿瘤相关病毒抗原(例如，HPV 16 E7)，睾丸癌抗原(例如，MAGE，BAGE，NY-SEO-1)，胚胎抗原(例 如，CEA，α-甲胎蛋白)，肿瘤蛋白抗原(例如，Ras，p53)，超表 达的蛋白抗原(例如，ErbB2(Her2/Neu)，MUC1)，或突变的蛋白抗 原。由异源核酸序列编码的肿瘤相关抗原包括，但不限于，707-AP， 膜联蛋白II，AFP，ART-4，BAGE，β-连环蛋白/m，BCL-2，bcr-abl， bcr-abl p190，bcr-abl p210，BRCA-1，BRCA-2，CAMEL，CAP-1，CASP-8， CDC27/m，CDK-4/m，CEA(Huang等，Exper Rev.Vaccines(2002)1： 49-63)，CT9，CT10，Cyp-B，Dek-cain，DAM-6(MAGE-B2)， DAM-10(MAGE-B1)，EphA2(Zantek等，Cell Growth Differ.(1999) 10：629-38；Carles-Kinch等，Cancer Res.(2002)62：2840-7)， ELF2M，EphA2(Zantek等，Cell Growth Differ.(1999)10：629-38； Carles-Kinch等，Cancer Res.(2002)62：2840-7)，ETV6-AML1，G250， GAGE-1，GAGE-2，GAGE-3，GAGE-4，GAGE-5，GAGE-6，GAGE-7B，GAGE-8， GnT-V，gp100，HAGE，HER2/neu，HLA-A*0201-R170I，HPV-E7，H-Ras， HSP70-2M，HST-2，hTERT，hTRT，iCE，细胞凋亡的抑制剂(例如，存 活素)，KIAA0205，K-Ras，12-K-Ras(具有密码子12突变的K-Ras)， LAGE，LAGE-1，LDLR/FUT，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-6，MAGE-A1， MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A6，MAGE-A10，MAGE-A12，MAGE-B5， MAGE-B6，MAGE-C2，MAGE-C3，MAGE-D，MART-1，MART-1/Melan-A， MC1R，MDM-2，间皮素，肌球蛋白/m，MUC1，MUC2，MUM-1，MUM-2， MUM-3，新-多聚腺苷酸聚合酶，NA88-A，N-Ras，NY-ESO-1，NY-ESO-1a (CAG-3)，PAGE-4，PAP，蛋白酶3(PR3)(Molldrem等，Blood(1996) 88：2450-7；Molldrem等，Blood(1997)90：2529-34)，P15，p190， Pm1/RARa，PRAME，PSA，PSM，PSMA，RAGE，RAS，RCASI，RU1，RU2， SAGE，SART-1，SART-2，SART-3，SP17，SPAS-1，TEL/AML1，TPI/m， 酪氨酸酶，TARP，TRP-1(gp75)，TRP-2，TRP-2/INT2，WT-1，或者， 翻译的NY-ESO-ORF2和CAMEL蛋白质，源自NY-ESO-1和LAGE-1基因。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体中的多核苷 酸编码的抗原包括可以引发肿瘤特异性免疫应答的任何肿瘤相关抗 原，包括仍待鉴定的抗原。一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒 和/或载体中的多核苷酸编码多于一个肿瘤相关抗原。
一些实施方案中，抗原是间皮素(Argani等，Clin Cancer Res. 7(12)：3862-8(2001))，Sp17(Lim等，Blood 97(5)：1508-10 (2001))，gp100(Kawakami等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA91： 6458(1994))，PAGE-4(Brinkmann等，Cancer Res.59(7)：1445-8 (1999))，TARP(Wolfgang等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA97(17)： 9437-42(2000))，EphA2(Tatsumi等，Cancer Res.63(15)：4481-9 (2003))，PR3(Muller-Berat等，Clin.Immunol.Immunopath.70 (1)：51-9(1994))，前列腺干细胞抗原(PSCA)(Reiter等，Proc. Nat1.Acad.Sci.USA，95：1735-40(1998)；Kiessling等，Int. J.Cancer，102：390-7(2002))，或SPAS-1(美国专利申请公开 No.2002/0150588)。
本发明的一些实施方案中，由重组核酸分子或表达盒编码的抗原 是CEA。其他实施方案中，抗原是CEA的抗原片段和/或抗原变体。CEA 是在相当大比例的人肿瘤(包括90％的结肠直肠癌，胃癌和胰腺癌， 70％的非小细胞肺癌，和50％的乳癌)中超表达的180-kDA膜细胞间粘 着糖蛋白，(Hammarstrom，Semin.Cancer Biol.，9：67-81)。已 经研究了多种免疫治疗剂如模拟CEA的抗个体基因型单克隆抗体 (Foon等，Clin.Cancer Res.，87：982-90(1995)，或使用表达 CEA的重组牛痘病毒疫苗接种(Tsang等，J.Nat1.Cancer Inst.， 87：982-90(1995))，然而，不幸地，只获得有限的成功。尽管如此， 研究者已经鉴定了由从接种的患者中产生的人T细胞系识别的 HLA*0201-限制的抗原决定部位，CAP-1(CEA605-613)。用该抗原决 定部位脉冲的DC接种患者未能诱导临床响应(Morse等，Clin.Cancer Res.，5：1331-8(1999))。最近，鉴定了CEA605-613肽激动剂，具 有在位置610天冬氨酸至天冬酰胺替换的不规则变化(CAP1-6D)。尽 管该氨基酸替换没有改变该肽的MHC结合亲和性，改变的肽配体(APL) 的使用仍然导致了体外CEA-特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)产生 的提高。CAP1-6D-特异性CTL维持它们识别和裂解表达天然CEA的肿 瘤细胞的能力(Zaremba等，Cancer Res.，57：4570-7(1997)；Salazar 等，Int.J.Cancer，85：829-38(2000))。Fong等证明了用与该 APL一起孵育的Flt 3-配体扩展的DC接种的结肠癌患者中CEA-特异性 免疫性的诱导。鼓舞人心地，12名患者中的2名在接种疫苗后经历了 引人注目的与肽-MHC四聚物+T细胞的诱导相关的肿瘤退化(Fong等， Proc.Nat1.Acad.Sci.USA.，98：8809-14(2001))。
另一实施方案中，抗原是蛋白酶-3或源自蛋白酶-3。例如，一实 施方案中，抗原包括HLA-A2.1-限制肽PR1(aa 169-177；VLQELNVTV (SEQ ID NO：63))。关于蛋白酶-3和/或PR1抗原决定部位的信息 在以下的参考文献中可获得：美国专利No.5,180,819，Molldrem等， Blood，90：2529-2534(1997)；Molldrem等，Cancer Research， 59：2675-2681(1999)；Molkdrem等，Nature Medicine，6：1018-1023 (2000)；和Molldrem等，Oncogene，21：8668-8673(2002)。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体中的多 核苷酸编码的多肽包括选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP和CEA的抗原，或包括源自选自K-Ras， H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素， gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP和CEA抗原 的抗原。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体中的多核苷 酸编码的多肽包括选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素， PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA的抗原。一些实施方案中，多肽包括K-Ras。 一些实施方案中，多肽包括H-Ras。一些实施方案中，多肽包括N-Ras。 一些实施方案中，多肽包括K-Ras。一些实施方案中，多肽包括间皮 素(例如，人间皮素)。一些实施方案中，多肽包括PSCA。一些实施 方案中，多肽包括NY-ESO-1。一些实施方案中，多肽包括WT-1。一些 实施方案中，多肽包括存活素。一些实施方案中，多肽包括gp100。 一些实施方案中，多肽包括PAP。一些实施方案中，多肽包括蛋白酶3。 一些实施方案中，多肽包括SPAS-1。一些实施方案中，多肽包括SP-17。 一些实施方案中，多肽包括PAGE-4。一些实施方案中，多肽包括TARP。 一些实施方案中，多肽包括CEA。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体中的多核苷 酸编码的抗原是选自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA的抗原。一些实施方案中，抗原是K-Ras。一些 实施方案中，抗原是H-Ras。一些实施方案中，抗原是N-Ras。一些实 施方案中，抗原是K-Ras。一些实施方案中，抗原是间皮素。一些实 施方案中，抗原是PSCA。一些实施方案中，抗原是NY-ESO-1。一些实 施方案中，抗原是WT-1。一些实施方案中，抗原是存活素。一些实施 方案中，抗原是gp100。一些实施方案中，抗原是PAP。一些实施方案 中，抗原是蛋白酶3。一些实施方案中，抗原是SPAS-1。一些实施方 案中，抗原是SP-17。一些实施方案中，抗原是PAGE-4。一些实施方 案中，抗原是TARP。一些实施方案中，抗原是CEA。一些实施方案中， 抗原是人间皮素。
一些实施方案中，抗原是间皮素，SPAS-1，蛋白酶3，EphA2，SP-17， gp100，PAGE-4，TARP或CEA，或源自那些蛋白质中一种的抗原。一些 实施方案中，抗原是间皮素或源自间皮素。其他实施方案中，抗原是 EphA2或源自EphA2的抗原。一些实施方案中，由在此所述的重组核 酸分子，表达盒或表达载体中的多核苷酸编码的抗原不是Epha 2(或 源自Epha2的抗原)。一些实施方案中，抗原是除Epha 2以外的肿瘤 相关抗原。一些实施方案中，抗原源自除Epha2以外的肿瘤相关抗原。 一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体中的多核苷 酸编码的多肽包括除Epha2以外的抗原。一些实施方案中，由重组核 酸分子，表达盒和/或表达载体中的多核苷酸编码的多肽包括除Epha2 或源自Epha2抗原以外的抗原。
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒和/或表达载体中的多核 苷酸编码多肽，该多肽包括源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA的抗原。一些实施方案中，多 肽包括源自K-Ras的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自H-Ras的 抗原。一些实施方案中，多肽包括源自N-Ras的抗原。一些实施方案 中，多肽包括源自12-K-Ras的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自 间皮素的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自PSCA的抗原。一些实 施方案中，多肽包括源自NY-ESO-1的抗原。一些实施方案中，多肽包 括源自WT-1的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自存活素的抗原。 一些实施方案中，多肽包括源自gp100的抗原。一些实施方案中，多 肽包括源自PAP的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自蛋白酶3的 抗原。一些实施方案中，多肽包括源自SPAS-1的抗原。一些实施方案 中，多肽包括源自SP-17的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自 PAGE-4的抗原。一些实施方案中，多肽包括源自TARP的抗原。一些 实施方案中，多肽包括源自CEA的抗原。
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒和/或表达载体中的多核 苷酸编码源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素，PSCA， NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1，SP-17， PAGE-4，TARP或CEA的抗原。一些实施方案中，抗原源自K-Ras。一 些实施方案中，抗原源自H-Ras。一些实施方案中，抗原源自N-Ras。 一些实施方案中，抗原源自12-K-Ras。一些实施方案中，抗原是源自 间皮素的抗原。一些实施方案中，抗原是源自PSCA的抗原。一些实施 方案中，抗原是源自NY-ESO-1的抗原。一些实施方案中，抗原是源自 WT-1的抗原。一些实施方案中，抗原是源自存活素的抗原。一些实施 方案中，抗原是源自gp100的抗原。一些实施方案中，抗原是源自PAP 的抗原。一些实施方案中，抗原是源自蛋白酶3的抗原。一些实施方 案中，抗原是源自SPAS-1的抗原。一些实施方案中，抗原是源自SP-17 的抗原。一些实施方案中，抗原是源自PAGE-4的抗原。一些实施方案 中，抗原是源自TARP的抗原。一些实施方案中，抗原是源自CEA的抗 原。
一些实施方案中，抗原是间皮素，或其抗原片段或抗原变体。因 此，一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或载体中的多核苷 酸编码的多肽包括间皮素，或其抗原片段或抗原变体。一些实施方案 中，由多核苷酸编码的多肽是间皮素，或其抗原片段或抗原变体。
一些实施方案中，抗原是其中间皮素信号肽和/或GPI(糖基磷脂 酰肌醇)锚已经缺失的间皮素(例如，人间皮素)。因此，一些实施 方案中，由多核苷酸编码的多肽包括其中间皮素信号肽和/或GPI锚已 经缺失的间皮素。一些实施方案中，由多核苷酸编码的多肽是其中间 皮素信号肽和/或GPI锚已经缺失的间皮素。一些实施方案中，由多核 苷酸编码的多肽是其中间皮素信号肽和/或GPI锚已经缺失的人间皮 素。一些实施方案中，由多核苷酸编码的多肽是其中间皮素信号肽和 GPI锚两者都已经缺失的人间皮素。
一些实施方案中，抗原是NY-ESO-1，或其抗原片段或抗原变体。 因此，一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或载体中的多核苷 酸编码的多肽包括NY-ESO-1抗原，或其抗原片段或抗原变体。一些实 施方案中，多肽是NY-ESO-1抗原，或其抗原片段或抗原变体。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或载体中的多核苷酸 编码的多肽包括至少一个肿瘤相关抗原的抗原片段，例如，人前列腺 干细胞抗原(PSCA；Genbank Acc.No.AF043498)，人睾丸抗原 (NY-ESO-1；Genbank Acc.No.NM_001327)，人癌胚抗原(CEA； Genbank Acc.No.M29540)，人间皮素(Genbank Acc.No.U40434)， 人存活素(Genbank Acc.No.U75285)，人蛋白酶3(Genbank No. X55668)，人K-Ra s(Genbank Acc.Nos.M54969&P01116)，人H-Ras (Genbank Acc.No.P01112)，人N-Ras(Genbank Acc.No.P01111)， 和人12-K-Ras(包括Gly12Asp突变的K-Ras)(参见，例如，Genbank Acc.No.K00654)。一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或表 达载体中的多核苷酸编码的多肽包括具有至少一个保守替换的氨基酸 的肿瘤相关抗原的抗原片段。一些实施方案中，由重组核酸分子，表 达盒或表达载体中的多核苷酸编码的多肽包括具有至少一个缺失的氨 基酸残基的抗原片段。一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒或 表达载体中的多核苷酸编码的多肽包括源自多于一种类型的肿瘤相关 抗原的抗原序列的组合，例如，源自间皮素和Ras两者的抗原片段的 组合。
预测是抗原性的肿瘤抗原区域的实例包括下列：Genbank Acc.No. AF043498中的PSCA氨基酸序列的氨基酸25-35；70-80；和90-118； Genbank Acc.No.NM_001327中NY-ESO-1的氨基酸40-55，75-85， 100-115和128-146；Genbank Acc.No.M29540的CEA氨基酸序列的 氨基酸70-75，150-155，205-225，330-340和510-520；Genbank Acc. No.U40434的间皮素多肽序列的氨基酸90-110，140-150，205-225， 280-310，390-410，420-425和550-575；Genbank Acc.No.U75285 的存活多肽序列的氨基酸12-20，30-40，45-55，65-82，90-95，102-115 和115-130；Genbank Acc.No.X55668中发现的蛋白酶3的氨基酸序 列的氨基酸10-20，30-35，65-75，110-120和160-170；Genbank Acc. No.P01117或M54968(人K-Ras)的氨基酸10-20，30-50，55-75， 85-110，115-135，145-155和160-185；Genbank Acc.No.P01112(人 H-Ras)的氨基酸10-20，25-30，35-45，50-70，90-110，115-135 和145-175；Genbank Acc.No.P01111(人N-Ras)的氨基酸10-20， 25-45，50-75，85-110，115-135，140-155和160-180；和12-k-Ras (公开于Genbank Acc.No.K00654中的序列)的头25个氨基酸。通 过Hopp-Woods和Welling抗原性标绘来预测这些抗原区域。
一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的多肽作为离散的多 肽，作为具有选定信号肽的融合蛋白，或作为其中多肽已插入另一多 肽的蛋白质嵌合体，是包括一个或多个以下人间皮素肽的多肽： SLLFLLFSL(氨基酸20-28；(SEQ ID NO：64))；VLPLTVAEV(氨基 酸530-538；(SEQ ID NO：65))；ELAVALAQK(氨基酸83-92；(SEQ ID NO：66))；ALQGGGPPY(氨基酸225-234；(SEQ ID NO：67))； FYPGYLCSL(氨基酸435-444；(SEQ ID NO：68))；和LYPKARLAF(氨 基酸475-484；(SEQ ID NO：69))。例如，一些实施方案中，由本 发明的多核苷酸编码的抗原是包括这些肽中一个或多个的人间皮素 (抗原性)片段。关于这些间皮素肽序列及其与医学相关免疫应答相 关性的其他信息可以在PCT公开WO 2004/006837中找到。
或者，重组核酸分子，表达盒或表达载体中的多核苷酸可以编码 自体免疫疾病特异性抗原(或包括自体免疫疾病特异性抗原的多肽)。 T细胞介导的自体免疫疾病中，T细胞对自体抗原的响应导致自体免疫 疾病。用本发明的疫苗治疗自体免疫疾病中所用的抗原类型可以靶向 引起自体免疫应答的特异性T细胞。例如，抗原可以是T细胞受体的 一部分，即，对那些导致自体免疫应答的T细胞是特异性的个体基因 型，其中引入本发明疫苗中的抗原将引发对那些导致自体免疫应答的 T细胞具有特异性的免疫应答。消除那些T细胞是缓解自体免疫疾病 的治疗机理。另一种可能性是将编码抗原的多核苷酸引入重组核酸分 子中，该抗原将导致靶向在自体免疫疾病中对自体抗原产生的抗体或 靶向分泌该抗体的特异性B细胞克隆的免疫应答。例如，可以将编码 个体基因型抗原的多核苷酸引入重组核酸分子中，其将导致对这样B 细胞的抗个体基因型免疫应答和/或抗体与自体免疫疾病中的自体抗 原反应。用包括含有本发明的表达盒和重组核酸分子的细菌的疫苗可 治疗的自体免疫疾病包括，但不限于，类风湿性关节炎，多发性硬化， 节段性回肠炎，狼疮，重症肌无力，白癜风，硬皮病，牛皮癣，寻常 型天疱疮，纤维肌痛，结肠炎和糖尿病。可以采用相似的方法来治疗 变态反应，其中引入疫苗细菌中的抗原靶向T细胞，B细胞或有效调 节变态反应的抗体。一些自体免疫疾病如牛皮癣中，疾病导致超增生 细胞生长，以及也可以靶向的抗原的表达。应考虑这样的将导致对超 增生细胞的免疫应答的抗原。
一些实施方案中，抗原是靶向独特疾病相关蛋白质结构的抗原。 这种情况的实例之一是使用如上所述的个体基因型抗原靶向抗体，B 细胞或T细胞。另一种可能性是靶向由特定疾病产生的独特蛋白质结 构。这种情况的实例是引入将会产生对蛋白质的免疫应答的抗原，该 蛋白质导致在疾病如阿尔茨海默症，克罗伊茨费尔特-雅各布症(CJD) 和牛海绵状脑病(BSE)中观察到的淀粉状蛋白斑。尽管这种方法可能 只用于斑形成的减少，但它在如CJD的疾病情况中可能提供有疗效的 疫苗。这种疾病是由朊病毒蛋白的传染形式引起的。一些实施方案中， 本发明的多核苷酸编码朊病毒蛋白感染形式的抗原，使得由疫苗产生 的免疫应答可以消除、减轻或控制导致CJD的感染性蛋白。
一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的多核 苷酸编码的多肽包括传染病抗原或源自传染病抗原的抗原。一些实施 方案中，多肽包括传染病抗原。一些其他实施方案中，多肽包括源自 传染病抗原的抗原。一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/ 或表达载体的多核苷酸编码的多肽是传染病抗原或源自传染病抗原的 抗原。一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载体编码 的多肽是传染病抗原。一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/ 或表达载体编码的多肽源自传染病抗原。
本发明的其他实施方案中，抗原源自人或动物的病原体。病原体 可选地是病毒，细菌，真菌或原生动物。例如，抗原可以是病毒或真 菌或细菌抗原。一实施方案中，由重组核酸分子，表达盒和/或表达载 体编码的源自病原体的抗原是由病原体产生的蛋白质，或源自由病原 体产生的蛋白质。例如，一些实施方案中，由重组核酸分子，表达盒 和/或表达载体编码的多肽是由病原体产生的蛋白质的片段和/或变 体。
例如，一些实施方案中，抗原源自人免疫缺陷病毒(如gp120， gp160，gp41，gag抗原如p24gag和p55gag，以及源自HIV的pol， env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR区域的蛋白质)，猫免 疫缺陷病毒，或人或动物肝炎病毒。例如，一些实施方案中，抗原是 gp120。一实施方案中，抗原源自1型和2型单纯疱疹病毒(HSV)(如 gD，gB，gH，立即早期蛋白如ICP27)，来自细胞肥大病毒(如gB和 gH)，来自次肺病毒(metapneumovirus)，来自EB病毒或来自水痘- 带状疱疹病毒(如gpI，II或III)(参见，例如，Chee等(1990) Cytomegaloviruses(J.K.McDougall，编辑，Springer Verlag，pp. 125-169；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574；美国 专利No.5,171,568；Baer等，(1984)Nature 310：207-211；和Davison 等(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816.)
另一实施方案中，抗原源自肝炎病毒如乙肝病毒(例如，乙肝表 面抗原)，甲肝病毒，丙肝病毒，δ肝炎病毒，肝炎E病毒，或肝炎 G病毒。参见，例如，WO 89/04669；WO 90/11089和WO 90/14436。 肝炎抗原可以是表面，核心或其他相关的抗原。HCV基因组编码几种 病毒蛋白，包括E1和E2。参见，例如，Houghton等，Hepatology 14：381-388(1991)。
是病毒抗原的抗原任选地源自以下任一病毒科的病毒：小核糖核 酸病毒科(例如，脊髓灰质炎病毒，鼻病毒等)；杯状病毒科；外衣 病毒科(例如，风疹病毒，登革热病毒等)；黄病毒科；冠状病毒科； 呼肠弧病毒科(例如，轮状病毒等)；双RNA病毒科；弹状病毒科(例 如，狂犬病毒，等)；正粘病毒科(例如，甲，乙，丙型流感病毒， 等)；线状病毒科；副粘病毒科(例如，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼 吸道合胞病毒，副流感病毒，等)；布尼罗奥病毒科；沙粒病毒科； 逆转录病毒科(例如，HTLV-I；HTLV-11；HIV-1(也称为HTLV-111， LAV，ARV，hTLR，等))，其中包括但不限于来自分离物HIVI11b， HIVSF2，HTVLAV，HIVLAI，HIVMN；HIV-1CM235，HIV-1；HIV-2；猿 免疫缺陷病毒(SIV)；乳头瘤病毒，蝉传脑炎病毒；等的抗原。参见， 例如，Virology，第3版(W.K.Joklik编辑，1988)；Fundanental Virology，第3版(B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley编辑，1996)， 描述了这些和其他病毒。一实施方案中，抗原是Flu-HA(Morgan等， J.Immunol.160：643(1998))。
一些备选的实施方案中，抗原源自细菌病原体，如分枝杆菌属， 芽孢杆菌属，耶尔森氏菌属，沙门氏菌属，奈瑟氏球菌属(Neisseria)， 疏螺旋体属(Borrelia)(例如，OspA或OspB或其衍生物)，衣原 体属(Chlamydia)或博尔德氏菌(Bordetella)(例如，P.69，PT 和FHA)，或源自寄生虫如疟原虫或弓浆虫。一实施方案中，抗原源 自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(例如，ESAT-6， 85A，85B，85C，72F)，炭疽芽孢杆菌(例如，PA)或鼠疫耶尔森氏 菌(例如，F1，V)。此外，可以从已知引起疾病的病原体获得或产生 适用于本发明中的抗原，这些疾病包括，但不限于，白喉，百日咳， 破伤风，肺结核，细菌性肺炎或真菌性肺炎，中耳炎，淋病，霍乱， 伤寒，脑膜炎，单核细胞增多症，瘟疫，志贺氏菌病或沙门氏菌病， 军团病，拉姆病，麻风病，疟疾，钩虫病，盘尾丝虫病，血吸虫病， 锥虫病，利什曼病，贾第鞭毛虫病，阿米巴病，丝虫病，Borelia和 旋毛虫病。再更多的抗原可以从非常规病原体获得或产生，所述非常 规病原体如库鲁病，CJ病(CJD)，瘙痒病，遗传性貂脑病和慢性萎 缩病的病原体，或来自蛋白感染性颗粒如与疯牛病相关的朊病毒。
仍然其他实施方案中，抗原从神经变性疾病(如阿尔茨海默氏症)， 代谢疾病(如I型糖尿病)和药物成瘾(如尼古丁成瘾)的发作或进 展中所涉及的生物因子获得或产生。或者，由重组核酸分子编码的抗 原用于控制疼痛，且抗原是疼痛受体或疼痛信号传导中所涉及的其他 因子。
一些实施方案中，抗原是人蛋白质或源自人蛋白质。其他实施方 案中，抗原是非人蛋白质或源自非人蛋白质(其片段和/或变体)。一 些实施方案中，由表达盒编码的融合蛋白的抗原部分是来自非人动物 的蛋白质或是源自非人动物的蛋白质。例如，即使抗原将在用于人体 中的基于利斯特氏菌的疫苗中表达，一些实施方案中，抗原也可以是 鼠间皮素或源自鼠间皮素。
V.密码子最佳化
一些实施方案中，重组核酸分子，表达盒和/或表达载体内的一个 或多个多核苷酸(即，多核苷酸序列)是密码子最佳化的(相对于天 然编码序列)。一些实施方案中，在此所述的重组核酸分子(和/或表 达盒和/或表达载体)中的编码信号肽的多核苷酸对于在细菌中的表达 是密码子最佳化的。一些实施方案中，编码信号肽以外的多肽如抗原 或其他治疗性蛋白的多核苷酸，对于在细菌中的表达是密码子最佳化 的。一些实施方案中，编码信号肽的多核苷酸和编码另一与信号肽融 合的多肽的多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的。一些实 施方案中，编码用作支架的分泌蛋白(或其片段)的多核苷酸或编码 自溶素(或其片段或变体)的多核苷酸是密码子最佳化的。
如果多核苷酸天然编码序列的至少一个密码子已经被其中待表达 编码序列的生物体(“靶生物体”)比天然编码序列的原始密码子更 常用的密码子替代，则包括编码序列的多核苷酸是“密码子最佳化的”。 例如，如果至少一个来自天然细菌多核苷酸序列的密码子被其中待表 达非细菌抗原的特定细菌种中优先表达的密码子替代，则编码待在特 定细菌种中表达的非细菌抗原的多核苷酸是密码子最佳化的。作为另 一个实例，如果多核苷酸序列中的至少一个密码子被单核细胞增生利 斯特氏菌比原始人序列中的密码子更常用于该氨基酸的密码子替代， 则将为重组单核细胞增生利斯特氏菌中表达盒的一部分的编码人癌症 抗原的多核苷酸是密码子最佳化的。同样，如果编码信号肽的多核苷 酸序列中的至少一个密码子被单核细胞增生利斯特氏菌比原始(天然) 序列中的密码子更常用于该氨基酸的密码子替代，则将为重组单核细 胞增生利斯特氏菌中编码包括人癌症抗原的融合蛋白的表达盒的一部 分的编码单核细胞增生利斯特氏菌天然信号肽(如来自单核细胞增生 利斯特氏菌的LLO信号肽)的多核苷酸是密码子最佳化的。一些实施 方案中，密码子最佳化序列中被替代的至少一个密码子是被靶生物体 最常用于编码相同氨基酸的密码子替代的。
一些实施方案中，多核苷酸天然编码序列的至少两个密码子已经 被其中待表达编码序列的生物体比天然编码序列的原始密码子更常用 的密码子替代。一些实施方案中，多核苷酸天然编码序列的至少约5 个密码子，至少约10个密码子，或至少约20个密码子已经被其中待 表达编码序列的生物体比天然编码序列的原始密码子更常用的密码子 替代。
一些实施方案中，密码子最佳化多核苷酸中至少约10％的密码子 已经被靶生物体(比天然序列的原始密码子)更常用(或最常用)的 密码子替代。一些实施方案中，密码子最佳化多核苷酸中至少约25％ 的密码子已经被靶生物体更常用(或最常用)的密码子替代。其他实 施方案中，密码子最佳化多核苷酸中至少约50％的密码子已经被靶生 物体更常用(或最常用)的密码子替代。仍然其他实施方案中，密码 子最佳化多核苷酸中至少约75％的密码子已经被靶生物体更常用(或 最常用)的密码子替代。
本领域技术人员已经广泛研究了不同生物体的密码子优先选择。 例如，参见Sharp等，Nucleic Acids Res.，15：1281-95(1987)和 Uchijima等，The Journal of Immunology，161：5594-9(1998)。 结果，多种生物体的密码子选择表是公众可获得的。例如，可以在互 联网上以www.kazusa.or.jp/codon/以及在其他公众可获得的网站上 找到多种生物体的密码子选择表。(参见，例如，Nakamura等，(2000) Nucleic Acids Research 28：292。)来自www.kazusa.or.jp/codon/ 的示范密码子选择表，单核细胞增生利斯特氏菌的密码子选择表 (http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？specie s＝Listeria+monocytogenes+[gbbtc])，为了方便在以下的表2A中再 现。以下表2B，2C，2D，2E和2F中还分别提供了炭疽芽孢杆菌，结 核分枝杆菌，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，牛分枝 杆菌(Mycobacterium bovis)BCG和费氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的示范密码子选择表。
表2A：单核细胞增生利斯特氏菌的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
单核细胞增生利斯特氏菌：3262 CDS′s(1029006个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 29.4(30274) UUC 14.1(14486) UUA 36.8(37821) UUG 12.3(12704) UCU 13.2(13586) UCC 6.5(6714) UCA 10.4(10751) UCG 6.1(6278) UAU 22.9(23604) UAC 10.7(11055) UAA 2.2(2307) UAG 0.4(372) UGU 3.8(3960) UGC 1.9(1972) UGA 0.6(583) UGG 9.3(9580) CUU 21.0(21567) CUC 5.4(5598) CUA 12.9(13279) CUG 5.0(5120) CCU 8.4(8622) CCC 1.7(1780) CCA 18.5(18996) CCG 7.0(7219) CAU 12.0(12332) CAC 5.2(5336) CAA 29.9(30719) CAG 5.1(5234) CGU 12.6(12930) CGC 7.0(7215) CGA 5.6(5732) CGG 2.8(2884) AUU 49.3(50692) AUC 18.4(18894) AUA 9.4(9642) AUG 25.9(26651) ACU 17.1(17614) ACC 6.9(7089) ACA 26.5(27318) ACG 12.9(13285) AAU 33.0(33908) AAC 15.3(15790) AAA 61.6(63379) AAG 10.4(10734) AGU 14.1(14534) AGC 8.8(9031) AGA 6.9(7111) AGG 1.2(1254) GUU 26.4(27202) GUC 8.7(8990) GUA 21.6(22247) GUG 13.1(13518) GCU 24.3(24978) GCC 8.4(8612) GCA 28.6(29401) GCG 16.6(17077) GAU 39.8(40953) GAC 14.3(14751) GAA 60.4(62167) GAG 13.1(13507) GGU 24.2(24871) GGC 14.2(14581) GGA 19.1(19612) GGG 8.7(9003)
表2B：炭疽芽孢杆菌的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
炭疽芽孢杆菌[gbbct]：312CDS′s(90023个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 32.4(2916) UUC 10.4(934) UUA 43.7(3931) UUG 11.4(1024) UCU 17.2(1547) UCC 5.0(453) UCA 14.8(1330) UCG 4.2(375) UAU 31.9(2876) UAC 9.5(853) UAA 2.2(199) UAG 0.7(66) UGU 5.1(455) UGC 1.8(164) UGA 0.5(47) UGG 9.3(835) CUU 14.4(1300) CUC 3.7(335) CUA 12.4(1117) CUG 4.4(392) CCU 10.7(967) CCC 2.7(242) CCA 17.8(1599) CCG 5.9(534) CAU 15.5(1392) CAC 4.2(379) CAA 32.3(2912) CAG 9.5(859) CG0 9.8(883) CGC 2.5(223) CGA 6.3(569) CGG 2.0(179) AUU 44.5(4009) AUC 11.9(1072) AUA 22.7(2042) AUG 23.3(2098) ACU 21.0(1890) ACC 5.0(453) ACA 26.8(2414) ACG 9.4(844) AAU 44.0(3959) AAC 14.1(1268) AAA 64.3(5786) AAG 22.7(2047) AGU 17.4(1565) AGC 5.2(467) AGA 13.7(1236) AGG 4.1(368) GUU 20.3(1824) GUC 4.6(414) GUA 26.4(2374) GUG 10.8(973) GCU 17.8(1598) GCC 4.1(372) GCA 23.5(2117) GCG 7.9(709) GAU 39.3(3536) GAC 9.0(811) GAA 53.9(4855) GAG 17.9(1614) GGU 17.9(1611) GGC 5.8(524) GGA 24.5(2203) GGG 12.0(1083)
编码GC34.55％第一个字母GC44.99％第二个字母GC33.16％第三个字母GC25.51％
表2C：结核分枝杆菌的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
结核分枝杆菌[gbbct]：363CDS′s(131426个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 5.4(709) UUC 25.6(3359) UUA 1.8(231) UUG 14.8(1945) UCU 2.0(265) UCC 11.4(1499) UCA 4.3(571) UCG 19.2(2522) UAU 6.0(788) UAC 17.6(2307) UAA 0.4(52) UAG 0.8(103) UGU 2.5(326) UGC 5.6(738) UGA 1.5(201) UGG 17.9(2352) CUU 5.9(778) CUC 17.7(2329) CUA 4.0(521) CUG 45.9(6032) CCU 3.9(511) CCC 18.3(2411) CCA 6.4(843) CCG 33.2(4359) CAU 5.4(711) CAC 14.7(1928) CAA 7.8(1030) CAG 24.2(3176) CGU 8.0(1048) CGC 26.7(3508) CGA 5.8(764) CGG 21.1(2772) AUU 7.6(993) AUC 32.7(4300) AUA 2.1(282) AUG 19.7(2591) ACU 4.1(545) ACC 36.0(4735) ACA 4.7(616) ACG 16.4(2158) AAU 4.8(637) AAC 26.3(3451) AAA 5.8(761) AAG 26.5(3485) AGU 4.0(531) AGC 15.0(1976) AGA 1.5(192) AGG 3.3(429) GUU 8.3(1095) GUC 32.3(4249) GUA 4.7(622) GUG 35.7(4687) GCU 11.2(1473) GCC 51.5(6769) GCA 12.4(1625) GCG 41.7(5482) GAU 15.6(2046) GAC 44.6(5858) GAA 16.8(2211) GAG 35.8(4702) GGU 18.7(2455) GGC 48.6(6383) GGA 9.0(1183) GGG 16.9(2215)
编码GC64.43％第一个字母GC65.27％第二个字母GC48.28％第三个字母GC79.95％
表2D：鼠伤寒沙门氏菌的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
鼠伤寒沙门氏菌[gbbct]：1322CDS′s(416065个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 21.7(9041) UUC 15.1(6265) UUA 13.6(5650) UUG 12.1(5025) UCU 8.5(3518) UCC 10.6(4430) UCA 7.9(3286) UCG 9.4(3924) UAU 16.5(6853) UAC 11.6(4826) UAA 1.8(731) UAG 0.3(121) UGU 4.6(1920) UGC 6.1(2524) UGA 1.1(465) UGG 14.1(5851) CUU 12.1(5038) CUC 10.6(4396) CUA 4.7(1958) CUG 49.3(20508) CCU 7.9(3290) CCC 7.0(2921) CCA 6.5 (2712) CCG 22.7(9463) CAU 12.1(5047) CAC 9.2(3818) CAA 12.8(5315) CAG 30.8(12803) CGU 18.1(7542) CGC 20.8(8659) CGA 4.1(1695) CGG 7.2(3004) AUU 28.1(11700) AUC 23.9(9941) AUA 6.7(2771) AUG 26.1(10842) ACU 8.2(3401) ACC 24.0(9980) ACA 8.0(3316) ACG 18.6(7743) AAU 19.5(8107) AAC 21.4(8920) AAA 33.0(13740) AAG 12.4(5151) AGU 8.6(3569) AGC 18.0(7485) AGA 3.2(1348) AGG 2.3(959) GUU 16.4(6831) GUC 17.7(7367) GUA 11.9(4935) GUG 24.3(10092) GCU 14.4(5985) GCC 27.5(11462) GCA 14.8(6156) GCG 37.0(15387) GAU 32.9(13700) GAC 21.5(8949) GAA 36.1(15021) GAG 20.9(8715) GGU 18.1(7541) GGC 33.0(13730) GGA 9.1(3788) GGG 11.6(4834)
编码GC52.45％第一个字母GC58.32％第二个字母GC41.31％第三个字母GC57.71％
表2E：牛分枝杆菌BGG的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
牛分枝杆菌BGG[gbbct]：51CDS′s(16528个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 4.7(77) UUC 27.4(453) UUA 1.6(26) UUG 14.7(243) UCU 1.9(31) UCC 11.4(189) UCA 4.5(74) UCG 20.8(343) UAU 6.6(109) UAC 17.0c281) UAA 0.9(15) UAG 0.8(14) UGU 2.0(33) UGC 6.7(110) UGA 1.3(22) UGG 14.3(237) CUU 5.6(92) CUC 14.8(244) CUA 5.1(85) CUG 51.5(852) CCU 2.9(48) CCC 16.3(270) CCA 5.1(84) CCG 31.0(512) CAU 4.9(81) CAC 17.2(285) CAA 7.3(120) CAG 25.5(421) CGU 9.4(155) CGC 33.8(559) CGA 7.1(118) CGG 26.7(441) AUU 6.1(100) AUC 39.6(654) AUA 2.2(37) AUG 20.2(334) ACU 3.1(51) ACC 36.8(609) ACA 4.4(73) ACG 17.4(288) AAU 4.8(80) AAC 22.3(369) AAA 6.2(102) AAG 24.5(405) AGU 2.8(46) AGC 14.5(240) AGA 1.1(19) AGG 3.8(62) GUU 7.8(129) GUC 30.1(497) GUA 4.1(67) GUG 37.6(621) GCU 9.6(158) GCC 54.3(898) GCA 12.5(206) GCG 41.7(689) GAU 13.4(222) GAC 45.6(754) GAA 16.5(273) GAG 32.7(541) GGU 16.9(280) GGC 42.6(704) GGA 7.3(120) GGG 16.7(276)
编码GC64.82％第一个字母GC65.36％第二个字母GC48.07％第三个字母GC81.04％
表2F：费氏志贺氏菌的密码子选择表(来自 www.kazusa.or.jp/codon/)
费氏志贺氏菌[gbbct]：706CDS′s(180312个密码子)
区域：[三联体][频率：每一千]([数目])
UUU 25.8(4658) UUC 15.1(2714) UUA 20.8(3756) UUG 13.4(2424) UCU 16.6(2986) UCC 9.5(1717) UCA 15.6(2821) UCG 6.9(1241) UAU 21.9(3945) UAC 11.0(1992) UAA 2.0(362) UAG 0.5(91) UGU 6.9(1252) UGC 5.6(1011) UGA 1.4(254) UGG 13.1(2357) CUU 17.6(3169) CUC 10.4(1878) CUA 7.2(1295) CUG 33.5(6045) CCU 9.2(1656) CCC 5.9(1072) CCA 9.7(1744) CCG 12.2(2199) CAU 15.1(2725) CAC 8.2(1472) CAA 15.9(2861) CAG 23.6(4255) CGU 15.0(2707) CGC 12.6(2269) CGA 5.8(1046) CGG 9.0(1627) AUU 30.0(5417) AUC 16.1(3018) AUA 18.9(3402) AUG 23.3(4198) ACU 13.8(2480) ACC 13.4(2413) ACA 16.2(2930) ACG 10.0(1809) AAU 33.5(6044) AAC 18.6(3348) AAA 41.6(7507) AAG 16.4(2961) AGU 15.3(2764) AGC 12.7(2281) AGA 10.3(1865) AGG 5.7(1029) GUU 19.8(3576) GUC 11.8(2126) GUA 13.1(2370) GUG 16.1(2910) GCU 19.6(3527) GCC 18.5(3338) GCA 22.2(4009) GCG 15.2(2732) GAU 34.0(6123) GAC 16.3(2939) GAA 37.5(6763) GAG 21.7(3913) GGU 19.2(3468) GGC 15.3(2754) GGA 15.1(2727) GGG 10.9(1970)
编码GC44.63％第一个字母GC51.72％第二个字母GC38.85％第三个字母GC43.32％
本发明的一些实施方案中，密码子最佳化编码序列中至少约10％， 至少约25％，至少约50％或至少约75％的密码子是靶生物体中所用的该 氨基酸的最优选密码子。其他实施方案中，密码子最佳化编码序列中 100％的密码子是靶生物体中所用的该氨基酸的最优选密码子(即，该 序列是“完全密码子最佳化的”)。例如，以下所示的实施例中，表 征为密码子最佳化的序列的所有密码子都是靶生物体最常用的密码 子；然而，形成比原始(天然)序列更常用的密码子的任何密码子替 换可以认为是“密码子最佳化的”。以下的表3中显示了单核细胞增 生利斯特氏菌中对每个氨基酸的最佳密码子选择。
表3：单核细胞增生利斯特氏菌中的最佳密码子选择表
氨基酸 单字母代码 最佳的利斯特氏菌密码子 丙氨酸 A GCA 精氨酸 R CGU 天冬酰胺 N AAU 天冬氨酸 D GAU 半胱氨酸 C UGU 谷氨酰胺 Q CAA 谷氨酸 E GAA 甘氨酸 G GGU 组氨酸 H CAU 异亮氨酸 I AUU 亮氨酸 L UUA 赖氨酸 K AAA 甲硫氨酸 M AUG 苯丙氨酸 F UUU 脯氨酸 P CCA 丝氨酸 S AGU 苏氨酸 T ACA 色氨酸 W UGG 酪氨酸 Y UAU 缬氨酸 V GUU
一些实施方案中，密码子最佳化多核苷酸编码信号肽。一些实施 方案中，信号肽对其中序列为密码子最佳化的细菌是外源的。其他实 施方案中，信号肽对其中序列为密码子最佳化的细菌是天然的。例如， 一些实施方案中，密码子最佳化的多核苷酸编码信号肽，这些信号肽 选自单核细胞增生利斯特氏菌的LLO信号肽，乳酸乳球菌的USP45信 号肽，炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信号肽，单核细胞增生利斯特氏菌 的p60信号肽和枯草芽孢杆菌的PhoD信号肽Tat信号肽。一些实施方 案中，密码子最佳化的多核苷酸编码除炭疽芽孢杆菌的保护性抗原信 号肽以外的信号肽。一些实施方案中，编码信号肽的多核苷酸对于在 单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。
一些实施方案中，密码子最佳化的多核苷酸编码对其中多核苷酸 序列已经是密码子最佳化的细菌外源的(非信号肽)蛋白质。一些实 施方案中，密码子最佳化的多核苷酸编码包括抗原的多肽。例如，一 些实施方案中，密码子最佳化的多核苷酸编码包括抗原的多肽，该抗 原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原的抗原。
一些实施方案中，编码信号肽和/或其他多肽的多核苷酸的密码子 最佳化，相对于对应的没有密码子最佳化的多核苷酸提高了包括信号 肽和/或其他多肽的多肽(如融合蛋白，蛋白质嵌合体和/或由重组核 酸分子，表达盒或表达载体编码的外源多肽)在细菌中的表达。一些 实施方案中，多核苷酸的密码子最佳化提高了表达至少约2倍，至少 约5倍，至少约10倍，或至少约20倍(相对于对应的没有密码子最 佳化的多核苷酸而言)。一些实施方案中，编码信号肽和/或其他多肽 的多核苷酸的密码子最佳化，相对于对应的没有密码子最佳化的多核 苷酸，提高了包括信号肽和/或其他多肽的多肽(如融合蛋白，蛋白质 嵌合体和/或外源多肽)从细菌中的分泌。一些实施方案中，密码子最 佳化提高了分泌至少约2倍，至少约5倍，至少约10倍，或至少约 20倍(相对于对应的没有密码子最佳化的多核苷酸)。一些实施方案 中，同时提高了表达和分泌的水平。使用本领域的那些标准技术如各 种相关细菌培养物组分的蛋白质印迹分析可以容易地评定表达和/或 分泌的水平。
VI.表达盒
本发明还提供了表达盒。例如，一些实施方案中，本发明提供了 包括在此所述的任一重组核酸分子且进一步包括可操作地连接重组核 酸分子中编码序列(例如，编码信号肽的第一个多核苷酸和编码另一 多肽的第二个多核苷酸)的启动子序列的表达盒。一些实施方案中， 表达盒是分离的。一些其他实施方案中，表达盒包含于表达载体中， 该表达载体可以是分离的或可以包含于细菌内。仍然更多的实施方案 中，表达盒位于细菌的染色体DNA中。例如，一些实施方案中，表达 盒已经整合至细菌的基因组中。一些实施方案中，整合至细菌基因组 中的表达盒包括一个或多个来自基因组DNA的元件。例如，一些实施 方案中，重组核酸分子插入细菌基因组DNA的某一位点(例如，通过 位点特异性整合或同源重组)，使得该重组核酸可操作地连接已经存 在于基因组DNA中的启动子，因此产生整合至基因组DNA中的新表达 盒。一些其他的实施方案中，表达盒作为包括启动子和重组核酸分子 的完整单位整合至基因组DNA中(例如，通过位点特异性整合或同源 重组)。
一些实施方案中，设计表达盒用于在细菌中表达多肽。一些实施 方案中，设计表达盒用于在细菌中表达异源多肽如异源抗原。一些实 施方案中，表达盒提供了多肽提高的表达和/或分泌。
通常，表达盒包括以下有序元件：(1)启动子和(2)编码多肽 的多核苷酸。一些实施方案中，表达盒包括以下元件：(1)启动子； (2)编码信号肽的多核苷酸；和(3)编码多肽(例如，异源蛋白质) 的多核苷酸。仍然其他实施方案中，表达盒包括以下元件：(1)原核 生物的启动子；(2)SD序列；(3)编码信号肽的多核苷酸；和(4) 编码多肽(如异源蛋白质)的多核苷酸。一些实施方案中，表达盒包 括多于一个启动子。
一些实施方案中，表达盒还可以包含插入与异源多肽相关的翻译 终止密码子C-末端下游的转录终止序列。例如，一些实施方案中，转 录终止序列可以在设计用于稳定整合至细菌染色体内的构建体中使 用。尽管不需要，将转录终止序列作为最终的有序元件包含于异源基 因表达盒中可以防止由于连读转录引起的对邻近基因表达调节的极性 影响。因此，一些实施方案中，本领域技术人员已知的促进依赖rho 的和不依赖rho的转录终止的合适序列元件可以置于异源蛋白质表达 盒中。
一方面中，本发明提供了包括以下成分的表达盒：(a)编码信号 肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密 码子最佳化的；(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷 酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中；和(c)可操作地连接第 一个和第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和多肽 的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了表达盒，包括(a)编码细菌天然信号 肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密 码子最佳化的，(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷 酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，和(c)可操作地连接表 达盒的第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中重组核酸分子编码包 括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编 码的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸与 第一个多核苷酸是异源的。一些实施方案中，多肽对信号肽为天然的 细菌是异源的(即，对细菌是外源的)。一些实施方案中，产生信号 肽的细菌是胞内细菌。一些实施方案中，细菌选自利斯特氏菌属，芽 孢杆菌属，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属， 分枝杆菌和大肠杆菌。一些实施方案中，细菌是利斯特氏菌属的细菌 (例如，单核细胞增生利斯特氏菌)。一些实施方案中，第二个多核 苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的。
另一方面中，本发明提供了表达盒，其中表达盒包括(a)编码信 号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在利斯特氏菌属细 菌中的表达是密码子最佳化的，(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其 中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，和(c) 可操作地连接表达盒的第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中重组 核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，表达 盒是多顺反子表达盒。一些实施方案中，第二个多核苷酸对于在利斯 特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，由第二 个多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外源的(即，对利斯特 氏菌属细菌是异源的)。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的 多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，表达盒包括多于一个启动 子。
另一方面中，本发明提供了表达盒，包括(a)编码非-secA1细 菌信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译 读框内的编码多肽的第二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和 第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和多肽的融合 蛋白。一些实施方案中，第一个多核苷酸和/或第二个多核苷酸对于在 细菌中的表达是密码子最佳化的，所述细菌如利斯特氏菌属，芽孢杆 菌属，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分 枝杆菌或大肠杆菌。一些实施方案中，多核苷酸对于在利斯特氏菌如 单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案 中，由密码子最佳化的第一个多核苷酸编码的信号肽对密码子最佳化 的细菌是天然的。一些实施方案中，编码信号肽的第一个多核苷酸与 第二个多核苷酸是异源的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码 的多肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，表达盒是多顺反子表达 盒。一些实施方案中，第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个 和第二个多核苷酸两者对于在利斯特氏菌属细菌(例如，单核细胞增 生利斯特氏菌)中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一 个和第二个多核苷酸是彼此异源的。一些实施方案中，由第二个多核 苷酸编码的多肽和信号肽是彼此异源的。一些实施方案中，由第二个 多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属细菌是外源的(即，对利斯特氏 菌属细菌是异源的)。一些实施方案中，表达盒包括多于一个启动子。
本发明还提供了包括以下成分的表达盒：(a)编码利斯特氏菌外 源多肽的多核苷酸，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码 子最佳化的；和(b)启动子，可操作地连接编码外源多肽的多核苷酸。 一些实施方案中，由表达盒编码的多肽是抗原(例如，参见以上一些 可能抗原的描述)。一些实施方案中，表达盒进一步包括编码信号肽 的多核苷酸。编码信号肽的多核苷酸也可操作地连接启动子，使得表 达盒表达包括外源多肽和信号肽两者的融合蛋白。适用于表达盒中的 编码信号肽的多核苷酸包括，但不限于，以上描述的那些。一些实施 方案中，包括于表达盒中的编码信号肽的多核苷酸对于在细菌如如上 所述的利斯特氏菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)中的表达是密 码子最佳化的。
本发明还提供了包括以下成分的表达盒：(a)编码非利斯特氏菌 信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读 框中的编码多肽的第二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第 二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码包括非利斯特氏菌信号肽和 多肽两者的融合蛋白。一些实施方案中，表达盒是多顺反子表达盒。 一些实施方案中，第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个和第 二个多核苷酸两者对于在利斯特氏菌(例如，单核细胞增生利斯特氏 菌)中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一个和第二个 多核苷酸是彼此异源的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的 多肽和信号肽是彼此异源的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编 码的多肽对利斯特氏菌属的细菌是外源的(即，对利斯特氏菌属的细 菌是异源的)。一些实施方案中，表达盒包括多于一个启动子。
本发明进一步提供了表达盒，其中表达盒包括(a)编码细菌自溶 素或其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸；和(b)编码 多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸 相同的翻译读框中，和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的 启动子，其中表达盒编码包括由第二个多核苷酸编码的多肽和自溶素 或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其中在蛋白质嵌 合体中，多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变体融合，或插 入自溶素或其催化活性片段或催化活性变体内。一些实施方案中，蛋 白质嵌合体具有和自溶素一样的催化活性。一些实施方案中，多肽与 自溶素是异源的。一些实施方案中，细菌自溶素来自胞内细菌(例如， 利斯特氏菌)。一些实施方案中，将编码多肽的第二个多核苷酸插入 编码自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸内， 且表达盒编码其中多肽插入自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 内的蛋白质嵌合体(即，多肽包埋于自溶素或其催化活性片段或催化 活性变体内)。备选的实施方案中，第二个多核苷酸位于编码自溶素 或其催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸之外，且表达盒 编码其中多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变体融合的蛋白 质嵌合体。一些实施方案中。多肽与自溶素是异源的。一些实施方案 中，第一个多核苷酸和第二个多核苷酸是彼此异源的。一些实施方案 中，自溶素是SecA2-依赖性自溶素。一些实施方案中，自溶素是肽聚 糖水解酶(例如，N-乙酰胞壁酸酶或p60)。一些实施方案中，表达 盒进一步包括编码信号肽(例如，通常与自溶素相关的信号肽或与该 信号肽异源的信号肽)的多核苷酸。例如，一些实施方案中，表达盒 编码包括p60信号肽，p60蛋白质(或其催化活性片段或催化活性变 体)和包埋于p60序列中的与p60异源的多肽的蛋白质嵌合体。一些 实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽是非利斯特氏菌多肽。
另一方面中，本发明提供了表达盒，包括(a)编码信号肽的第一 个多核苷酸，(b)编码分泌蛋白或其片段的第二个多核苷酸，其中第 二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，(c)编码与 分泌蛋白或其片段异源的多肽的第三个多核苷酸，其中第三个多核苷 酸位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读框中，和(d)可操 作地连接第一个，第二个和第三个多核苷酸的启动子，其中重组核酸 分子编码包括信号肽，由第二个多核苷酸编码的多肽和分泌蛋白或其 片段的蛋白质嵌合体，且其中在蛋白质嵌合体中，由第三个多核苷酸 编码的多肽与分泌蛋白或其片段融合，或位于分泌蛋白或其片段内。
一些实施方案中，在此所述的表达盒(或在此所述的重组核酸分 子)中的启动子是原核生物启动子。例如，原核生物启动子可以是利 斯特氏菌启动子。一些实施方案中，利斯特氏菌启动子是hly启动子。 一些实施方案中，启动子是prfA-依赖性启动子(例如，actA启动子)。 一些实施方案中，启动子是组成型启动子(例如，p60启动子)。一 些实施方案中，包括在此所述的重组核酸分子的表达盒包括可操作地 连接重组核酸分子的多核苷酸的hly，actA或p60启动子。考虑到表 达盒的预期用途和将放置表达盒的宿主细菌本领域技术人员能够容易 地鉴定出适用于表达盒中的另外的原核生物和/或利斯特氏菌启动子。
例如，适用于分枝杆菌和其他细菌内的重组表达盒中的多种分枝 杆菌启动子是已知的。这些启动子包括牛分枝杆菌BCG启动子HSP60 和HSP70，还包括这样的启动子如分枝菌素启动子，结核分枝杆菌和 BCG的α-抗原启动子和45KDa抗原启动子，超氧化物歧化酶启动子， MBP-70，分枝杆菌asd启动子，分枝杆菌14kDa和12kDa抗原启动子， 分枝杆菌噬菌体启动子如Bxb1，Bxb2和Bxb3启动子，L1和L5启动 子，D29启动子和TM4启动子(参见，例如，美国专利No.6,566,121)。 适用于炭疽芽孢杆菌中的启动子包括，但不限于，pagA启动子，α- 淀粉酶启动子(Pamy)和Pntr(参见，例如，Gat等，Infect.Immun.， 71；801-13(2003))。适用于重组沙门氏菌表达盒和疫苗中的启动 子也是已知的并包括nirB启动子，osmC启动子，P(pagC)和P(tac) (参见，例如Bumann，Infect.Immun.69：7493-500(2001)；Wang 等，Vaccine，17：1-12(1999)；McSorley等，Infect.Immun.65：171-8 (1997))。多种大肠杆菌启动子也是本领域普通技术人员已知的。
一些实施方案中，在此所述的表达盒中所用的启动子是组成型启 动子。其他实施方案中，在此所述的表达盒中所用的启动子是诱导型 启动子。用其中将使用表达盒的细菌的内源分子(例如，蛋白质)可 以诱导诱导型启动子。或者，可以用其中将使用表达盒的细菌的异源 分子(例如，小分子或蛋白质)来诱导诱导型启动子。多种诱导型启 动子是本领域普通技术人员公知的。
表达盒的一些实施方案中，启动子的3’-端是多嘌呤SD序列，即 30S核糖体亚基(经由16S rRNA)与异源基因RNA转录物衔接和翻译 启动所需要的元件。SD序列通常具有以下的共有序列：5’ -NAGGAGGU-N5-10-AUG(起始密码子)-3’(SEQ ID NO：85)。存在多 嘌呤SD序列的变异。特别地，编码利斯特氏菌溶素O(LLO)的利斯 特氏菌hly基因具有以下的SD序列：AAGGAGAGTGAAACCCATG(SEQ ID NO：70)(加下划线的是SD序列，加粗的是翻译起始密码子)。
用于细菌中的表达盒的构建，甚至专门用于重组细菌疫苗中的表 达盒的构建，是本领域已知的。例如，多种细菌表达盒和/或重组细菌 疫苗的生产和使用的描述可以在以下参考文献中找到，其中每篇在此 以其整体引入作为参考：Horwitz等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA， 97：13853-8(2000)；Garmory等，JDrug Target，11：471-9(2003)； Kang等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.，37：99-104(2003)； Garmory等，Vaccine，21：3051-7(2003)；Kang等，Infec t.Immun.， 1739-49(2002)；Russman等，J.Immunol.，167：357-65(2001)； Harth等，Microbiology，150：2143-51(2004)；Varaldo等，Infect. Immun.，72：3336-43(2004)；Goonetilleke等，J.Immunol.，171： 1602-9(2003)；Uno-Furuta等，Vaccine，21：3149-56(2003)； Biet等，Infect.Immun.，71：2933-7(2003)；Bao等，Infect.Immun. 71：1656-61(2003)；Kawahara等，Clin.Immunol.，105：326-31 (2002)；Anderson等，Vaccine，18：2193-202(2000)；Bumann，Infect Immun.，69：7493-500(2001)；Wang等，Vaccine，17：1-12(1999)； McSorley等，Infect.Immun.，65：171-8(1997)；Gat等，Infect. Immun.，71：801-13(2003)；美国专利No.5,504,005；美国专利 No.5,830,702；美国专利No.6,051,237；美国专利公开No. 2002/0025323；美国专利公开No.2003/0202985；WO 04/062597；美 国专利No.6,566,121；和美国专利No.6,270,776。
一些实施方案中，理想的是构建利用异源编码序列的双顺反子， 多顺反子(也称为多重顺反子)表达的表达盒。这样的表达盒可以利 用，例如，可操作地连接两个或多个独立编码序列的单个启动子。这 些编码序列可以，例如，对应于单独的基因或可以对应于整个指定基 因所需的和/或选定的亚片段。该后一实例中，基因可以含有编码疏水 跨膜结构域的序列，该结构域可以潜在地抑制从利斯特氏菌的有效分 泌。因此，在两个亚片段中使该基因的编码序列与疏水结构域隔开可 能是理想的；这种情况下，然后将两个亚片段表达为双顺反子信息。 使用多顺反子表达需要第一个编码序列翻译终止和50s核糖体亚基的 释放后30S核糖体亚基停留在多顺反子RNA信息上，随后“连读”RNA 信息至下一个起始密码子，该过程中50s核糖体亚基与结合了RNA的 30s核糖体亚基结合，并再次启动翻译。
单核细胞增生利斯特氏菌，和其他细菌一样，利用其基因组所有 组成成分的多顺反子表达。例如，来自选定的多顺反子信息的单核细 胞增生利斯特氏菌的基因间隔区可以用于构建多顺反子表达盒用于表 达来自重组利斯特氏菌种的选定的异源蛋白质。例如，从多顺反子信 息表达来自单核细胞增生利斯特氏菌的几个prfA-依赖性毒力因子。 例如，单核细胞增生利斯特氏菌ActA和PlcB蛋白质作为双顺反子信 息来表达。以下显示了对应于单核细胞增生利斯特氏菌actA-plcB基 因间序列的DNA序列(5’-3’)：
5’-TAAAAACACAGAACGAAAGAAAAAGTGAGGTGAATGA-3’(SEQ ID NO：71)
(用粗体显示了plcB翻译起始的SD序列。序列的头3个核苷酸 对应于Ochre终止密码子)。对于双顺反子表达载体的非限制性实例， 用于单核细胞增生利斯特氏菌中的双顺反子hEphA2表达载体，参见以 下的实施例28。
或者，其他已知的基因间隔区或合成序列可以用于构建用于利斯 特氏菌或其他细菌中的多顺反子表达盒。应当防止导致实质性二级 RNA结构的基因间隔区的构建，来避免不需要的通过不依赖rho的机 理的转录终止。
重要地，如果需要从多顺反子信息表达的任何或全部翻译蛋白质 的分泌，信号肽必需功能上连接每个编码区。一些实施方案中，这些 信号肽彼此不同。
因此，一些实施方案中，在此所述的用于利斯特氏菌或其他细菌 中的表达盒是多顺反子的(例如，双顺反子的)。由双顺反子或多顺 反子表达盒编码作为离散多肽的两个或多个多肽。一些实施方案中， 双顺反子或多顺反子表达盒包括位于这两个多肽编码序列之间的基因 间序列(例如，来自双顺反子或多顺反子基因)。一些实施方案中， 基因间序列包括促进核糖体进入和翻译起始的序列。一些实施方案中， 基因间序列包括SD序列。一些实施方案中，基因间序列是单核细胞增 生利斯特氏菌actA-plcB基因间序列。通常，基因间序列位于编码第 一个多肽(或包括第一个多肽和信号肽的第一个融合蛋白)的多核苷 酸序列和编码第二个多肽(或包括第二个多肽和信号肽的第二个融合 蛋白)的多核苷酸序列之间。
因此，一方面中，本发明提供了包括以下成分的表达盒：(a)编 码第一个多肽的第一个多核苷酸；(b)编码第二个多肽的第二个多核 苷酸；(c)位于第一个和第二个多核苷酸之间的基因间序列；和(f) 可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码作 为两个离散多肽的第一个和第二个多肽。一些实施方案中，第一个和 第二个多肽是选自在此(例如，在以上IV部分中)所述任一种多肽的 多肽。一些实施方案中，第一个或第二个多肽中至少一个包括抗原。 一些实施方案中，第一个和第二个多核苷酸各自包括相同抗原的(不 同或相同)片段。一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原或源自肿瘤 相关抗原。
本发明进一步提供了包括以下成分的表达盒：(a)编码第一个信 号肽的第一个多核苷酸；(b)编码第一个(非信号)多肽的第二个多 核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框 中；(c)编码第二个信号肽的第三个多核苷酸；(d)编码第二个(非 信号)肽的第四个多核苷酸，其中第四个多核苷酸位于和第三个多核 苷酸相同的翻译读框中；(e)基因间序列(通常位于第二个多核苷酸 和第三个多核苷酸之间)；和(f)可操作地连接第一个多核苷酸，第 二个多核苷酸，第三个多核苷酸和第四个多核苷酸的启动子，使得表 达盒编码包括第一个信号肽和第一个多肽的第一个融合蛋白以及包括 第二个信号肽和第二个多肽的第二个融合蛋白。一些实施方案中，编 码信号肽的一个或多个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化 的。一些实施方案中，第三个和/或第四个多核苷酸对于在细菌中的表 达是密码子最佳化的(优选除了编码信号肽的多核苷酸的密码子最佳 化以外)。一些实施方案中，第一个和/或第二个信号肽是非-secA1 细菌信号肽。一些实施方案中，基因间序列是单核细胞增生利斯特氏 菌actA-plcB基因间序列。一些实施方案中，第二个和第三个多肽是 选自在此(例如，在以上的IV部分)所述的任一种多肽的多肽，如包 括抗原的多肽。一些实施方案中，第一个和第二个多肽是选自在此(例 如，在以上的IV部分中)所述的任一种多肽的多肽。一些实施方案中， 第一个或第二个多肽中至少一个包括抗原。一些实施方案中，第一个 和第二个多肽各自包括相同抗原的片段。一些实施方案中，抗原是肿 瘤相关抗原或源自肿瘤相关抗原。
例如，本发明提供了用于在利斯特氏菌中表达异源多肽的多顺反 子表达盒，其中表达盒编码至少两个离散的非利斯特氏菌多肽。一些 实施方案中，多顺反子表达盒是双顺反子表达盒，其编码两个离散的 非利斯特氏菌多肽。一些实施方案中，表达盒包括下列：(a)编码第 一个非利斯特氏菌多肽的第一个多核苷酸；(b)编码第二个非利斯特 氏菌多肽的第二个多核苷酸；(c)第一个和第二个多核苷酸之间的基 因间序列；和(d)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子， 其中表达盒编码作为两个离散多肽的第一个和第二个多肽。如果表达 盒是编码作为离散多肽的三个多肽的多顺反子表达盒，则表达盒将包 括可操作地连接启动子的第三个多核苷酸以及位于第二个和第三个多 核苷酸之间的第二个基因间序列。一些实施方案中，至少一个非利斯 特氏菌多肽包括抗原。一些实施方案中，至少两个非利斯特氏菌多肽 各自包括相同抗原的片段。
一些实施方案中，表达盒包括下列：(a)编码第一个信号肽的第 一个多核苷酸；(b)编码第一个(非信号)非利斯特氏菌多肽的第二 个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译 读框中；(c)编码第二个信号肽的第三个多核苷酸；(d)编码第二 个(非信号)非利斯特氏菌多肽的第四个多核苷酸，其中第四个多核 苷酸位于和第三个多核苷酸相同的翻译读框中；(e)位于第二个多核 苷酸和第三个多核苷酸之间的基因间序列；和(f)可操作地连接第一 个多核苷酸，第二个多核苷酸，第三个多核苷酸和第四个多核苷酸的 启动子，使得表达盒编码包括第一个信号肽和第一个多肽的第一个融 合蛋白以及包括第二个信号肽和第二个多肽的第二个融合蛋白。一些 实施方案中，至少一个非利斯特氏菌多肽是抗原。一些实施方案中， 至少两个非利斯特氏菌多肽各自是相同抗原的片段。
本发明还提供了使用在此所述的任一表达盒来生产重组细菌(例 如，重组利斯特氏菌属的细菌)的方法。一些实施方案中，使用在此 所述的表达盒来制备重组细菌的方法包括将表达盒引入细菌中。一些 实施方案中，将表达盒整合至细菌的基因组中。一些其他实施方案中， 表达盒是位于引入细菌的质粒上。一些实施方案中，通过接合来进行 表达盒进入细菌的引入。表达盒进入细菌中的引入可以通过本领域已 知的任一种标准技术来实现。例如，通过接合，转导(转染)或转化 来进行表达盒进入细菌的引入。
VII.载体
本发明进一步提供了载体，如表达载体，其包括在此所述的任一 表达盒和/或重组核酸分子。一些实施方案中，载体是质粒，一些实施 方案中，载体是线性的。一些实施方案中，载体是环状的。一些实施 方案中，载体是整合或同源重组载体。一些实施方案中，载体是 pAM401。一些实施方案中，载体是pPL2。一些实施方案中，载体是分 离的。
如上所述，一些实施方案中，在此所述的表达盒包含于表达载体 内。一些实施方案中，载体是质粒。其他实施方案中，载体是线性的。 备选的实施方案中，使用表达载体将表达盒插入(即，整合)至细菌 的基因组DNA中。一些实施方案中，表达载体是线性的。其他实施方 案中，表达载体是环状的。
适用于细菌如利斯特氏菌中的表达载体是本领域技术人员已知 的。存在多种合适的载体适于用作质粒构建体骨架用于装配表达盒。 基于需要多核苷酸(即，编码异源抗原的多核苷酸)的表达是来自细 菌染色体还是来自染色体外的游离基因来选择特定质粒构建体骨架。
一些实施方案中，使用含有利斯特氏菌噬菌体整合酶的表达盒的 整合载体来完成表达盒(和/或重组核酸分子)进入单核细胞增生利斯 特氏菌(利斯特氏菌)的细菌染色体中的掺入，所述整合酶催化载体 进入利斯特氏菌染色体中的序列特异性整合。例如，称为pPL1和pPL2 的整合载体执行细菌基因组无害区域内的异源蛋白质表达盒的稳定单 拷贝整合，并且已经描述于文献中(Lauer等，2002， J.Bacteriol.184：4177-4178；美国专利公开No.20030203472)。整 合载体作为大肠杆菌中的质粒是稳定的并通过接合引入所需的利斯特 氏菌背景中。每个载体缺乏利斯特氏菌特异性的复制起点并编码噬菌 体整合酶，使得载体只在整合至染色体噬菌体附着位点中时是稳定的。 用所需的质粒构建体开始，产生表达所需蛋白质的重组利斯特氏菌菌 株的过程大约需要一周时间。pPL1和pPL2整合载体各自基于U153和 PSA利斯特氏菌噬菌体。pPL1载体在comK基因的开放读框内整合，而 pPL2在tRNAArg基因内整合，用这样的方式使得基因的天然序列在成 功整合时得到恢复，因此保持其天然表达功能的完整。pPL1和pPL2 整合载体包含多克隆位点序列，以便有助于含有重组核酸分子的质粒 或表达盒如异源蛋白表达盒的构建。以下实施例2和实施例3中描述 了使用pPL2整合载体的一些具体实例。
或者，通过本领域技术人员已知的等位基因交换方法来完成表达 盒(和/或重组核酸分子)进入利斯特氏菌染色体中的掺入。特别地， 其中不需要引入编码抗生素抗性蛋白的基因作为含有表达盒的构建体 的一部分的组合物，等位基因交换方法是理想的。例如，pKSV7载体 (Camilli等，Mol.Microbiol.(1993)8，143-157)，含有温度敏 感性利斯特氏菌革兰氏阳性复制起点，将其用于在非许可温度下选择 代表重组至利斯特氏菌染色体中的pKSV7质粒的重组克隆。pKSV7等 位基因交换质粒载体含有多克隆位点序列，以便有助于含有蛋白表达 盒以及氯霉素抗性基因的质粒的构建。为了插入利斯特氏菌染色体中， 表达盒构建体可以侧接约1kb的对应于所需整合精确位置的染色体 DNA序列。根据革兰氏阳性细菌电穿孔的标准方法，通过电穿孔可以 将pKSV7-表达盒质粒引入所需的细菌菌株中。以下的实施例16中提 供了使用pSKV7载体来实现等位基因交换的方法的非限制性实施例。
其他实施方案中，可能希望从稳定的质粒游离基因中表达多肽(包 括含有多肽的融合蛋白)。通过多世代的传代维持质粒游离基因需要 蛋白的共表达，该蛋白对于含质粒的细菌给予选择优势。作为非限制 性实例，结合多肽从质粒共表达的蛋白可以是抗生素例如氯霉素抗性 蛋白，或可以是也能赋予选择优势的细菌蛋白(从野生型细菌的染色 体表达的蛋白)。细菌蛋白的非限制性实例包括嘌呤或氨基酸生物合 成所需要的酶(使用缺少相关氨基酸或其他必需前体大分子的成分明 确培养基选择的)，或赋予体外或体内选择优势的基因表达所需要的 转录因子(Gunn等，2001，J.Immuol.167：6471-6479)。作为非限 制性实例，pAM401是合适的质粒用于选定多肽在不同的革兰氏阳性细 菌属中的游离基因表达(Wirth等，1986 J.Bacteriol 165：831-836)。 对于使用pAM401的实例的进一步描述，参见以下的实施例3和13。
例如，用含有噬菌体整合酶的表达盒的整合载体可以实现表达盒 进入炭疽芽孢杆菌的细菌染色体的掺入，所述整合酶催化载体进入炭 疽芽孢杆菌染色体中的序列特异性整合。炭疽芽孢杆菌噬菌体的整合 酶和附着位点可以用于衍生整合载体，将所需的抗原表达盒引入疫苗 组合物中，作为非限制性的实例，炭疽芽孢杆菌温和噬菌体w-α的整 合酶和附着位点用于衍生炭疽芽孢杆菌特异性整合载体(McCloy， E.W.1951，Studies on a lysogenic Bacillusus strain(对溶源芽 孢杆菌菌株的研究)I.A bacteriophage specific for Bacillusus anthracis(对炭疽芽孢杆菌具有特异性的噬菌体) J.Hyg.49：114-125)。
或者，通过本领域技术人员已知的等位基因交换方法可以完成抗 原表达盒进入炭疽芽孢杆菌染色体中的掺入。参见，例如，Gat等， Infect.Immun，71；801-13(2003)。特别是，其中不需要引入编码 抗生素抗性蛋白的基因作为含有表达盒的构建体的一部分的组成，等 位基因交换方法是理想的。例如，pKSV7载体(Camilli等，Mol. Microbiol.(1993)8，143-157)，含有温度敏感性利斯特氏菌革兰 氏阳性复制起点，将其用于在非许可温度下选择代表重组至细菌染色 体中的pKSV7质粒的重组克隆。pKSV7等位基因交换质粒载体含有多 克隆位点序列，以便有助于含有蛋白表达盒以及氯霉素抗性基因的质 粒的构建。为了插入炭疽芽孢杆菌染色体中，表达盒构建体可以侧接 约1kb的对应于所需整合精确位置的染色体DNA序列。根据革兰氏阳 性细菌电穿孔的标准方法，通过电穿孔可以将pKSV7-表达盒质粒引入 所需的细菌菌株中。美国专利申请系列号10/883,559提供了在炭疽芽 孢杆菌中实现等位基因交换方法的非限制性实例，在此以其整体引入 作为参考。特别地，使用pKSV7载体的等位基因交换可以用于炭疽芽 孢杆菌菌株中以在细菌染色体内的任何所需位置加入所需的抗原表达 盒。
上述使用pKSV7的等位基因交换方法可广泛适用于在革兰氏阳性 细菌中使用，此外，用于细菌中的多种表达载体，包括重组细菌载体， 是本领域普通技术人员已知的。实例包括以下参考文献中所描述的那 些载体，其中每篇在此以其整体引入作为参考：Horwitz等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，97：13853-8(2000)；Garmory等，J：Drug Target， 11：471-9(2003)；Kang等，FEMS Immunol.Med.Microbiol.，37： 99-104(2003)；Garmory等，Vaccine，21：3051-7(2003)；Kang等， Infect.Immun.，1739-49(2002)；Russman等，J.Immunol.，167： 357-65(2001)；Harth等，Microbiology，150：2143-51(2004)； Varaldo等，Infect.Immun.，72：3336-43(2004)；Goonetilleke 等，J：Immunol.，171：1602-9(2003)；Uno-Furuta等，Vaccine， 21：3149-56(2003)；Biet等，Infect.Immun.，71：29 33-7(2003)； Bao等，Infec t.Immun.，71：1656-61(2003)；Kawaha ra等，Clin. Immunol，105：326-31(2002)；Anderson等，Vaccine，18：2193-202 (2000)；Bumann，Infect.Immun.，69：7493-500(2001)；Wang等， Vaccine，17：1-12(1999)；McSorley等，Infect Immun.，65：171-8 (1997)；Gat等，Infect.Immun.，71：801-13(2003)；美国专利 No.5,504,005；美国专利No.5,830,702；美国专利No.6,051,237； 美国专利公开No.2002/0025323；美国专利公开No.2003/0202985； WO 04/062597；美国专利No.6,566,121；和美国专利No.6,270,776。
本发明进一步提供了包括表达盒的表达载体，该表达盒包括下列： (a)编码第一个信号肽的第一个多核苷酸；(b)编码第一个多肽的 第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的 翻译读框中；(c)基因间序列；(d)编码第二个信号肽的第三个多 核苷酸；(e)编码第二个多肽的第四个多核苷酸，其中第四个多核苷 酸位于和第三个核苷酸相同的翻译读框中；和(f)可操作地连接第一 个多核苷酸，第二个多核苷酸，第三个多核苷酸，第四个多核苷酸和 基因间序列的启动子，使得表达盒编码包括第一个信号肽和第一个多 肽的第一个融合蛋白以及包括第二个信号肽和第二个多肽的第二个融 合蛋白。
本发明进一步提供了使用在此所述的任一种表达载体来生产重组 细菌(例如，重组利斯特氏菌属的细菌)的方法。一些实施方案中， 使用在此所述的表达载体来制备重组细菌的方法包括将表达载体引入 细菌中。
VIII.细菌和其他宿主细胞
本发明进一步提供了包括在此所述的重组核酸分子，表达盒和/ 或载体的宿主细胞(参见，例如，以上的发明概述和发明详述的第I， II，VI和VII部分以及以下的具体实施例)。一些实施方案中，细胞 是原核生物的。一些实施方案中，细胞是真核生物的。一些实施方案 中，细胞是哺乳动物的。一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，如 树突细胞。一些实施方案中，细胞是细菌细胞。一些实施方案中，宿 主细胞是分离的。
例如，本发明提供了包括在此所述的重组核酸分子，表达盒和/ 或载体的细菌(参见，例如，以上的发明概述和发明详述的第I，II， VI和VII部分以及以下的具体实施例)。包括这些多核苷酸的细菌在 此备选地称为“重组细菌”，且包括在此所述的重组核酸分子，表达 盒或载体的细菌在此备选地称为“重组细菌”。一些实施方案中，包 括重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的细菌是分离的。一些实施方 案中，包括重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的重组细菌表达由其 中所含的重组核酸分子，表达盒和/或表达载体编码的多肽或融合蛋 白。一些实施方案中，重组细菌分泌由其中所含的重组核酸分子，表 达盒和/或表达载体编码的多肽或融合蛋白。一些实施方案中，重组细 菌表达和分泌多肽和/或融合蛋白，其量足以在将细菌(或含有细菌的 组合物)给予宿主(例如，人患者)时在宿主中产生免疫应答。
一些实施方案中，细菌选自革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌， 胞内细菌和分枝杆菌。一些实施方案中，细菌是革兰氏阳性细菌。本 发明的一些实施方案中，细菌是胞内细菌(例如，兼性的胞内细菌)。 一些实施方案中，细菌属于利斯特氏菌属。其他实施方案中，细菌是 单核细胞增生利斯特氏菌种的成员。一些其他实施方案中，细菌是伊 氏利斯特氏菌(Listeria ivanovii)，斯氏利斯特氏菌(Listeria seeligerii)或无害利斯特氏菌(Listeria innocuai)种的成员。 一些实施方案中，细菌是芽孢杆菌属的成员。另一实施方案中，细菌 是炭疽芽孢杆菌。仍然另一实施方案中，细菌是鼠疫耶尔森氏菌。本 发明的其他实施方案中，细菌来自沙门氏菌属。一些实施方案中，细 菌是鼠伤寒沙门氏菌。一些实施方案中，细菌属于志贺氏菌属。例如， 一些实施方案中，细菌是费氏志贺氏菌。一些实施方案中，细菌是布 鲁氏菌属的成员。备选的实施方案中，细菌是分枝杆菌。分枝杆菌任 选地是结核分枝杆菌种的成员，一些实施方案中，细菌是卡介苗(BCG)。 一些实施方案中，细菌是大肠杆菌，例如，已经修饰来表达利斯特氏 菌溶素O(LLO)的大肠杆菌。因此，一些实施方案中，包括在此所述 的重组核酸分子，表达盒和/或载体的细菌选自利斯特氏菌属，炭疽芽 孢杆菌，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属和分枝杆菌。一些其他实施方 案中，包括在此所述的重组核酸分子，表达盒和/或载体的细菌选自利 斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌 属，布鲁氏菌属，分枝杆菌和大肠杆菌。
一些实施方案中，通过插入在此所述的重组核酸分子，表达盒和/ 或载体来修饰(例如，参见以上的发明概述和发明详述的第I，II， VI和VII部分以及以下的实施例)以表达多肽，且在至少一些实施方 案中，分泌多肽的本发明细菌是野生型细菌。例如，一些实施方案中， 重组细菌是包括重组核酸分子，表达盒和/或载体的野生型利斯特氏菌 属细菌，如单核细胞增生利斯特氏菌。然而，本发明的一些实施方案 中，包括表达盒和/或载体的细菌是细菌的突变株。一些实施方案中， 细菌是减毒的。一些实施方案中，细菌是细菌的减毒突变株。其中基 因“xyz”已经缺失的突变体在此备选地称为Δxyz或xyz-或xyz缺失 突变体。例如，其中urvA基因已经缺失的细菌菌株在此备选地称为 urvA突变体，ΔurvA或urvA-。此外，本领域普通技术人员将理解将 特定的突变体或菌株称为“xyz”突变体或“xyz”菌株有时是指其中 xyz基因已经缺失的突变体或菌株。
包括表达盒和/或表达载体的突变细菌中的突变可以是任何类型 的突变。例如，突变可以构成点突变，移码突变，插入，部分或全部 基因的缺失。此外，修饰菌株的一些实施方案中，细菌基因组的一部 分已经被异源多核苷酸替代。一些实施方案中，突变是自然发生的。 其他实施方案中，突变是人工突变方法的结果。仍然其他实施方案中， 细菌基因组中的突变是基因工程的结果。
一些实施方案中，包括在此所述重组核酸分子，表达盒和/或载体 之任一种的细菌是减毒的(相对于野生型细菌)用于细胞与细胞间的 扩散，进入非吞噬细胞或增殖。可以通过突变或通过其他修饰将细菌 减毒。一些实施方案中，包括在此所述任一种重组核酸分子，表达盒 和/或表达载体的细菌是减毒的用于细胞与细胞间的扩散(例如，单核 细胞增生利斯特氏菌actA突变体)。一些实施方案中，包括在此所述 重组核酸分子，表达盒和/或表达载体之任一种的细菌是减毒的用于进 入非吞噬细胞(例如，单核细胞增生利斯特氏菌internalin突变体， 如in1B缺失突变体)。一些实施方案中，包括在此所述重组核酸分子， 表达盒和/或表达载体之任一种的细菌是减毒的用于增殖。一些实施方 案中，细菌是减毒的用于细胞与细胞间的扩散和进入非吞噬细胞。
一些实施方案中，将包括在此所述的表达盒和/或表达载体的细菌 减毒用于细胞与细胞间的扩散。一些实施方案中，细菌(例如，利斯 特氏菌)缺乏(相对于非突变体或野生型细菌)或其等价物(取决于 生物体)。一些实施方案中，细菌包括一个或多个actA突变。例如， 细菌(例如，利斯特氏菌)可以是actA缺失突变体。ActA是由actA 基因编码的肌动蛋白聚合酶(Kock等，Cell，68：521-531(1992)； Genbank登录号no.AL591974，nts 9456-11389)。肌动蛋白聚合酶 蛋白参与宿主F-肌动蛋白在利斯特氏菌属细菌的一个极点的募集和 聚合。随后肌动蛋白的聚合和溶解导致利斯特氏菌遍及细胞溶质的推 进并进入邻近的细胞中。这种运动性能够使细菌直接在细胞与细胞间 扩散而不会进一步暴露于胞外环境中，因此逃避宿主的防御如产生抗 体。一些实施方案中，减毒的利斯特氏菌任选地包括internalin基因 如in1B和actA的突变。本发明该实施方案的利斯特氏菌菌株对于进 入非吞噬细胞是减毒的，以及对于细胞与细胞间的扩散是减毒的。
一些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌(例如，野生型细 菌)，减毒细菌用于细胞与细胞间扩散的能力降低至少约10％，至少 约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约90％。一些实施方案中， 相对于没有减毒突变的细菌，减毒细菌用于细胞与细胞间扩散的能力 降低至少约25％。一些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌，减 毒细菌用于细胞与细胞间扩散的能力降低至少约50％。
测定细菌如利斯特氏菌属细菌用于细胞与细胞间扩散是否是减毒 的体外测定法是本领域普通技术人员已知的。例如，可以测量选定的 培养细胞单层感染后在一段时间内形成的噬菌斑的直径。如之前在 Sun，A.，A.Camilli和D.A.Portnoy，1990，Isolation of Listeria monocytogenes small-plaque mutants defective for intracellular growth and cell-to-cells pread(对于胞内生长和细胞与细胞间扩 散有缺陷的单核细胞增生利斯特氏菌小噬菌斑突变体的分离)， Infect.Immun.58：3770-3778中所述的进行L2细胞单层内的噬菌斑测 定，使用改进的测量方法，如描述于Skoble，J.，D.A.Portnoy和 M.D.Welch.2000，Three regions within ActA promote Arp2/3 complex-mediated actin nucleation and Listeria monocytogenes motility(ActA内的三个区促进Ar p2/3复合物-介导的肌动蛋白成核 和单核细胞增生利斯特氏菌运动)，J.Cell Biol.150：527-538。简 而言之，L2细胞在六孔组织培养皿中生长至汇合然后用细菌感染1h。 感染后，用温热至40℃的由含有0.8％琼脂糖的DME，胎牛血清(例如， 2％)和所需浓度庆大霉素组成的培养基将细胞覆盖。培养基中的庆大 霉素浓度显著影响噬菌斑大小，是选定的利斯特氏菌菌株进行细胞与 细胞间扩散能力的测量(Glomski，I J.，M.M.Gedde，A.W.Ts ang， J.A.Swanson，和D.A.Portnoy，2002，J.Cell Biol.156：1029-1038)。 例如，单层感染后3天，用含有浓度为50μg/ml的庆大霉素的培养基 覆盖时，与野生型利斯特氏菌相比较，具有细胞与细胞间扩散缺陷表 型的利斯特氏菌菌株的噬菌斑大小减小至少50％。另一方面，当用培 养基+只含有5μg/ml庆大霉素的琼脂糖覆盖感染的单层时，具有细 胞与细胞间扩散缺陷表型的利斯特氏菌菌株和野生型利斯特氏菌之间 的噬菌斑大小是相似的。因此，可以通过改变含有琼脂糖的培养基中 的庆大霉素浓度来测定选定的菌株相对于野生型利斯特氏菌进行感染 细胞单层中细胞与细胞间扩散的相对能力。任选地，通过在感染后48 小时加入含有中性红(GIBCO BRL；在DME+琼脂糖培养基中1∶250稀 释度)的培养基来覆盖可有助于噬菌斑直径的观察和测量。此外，可 以在源自其他初级细胞或连续细胞的单层中进行噬菌斑测定。例如 HepG2细胞，肝细胞衍生的细胞系，或初级人肝细胞可以用于评价选 定的利斯特氏菌突变体进行细胞与细胞间扩散的能力，与野生型利斯 特氏菌相比较。一些实施方案中，包括突变或使利斯特氏菌减毒用于 细胞与细胞间扩散的其他修饰的利斯特氏菌在高浓度庆大霉素(约50 μg/ml)时产生“针尖”噬菌斑。
一些实施方案中，包括在此所述的表达盒和/或表达载体的细菌是 被减毒用于核酸修复的突变细菌(相对于野生型如没有减毒基因突变 的细菌)。例如，一些实施方案中。细菌是至少一个DNA修复酶缺失 的(例如，单核细胞增生利斯特氏菌uvrAB突变体)。一些实施方案 中，细菌是PhrB，UvrA，UvrB，UvrC，UvrD和/或RecA，或它们的等 价物之一缺失的(取决于细菌的属和种)。一些实施方案中，细菌是 UvrA，UvrB和/或UvrC缺失的。一些实施方案中，细菌包括phrB，uvrA， uvrB，uvrC，uvrD和/或recA基因的减毒突变。一些实施方案中，细 菌包括uvrA，uvrB和/或uvrC基因中一个或多个的突变。一些实施方 案中，细菌是功能上缺失UvrA，UvrB和/或UvrC的。一些实施方案中， 细菌是功能上缺失UvrA和UvrB的。一些实施方案中，细菌是uvrAB 缺失突变体。一些实施方案中，细菌是ΔuvrAΔactA突变体。一些实 施方案中，被减毒用于核酸修复的和/或对于至少一个DNA修复酶是缺 失的细菌的核酸通过与核酸靶向化合物反应被修饰(参见以下)。核 酸修复突变体，如ΔuvrAB单核细胞增生利斯特氏菌突变体，以及制 备该突变体的方法，详细描述于美国专利公开No.2004/0197343中(参 见，例如，U.S.2004/0197343的实施例7)。
一些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌(例如，野生型细 菌)，减毒细菌用于核酸修复的能力降低至少约10％，至少约25％，至 少约50％，至少约75％，或至少约90％。一些实施方案中，相对于没有 减毒突变的细菌，减毒细菌用于核酸修复的能力降低至少约25％。一 些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌，减毒细菌用于核酸修复 的能力降低至少约50％。
通过本领域普通技术人员已知的多种方法可以获得细菌菌株中存 在特定突变的确认。例如，可以将菌株基因组相关部分克隆并测序。 或者，可以使用编码与缺失或其他突变邻近区域的成对引物通过PCR 来鉴定特定的突变。DNA印迹也可以用来检测细菌基因组中的改变。 以及，可以使用本领域的标准技术如蛋白质印迹法来分析特定蛋白是 否被该菌株表达。通过该菌株的表型与之前报道的表型比较也可以获 得所需基因中含有突变的菌株的证实。例如，可以使用下述测定法测 定核苷酸切除修复突变如uvrAB缺失的存在，即使用核苷酸切除修复 (NER)方法测试细菌修复核酸的能力并比较相对于野生型细菌的该能 力。这样的功能测定法是本领域已知的。例如，可以测量环丁烷二聚 物切除或UV-诱导的(6-4)产物的切除来测定突变体中NER酶的缺乏 (参见，例如，Franklin等，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA， 81：3821-3824(1984)))。或者，可以进行存活测量来测定核酸修 复的缺乏。例如，对细菌进行补骨脂素/UVA处理，然后测定它们与野 生型相比较增殖和/或存活的能力。
一些实施方案中，细菌是减毒的用于进入非吞噬细胞(相对于非 突变或野生型细菌)。一些实施方案中，细菌(例如，利斯特氏菌) 对于一个或多个internalin(或等价物)是缺失的。一些实施方案中， 细菌对于internalin A是缺失的。一些实施方案中，细菌对于 internalin B是缺失的。一些实施方案中，细菌包括in1A的突变。 一些实施方案中，细菌包括in1B的突变。一些实施方案中，细菌包括 actA和in1B两者的突变。一些实施方案中，细菌缺失功能性ActA和 internalin B。一些实施方案中，细菌是ΔactAΔin1B双缺失突变体。 一些实施方案中，细菌对于ActA和internalin B两者是缺失的。
一些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌(例如，野生型细 菌)，减毒细菌进入非吞噬细胞的能力降低至少约10％，至少约25％， 至少约50％，至少约75％，或至少约90％。一些实施方案中，相对于没 有减毒突变的细菌，减毒细菌进入非吞噬细胞的能力降低至少约25％。 一些实施方案中，相对于没有减毒突变的细菌，减毒细菌进入非吞噬 细胞的能力降低至少约50％。一些实施方案中，相对于没有减毒突变 的细菌，减毒细菌进入非吞噬细胞的能力降低至少约75％。
一些实施方案中，减毒的细菌，如突变的利斯特氏菌菌株，用于 进入多于一种类型的非吞噬细胞不是减毒的。例如，减毒的菌株用于 进入肝细胞可能是减毒的，但用于进入上皮细胞不是减毒的。作为另 一个实例，减毒菌株用于进入上皮细胞可能是减毒的，但用于进入肝 细胞不是减毒的。还应当理解用于特定的修饰细菌进入非吞噬细胞的 减毒是使指定基因突变的结果，例如缺失突变，该基因编码其与特定 细胞受体相互作用的入侵入蛋白质，且结果有助于非吞噬细胞的感染。 例如，利斯特氏菌Δin1B突变菌株用于进入表达肝细胞生长因子受体 (c-met)的非吞噬细胞包括肝细胞细胞系(例如，HepG2)和初级人 肝细胞是减毒的。
一些实施方案中，即使细菌(例如，突变的利斯特氏菌)用于进 入非吞噬细胞是减毒的，利斯特氏菌仍然能够被吞噬细胞如至少树突 细胞和/或巨噬细胞摄入。一实施方案中，减毒细菌进入吞噬细胞的能 力没有因对菌株所进行的改变，如侵袭素的突变而降低(即，在改变 后维持菌株被约95％或更多测得的吞噬细胞摄入的能力)。其他实施 方案中，减毒细菌进入吞噬细胞的能力降低不高于约10％，不高于约 25％，不高于约50％，或不高于约75％。
本发明的一些实施方案中，细菌(例如，利斯特氏菌属细菌)进 入非吞噬细胞能力的衰减量为两倍降低至更高水平的衰减。一些实施 方案中，细菌进入非吞噬细胞能力的衰减为至少约0.3log，约1log， 约2log，约3log，约4log，约5log，或至少约6log。一些实施方案 中，衰减为约0.3至＞0.8log，约2至＞8log，约4至＞8log，约6至＞8log， 约0.3-8log，以及约0.3-7log，以及约0.3-6log，以及约0.3-5log， 以及约0.3-4log，以及约0.3-3log，以及约0.3-2log，以及约 0.3-1log。一些实施方案中，衰减为约1至＞8log，1-7log，1-6log， 以及约2-6log，以及约2-5log，以及约3-5log。
已经在单核细胞增生利斯特氏菌中鉴定了多个internalin (Boland等，Clinical Microbiology Reviews，2001，14：584-640)。 这些internalin包括，但不限于In1A，In1B，In1C，In1C2，In1D， In1E，In1F，In1G和In1H(Dramsi等，Infection and Immunity， 65：1615-1625(1997)；Raffelsbauer等，Mol.Gen.Genet.260：144-158 (1988))。之前已经报道过了编码这些蛋白的基因序列。例如，in1A 和in1B的序列已经报道于Gaillard等，Cell，65：1127-1141(1991) 且GenBank登录号为M67471。在Glaser等，Science，294：849-852 (2001)的增补网页材料的网页表2 (www.sciencemag.org/cgi/content/full/294/5543/849/DC1)中鉴 定了编码internalin相关蛋白家族的其他成员的基因，包括lmo0327， lmo0331，lmo0514，lmo0610，lmo0732，lmo1136，lmo1289，lmo2396， lmo0171，lmo0333，lmo0801，lmo1290，lmo2026和lmo2821。 (internalin相关蛋白家族每个成员的序列可以在单核细胞增生利 斯特氏菌菌株EGD基因组，GenBank登录号no.AL591824，和/或单核 细胞增生利斯特氏菌菌株EGD-e基因组，GenBank登录号no.NC_003210 中找到。Glaser等中指明了各种internalin相关基因的位置)。
In1A(internalin A)(Gaillard等，Cell，65：1127-1141(1991)； GenBank登录号no.NC_003210)指导上皮细胞如肠的那些对利斯特氏 菌的摄入。
In1B(internalin B)(Gaillard等，Cell，65：1127-1141(1991)； GenBank登录号no.AL591975(单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完 整基因组，片段3/12，in1B基因区：nts.97008-98963)；和GenBank 登录号no.NC_003210(单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因， in1B基因区：nts.457008-458963)，其中每个在此以其整体引入作 为参考)指导肝细胞或上皮细胞如包括血脑屏障的脑微脉管系统的脉 管上皮细胞对利斯特氏菌的摄入。(关于internalin B的更多描述， 参见Ireton等，J.of Biological Chemistry，274：17025-17032 (1999)；Dramsi等，Molecular Microbiology 16：251-261(1995)； Mansell等，J.of Biological Chemistry，276：43597-43603(2001)； 和Bierne等，J.of Cell Science 115：3357-3367(2002)，其中 每篇在此以其整体引入作为参考)。
一些实施方案中，细菌是ActA，internalin B，或ActA和 internalin B两者缺乏的。一些实施方案中，细菌是功能性ActA， internalin B，或ActA和internalin B两者缺失的。一些实施方案 中，细菌是功能性ActA缺失的。一些实施方案中，细菌是功能性 internalin B缺失的。一些实施方案中，细菌是功能性ActA和 internalin B缺失的。
测定细菌(例如，突变利斯特氏菌菌株)用于进入非吞噬细胞是 否是减毒的体外测定法是本领域普通技术人员已知的。例如，Dramsi 等，Molecular Microbiology 16：251-261(1995)和Gaillard等， Cell 65：1127-1141(1991)描述了筛选突变单核细胞增生利斯特氏菌 菌株进入某些细胞系的能力的测定法。例如，为了测定具有特定修饰 的利斯特氏菌属细菌对于进入特定类型的非吞噬细胞是否是减毒的， 测定减毒的利斯特氏菌属细菌进入特定类型的非吞噬细胞的能力并与 没有改变的相同利斯特氏菌属细菌进入非吞噬细胞的能力相比较。同 样，为了测定具有特定突变的利斯特氏菌菌株对于进入特定类型的非 吞噬细胞是否是减毒的，测定突变利斯特氏菌菌株进入特定类型的非 吞噬细胞的能力并与没有突变的利斯特氏菌菌株进入非吞噬细胞的能 力相比较。此外，通过将菌株的表型与之前报道的internalin B突变 体的表型相比较也可以获得菌株是internalin B缺乏的证实。
一些实施方案中，根据利斯特氏菌对宿主的生物效果可以测量细 菌的减毒。通过测量小鼠或其他脊椎动物中的LD50可以测定细菌菌株 的病原性。LID50是导致50％脊椎动物死亡需要注射入脊椎动物的利斯特 氏菌的用量或剂量。可以比较具有特定改变(例如，突变)的细菌与 没有特定改变细菌的LD50值来作为减毒水平的度量。例如，如果没有 特定突变的细菌菌株具有103细菌的LD50和具有特定突变的细菌菌株 具有105细菌的LD50，则菌株已经减毒，使得LD50提高100倍或2log。
或者，可以在体外更直接地测定细菌(例如，利斯特氏菌)感染 非吞噬细胞能力的减毒程度。例如，改变的利斯特氏菌感染非吞噬细 胞如肝细胞的能力，可以与非改变的利斯特氏菌或野生型利斯特氏菌 感染吞噬细胞的能力相比较。这样的测定中，通常将改变的或非改变 的利斯特氏菌体外加入非吞噬细胞中一段有限的时间(例如，一小时)， 然后用含有庆大霉素的溶液洗涤细胞以杀灭任何胞外细菌，将细胞裂 解然后涂布来测定滴度。这样的测定实例可以在美国专利公开 No.2004/0228877中找到。
作为另外的实例，还可以通过其他生物效果如组织病变的程度或 血清肝酶水平来定量测量减毒的程度。在临床实验室中测定注射了利 斯特氏菌(或其他细菌)的小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)， 天冬氨酸氨基转移酶(AST)，清蛋白和胆红素水平。对于具有或不具 有特定改变/突变的利斯特氏菌，可以进行小鼠或其他脊椎动物中这些 效果的比较，来作为测定利斯特氏菌减毒的一种方法。也可以通过组 织病理学测定利斯特氏菌的减毒。可以从感染脊椎动物的各种组织如 肝脏，脾脏和神经系统中取得的利斯特氏菌的量，也可以用作减毒水 平的度量，通过比较注射了突变与非突变利斯特氏菌的脊椎动物中的 这些值。例如，可以从感染组织如肝脏或脾脏取得的随时间变化的利 斯特氏菌的量可以用作减毒的度量，通过比较注射了突变与非突变利 斯特氏菌的小鼠中的这些值。
因此，可以根据小鼠特别选定器官中的细菌负荷来测量利斯特氏 菌的减毒，已知小鼠是野生型利斯特氏菌的靶。例如，通过计数在BHI 琼脂培养基上涂布肝脏或脾脏匀浆(在H2O+0.2％NP40中均化)的稀释 物而形成的菌落(菌落形成单位；CFU)来测量利斯特氏菌的减毒。例 如，可以在通过任何的途径，包括静脉内，腹膜内，肌内和皮下给予 改变的利斯特氏菌后，测量在一段时间内肝脏或脾脏的cfu。此外， 可以测量利斯特氏菌并通过如所述的竞争性指数测定法与给药后在一 段时间内肝脏和脾脏(或任何其他选定器官)中的耐药性，野生型利 斯特氏菌(或任何其他选定的利斯特氏菌菌株)相比较。
为了提供安全而有效的疫苗，非吞噬细胞摄入减毒细菌的减毒程 度不需要绝对减毒。一些实施方案中，减毒程度是毒性的降低足以预 防或减轻毒性症状至非致命水平。
本发明的一些实施方案中，包括在此所述的重组核酸分子，表达 盒和/或表达载体的细菌是利斯特氏菌的突变株。另外的实施方案中， 细菌是单核细胞增生利斯特氏菌的减毒突变株。多种利斯特氏菌的减 毒突变株实例描述于美国专利申请No.60/446,051(2003年2月6日 申请)，60/449,153(2003年2月21日申请)，60/511,719(2003 年10月15日申请)，60/511,919(2003年10月15日申请)，60/511,869 (2003年10月15日申请)，60/541,515(2004年2月2日申请)和 10/883,599(2004年6月30日申请)，以及美国专利公开 No.2004/0197343和US2004/0228877，其中每篇在此以其整体引入作 为参考。利斯特氏菌的突变株还描述于2004年7月23日申请的国际 申请No.PCT/US2004/23881中，在此以其整体引入作为参考。例如， 包括表达盒和/或载体的细菌任选地是缺乏ActA或internalin B，或 ActA和internalin B两者的单核细胞增生利斯特氏菌的突变株。一 些实施方案中，细菌是单核细胞增生利斯特氏菌的突变株，即，actA-(例如，DP-L4029(描述于Skoble等，J.of Cell Biology，150： 527-537(2000)中的DP-L3078菌株，在此以其整体引入作为参考， 如在(Lauer等，J.Bacteriol.184：4177(2002)；美国专利申请 No.2003/0203472)中所述其噬菌体已自愈)，actA-in1B-(例如， DP-L4029in1B，于2003年10月3日，根据用于专利程序目的的国际 公认的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，保藏于美国典型培养物培 养中心(ATCC)，10801 University B1vd.，马纳萨斯(Manassas)， 弗吉尼亚(Virginia)20110-2209，美国(Unitited States of Amercian)，且保藏号为PTA-5562)，actA-uvrAB-(例如， DP-L4029 uvrAB，于2003年10月3日，根据用于专利程序目的的国际 公认的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，保藏于美国典型培养物保 藏中心(ATCC)，10801 University B1vd.，马纳萨斯(Manassas)， 弗吉尼亚(Virginia)20110-2209，美国(Unitited States of Amercian)，且保藏号为PTA-5563)，或actA-in1B-uvrAB-。一些 实施方案中，减毒的利斯特氏菌属细菌(例如，单核细胞增生利斯特 氏菌)是ΔactAΔin1B双缺失突变体。
可以通过传统的诱变方法，如诱变化学药品或辐射来获得细菌突 变接着选择突变体。本领域技术人员还可以通过重组DNA技术获得细 菌突变。例如，使用Camilli等，Molecular Micro.8：143-157(1993) 中所述的pKSV7载体的和以上关于将异源表达盒引入细菌基因组中所 述的等位基因交换方法适用于产生突变体包括缺失突变体。(Camilli 等(1993)在此以其整体引入作为参考)。以下的实施例24中提供了 使用pKSV7载体生产单核细胞增生利斯特氏菌internalin B突变体的 一个代表性实施例。或者，可以使用Biswas等，J.Bacteriol. 175：3628-3635(1993)中所述的基因替代实验方案。其他相似的方法 是本领域普通技术人员已知的。
多种细菌突变体的构建描述于美国专利申请系列号10/883,599， 美国专利公开No.2004/0197343和美国专利公开No.2004/0228877 中，其中每篇在此以其整体引入作为参考。
本发明的一些实施方案中，包括重组核酸分子，表达盒和/或表达 载体的细菌是炭疽芽孢杆菌的突变株。一些实施方案中，细菌是 Sterne菌株。一些实施方案中，细菌是Ames菌株。一些实施方案中， 炭疽芽孢杆菌菌株是uvrAB突变体。一些实施方案中，炭疽芽孢杆菌 菌株是uvrC突变体。一些实施方案中，炭疽芽孢杆菌突变体是recA 突变体。一些实施方案中，细菌是炭疽芽孢杆菌的ΔuvrAB突变体(例 如炭疽芽孢杆菌SterneΔuvrAB突变体，于2004年2月20日，根据 用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约的规定， 保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，108011 University B1vd.， 马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚(Virginia)20110-2209，美国 (Unitited States of Amercian)，保藏号为PTA-5825)。
改变炭疽芽孢杆菌基因组的方法是本领域技术人员已知的。在炭 疽芽孢杆菌中产生突变的一种方法是通过使用本领域技术人员已知的 等位基因交换载体的等位基因交换。代表性等位基因交换质粒是 pKSV7，描述于Camilli等，Molecular Microbiology，8：143-147 (1993)。作为产生突变炭疽芽孢杆菌的第一步，将待缺失或突变的 基因组区域和炭疽芽孢杆菌基因组上游和下游的约1000bp进行PCR 扩增，然后克隆至pKSV7质粒载体(或类似的载体)中。(芽孢杆菌 属特异性或炭疽芽孢杆菌特异性温度(ts)复制子可以替代存在于 pKSV7等位基因交换质粒载体中的利斯特氏菌ts复制子)。待缺失或 突变的区域中的限制性内切核酸酶识别位点可以用于缺失该区域中靶 向基因的所需部分。或者，可以除去该区域内靶向基因的一部分并用 含有所需突变或其他改变的序列来替代。在克隆至等位基因交换质粒 之前或之后，所扩增的炭疽芽孢杆菌基因组的区域可以改变，例如， 使用限制酶或限制酶和合成基因序列的组合。一些实施方案中，序列 可以改变为PCR扩增子然后克隆至pKSV7中。备选的实施方案中，首 先将扩增子插入另一个质粒中，然后改变，切除并插入pKSV7中。或 者，将PCR扩增子直接插入pKSV7质粒中，然后改变，例如，使用常 规的限制酶。然后将含有改变序列的pKSV7质粒引入炭疽芽孢杆菌中。 这可以通过电穿孔来进行。然后在氯霉素存在下在许可温度下在培养 基上选择细菌。接着在氯霉素存在下在非许可温度下通过多个世代的 传代选择用于进入细菌染色体中的单交换整合。最后，菌落在不含有 抗生素的培养基中在许可温度下进行多个世代的传代来获得质粒切除 和消除(双交换)。美国临时申请系列号60/584,886和60/599,522 和美国专利公开No.2004/0197343，在此以其整体引入作为参考，提 供了另外的关于不同类型的炭疽芽孢杆菌突变体构建的描述。
本发明的一些实施方案中，包括重组核酸分子，表达盒和/或表达 载体的细菌是已经改变的细菌，使得细菌用于增殖是减毒的(相对于 非改变的细菌)。优选，尽管改变，改变的细菌仍维持足够的基因表 达水平。例如，一些实施方案中，基因表达水平基本上没有受到改变 的影响，使得在将表达抗原的细菌给予宿主时抗原的表达水平足以刺 激对抗原的免疫应答。一些实施方案中，细菌的核酸已经通过与核酸 靶向化合物反应被修饰。一些实施方案中，改变的细菌的核酸已经通 过与直接与核酸反应的核酸靶向化合物反应被修饰，使得细菌的增殖 衰减。一些实施方案中，核酸靶向化合物是核酸烷化剂(alkylator)， 如β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。一些实 施方案中，通过辐射如UVA照射激活核酸靶向化合物。一些实施方案 中，已经用补骨脂素化合物处理了细菌。例如，一些实施方案中，已 经用补骨脂素，如4′-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5′，8-三甲基补骨脂素 (“S-59”)和UVA光处理来改变细菌。一些实施方案中，已经通过 用补骨脂素化合物处理和UVA照射来修饰细菌的核酸。使用核酸靶向 化合物来改变细菌以将其减毒用于增殖的方法描述于以下每个美国专 利申请或出版物中，其中每个在此以其整体引入作为参考：60/446,051 (2003年2月6日申请)，60/449,153(2003年2月21日申请)， 60/490,089(2003年7月24日申请)，60/511,869(2003年10月 15日申请)，60/541,515(2004年2月2日申请)10/883,599(2004 年6月30日申请)和US2004/0197343。改变的细菌及其用途还描述 于2004年7月23日申请的国际申请No.PCT/US2004/23881中，在此 以其整体引入作为参考。
例如，对于ΔactAΔuvrAB单核细胞增生利斯特氏菌的处理，一 些实施方案中，可以在(约)OD600＝0.5的对数期培养物中加入S-59 补骨脂素至200nM，当培养物的光密度达到1时，接着用6J/m2UVA 光灭活。在利斯特氏菌actA/uvrAB菌株的细菌生长过程中，通过改变 S-59的浓度，UVA剂量，在UVA处理之前接触S-59的时间以及改变处 理的时间来最佳化灭活条件。将亲本利斯特氏菌菌株用作对照。通过 细菌在BHI(脑心浸液)琼脂平板上无形成菌落的能力来测定利斯特 氏菌的灭活(log-杀灭)。此外，本领域技术人员可以使用35S-脉冲 追踪实验证实S-59/UVA灭活的利斯特氏菌的异源蛋白和毒力因子如 LLO和p60的表达来测定S-59/UVA灭活后新表达的蛋白质的合成和分 泌。使用35S-代谢标记的LLO和p60的表达可以常规测定。可以在35S- 甲硫氨酸存在下将S-59/UVA灭活的利斯特氏菌actA/uvrAB孵育1小 时。可以测定整个细胞裂解物和细菌培养液TCA沉淀的异源蛋白质， 内源LLO和p60的抗原表达和分泌。LLO，p60和异源蛋白质特异性单 克隆抗体可以用于免疫沉淀来验证灭活后从重组利斯特氏菌的持续表 达和分泌。
一些实施方案中，减毒用于增殖的细菌用于核酸修复也是减毒的 和/或是缺乏至少一个DNA修复酶的。例如，一些实施方案中，其中核 酸已经通过核酸靶向化合物如补骨脂素(结合UVA处理)修饰的细菌 是uvrAB缺失突变体。
一些实施方案中，细菌增殖衰减至少约0.3log，以及至少约1log， 约2log，约3log，约4log，约6log，或至少约8log。另一实施方案 中，细菌增殖衰减至少约0.3至＞10log，约2至＞10log，约4至＞10log， 约6至＞10log，约0.3-8log，约0.3-6log，约0.3-5log，约1-5log， 或约2-5log。一些实施方案中，细菌对抗原的表达为其中细菌核酸没 有被修饰的细菌对抗原的表达的至少约10％，约25％，约50％，约75％， 或至少约90％。
一些实施方案中，细菌的核酸尚未通过与核酸靶向化合物反应被 修饰。一些实施方案中，重组细菌对于增殖尚未衰减。一些实施方案 中，重组细菌对于核酸修复能力没有衰减。一些实施方案中，重组细 菌不是缺乏至少一个DNA修复酶的。
一些实施方案中，由重组细菌内所含的重组核酸分子，表达盒和/ 或表达载体中的第一个多核苷酸编码的信号肽对重组细菌是天然的。 一些实施方案中，编码重组细菌天然信号肽的多核苷酸对于在重组细 菌中的表达已经是密码子最佳化的。一些实施方案中，多核苷酸已经 是完全密码子最佳化的。一些实施方案中，由重组细菌内所含的重组 核酸分子，表达盒和/或表达载体中的第一个多核苷酸编码的信号肽对 宿主重组细菌是外源的。一些实施方案中，编码宿主重组细菌外源信 号肽的多核苷酸对于在重组细菌中的表达已经是密码子最佳化的。
一些实施方案中，重组细菌内的重组核酸分子，表达盒和/或表达 载体中的第二个多核苷酸对于在重组细菌中的表达已经是密码子最佳 化的。一些实施方案中，第二个多核苷酸对于在重组细菌中的表达已 经是完全密码子最佳化的。一些实施方案中，重组细菌内的第一个和 第二个多核苷酸对于在重组细菌中的表达已经是密码子最佳化的。一 些实施方案中，重组细菌内的第一个和第二个多核苷酸对于在重组细 菌中的表达已经是完全密码子最佳化的。
一方面中，本发明提供了包括表达盒的细菌，其中表达盒包括(a) 编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的 表达是密码子最佳化的；(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二 个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中；和(c)可操作 地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码包括信号 肽和多肽的融合蛋白。如在此，例如，在部分III中所述的，一些实 施方案中，所编码的信号肽源自细菌。一些实施方案中，由表达盒编 码的细菌信号肽源自与包括表达盒的细菌相同属和/或种的细菌。一些 实施方案中，信号肽对宿主重组细菌是天然的。其他实施方案中，由 表达盒编码的细菌信号肽源自与包括表达盒的细菌不同属和/或种的 细菌。一些实施方案中，信号肽对宿主重组细菌是外源的。一些实施 方案中，信号肽是secA1，secA2或Tat信号肽。一些实施方案中，由 第二个多核苷酸编码的多肽对细菌是异源的(即，外源的)。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的细菌，包括(a) 编码细菌天然信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在 细菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中 重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中， 细菌是胞内细菌。一些实施方案中，重组核酸分子是表达盒的一部分， 该表达盒进一步包括可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动 子。一些实施方案中，细菌选自利斯特氏菌属，芽孢杆菌属，鼠疫耶 尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌和大肠 杆菌。一些实施方案中，细菌是利斯特氏菌(例如，单核细胞增生利 斯特氏菌)。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属的细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)，其中重组核酸分子包 括(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在利 斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二 个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译 读框中，其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些 实施方案中，重组核酸分子是表达盒的一部分，该表达盒进一步包括 可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子。一些实施方案中， 第二个多核苷酸对于在利斯特氏菌属细菌中的表达是密码子最佳化 的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽对利斯特氏菌属 的细菌是外源的(即，对利斯特氏菌属细菌是异源的)。一些实施方 案中，利斯特氏菌属细菌是减毒的。例如，可以将利斯特氏菌减毒用 于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞或增殖。一些实施方案中， 重组利斯特氏菌属细菌是缺乏ActA，Internalin B或ActA和 Internalin B两者的(例如，ΔactA/Δin1B双缺失突变体)。一些实 施方案中，已经通过与核酸靶向化合物(例如，补骨脂素化合物)反 应修饰了重组细菌的核酸。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的细菌，其中重组 核酸分子包括编码非secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸，和编码多 肽(例如，抗原)的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第 一个多核苷酸相同的翻译读框中，且其中重组核酸分子编码包括信号 肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多 肽与信号肽是异源的。一些实施方案中，重组核酸分子是表达盒的一 部分，该表达盒进一步包括可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的 启动子。一些实施方案中，细菌是选自利斯特氏菌属，芽孢杆菌属， 鼠疫耶尔森氏菌，沙门氏菌属，志贺氏菌属，布鲁氏菌属，分枝杆菌 或大肠杆菌的细菌。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽 对细菌是外源的(即，对细菌是异源的)。
另一方面中，本发明提供了包括表达盒的细菌，其中表达盒包括 (a)编码非secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一 个多核苷酸相同翻译读框中的编码多肽(例如，对细菌异源的多肽) 的第二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的 启动子，其中表达盒编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。如在此，例 如在以上的部分III中所述的，一些实施方案中，非secA1细菌信号 肽是secA2信号肽。一些其他实施方案中，非secA1细菌信号肽是Tat 信号肽。一些实施方案中，由表达盒编码的细菌信号肽源自与包括表 达盒的细菌相同属和/或种的细菌。其他实施方案中，由表达盒编码的 细菌信号肽源自与包括表达盒的细菌不同属和/或种的细菌。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属的细菌，其中重组核酸分子包括(a)编码非secA1细菌信号肽的第 一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核 苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸分子编 码包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，重组核酸分子是 表达盒的一部分，该表达盒进一步包括可操作地连接第一个和第二个 多核苷酸的启动子。一些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌是减毒的。 一些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌是单核细胞增生利斯特氏菌。 例如，可以将利斯特氏菌减毒用于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬 细胞或增殖。一些实施方案中，重组利斯特氏菌属的细菌是缺乏ActA， Internalin B，或ActA和Internalin B两者的(例如，ΔactA/Δin1B 双缺失突变体)。一些实施方案中，已经通过与核酸靶向化合物(例 如，补骨脂素化合物)反应修饰了重组细菌的核酸。
另一方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏菌 属的细菌，其中重组核酸分子包括编码利斯特氏菌属细菌外源多肽的 多核苷酸，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化 的。
再一方面中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏菌属的细 菌，其中表达盒包括以下的成分：(a)编码利斯特氏菌属细菌外源多 肽的多核苷酸，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最 佳化的；和(b)启动子，可操作地连接编码外源多肽的多核苷酸。此 外，一些实施方案中，利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌。其他 实施方案中，利斯特氏菌属的细菌属于伊氏利斯特氏菌，斯氏利斯特 氏菌或无害利斯特氏菌种。一些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌是 如上所述的利斯特氏菌属细菌的减毒菌株。
另外的方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的重组利斯特氏 菌属的细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)，其中重组核酸分子 包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸；和(b)位于 和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸， 其中重组核酸分子编码包括非利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。 一些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌是减毒的。例如，可以将利斯 特氏菌减毒用于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞或增殖。一些 实施方案中，重组利斯特氏菌属的细菌是缺乏ActA，Internalin B， 或ActA和Internalin B两者的(例如，ΔactA/Δin1B双缺失突变体)。 一些实施方案中，已经通过与核酸靶向化合物(例如，补骨脂素化合 物)反应修饰了重组细菌的核酸。
再一方面中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏菌属的细 菌(例如，来自单核细胞增生利斯特氏菌种)，该表达盒包括编码非 利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸，位于和第一个多核苷酸相同的 翻译读框中的编码多肽(例如，非利斯特氏菌多肽)的第二个多核苷 酸，和可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子。表达盒编码 包括非利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，利斯 特氏菌属的细菌用于细胞与细胞间的扩散，进入非吞噬细胞或增殖是 减毒的。一些实施方案中，重组利斯特氏菌属的细菌是缺乏ActA， Internalin B，或ActA和Internalin B两者的(例如，ΔactAΔin1B 双缺失突变体)。一些实施方案中，已经通过与核酸靶向化合物(例 如，补骨脂素化合物)反应修饰了重组细菌的核酸。一些实施方案中， 第一个多核苷酸，第二个多核苷酸，或第一个和第二个核苷酸两者对 于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一 个多核苷酸和/或第二个多核苷酸对于在单核细胞增生利斯特氏菌中 的表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，由第二个多核苷酸编码 的多肽是抗原，在一些情况中，可以是非细菌抗原。例如，一些实施 方案中，多肽是肿瘤相关抗原或源自这样的肿瘤相关抗原。例如，一 些实施方案中，多肽是K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras，间皮素， PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3，SPAS-1， SP-17，PAGE-4，TARP或CEA，或源自K-Ras，H-Ras，N-Ras，12-K-Ras， 间皮素，PSCA，NY-ESO-1，WT-1，存活素，gp100，PAP，蛋白酶3， SPAS-1，SP-17，PAGE-4，TARP或CEA。例如，一些实施方案中，多肽 是间皮素，或是间皮素的片段或变体。一些其他实施方案中，多肽是 NY-ESO-1，或是NY-ESO-1的片段或变体。一些实施方案中，抗原是传 染病抗原或源自传染病抗原。优选实施方案中，信号肽是细菌的。一 些实施方案中，信号肽来自属于芽孢杆菌属，葡萄球菌属或乳球菌属 的细菌。例如，一些实施方案中，信号肽来自炭疽芽孢杆菌，枯草芽 孢杆菌，金黄色葡萄球菌或乳酸乳球菌。一些实施方案中，信号肽是 secA1信号肽，如来自乳酸乳球菌的USP45信号肽或来自炭疽芽孢杆 菌的保护性抗原信号肽。一些实施方案中，信号肽是secA2信号肽。 仍然另外的实施方案中，信号肽是Tat信号肽，如枯草芽孢杆菌Tat 信号肽(例如，PhoD)。
本发明进一步提供了包括重组核酸分子的重组细菌，其中重组核 酸分子包括：(a)编码细菌自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 的第一个多核苷酸；和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个 多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸分 子编码包括由第二个多核苷酸编码的多肽和自溶素或其催化活性片段 或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其中，在蛋白质嵌合体中，多肽与 自溶素或其催化活性片段或催化活性变体融合，或位于自溶素或其催 化活性片段或催化活性变体内。一些实施方案中，重组细菌是胞内细 菌，如利斯特氏菌属的细菌(例如，单核细胞增生利斯特氏菌)。一 些实施方案中，由第二个多核苷酸编码的多肽对重组细菌是外源的。
再一方面中，本发明提供了包括多顺反子表达盒的重组利斯特氏 菌属的细菌，其中多顺反子表达盒编码至少两个离散的非利斯特氏菌 多肽。例如，一些实施方案中，表达盒包括编码第一个非利斯特氏菌 多肽的第一个多核苷酸，编码第二个非利斯特氏菌多肽的第二个多核 苷酸，和可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子。一些实施 方案中，重组利斯特氏菌属的细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。 一些实施方案中，第一个和/或第二个非利斯特氏菌多肽包括抗原(或 其片段)。
一些实施方案中，本发明提供了包括表达盒的重组细菌(例如， 利斯特氏菌)，该表达盒包括以下的成分：(a)编码第一个信号肽的 第一个多核苷酸；(b)编码第一个多肽的第二个多核苷酸，其中第二 个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中；(c)基因间序 列；(d)编码第二个信号肽的第三个多核苷酸；(e)编码第二个多 肽的第四个多核苷酸，其中第四个多核苷酸位于和第三个多核苷酸相 同的翻译读框中；和(f)可操作地连接第一个多核苷酸，第二个多核 苷酸，第三个多核苷酸，第四个多核苷酸和基因间序列的启动子，使 得表达盒编码包括第一个信号肽和第一个多肽的第一个融合蛋白以及 包括第二个信号肽和第二个多肽的第二个融合蛋白。一些实施方案中， 编码信号肽的一个或多个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳 化的。一些实施方案中，第三个和/或第四个多核苷酸对于在细菌中的 表达是密码子最佳化的。一些实施方案中，第一个和/或第二个多肽对 重组细菌是异源的(例如，异源抗原)。一些实施方案中，第一个和/ 或第二个信号肽是非secA1细菌信号肽。第一个和/或第二个信号肽对 重组细菌是天然的或外源的。一些实施方案中，重组细菌是利斯特氏 菌属的细菌以及第一个和/或第二个信号肽是非利斯特氏菌的。一些实 施方案中，基因间序列是单核细胞增生利斯特氏菌actA-plcB基因间 序列。一些实施方案中，细菌是单核细胞增生利斯特氏菌。
其他方面中，本发明提供了包括重组核酸分子的细菌，该重组核 酸分子包括(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，(b)编码分泌蛋白 或其片段的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核 苷酸相同的翻译读框中，和(c)编码与分泌蛋白或其片段异源的多肽 的第三个多核苷酸，其中第三个多核苷酸位于和第一个以及第二个多 核苷酸相同的翻译读框中，且其中重组核酸分子编码包括信号肽，由 第二个多核苷酸编码的多肽和分泌蛋白或其片段的蛋白质嵌合体，且 其中在蛋白质嵌合体中，多肽与分泌蛋白或其片段融合，或位于分泌 蛋白或其片段内。一些实施方案中，细菌是利斯特氏菌属的细菌。一 些实施方案中，细菌是利斯特氏菌属的细菌，由第三个多核苷酸编码 的多肽对该利斯特氏菌是外源的。一些实施方案中，细菌是单核细胞 增生利斯特氏菌。
一些实施方案中(例如，上述每个方面的一些实施方案中)，细 菌内所含的表达盒是整合至细菌基因组中的。其他实施方案中，细菌 内所含的表达盒是在细菌内的质粒上的。
通常，表达盒中所用的启动子是适于用选定的特定细菌宿主进行 异源表达的表达盒。本领域技术普通人员可以容易地辨别哪些启动子 适于在哪些细菌中使用。一些实施方案中，启动子是细菌启动子。另 外的实施方案中，细菌中表达盒上的启动子是来自属于与含有该表达 盒的细菌相同属的细菌的启动子。其他实施方案中，细菌中表达盒上 的启动子是来自属于与含有该表达盒的细菌相同种的细菌的启动子。 例如，如果含有表达盒的细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种，那么 表达盒上所用的启动子任选地源自利斯特氏菌基因如hly。其他实施 方案中，启动子是组成型启动子(例如，p60启动子)或prfA-依赖性 启动子(例如，actA启动子)。此外，如上所述，一些实施方案中， 表达盒的启动子是组成型启动子。其他实施方案中，也如上所述，表 达盒的启动子是诱导型启动子。
一些实施方案中(例如，上述每个方面的一些实施方案中)，由 细菌中的表达盒编码的多肽或包括该多肽的融合蛋白是抗原或具有治 疗价值的其他蛋白质，例如，如以上部分IV中所述的。一些实施方案 中，多肽或包括该多肽的蛋白质从细菌中分泌出来。一些实施方案中， 从细菌表达和/或分泌出来的多肽对细菌是异源的。
因此，一些实施方案中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特 氏菌，其中表达盒包括(a)编码细菌(利斯特氏菌或非利斯特氏菌) 信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在利斯特氏菌中 的表达是密码子最佳化的；(b)编码非利斯特氏菌抗原的第二个多核 苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中； 和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒 编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。进一步的实施方案中，利斯特氏 菌是单核细胞增生利斯特氏菌菌株，如actA-in1B-菌株。一些实施方 案中，已经将表达盒整合至重组利斯特氏菌的基因组中。一些实施方 案中，第二个多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。
本发明还提供了包括表达盒的利斯特氏菌，其中表达盒包括(a) 编码secA2或Tat细菌信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个 多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第二个多核苷酸；和(c)可 操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码包括 信号肽和抗原的融合蛋白。一些实施方案中，细菌信号肽是利斯特氏 菌的。其他实施方案中，细菌信号肽是非利斯特氏菌的。进一步的实 施方案中，利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏菌的菌株，如actA-in1B-菌株。一些实施方案中，已经将表达盒整合至重组利斯特氏菌的 基因组中。一些实施方案中，编码信号肽(即使信号肽是利斯特氏菌 信号肽)的多核苷酸和/或编码抗原的多核苷酸对于在利斯特氏菌中的 表达是密码子最佳化的。
进一步的实施方案中，本发明提供了包括表达盒的重组利斯特氏 菌，其中表达盒包括以下的成分：(a)编码非利斯特氏菌抗原的多核 苷酸，其中多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的； 和(b)启动子，可连接地连接编码外源多肽的多核苷酸。一些实施方 案中，表达盒进一步包括编码细菌信号肽的多核苷酸，其对于在利斯 特氏菌中的表达也是密码子最佳化的。一实施方案中，细菌信号肽是 利斯特氏菌的。另一实施方案中，细菌信号肽是非利斯特氏菌的。一 些实施方案中，细菌信号肽是secA1信号肽，secA2信号肽，或Tat 信号肽。进一步的实施方案中，利斯特氏菌是单核细胞增生利斯特氏 菌的菌株，如actA-in1B-菌株。一些实施方案中，已经将表达盒整合 至重组利斯特氏菌的基因组中。
再一实施方案中，本发明提供了重组利斯特氏菌属的细菌，包括 (a)编码细菌(利斯特氏菌或非利斯特氏菌)信号肽的第一个多核苷 酸，其中第一个多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化 的；(b)编码非利斯特氏菌抗原的第二个多核苷酸，其中第二个多核 苷酸对于在利斯特氏菌中的表达也是密码子最佳化的且位于和第一个 多核苷酸相同的翻译读框中；和(c)可操作地连接第一个和第二个多 核苷酸的启动子，其中表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。一 些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌属于单核细胞增生利斯特氏菌种。 一些实施方案中，利斯特氏菌属的细菌是单核细胞增生利斯特氏菌的 actA-in1B-突变株。
本发明进一步提供了包括多于一个在此所述表达盒的细菌如利斯 特氏菌。特定的组成中，给定蛋白质的分子量可以抑制其从重组细菌 如重组利斯特氏菌的表达。解决该问题的一种方法是将编码目标蛋白 的基因分子上“分割”并将每个分割部分功能上与执行其从细菌中分 泌的序列(例如，secA1，secA2或Tat元件)融合。一种方法是单独 生成表达异源基因各个分割部分的重组利斯特氏菌。或者，将分子上 分割的基因的各个组分(也包括用于分泌的合适元件)引入贯穿细菌 染色体的基因间隔区中，使用本领域公知的方法，例如通过等位基因 交换。另一个实例是作为单个多顺反子信息来表达分子上分割的基因。 根据这种组成，散置在分子上分割的基因的蛋白质编码序列之间的将 是SD核糖体结合序列，以便根据多顺反子信息再启动蛋白质合成。
其他方面中，本发明提供了提高异源多肽在重组细菌如利斯特氏 菌中的表达和/或分泌的方法。在此所述的多核苷酸，表达盒和/或表 达载体中的任一种都可以用于这些方法中。例如，本发明提供了提高 与信号肽融合的异源多肽在利斯特氏菌中的表达和/或分泌的方法，包 括将表达盒上的多肽编码序列，表达盒的信号肽编码序列，或两者密 码子最佳化。本发明还提供了提高与信号肽融合的异源多肽在利斯特 氏菌中的表达和/或分泌的方法，包括使用来自非利斯特氏菌来源的和 /或来自secA1以外分泌途径的信号肽。
本发明还提供了生产重组细菌(例如，重组利斯特氏菌属的细菌) 的方法，包括将在此所述的重组核酸分子，表达盒和/或表达载体引入细 菌中来生产重组细菌。例如，一些实施方案中，重组核酸分子包括(a) 编码细菌天然信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细 菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重 组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白，将该重组核酸分子引入 细菌中来生产重组细菌。一些实施方案中，重组核酸分子包括(a)编 码非-secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第二个 多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框 中，且其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白，将该重组 核酸分子引入细菌中来生产重组细菌。一些实施方案中，引入细菌中来 生产重组细菌的重组核酸分子是这样的重组核酸分子，其中该重组核酸 分子包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b)位 于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸， 其中重组核酸分子编码包括非利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。一 些实施方案中，用于生产重组细菌的重组核酸分子是包括以下成分的重 组核酸分子：(a)编码细菌自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个 多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中重组核酸分子 编码蛋白质嵌合体，其中非利斯特氏菌多肽与自溶素或其催化活性片段 或催化活性变体融合，或插入自溶素或其催化活性片段或催化活性变体 内。一些其他实施方案中，提供了生产重组利斯特氏菌属细菌的方法， 包括将多顺反子表达盒引入利斯特氏菌属的细菌中来生产重组利斯特 氏菌属的细菌，其中表达盒编码至少两个离散的非利斯特氏菌多肽。
IX.药物组合物，免疫原性组合物和/或疫苗组合物
本发明还提供了多种不同的组合物如药物组合物，免疫原性组合 物和疫苗。这些组合物包括在此所述的任一重组细菌(参见，例如， 以上的发明概述，发明详述的部分I和VIII，和说明书的其他地方， 包括以下的实施例)。一些实施方案中，组合物是分离的。
例如，本发明提供了包括以下成分的药物组合物：(i)药物学上 可接受的载体；和(ii)在此所述的重组细菌。
例如，本发明提供了包括以下成分的药物组合物：(i)药物学上 可接受的载体；和(ii)包括表达盒的重组细菌，该表达盒包括编码 信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达 是密码子最佳化的，编码多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷 酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，和可操作地连接第一个 和第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和多肽的融 合蛋白。
本发明还提供了包括(i)药物学上可接受的载体；和(ii)包括 表达盒的重组细菌的药物组合物，其中表达盒包括编码非secA1细菌 信号肽的第一个多核苷酸，位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中 的编码多肽的第二个多核苷酸，和可操作地连接第一个和第二个多核 苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。
本发明进一步提供了包括(i)药物学上可接受的载体；和(ii) 包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌的药物组合物，其中表达盒包括 以下的成分：(a)编码利斯特氏菌外源多肽的多核苷酸，其中多核苷 酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的；和(b)启动子，可 操作地连接编码外源多肽的多核苷酸。
本发明还提供了药物组合物，包括(i)药物学上可接受的载体； 和(ii)包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌，该表达盒包括(a)编 码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷 酸相同的翻译读框中的编码多肽的第二个多核苷酸；和(c)可操作地 连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码包括非利斯 特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。
如在此所用的，“载体”包括任何和所有的溶剂，分散介质，赋 形剂，包衣，稀释剂，抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂，缓冲剂，载 体溶液，悬浮液，胶体等。药物学上可接受的载体是本领域普通技术 人员公知的，并包括任何材料，该材料与活性成分组合时，使得活性 成分保持生物活性并且不与患者的免疫系统反应。例如，药物学上可 接受的载体包括，但不限于，水，缓冲的盐溶液(例如，0.9％的盐水)， 乳液如油/水乳液和各种类型的润湿剂。可能的载体包括，但不限于， 油(例如，矿物油)，葡萄糖溶液，甘油溶液，白垩，淀粉，盐，甘 油和明胶。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适载体都可用于药物组合 物中，但载体的类型将根据给药方式而改变。可以将本发明的组合物 配制来用于任何合适的给药方式，包括例如，局部，口服，鼻，静脉 内，颅内，腹膜内，皮下或肌内给药。一些实施方案中，对于非肠道 给药，如皮下注射，载体包括水，盐水，乙醇，脂肪，蜡或缓冲剂。 一些实施方案中，以上载体或固体载体的任一种，如甘露醇，乳糖， 淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石，纤维素，葡萄糖，蔗糖和碳酸镁， 都可以用于口服给药。
通过公知的常规方法来配制包括这些载体的组合物(参见，例如， Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编辑， Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；和Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing，2000)。
除了药物组合物以外，还提供了免疫原性组合物。例如，本发明 提供了包括在此所述重组细菌(参见，例如，以上的发明概述，发明 详述的部分I和VIII，和说明书的其他地方，包括以下的实施例)的 免疫原性组合物。一些实施方案中，免疫原性组合物包括重组细菌， 其中由重组细菌表达的多肽的一部分的多肽序列，作为离散的蛋白质， 作为融合蛋白的一部分，或包埋于蛋白质嵌合体中(取决于所用的重 组核酸分子或表达盒)，是抗原或包括抗原。换句话说，一些实施方 案中，免疫原性组合物包括重组细菌，该重组细菌包括编码包括抗原 的多肽的重组核酸分子或表达盒。合适的抗原包括，但不限于，在此 所述那些中(例如，在以上部分IV中)的任一种。一些实施方案中， 免疫原性组合物中的重组细菌表达包括抗原的多肽，以在将组合物给 予宿主(例如哺乳动物如人)时足以诱导对抗原的免疫应答的水平。 一些实施方案中，免疫原性组合物刺激的免疫应答是细胞介导的免疫 应答。一些实施方案中，免疫原性组合物刺激的免疫应答是体液免疫 应答。一些实施方案中，免疫原性组合物刺激的免疫应答包括体液和 细胞介导的免疫应答。
例如，一方面中，本发明提供了包括重组细菌的免疫原性组合物， 其中细菌包括表达盒，表达盒包括以下的成分：(a)编码信号肽的第 一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最 佳化的；(b)编码抗原的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于 和第一个多核苷酸相同的翻译读框中；和(c)可操作地连接第一个和 第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合 蛋白。
另一方面中，本发明提供了包括重组细菌的免疫原性组合物，其 中细菌包括表达盒，表达盒包括以下的成分：(a)编码非secA1细菌 信号肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读 框中的编码抗原的第二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第 二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋 白。
再一方面中，本发明提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的免疫原 性组合物，其中重组利斯特氏菌属细菌包括表达盒，其中表达盒包括 以下的成分：(a)编码非利斯特氏菌抗原和对于在利斯特氏菌中表达 是密码子最佳化的多核苷酸；和(b)启动子，可操作地连接编码抗原 的多核苷酸。
本发明还提供了包括含有表达盒的重组利斯特氏菌属细菌的免疫 原性组合物，该表达盒包括：(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个 多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原 的第二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的 启动子，其中表达盒编码包括非利斯特氏菌信号肽和抗原的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了包括含有重组核酸分子的重组细菌的 免疫原性组合物(或疫苗)，其中重组核酸分子包括(a)编码细菌天 然信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于在细菌中的表 达是密码子最佳化的，和(b)编码包括抗原的多肽的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中 重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了包括重组利斯特氏菌细菌的免疫原性 组合物(或疫苗)，其中重组细菌包括重组核酸分子，该重组核酸分 子包括(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多核苷酸对于 在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码包括抗原的多 肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相 同的翻译读框中，其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋 白。
另一方面中，本发明提供了包括含有重组核酸分子的重组细菌的 免疫原性组合物(或疫苗)，其中重组核酸分子包括编码非secA1细 菌信号肽的第一个多核苷酸，和编码包括抗原的多肽的第二个多核苷 酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中， 且其中重组核酸分子编码包括信号肽和多肽的融合蛋白。
再一方面中，本发明提供了包括含有重组核酸分子的重组利斯特 氏菌属细菌的免疫原性组合物(或疫苗)，其中重组核酸分子包括(a) 编码非secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸，和( b)编码与信号肽异 源的或对细菌为外源的多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸 位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，且其中重组核酸分子编码 包括信号肽和多肽的融合蛋白。一些实施方案中，第一个多核苷酸编 码的多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的免疫原 性组合物(或疫苗)，其中重组利斯特氏菌属细菌包括重组核酸分子， 其中重组核酸分子包括编码利斯特氏菌外源多肽的多核苷酸，其中编 码外源多肽的多核苷酸对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化 的。一些实施方案中，外源多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的免疫原 性组合物(或疫苗)，其中重组细菌包括重组核酸分子，该重组核酸 分子包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b) 编码包括抗原的多肽的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和 第一个多核苷酸相同的翻译读框中，且其中重组核酸分子编码包括非 利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。
本发明还提供了包括重组细菌的免疫原性组合物(或疫苗)，其 中重组细菌包括核酸分子，该核酸分子包括(a)编码细菌自溶素或其 催化活性片段或催化活性变体的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的 第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的 翻译读框中，其中重组核酸分子编码包括第二个多核苷酸编码的多肽 和自溶素或其催化活性片段或催化活性变体的蛋白质嵌合体，其中在 蛋白质嵌合体中，多肽与自溶素或其催化活性片段或催化活性变体融 合，或位于自溶素或其催化活性片段或催化活性变体内。一些实施方 案中，第二个多核苷酸编码的多肽包括抗原。
另一方面中，本发明提供了包括重组利斯特氏菌属细菌的免疫原 性组合物(或疫苗)，其中重组利斯特氏菌属细菌包括重组核酸分子， 其中重组核酸分子编码至少两个离散的非利斯特氏菌多肽，其中至少 一个包括抗原。
其他方面中，本发明提供了包括重组细菌的免疫原性组合物(或 疫苗)，该重组细菌包括重组核酸分子，该重组核酸分子包括(a)编 码信号肽的第一个多核苷酸，(b)编码分泌蛋白或其片段的第二个多 核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框 中，和(c)编码与分泌蛋白或其片段异源的多肽的第三个多核苷酸， 其中第三个多核苷酸位于和第一个以及第二个多核苷酸相同的翻译读 框中，其中重组核酸分子编码包括信号肽，第三个多核苷酸编码的多 肽和分泌蛋白或其片段的蛋白质嵌合体，且其中在蛋白质嵌合体中， 第三个多核苷酸编码的多肽与分泌蛋白或其片段融合，或位于分泌蛋 白或其片段内。一些实施方案中，第三个多核苷酸编码的异源多肽包 括抗原。
可以通过测试重组细菌在体外或在模型系统内刺激免疫应答的能 力来测定特定形式的重组细菌(和/或特定表达盒)是否可用于免疫原 性组合物中(或作为疫苗)。
可以通过体外和体内方法来测量这些免疫细胞反应来测定特定重 组细菌(和/或特定表达盒)的免疫应答是否有效。一种可能性是测量 目标蛋白或抗原通过已经与重组细菌群混合的抗原呈递细胞的呈递。 重组细菌可以与合适的抗原呈递细胞或细胞系例如树突细胞混合，并 可以测量树突细胞对识别蛋白或抗原的T细胞的抗原呈递。如果重组 细菌以足够的水平表达蛋白或抗原，则将通过树突细胞将其加工成肽 片段并在MHC I类或II类环境中呈递给T细胞。为了检测呈递的蛋白 或抗原的目的，可以使用响应特定蛋白或抗原的T细胞克隆或T细胞 系。T细胞也可以是T细胞杂交瘤，其中通过与癌细胞系融合来使T 细胞无限增殖。这样的T细胞杂交瘤，T细胞克隆或T细胞系可以包 括CD8+或CD4+T细胞。根据加工抗原的途径，树突细胞可以呈递给CD8+ 或CD4+T细胞。CD8+T细胞识别MHC I类环境内的抗原，而CD4+识别 MHC II类环境内的抗原。通过T细胞受体特异性识别由呈递的抗原刺 激了T细胞，导致可以定量测量(例如，使用ELISA测定法，ELISPOT 测定法，或胞内细胞因子染色(ICS))的某些蛋白如IL-2，肿瘤坏 死因子-α(TNF-α)，或干扰素-γ(INF-γ)的产生。这些是本领 域公知的以及以下的实施例中也具体说明了的技术(参见，例如，以 下的实施例21)。
或者，可以设计杂交瘤来包括在呈递的抗原刺激T细胞杂交瘤时 激活的报道基因，如半乳糖苷酶。可以通过其对底物如氯酚红-β-半乳 糖苷的活性来容易地测量β-半乳糖苷酶产生的增加，其导致颜色的改 变。颜色改变可以作为特定抗原呈递的指示剂来直接测量。
测定本发明重组细菌疫苗的抗原表达的其他体外和体内方法是本 领域普通技术人员已知的。也可以直接测量重组细菌对特定异源抗原 的表达。例如，可以将放射性标记的氨基酸加入细胞群中，并测定掺 入特定蛋白质中的放射性量。可以将由细胞群合成的蛋白质分离，例 如通过凝胶电泳或毛细管电泳，并定量测量放射性量来测定特定蛋白 的表达水平。或者，可以表达没有放射性的蛋白并通过各种方法来观 察，如ELISA测定法或通过凝胶电泳和蛋白质印迹分析，使用酶联抗 体或荧光标记抗体来检测。
以下的实施例21，提供了怎样将本领域普通技术人员已知技术中 的一些用于测定免疫原性的一些具体的代表性实施例。例如，Elispot 测定法，胞内细胞因子染色测定法(ICS)，刺激的脾细胞的细胞因子 表达的测量，以及体外和体内细胞毒性T细胞活性的测试都是本领域 技术人员已知的用于测定免疫原性的技术。实施例21中提供了使用模 式抗原的这些技术的代表性描述。以下实施例31A和31E中也描述了 代表性的测定法。
此外，可以通过将免疫原性组合物或疫苗给予动物模型如小鼠模 型，接着测定存活或肿瘤生长来更直接地测定疫苗组合物的治疗功效。 例如，可以在给药和激发(例如，使用肿瘤或病原体)后测量存活。 参见，例如，以下实施例20和31B-D中所述的测定法。
首先改变肿瘤细胞，使其表达目标抗原或模式抗原，然后将表达 目标抗原的肿瘤细胞植入小鼠中能够生产用于测试表达特定抗原的免 疫原性组合物或疫苗的免疫原性的小鼠模型。在肿瘤细胞植入之前(为 了测试候选组合物的预防功效)或肿瘤细胞植入小鼠之后(为了测试 候选组合物的治疗功效)，可以用包括表达含有目标抗原或模式抗原 的多肽的重组细菌的候选免疫原性组合物或疫苗接种小鼠。
例如，可以用合适的包括编码所需抗原或模式抗原的表达盒的载 体，使用本领域的标准技术转染CT26小鼠鼠结肠癌细胞。然后可以将 标准技术如流式细胞计数和蛋白质印迹用于鉴定以足够的水平来表达 抗原或模式抗原的克隆来用于免疫原性和/或功效的测定中。
或者，可以测试包括表达抗原的重组细菌的候选组合物，该抗原 对应于或源自肿瘤细胞系内源抗原(例如，CT26小鼠鼠结肠癌细胞内 源的逆转录病毒gp70肿瘤抗原AH1，或不规则变化的抗原决定部位 AH1-A5)。这样的测定中，可以将肿瘤细胞植入动物模型中而不需要 进一步改变来表达另外的抗原。然后可以测试包括抗原的候选疫苗。
如所述的，还提供了包括在此所述细菌的疫苗组合物。例如，本 发明提供了包括在此所述重组细菌(参见，例如，在以上的发明概述， 发明详述部分I和VIII，和说明书的其他地方，包括以下的实施例中 所述的重组细菌)的疫苗，其中作为离散的蛋白质，作为融合蛋白的 一部分，或包埋于蛋白质嵌合体中(取决于所用的重组核酸分子或表 达盒)由重组细菌表达的多肽的一部分的多肽序列是抗原。合适的抗 原包括在此所述那些中(例如，在以上的部分IV中)的任一种。
一方面中，本发明提供了包括细菌的疫苗，其中细菌包括含有以 下成分的表达盒：(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第一个多 核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的；(b)编码抗原的第二 个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译 读框中；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，使 得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了包括细菌的疫苗，其中细菌包括含有 以下成分的表达盒：(a)编码非secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸； (b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第二个多 核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，使 得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。
再一方面中，本发明提供了包括含有核酸分子的重组利斯特氏菌 属细菌的疫苗，其中核酸分子包括以下的成分：(a)编码非利斯特氏 菌抗原且对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的多核苷酸；和 (b)启动子，可操作地连接编码抗原的多核苷酸。
另一方面中，本发明提供了包括含有表达盒的重组利斯特氏菌属 细菌的疫苗，该表达盒包括：(a)编码非利斯特氏菌信号肽的多核苷 酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第二 个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子， 其中表达盒编码包括非利斯特氏菌信号肽和抗原的融合蛋白。
一些实施方案中，疫苗组合物包括已经用在此所述的任一重组细 菌感染的抗原呈递细胞(APC)。一些实施方案中，疫苗(或免疫原性 组合物或药物组合物)不包括抗原呈递细胞(即，疫苗或组合物是基 于细菌的疫苗或组合物，不是基于APC的疫苗或组合物)。
适于给药疫苗组合物(和药物组合物以及免疫原性组合物)的给 药方法是本领域已知的，并包括口服，静脉内，皮内，腹膜内，肌内， 淋巴内，鼻内和皮下的给药途径。
疫苗制剂是本领域已知的，且在一些实施方案中可以包括许多的 添加剂，如防腐剂(例如，硫柳汞，2-苯氧基乙醇)，稳定剂，佐剂 (例如，氢氧化铝，磷酸铝，细胞因子)，抗生素(例如，新霉素， 链霉素)和其他物质。一些实施方案中，加入稳定剂如乳糖或谷氨酸 一钠(MSG)来稳定疫苗制剂以对抗多种条件，如温度改变或冻干处理。 一些实施方案中，疫苗制剂还可以包括悬浮液体或稀释剂如无菌水， 盐水或等渗缓冲盐水(例如，缓冲至生理pH的磷酸盐)。疫苗还可以 含有少量来自生产过程的残余物质。
例如，一些实施方案中，将疫苗组合物冻干(即，冷冻干燥)。 在给药之前，可以将冻干的制剂与无菌溶液(例如，柠檬酸盐-碳酸氢 盐缓冲剂，缓冲的水，0.4％盐水，等)合并。
一些实施方案中，疫苗组合物可以进一步包括本领域已知的其他 成分来提高对疫苗的免疫应答，如佐剂或共刺激分子。除了以上所示 的那些以外，可能的佐剂包括趋化因子和细菌核酸序列，如CpG。一 些实施方案中，疫苗包括提高对疫苗的免疫应答的抗体，如CTLA4。 一些实施方案中，本发明的疫苗组合物任选地包括共刺激分子，该共 刺激分子包括一种或多种选自GM-CSF，IL-2，IL-12，IL-14，IL-15， IL-18，B7.1，B7.2和B7-DC的因子。其他共刺激分子是本领域普通 技术人员已知的。
其他方面中，本发明提供了改进包括表达抗原的利斯特氏菌的疫 苗或免疫原性组合物的方法。在此所述的任一种多核苷酸，表达盒和/ 或表达载体都可以用于这些方法中。例如，本发明提供了改进包括利 斯特氏菌属细菌的疫苗或免疫原性组合物的方法，其中利斯特氏菌属 细菌表达与信号肽融合的异源抗原，包括将表达盒上的多肽编码序列， 表达盒的信号肽编码序列或两者密码子最佳化。本发明提供了改进包 括利斯特氏菌属细菌的疫苗或免疫原性组合物的方法，其中利斯特氏 菌属细菌表达与信号肽融合的异源抗原，包括使用来自非利斯特氏菌 来源的和/或来自除secA1以外的分泌途径的信号肽。
还提供了生产本发明疫苗的方法。例如，一实施方案中，生产包 括重组细菌(例如，重组利斯特氏菌属细菌)的疫苗的方法包括将在 此所述的重组核酸分子，表达盒或表达载体引入细菌中，其中重组核 酸分子，表达盒或表达载体编码抗原。例如，一些实施方案中，重组 核酸分子包括(a)编码细菌天然信号肽的第一个多核苷酸，其中第一 个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的，和(b)编码抗原 的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同 的翻译读框中，其中重组核酸分子编码包括信号肽和抗原的融合蛋白， 将该重组核酸分子引入细菌中来生产疫苗。一些实施方案中，重组核 酸分子包括(a)编码非secA1细菌信号肽的第一个多核苷酸，和(b) 编码抗原的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核 苷酸相同的翻译读框中，且其中重组核酸分子编码包括信号肽和抗原 的融合蛋白，将该重组核酸分子引入细菌中来生产疫苗。一些实施方 案中，引入细菌中来生产疫苗的重组核酸分子是这样的重组核酸分子， 其中重组核酸分子包括(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷 酸，和(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第 二个多核苷酸，其中重组核酸分子编码包括非利斯特氏菌信号肽和抗 原的融合蛋白。一些实施方案中，用于生产疫苗的重组核酸分子是这 样的重组核酸分子，包括(a)编码细菌自溶素或其催化活性片段或催 化活性变体的第一个多核苷酸，和(b)编码多肽的第二个多核苷酸， 其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中，其中 重组核酸分子编码蛋白质嵌合体，其中非利斯特氏菌多肽与自溶素或 其催化活性片段或催化活性变体融合，或插入自溶素或其催化活性片 段或催化活性变体内。一些实施方案中，提供了生产包括重组利斯特 氏菌属细菌的疫苗的方法，其包括将多顺反子表达盒引入利斯特氏菌 属细菌中来生产疫苗，其中多顺反子表达盒编码至少两个离散的非利 斯特氏菌多肽，其中至少一个多肽是抗原。
还提供了包括任一种本发明的重组核酸分子，表达盒，载体，细 菌和/或组合物的药盒。
X.使用方法
提供了使用在此所述的重组细菌或药物组合物，免疫原性组合物 或疫苗组合物诱导免疫应答，和/或预防或治疗宿主病症的多种方法。 一些实施方案中，所治疗或预防的病症是疾病。一些实施方案中，疾 病是癌症。一些实施方案中，疾病是传染病。此外，重组细菌还可以 用于生产和分离异源蛋白，如哺乳动物蛋白。
如在此所用的，(关于病症或疾病)的“治疗(treatment)”或 “治疗(treating)”是获得有益或所需效果，包括并优选临床效果 的方法。为了本发明的目的，关于疾病的有益或所需效果包括，但不 限于，以下的一种或多种：改善与疾病相关的病症，治愈疾病，减轻 疾病的严重程度，延迟疾病的进展，缓解一种或多种与疾病相关的症 状，提高患有疾病的患者的生活质量，和/或延长存活。同样，为了本 发明的目的，关于病症的有益或所需效果包括，但不限于，以下的一 种或多种：改善病症，治愈病症，减轻病症的严重程度，延缓病症的 进展，缓解与病症相关的一种或多种症状，提高患有病症患者的生活 质量，和/或延长存活。例如，那些将在此所述的组合物用于治疗癌症 的实施方案中，有益或所需的效果包括，但不限于，以下的一种或多 种：降低肿瘤细胞或癌细胞的增生(或破坏)肿瘤细胞或癌细胞，降 低癌症中发现的肿瘤细胞的转移，缩小肿瘤的尺寸，减轻由癌症引起 的症状，提高患有癌症的患者的生活质量，降低治疗疾病需要的其他 药物的剂量，延缓癌症的进展，和/或延长癌症患者的存活。
如在此所用的，术语“预防”疾病或“保护宿主”免受疾病(在 此可交替使用)包括，但不限于，以下的一种或多种：停止，延迟， 阻碍，减缓，阻滞和/或延缓疾病的发作或进展，稳定疾病的进展和/ 或延迟疾病的发展。术语“预防”病症或“保护患者”免受病症(在 此可交替使用)包括，但不限于，以下的一种或多种：停止，延迟， 阻碍，减缓，阻滞和/或延缓病症的发作或进展，稳定病症的进展和/ 或延迟病症的发展。这种预防的时间段可以是不同长度的时间，取决 于疾病或病症的历史和/或待治疗的个体。例如，当设计疫苗来预防或 抵抗由病原体引起的传染病时，术语“预防”疾病或“保护宿主”免 受疾病包括，但不限于，以下的一种或多种：停止，延迟，阻碍，减 缓，阻滞和/或延缓宿主病原体的感染，宿主病原体感染的进展，或与 病原体对宿主的感染相关的疾病的发作或进展，和/或稳定与病原体对 宿主的感染相关的疾病的进展。以及，例如，当疫苗是抗癌疫苗时， 术语“预防”疾病或“保护宿主”免受疾病包括，但不限于，以下的 一种或多种：停止，延迟，阻碍，减缓，阻滞和/或延缓癌症的发展或 转移，癌症的进展，或癌症的复发。
一方面中，本发明提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包 括将有效量的在此所述的重组细菌或有效量的包括在此所述重组细菌 (参见，例如，以上的发明概述，发明详述的部分I，VIII和IX，或 以下的实施例)的组合物(例如，药物组合物，免疫原性组合物或疫 苗)给予宿主。一些实施方案中，由重组细菌中的重组核酸分子，表 达盒和/或表达载体编码的多肽包括抗原，或是包括抗原的融合蛋白或 蛋白质嵌合体。
例如，一方面中，本发明提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方 法，包括将有效量的包括重组细菌的组合物给予宿主，其中重组细菌 包括含有以下成分的表达盒：(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其 中第一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的；(b)编码 抗原的第二个多核苷酸，其中第二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸 相同的翻译读框中；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的 启动子，使得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法， 包括将有效量的包括含有表达盒的重组细菌的组合物给予宿主，其中 表达盒包括以下的成分：(a)编码非secA1细菌信号肽的第一个多核 苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第 二个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动 子，使得表达盒编码包括信号肽和抗原的融合蛋白。
再一方面中，本发明提供了诱导宿主对非利斯特氏菌抗原的免疫 应答的方法，包括将有效量的包括含有核酸分子的重组利斯特氏菌属 细菌的组合物给予宿主，其中核酸分子包括以下的成分：(a)编码非 利斯特氏菌抗原且对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的多核 苷酸；和(b)启动子，可操作地连接编码抗原的多核苷酸。
另一方面中，本发明提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法， 包括将有效量的包括表达盒的重组利斯特氏菌属细菌给予宿主，该表 达盒包括以下的成分：(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个多核苷 酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码抗原的第二 个多核苷酸；和(c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子， 其中表达盒编码包括非利斯特氏菌信号肽和抗原的融合蛋白。
在此所述的诱导免疫应答的方法的一些实施方案中，以药物组合 物，免疫原性组合物和/或疫苗组合物的形式来给予细菌。
一些实施方案中，免疫应答是MHC I类免疫应答。其他实施方案 中，免疫应答是MHC II类免疫应答。仍然其他实施方案中，由给予细 菌或组合物诱导的免疫应答是MHC I类和MHC II类两种免疫应答。因 此，一些实施方案中，免疫应答包括CD4+T细胞响应。一些实施方案 中，免疫应答包括CD8+T细胞响应。一些实施方案中，免疫应答包括 CD4+T细胞响应和CD8+T细胞响应。一些实施方案中，免疫应答包括 B-细胞响应和/或T-细胞响应。可以使用本领域普通技术人员已知的 方法，通过测定针对抗原的抗体滴度来测量B-细胞响应。一些实施方 案中，由在此所述的组合物诱导的免疫应答是体液免疫应答。其他实 施方案中，诱导的免疫应答是细胞免疫应答。一些实施方案中，免疫 应答包括细胞和体液两种免疫应答。一些实施方案中，免疫应答是抗 原特异性的。一些实施方案中，免疫应答是抗原特异性的T-细胞响应。
除了提供诱导免疫应答的方法以外，本发明还提供了预防或治疗 宿主(例如，患者如人患者)病症的方法。一些实施方案中，该病症 是疾病。该方法包括将有效量的在此所述的重组细菌，或包括在此所 述重组细菌(参见，例如，发明概述，以上的发明详述部分I，VIII 和IX，或以下的实施例)的组合物给予宿主。一些实施方案中，疾病 是癌症。一些实施方案中，疾病是传染病。
例如，一方面中，本发明提供了预防或治疗宿主疾病(或病症) 的方法，包括将有效量的包括细菌的组合物给予宿主，其中细菌包括 含有以下成分的表达盒：(a)编码信号肽的第一个多核苷酸，其中第 一个多核苷酸对于在细菌中的表达是密码子最佳化的；(b)编码多肽 (例如，抗原和/或治疗性哺乳动物蛋白)的第二个多核苷酸，其中第 二个多核苷酸位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中；和(c)可操 作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编码包括信 号肽和抗原的融合蛋白。
另一方面中，本发明提供了预防或治疗宿主疾病(或病症)的方 法，包括将有效量的含有重组细菌的组合物给予宿主，其中细菌包括 表达盒，且其中表达盒包括以下的成分：(a)编码非secA1细菌信号 肽的第一个多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中 的编码多肽(例如，抗原和/和哺乳动物蛋白)的第二个多核苷酸；和 (c)可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，使得表达盒编 码包括信号肽和抗原的融合蛋白。
再一方面中，本发明提供了预防或治疗宿主疾病(或病症)的方 法，包括将有效量的包括含有核酸分子的重组利斯特氏菌属细菌的组 合物给予宿主，其中核酸分子包括以下的成分：(a)编码非利斯特氏 菌多肽(例如，抗原和/或治疗性哺乳动物蛋白)且对于在利斯特氏菌 中的表达是密码子最佳化的多核苷酸；和(b)启动子，可操作地连接 编码抗原的多核苷酸。
另一方面中，本发明提供了预防或治疗宿主疾病(或病症)的方 法，包括将有效量的包括含有表达盒的重组利斯特氏菌属细菌的组合 物给予宿主，该表达盒包括：(a)编码非利斯特氏菌信号肽的第一个 多核苷酸；(b)位于和第一个多核苷酸相同的翻译读框中的编码多肽 (例如，抗原和/或治疗性哺乳动物蛋白)的第二个多核苷酸；和(c) 可操作地连接第一个和第二个多核苷酸的启动子，其中表达盒编码包 括非利斯特氏菌信号肽和多肽的融合蛋白。
一些实施方案中，疾病是癌症。一些实施方案中，当待治疗或预 防的病症是癌症时，疾病是黑素瘤，乳癌，胰腺癌，肝癌，结肠癌， 结肠直肠癌，肺癌，脑癌，睾丸癌，卵巢癌，鳞状细胞癌，胃肠道癌， 子宫颈癌，肾癌，甲状腺癌或前列腺癌。一些实施方案中，癌症是黑 素瘤。一些实施方案中，癌症是胰腺癌。一些实施方案中，癌症是结 肠癌。一些实施方案中，癌症是前列腺癌。一些实施方案中，癌症是 转移性的。
其他实施方案中，疾病是自体免疫疾病。仍然其他实施方案中， 疾病是传染病或由病原体如病毒，细菌，真菌或原生动物引起的另一 种疾病。一些实施方案中，疾病是传染病。
一些实施方案中，预防或治疗癌症中重组细菌的使用包括将重组 细菌递送至个体免疫系统的细胞来预防或治疗存在的癌症或递送至风 险因素如环境暴露和/或家族因素提高的个体。其他实施方案中，预防 或治疗癌症中重组细菌的使用包括将重组细菌递送至已经切除了肿瘤 或过去患有癌症但目前症状缓解的个体。
一些实施方案中，将包括在此所述的重组细菌的组合物给予患者 引发了宿主的CD4+T细胞响应。一些其他实施方案中，将包括在此所 述的重组细菌的组合物给予宿主引发了宿主的CD8+T细胞响应。一些 实施方案中，将包括在此所述的重组细菌的组合物给予宿主引发了宿 主的CD4+T细胞响应和CD8+T细胞响应。
可以评价个体例如小鼠中疫苗或其他组合物治疗病症的功效。认 为小鼠模型是用于评价在人中的功效的模型并可用于评估和限定本发 明的疫苗。小鼠模型用于证明疫苗在任何个体中的有效性的潜能。可 以评价疫苗提供对抗特定疾病的预防或治疗效果的能力。例如，在传 染病的病例中，可以用所需量的本发明的合适疫苗接种一群小鼠，其 中重组细菌表达传染病相关抗原。随后可以用与疫苗抗原相关的感染 因子感染小鼠并测试对抗感染的保护。可以相对于对照群(非接种的 或只接种了载体或不含有合适抗原的细菌)来观察传染病的进展。
在癌症疫苗的情况中，可利用肿瘤细胞模型，其中可以在接种了 包括含有所需肿瘤抗原的本发明细菌的组合物之前(治疗模型)或之 后(预防模型)，将表达所需肿瘤抗原的肿瘤细胞系注射入一群小鼠 中。接种含有肿瘤抗原的重组细菌可以与没有接种，接种了载体或接 种了表达无关抗原的重组细菌的对照群相比较。可以根据肿瘤注射后 肿瘤体积随时间的变化或根据肿瘤注射后存活群体随时间的变化来评 价疫苗在这样模型中的有效性(例如，实施例31D)。一实施方案中， 接种了含有重组细菌的组合物的小鼠中的肿瘤体积比没有接种或接种 了载体或表达无关抗原的细菌的小鼠中的肿瘤体积小约5％，约10％， 约25％，约50％，约75％，约90％或约100％。另一实施方案中，在肿瘤 植入小鼠后至少约10，约17，或约24天观察到肿瘤体积的这种差异。 一实施方案中，接种了包括重组细菌的组合物的小鼠的半数存活时间 比没有接种或接种了载体或表达无关抗原的细菌的小鼠长至少约2， 约5，约7或至少约10天。
在此所述方法中的宿主(即，患者)是任何脊椎动物，优选哺乳 动物，包括家畜，变种动物和灵长类，包括人。一些实施方案中，宿 主是哺乳动物。一些实施方案中，宿主是人。
可以通过任何合适的方法，如皮内，皮下，腹膜内，静脉内，肌 内，淋巴内，口服或鼻内，以及通过对于任何给定的恶性或传染性疾 病或其他病症恰当的任何途径来递送重组细菌和包括该菌株的组合 物。
可以将包括重组细菌和免疫刺激剂的组合物同时，顺次或分开给 予宿主。免疫刺激剂的实例包括，但不限于，IL-2，IL-12，GMCSF， IL-15，B7.1，B7.2和B7-DC以及IL-14。以上的部分IX中提供了刺 激剂的其他实例。
如在此所用的，细菌或组合物(如药物组合物或免疫原性组合物) 的“有效量”是足以实现有益或所需效果的量。对于预防性用途，有 益或所需效果包括如消除或降低疾疾的风险，减轻疾病的严重程度， 或延迟疾病发作的效果，包括疾病的生化，组织和/或行为症状，其并 发症和疾病发展过程中呈现的中间病理学表型。对于治疗性用途，有 益或所需效果包括临床效果如抑制或压抑疾病，减少一种或多种由疾 病引起的症状(生化，组织和/或行为症状)，包括其并发症和疾病发 展过程中呈现的中间病理学表型，提高患有疾病患者的生活质量，降 低治疗疾病所需其他药物的剂量，提高另一种药物的效果，延迟疾病 的进展和/或延长患者的存活。可以以一次或多次给药形式来给予有效 量。为了本发明的目的，药物，化合物或药物组合物的有效量是足以 直接或间接实现预防性或治疗性治疗的量。如临床情况中所理解的， 药物，化合物或药物组合物的有效量可以或不可以结合另一种药物， 化合物或药物组合物来获得。因此，在给药一种或多种治疗剂的情况 中可以考虑有效量，如果结合一种和多种其他药剂，可能或获得了所 需结果，则可以认为是以有效量给予了单种药剂。
一些实施方案中，对于癌症的治疗性治疗，有效量包括将导致所 需免疫应答的量，其中免疫应答减慢了靶向肿瘤的生长，减小了肿瘤 大小，或优选完全消除了肿瘤。可以以合适的间隔来重复疫苗的给药， 且可以同时在接种的个体的多个不同部位给药。一些实施方案中，对 于癌症的预防性治疗，有效量包括将导致保护性免疫应答的剂量，使 得个体产生癌症的可能性显著降低。接种方案可以包括单剂量，或可 以在合适的间隔重复，直至建立保护性的免疫应答。
一些实施方案中，个体癌症的治疗性治疗可以开始于已经诊断为 癌症的个体作为初始治疗，或可以结合其他治疗使用。例如，为了减 少或消除个体中任何残余的肿瘤，或降低癌症复发的风险，已经外科 手术切除了肿瘤或已经用放疗或化疗治疗的个体可以用疫苗治疗。一 些实施方案中，个体癌症的预防性治疗，开始于由于环境条件或遗传 因素感染某些癌症的风险提高的个体。
给予宿主的药物组合物或疫苗的剂量将根据宿主的物种，宿主的 大小和宿主的病症或疾病而改变。组合物的剂量还将取决于组合物的 给药次数和给药途径。由单独的医师根据待治疗的患者来选择确切的 剂量。
一些实施方案中，方法中所用的药物组合物，免疫原性组合物或 疫苗包括含有在此所述的重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的重组 细菌。一些实施方案中，重组细菌是改变的和/或突变的细菌，如美国 专利申请系列号10/883,599，发明名称为“改变的自由生活的微生物， 疫苗组合物及其使用方法”，Thomas W.Dubensky，Jr等，2004年6 月30日申请，美国专利公开No.2004/0228877和美国专利公开 No.2004/0197343中所述的那些，其中每篇在此以其整体引入作为参 考。一些实施方案中，包括这样改变的和/或突变的细菌或在此所述的 任一种其他重组细菌的药物组合物或疫苗的单剂量包括约102至约 1012细菌生物体。另一实施方案中，单剂量包括约105至约1011细菌生 物体。另一实施方案中，单剂量包括约106至约1011细菌生物体。再一 实施方案中，药物组合物或疫苗的单剂量包括约107至约1010细菌生物 体。再一实施方案中，药物组合物或疫苗的单剂量包括约107至109细菌生物体。
一些实施方案中，单剂量包括至少约1×102细菌生物体。一些实 施方案中，组合物的单剂量包括至少约1×105生物体。另一实施方案 中，组合物或疫苗的单剂量包括至少约1×106细菌生物体。再一实施 方案中，组合物或疫苗的单剂量包括至少约1×107细菌生物体。
一些实施方案中，包括在此所述的重组的，改变的和/或突变的细 菌的药物组合物，免疫原性组合物或疫苗的单剂量包括约1CFU/kg 至约1×1010CFU/kg(CFU＝菌落形成单位)。一些实施方案中，组合物 的单剂量包括约10CFU/kg至约1×109CFU/kg。另一实施方案中，组 合物或疫苗的单剂量包括约1×102CFU/kg至约1×108CFU/kg。再一实 施方案中，组合物或疫苗的单剂量包括约1×103CFU/kg至约1× 108CFU/kg。再一实施方案中，组合物或疫苗的单剂量包括约1× 104CFU/kg至约1×107CFU/kg。一些实施方案中，组合物的单剂量包括 至少约1CFU/kg。一些实施方案中，组合物或疫苗的单剂量包括至少 约10CFU/kg。另一实施方案中。组合物或疫苗的单剂量包括至少约1 ×102CFU/kg。再一实施方案中，组合物或疫苗的单剂量包括至少约1 ×103CFU/kg。再一实施方案中，组合物或疫苗的单剂量包括至少约1 ×104CFU/kg。
一些实施方案中，对于一种宿主如人的合适的(即，有效的)剂 量可以使用本领域技术人员已知的方法从另一种宿主如小鼠的LD50数 据外推出来。
一些实施方案中，药物组合物，免疫原性组合物或疫苗包括已经 用包括在此所述的重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的重组细菌感 染的抗原呈递细胞，如树突细胞。一些实施方案中，细菌已经被改变 和/或是突变体如美国专利申请系列号10/883,599，2004年6月30 日申请，和美国专利公开No.2004/0228877和US2004/0197343中所 述的那些，其中每篇在此以其整体引入作为参考。例如，以下描述了 这样的基于抗原呈递细胞的疫苗：国际申请No.PCT/US2004/23881， 发明名称为“抗原呈递细胞疫苗及其使用方法”，Thomas W.Dubensky， Jr等，2004年7月23申请；美国专利申请系列号10/883,599，2004 年6月30日申请；美国专利公开No.2004/0228877；和美国专利公开 No.US2004/0197343，其中每篇在此以其整体引入作为参考。一些实施 方案中，基于抗原呈递细胞的包括如在此所述那些的细菌的疫苗的单 个剂量包括约1×103至约1×1010抗原呈递细胞。一些实施方案中，疫 苗的单个剂量包括约1×105至约1×109抗原呈递细胞。一些实施方案 中，疫苗的单个剂量包括约1×107至约1×109抗原呈递细胞。
一些实施方案中，优选剂量单位的多次给药，在一天中或在一周 或一个月或一年或几年的过程中。一些实施方案中，每天给予剂量单 位持续多天，或一周一次给药多周。
本发明进一步提供了在此所述的任何重组细菌(即，包括在此所 述的重组核酸分子，表达盒或载体的任何细菌)在制造诱导宿主对抗 原的免疫应答的药物中的用途，其中由细菌中的重组核酸分子，表达 盒和/或载体编码的多肽包括抗原。一些实施方案中，抗原是异源抗原。 本发明还提供了在此所述的重组细菌在制造预防或治疗宿主病症(例 如，疾病如癌症或传染病)的药物中的用途。本发明进一步提供了在 此所述的重组细菌用于诱导宿主对抗原的免疫应答，其中由细菌中的 重组核酸分子，表达盒和/或载体编码的多肽包括抗原。本发明进一步 提供了在此所述的重组细菌用于预防或治疗宿主病症(如疾病)。
本发明还提供了诱导抗原呈递细胞上MHC I类抗原呈递或MHC II 类抗原呈递的方法，包括使在此所述的细菌与抗原呈递细胞接触。
本发明进一步提供了诱导宿主对抗原的免疫应答的方法，包括以 下步骤：(a)在合适的条件和足以加载抗原呈递细胞的时间下，使在 此所述的重组细菌与来自宿主的抗原呈递细胞接触；和(b)将抗原呈 递细胞给予宿主。
重组核酸分子，表达盒和细菌的其他可能用途是本领域普通技术 人员能够认知的。例如，在此所述的重组核酸分子，表达盒，载体和 重组细菌(和其他宿主细胞)可用于生产和分离异源多肽。因此，可 选择的方面中，本发明提供了在细菌中表达多肽的方法，包括(a)将 在此所述的表达盒或载体引入细菌中(例如，通过转染，转化或接合)； 和(b)使细菌在适于蛋白表达的条件下在培养物中生长。另一可选择 的方面中，本发明提供了生产分离多肽的方法，包括以下的步骤：(a) 将在此所述的表达盒或载体引入细菌中(例如，通过转染，转化或接 合)；(b)使细菌在适于蛋白表达的条件下在细胞培养物中生长；和 (c)从细菌细胞培养物中分离蛋白。转化，转染和接合的合适方法是 本领域普通技术人员公知的，培养和使细菌生长以及从细胞培养物中 分离分泌的或非分泌的蛋白的方法也是如此。
实施例
提供了以下的实施例来说明但不限制本发明。
实施例1.示例突变利斯特氏菌菌株的制备
利斯特氏菌菌株源自10403S(Bishop等，J.Immunol.139：2005 (1987))。使用公认的方法通过SOE-PCR和等位基因交换来产生具 有所示基因的框内缺失的利斯特氏菌菌株(Camilli，等， Mol.Microbiol.8：143(1993))。突变株LLO L461T(DP-L4017)描 述于Glomski等，J. Cell.Biol.156：1029(2002)中，在此引入作为 参考。actA-突变株(DP-L4029)是描述于Skoble等，J.of Cell Biology，150：527-537(2000)中的DP-L3078菌株，在此以其整体 引入作为参考，其原噬菌体已经自愈。(原噬菌体自愈描述于(Lauer 等，J.Bacteriol.184：4177(2002)；美国专利公开 No.2003/0203472))。actA-uvrAB-菌株的构建描述于美国临时申请 60/446,051中，2003年2月6日申请，如L4029/uvrAB(参见，例如， 该申请的实施例7)，以及美国专利公开No.2004/0197343。 DP-L4029uvrAB(单核细胞增生利斯特氏菌actA-/uvrAB-双缺失突变 体)于2003年10月3日，根据用于专利程序目的的国际公认的微生 物保藏的布达佩斯条约的规定，保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC)，10801 University Blvd.，马纳萨斯(Manassas)，弗吉 尼亚(Virginia)20110-2209，美国(Unitited States of Amercian)， 且保藏号为PTA-5563。以下申请或出版物中提供了关于突变利斯特氏 菌的其他描述，其中每篇在此以其整体引入作为参考：美国专利公开 No.2004/0228877；美国专利公开No.US2004/0197343；PCT国际申 请No.PCT/US2004/23881，2004年7月23日申请；和美国专利申请系 列号10/883,599，2004年6月30日申请。此外，实例单核细胞增生 利斯特氏菌ΔactAΔinIB双缺失突变体已经于2003年10月3日，根 据用于专利程序目的的国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约的规 定，保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.， 马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚(Virginia)20110-2209，美国 (Unitited States of Amercian)，且保藏号为PTA-5562。
以下实施例24中提供了缺失单核细胞增生利斯特氏菌中的基因 来产生减毒突变体的方法的一个非限制性实施例。
实施例2.表达AH1/OVA或AH1-A5/OVA的利斯特氏菌菌株的构建
制得表达截短形式的模式抗原卵清蛋白(OVA)的突变利斯特氏菌 菌株，来自小鼠结肠直肠癌(CT26)的称为AH1的免疫显性抗原决定 部位(SPSYVYHQF(SEQ ID NO：72))；和改变的抗原决定部位AH1-A5 (SPSYAYHQF(SEQ ID NO：73)；Slansky等，Immunity，13：529-538 (2000))。pPL2整合载体(Lauer等，J Bacteriol.184：4177(2002)； 美国专利公开No.2003/0203472)用于产生含有整合至利斯特氏菌基 因组无害位点的单拷贝的OVA和AH1-A5/OVA重组利斯特氏菌菌株。
A.表达OVA利斯特氏菌(DP-L4056)的构建
首先制得由与截短OVA融合的溶血素缺失的LLO组成的并包含于 pPL2整合载体中的抗原表达盒(pPL2/LLO-OVA)。通过在PSA(来自 ScottA的噬菌体)附着位点tRNAArg-attBB’将pPL2/LLO-OVA引入噬 菌体自愈的单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056中来产生利斯特 氏菌-OVA疫苗菌株。
使用PCR来扩增溶血素缺失的LLO，使用以下的模板和引物：
来源：DP-L4056基因组DNA
引物：
正向(KpnI-LLO nts.1257-1276)：
5′-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO：74)
(Tm：LLO-特异性：52℃。总体上：80℃)
反向(BamHI-XhoI-LLO nts.2811-2792)：
5′-CAATGGATCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATCCC(SEQ ID NO：75)
(Tm：LLO-特异性：52℃。总体上：102℃)
还使用PCR来扩增截短的OVA，使用以下的模板和引物：
来源：来自DP-E3616大肠杆菌的pDP3616质粒DNA(Higgins等， Mol.Molbiol.31：1631-1641(1999))
引物：
正向(Xhol-NcoI OVA cDNA nts.174-186)：
5′-ATTTCTCGAGTCCATGGGGGGTTCTCATCATC(SEQ ID NO：76)
(Tm：OVA-特异性：60℃。总体上：88℃)
反向(XhoI-NotI-HindIII)：
5′-GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT(SEQ ID NO：77)
(Tm：总体上：82℃)
完成构建过程的一个实验方案包括首先用KpnI和BamHI来切割 LLO扩增子，并将KpnI/BamHI载体插入pPL2载体中(pPL2-LLO)。 然后用XhoI和NotI切割OVA扩增子并插入已经用XhoI/NotI切割的 pPL2-LLO中。(备注：pPL2载体不含有任何XhoI位点；pPD-3616含 有一个XhoI位点，用于OVA反向引物设计中)。通过限制分析 (KpnI-LLO-XhoI-OVA-NotI)和测序来证实构建体pPL2/LLO-OVA。通 过转化将质粒pPL2/LLO-OVA引入大肠杆菌中，接着通过接合引入并整 合至利斯特氏菌中(DP-L4056)，完全按照Lauer等所述的(或引入 另一种所需的利斯特氏菌菌株，如inlB-突变体或inlB-actA-双缺失 突变体)。
B.表达AH1/OVA或AHI-A5/OV的利斯特氏菌菌株的构建。
为了制得表达AH1/OVA或AH1-A5/OVA抗原序列的利斯特氏菌，首 先从寡核苷酸制得带有该抗原的插入片段，然后连接至载体 pPL2/LLO-OVA(如上制得)中。
以下寡核苷酸用于制备AH1或AH1-A5插入片段：
AH1抗原决定部位插入片段(ClaI-PstI匹配末端)：
上链寡聚物(AH1上)：
5′-CGATTCCCCTAGTTATGTTTACCACCAATTTGCTGCA(SEQ ID NO：78)
下链寡聚物(AH1下)：
5′-GCAAATTGGTGGTAAACATAACTAGGGGAAT(SEQ ID NO：79)
AHI-A5抗原决定部位插入片段(ClaI-AvaII匹配末端)：
AH1-A5抗原决定部位的序列为SPSYAYHQF(SEQ ID NO：73) (5′-AGT CCA AGT TAT GCA TAT CAT CAA TTT-3′(SEQ ID NO：80))。
上：5′-CGATAGTCCAAGTTATGCATATCATCAATTTGC(SEQ ID NO：81)
下：5′-GTCGCAAATTGATGATATGCATAACTTGGACTAT(SEQ ID NO：82)
将给定抗原决定部位的寡核苷酸以等摩尔比混合，在95℃加热5 分钟。然后使寡核苷酸混合物缓慢冷却。然后将退火的寡核苷酸对以 200比1的摩尔比与用相关限制酶消化制得的pPL2-LLO/OVA质粒连 接。通过限制分析和/或测序来验证新构建体的特性。
然后通过转化将质粒引入大肠杆菌，接着通过接合引入并整合至 利斯特氏菌(DPOL4056)中，完全按照Lauer等所述的，或引入另一 种所需的利斯特氏菌菌株中，如actA-突变株(DP-L4029)，LLO L461T 菌株(DP-L4017)，或actA-/uvrAB-菌株(DP-L4029uvrAB)。
实施例3.利斯特氏菌多核苷酸和表达盒元件的构建
A.克隆载体
将选定的异源抗原表达盒分子构建体插入pPL2(Lauer等，J Bacteriol.2002)，或pAM401(Wirth等，J Bacteriol.165：831-836)， 经修饰以含有pPL2的多克隆序列(AatII小片段，171bp)，插入钝 化的XbaI和NruI识别位点之间，四环素抗性基因内(pAM401-MCS， 图32)。通常，将hly启动子和(选定的)信号肽序列插入pPL2或 pAM401-MCS质粒载体内的唯一的KpnI和BamII位点之间。随后在唯 一的BamHI和SacI位点之间将选定的EphA2基因(有时候经修饰以含 有N-端和C-端抗原决定部位标记物；参见以下的描述)克隆至这些构 建体中。将基于pAM401-MCS质粒载体的分子构建体通过电穿孔引入至 选定的还用溶菌酶处理过的单核细胞增生利斯特氏菌菌株中，使用本 领域技术人员常用的方法。通过从在含有氯霉素(10μg/ml)的BHI 琼脂平板上形成的菌落中分离DNA通过限制酶分析来验证利斯特氏菌 转染子中预期的质粒结构。用各种基于pAM401-MCS的异源蛋白表达盒 转化的重组利斯特氏菌用来测量异源蛋白表达和分泌，如下所述。
将基于pPL2的异源蛋白表达盒构建体掺入选定利斯特氏菌菌株 基因组中的tRNAArg基因中，根据之前所述的方法[Lauer等，J Bacteriol.184，4177-4186(2002)]。简而言之，首先通过电穿孔 或通过化学方法将pPL2异源蛋白表达盒构建体质粒引入大肠杆菌宿 主菌株SM10中(Simon等，Bio/Technology 1：784-791(1983))。 随后，通过接合将基于pPL2的质粒从转化的SM10转移至选定的利斯 特氏菌菌株中。在如所述的含有7.5μg氯霉素每ml和200μg链霉素 每ml的药物选择性BHI琼脂平板上孵育之后，通过在相同组成的平板 上传代3次来纯化所选定的菌落。为了验证pPL2载体在噬菌体附着位 点的整合，挑选单个菌落并通过PCR筛选，使用正向引物NC16(5’ -gtcaaaacatacgctcttatc-3’(SEQ ID NO：94))和反向引物PL95 (5’-acataatcagtccaaagtagatgc-3’(SEQ ID NO：95))的引物对。 基于pPL2的质粒掺入选定的利斯特氏菌菌株基因组中的tRNAArg基因 中的选定的菌落产生了499bp的诊断性DNA扩增子。
B.启动子
异源蛋白表达盒含有prfA-依赖性hly启动子，其驱动编码利斯 特氏菌溶素O(LLO)的基因的转录，并在感染细胞的微环境内被激活。 通过PCR从单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056扩增核苷酸 205586-206000(414bp)，使用以下所示的引物对。扩增的区域包括 hly启动子以及LLO的头28个氨基酸，包括secA1信号肽(参见以上 的)和PEST结构域。对于单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD的该区域 的预期序列可以在GenBank中找到(登录号：gi|16802048|ref| NC_003210.1|[16802048])。PCR反应中所用的引物如下：
引物对：
正向(KpnI-LLO nts.1257-1276)：
5′-CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO：74)
反向(BamHI-LLO nts.)：
5′-CTCTGGATCCATCCGCGTGTTTCTTTTCG(SEQ ID NO：84)
(带下划线的是限制内切核酸酶识别位点。)
将442bp PCR扩增子克隆至质粒载体pCR-XL-TOPO(Invitrogen， Carlsbad，CA)中，根据制造商的说明书。测定pCR-XL-TOPO-hly启 动子质粒克隆中利斯特氏菌特异性碱基的核苷酸序列。与EGD菌株相 比较，单核细胞增生利斯特氏菌菌株DP-L4056在hly启动子中的prfA 盒两侧含有八个核苷酸碱基改变。以下的图1中显示了单核细胞增生 利斯特氏菌DP-L4056和EGD菌株的hly启动子比对。
通过用KpnI和BamHI消化从pCR-XL-TOPO-hly启动子质粒克隆中 释放出对应于hly启动子和secA1 LLO信号肽的422bp DNA，并克隆 至pPL2质粒载体(Lauer等，2002 J.Bact.)中，根据本领域技术人 员公知的常规方法。该质粒称为pPL2-hlyP(天然的)。
C.SD序列
在启动子的3’端含有多嘌呤SD序列，30S核糖体亚基(通过16S rRNA)与异源基因RNA转录物衔接和启动翻译所需要的序列。SD序列 通常具有以下的共有序列：5’-NAGGAGGU-N5-10-AUG(起始密码子)-3’ (SEQ ID NO：85)。存在多嘌呤SD序列的变化。特别地，编码利斯特 氏菌溶素O(LLO)的利斯特氏菌hly基因具有以下SD序列： AAGGAGAGTGAAACCCATG(SEQ ID NO：70)(带下划线的是SD序列， 且粗体的是翻译起始密码子)。
实施例4.编码包括secA1信号肽(LLO)和人EphA2的融合蛋白 的多核苷酸
图2中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)融合的全长人 EphA2抗原的表达盒序列，加上LLO PEST序列。图3中显示了由该表 达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例5.人EphA2胞外结构域(EX2)的密码子最佳化
编码人EphA2胞外结构域(氨基酸25-526)的序列对于在单核细 胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。图4中显示了编 码人EphA2胞外结构域的天然核苷酸序列。图5中显示了用于在利斯 特氏菌中的最佳密码子选择的核苷酸序列。图6中显示了人EphA2胞 外结构域的氨基酸序列。
实施例6.编码包括secA1信号肽(LLO)和huEphA2胞外结构域 (EX2)的融合蛋白的多核苷酸
A.没有密码子最佳化的多核苷酸
图7中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)融合的人EphA2 抗原的胞外结构域的多核苷酸序列，加上LLO PEST序列。图8中显示 了由该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
B.具有密码子最佳化的人EphA2胞外结构域的表达盒
图9中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)融合的人EphA2 抗原胞外结构域的表达盒序列，加上LLO PEST序列，其中编码EphA2 胞外结构域的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子 最佳化的。图10中显示了由该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
C.具有密码子最佳化的secA1信号肽和密码子最佳化的人EphA2 胞外结构域的表达盒
图11中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)的人EphA2抗 原胞外结构域的表达盒序列，加上LLO PEST序列，其中编码EphA2 胞外结构域和信号肽的序列以及PEST序列对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达都是密码子最佳化的。图12中显示了由该表达盒编码 的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例7.编码包括Tat信号肽(枯草芽孢杆菌phoD)和huEphA2 胞外结构域(EX2)的融合蛋白的密码子最佳化表达盒
图13中显示了编码与Tat信号肽(枯草芽孢杆菌phoD)融合的 EphA2抗原胞外结构域的表达盒序列，其中编码EphA2胞外结构域和 信号肽的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达都是密码子最 佳化的。图14中显示了由该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例8.人EphA2胞内结构域(CO)的密码子最佳化
编码人EphA2胞内结构域(氨基酸558-975)的序列对于在单核 细胞增生利斯特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。图15中显示了 编码人EphA2胞外结构域的天然核苷酸序列。图16中显示了用于在利 斯特氏菌中的最佳密码子选择的核苷酸序列。图17中显示了人EphA2 胞外结构域的氨基酸序列。
实施例9.编码包括secA1信号肽(LLO)和huEphA2胞内结构域 (CO)的融合蛋白的多核苷酸
A.没有密码子最佳化的多核苷酸
图18中显示了编码与secA1信号肽(LLO)融合的人EphA2抗原 胞内结构域的多核苷酸序列，加上LLO PEST序列。图19中显示了由 该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
B.具有密码子最佳化的人EphA2胞内结构域的表达盒
图20中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)融合的huEphA2 抗原胞内结构域的表达盒序列，加上LLO PEST序列，其中编码EphA2 胞内结构域的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子 最佳化的。图21中显示了由该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
C.具有密码子最佳化secA1信号肽和密码子最佳化人EphA2胞内 结构域的表达盒
图22中显示了编码与secA1信号肽(LLO信号肽)融合的EphA2 抗原胞内结构域的表达盒序列，加上LLO PEST序列，其中编码EphA2 胞内结构域和信号肽的序列以及PEST序列对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达都是密码子最佳化的。图23中显示了由该表达盒编码 的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例10.编码包括枯草芽孢杆菌phoD信号肽和huEphA2胞内结 构域(CO)的融合蛋白的密码子最佳化表达盒
图24中显示了编码与Tat信号肽(枯草芽孢杆菌phoD)融合的 EphA2抗原胞内结构域的表达盒序列，其中编码EphA2胞内结构域和 信号肽的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达都是密码子最 佳化的。图25中显示了由该表达盒编码的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例11.编码包括LLO信号肽和NY-ESO-1的融合蛋白的密码子 最佳化表达盒
设计表达盒来用于在单核细胞增生利斯特氏菌中表达人睾丸癌抗 原NY-ESO-1(GenBank登录号No.NM_001327)。图26中显示了编码 与secA1信号肽(LLO)融合的NY-ESO-1的表达盒序列，加上LLO PEST 序列。表达盒中编码抗原以及信号肽的序列对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达是密码子最佳化的。图27中显示了由该表达盒编码的 融合蛋白的氨基酸序列。
实施例12.编码与非利斯特氏菌secA1信号肽(乳酸乳球菌usp45) 融合的抗原的密码子最佳化表达盒
使用非利斯特氏菌secA1信号肽来设计表达盒以用于在单核细胞 增生利斯特氏菌中表达异源抗原。以下显示了来自乳酸乳球菌的 usp45信号肽的氨基酸序列(Steidler等，Nature Biotechnology， 21：785-9(2003))，其天然编码序列，和对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达最佳化的编码序列。
氨基酸序列：
MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGVYA′DT(SEQ ID NO：46)
信号肽酶识别位点：VYA-DT(SEQ ID NO：55)
天然核苷酸序列：
5′ATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCTACAGTGATACTTTCTGC TGCAGCCCCGTTGTCAGGTGTTTACGCTGACACA 3′(SEQ ID NO：86)
对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达最佳化的密码子：
5′ATGAAAAAAAAAATTATTAGTGCAATTTTAATGAGTACAGTTATTTTAAGTGC AGCAGCACCATTAAGTGGTGTTTATGCAGATACA 3′(SEQ ID NO：87)
图28中显示了包括可操作地连接密码子最佳化Usp45信号肽编码 序列的单核细胞增生利斯特氏菌hly启动子的部分表达盒的序列。该 序列可以和密码子最佳化或非密码子最佳化的抗原序列结合来表达包 括Usp45信号肽和所需抗原的融合蛋白。
实施例13.编码与secA2信号肽(p60)融合的抗原的密码子最佳 化表达盒和载体
A.密码子最佳化表达盒的设计
使用secA2分泌途径来设计表达盒以在单核细胞增生利斯特氏菌 中表达异源抗原。以下显示了单核细胞增生利斯特氏菌的p60信号肽 的氨基酸序列，其天然编码序列，和对于在单核细胞增生利斯特氏菌 中的表达最佳化的编码序列。
氨基酸序列：
MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASA′ST(SEQ ID NO：48)
信号肽酶识别位点：ASA-ST(SEQ ID NO：57)
天然核苷酸序列：
5′ATGAATATGAAAAAAGCAACTATCGCGGCTACAGCTGGGATTGCGGTAACAGC ATTTGCTGCGCCAACAATCGCATCCGCAAGCACT3′(SEQ ID NO：90)
对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达最佳化的密码子：
5′ATGAATATGAAAAAAGCAACAATTGCAGCAACAGCAGGTATTGCAGTTACAGC ATTTGCAGCACCAACAATTGCAAGTGCAAGTACA3′(SEQ ID NO：91)
图29中显示了包括可操作地连接p60信号肽天然编码序列的单核 细胞增生利斯特氏菌hly启动子的部分表达盒的序列。图30中显示了 包括可操作地连接p60信号肽密码子最佳化编码序列的单核细胞增生 利斯特氏菌hly启动子的部分表达盒的序列。
B.pPL2-hlypro-p60的构建
还可以构建表达盒，其中将抗原编码序列框内插入p60基因编码 序列内的一个或多个位点中。以下描述了用于在p60序列内框内插入 抗原序列的部分表达盒构建的描述。该部分表达盒含有hly启动子。
使用Pfx或Vent聚合酶进行单独的第一个PCR反应，使用以下的 引物和pPL2-hlyP-OVA(与以上实施例2A中所述的pPL2/LLO-OVA相 同)作为第一个模板：
pPL2-5F：5′-GACGTCAATACGACTCACTATAG(SEQ ID NO：92)
p60-hlyP-237R：5′-CTTTTTTCATATTCATGGGTTTCACTCTCCTTCTAC (SHQ ID NO：93)
所得到扩增子的大小为285bp。
还使用Pfx或Vent聚合酶进行了单独的第一个PCR反应，使用以 下的引物和pCR-TOPO-p60作为第二个模板。(载体pCR-TOPO-p60从 得自Invitrogen，Carlsbad，California的pCR-TOPO载体制得，其 中已经插入单核细胞增生利斯特氏菌的基因组p60序列。任何其他许 多可获得的可选择的来源的p60编码序列可以用作替代模板)。该PCR 反应中所用的引物如下：
hlyP-p60-1F：5′-AAGGAGAGTGAAACCCATGAATATGAAAAAAGCAAC(SEQ ID NO：88)
pCR-TOPO-2283R：5′-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTC(SEQ ID NO：89)
所得到扩增子的大小为1510bp。然后用S6柱(Bio-Rad Laboratories，Herculed，California)纯化PCR的反应物。
然后进行第二个PCR反应，使用约5μl每个第一个PCR的反应物 作为模板。第二个PCR反应使用以下引物：
Kpn1-LLO 1257F(之前所用的引物)：
5′CTCTGGTACCTCCTTTGATTAGTATATTC(SEQ ID NO：74)和
pCR-TOPO-2258R：5′-CCCTTGGGGATCCTTAATTATACG(SEQ ID NO：83)。所得到扩增子的大小为1715bp。通过琼脂糖凝胶电泳分析 来验证所有PCR反应中预期的扩增子大小。纯化第二个PCR的反应物， 用BamHI消化，再次纯化，并用KpnI消化。然后在pPL2和修饰的pAM401 (pAM401-MCS；图32)质粒中的BamHI和KpnI位点之间连接hlyP-p60 基因片段(KpnI-BamHI)(图30)。
然后用BamHI/KpnI(1697，6024bp)和HindIII(210，424，3460， 3634bp)消化来证实pPL2-p60质粒的构建。还证实了pPL2-p60中的 PstI位点是唯一的。(以及，KpnI/PstI消化将产生736和6985bp 的片段)。来自p60区域的pAM401-p60质粒(KpnI/PstI，和KpnI/ BamHI片段)的构建和pPL2构建体的构建相同。
然后使用本领域普通技术人员公知的方法制得每个质粒的大量制 备分离物。
然后可以使用本领域普通技术人员公知的技术将所需的抗原编码 序列插入p60序列内并位于和p60序列相同的翻译框中。通常，插入 应使得p60 N-末端的信号肽序列完整。还应使得p60 C-末端的自溶素 序列完整。
实施例14.用于在单核细胞增生利斯特氏菌中表达的人间皮素编 码序列的密码子最佳化
图33中显示了编码人间皮素的密码子最佳化的多核苷酸序列，间 皮素是一种癌症抗原。图33中所示的序列对于在单核细胞增生利斯特 氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。图34中显示了由图33中序列 编码的多肽序列。
实施例15.用于在单核细胞增生利斯特氏菌中表达的鼠间皮素编 码序列的密码子最佳化
图35中显示了编码鼠间皮素的密码子最佳化的多核苷酸序列，鼠 间皮素是一种癌症抗原。图35中所示的序列对于在单核细胞增生利斯 特氏菌中的表达已经是密码子最佳化的。图36中显示了由图35中序 列编码的多肽序列。
实施例16.表达盒通过等位基因交换整合至利斯特氏菌染色体中
作为使用整合载体如pPL2将异源基因表达盒插入利斯特氏菌的 染色体中的一种可能的备选方案，可以使用等位基因交换。
简而言之，通过涂布于含有氯霉素(10μg/ml)的BHI琼脂培养 基上来选择用pKSV7-异源蛋白表达盒质粒电穿孔的细菌，并在30℃的 许可温度下孵育。通过在含有氯霉素的培养基中在41℃的非许可温度 下将几个单个菌落传代多次来选择至细菌染色体的单交换整合。最终， 通过在不含有氯霉素的BHI培养基中在30℃的许可温度下将几个单个 菌落传代多次来获得质粒切除和消除(双交换)。通过PCR来验证异 源蛋白表达盒整合至细菌染色体中，使用扩增从异源蛋白表达盒内至 不包含于pKSV7质粒载体构建体中的细菌染色体靶向序列所限定的区 域的引物对。
实施例17.EphA2至pPL2载体中的克隆和插入用于在选定的重组 单核细胞增生利斯特氏菌菌株中的表达
分开克隆EphA2跨膜螺旋两侧的EphA2外部(EX2)和细胞质(CO) 结构域，用于插入各种pPL2-信号肽表达构建体中。使用对应于天然 哺乳动物序列或对于EphA2 EX2和CO结构域在单核细胞增生利斯特氏 菌中的表达密码子最佳化的基因。对于密码子最佳化的EphA2 EX2和 EphA2 CO，使用利斯特氏菌中对20个氨基酸中每个的最佳密码子(参 见，以上的表3)。使用本领域技术人员常用的技术，通过延伸重叠 的寡核苷酸来合成密码子最佳化的Eph2A EX2和CO结构域。通过核苷 酸测序来验证所有合成的EphA2构建体的预期序列。
EphA2的EX2和CO结构域的初级氨基酸序列，以及天然和密码子 最佳化的核苷酸序列显示于图4-6(EX2序列)和图15-17中(CO结 构域序列)。
此外，分别在合成的EphA2 EX2和CO基因的氨基和羧基末端框内 插入FLAG(Stratagene，La Jolla，CA)和myc抗原决定部位标记物， 用于通过蛋白质印迹分析来检测表达和分泌的EphA2，使用FLAG或蛋 白质特异性的抗体。因此，表达的蛋白具有以下有序元件：NH2-信号 肽-FLAG-EphA2-myc-CO2。以下所示的是FLAG和myc抗原决定部位标 记物氨基酸和密码子最佳化的核苷酸序列：
FLAG：
5′-GATTATAAAGATGATGATGATAAA(SEQ ID NO：96)
NH2-DYKDDDDK-CO2(SEQ ID NO：97)
Myc：
5′-GAACAAAAATTAATTAGTGAAGAAGATTTA(SEQ ID NO：98)
NH2-EQKLISEEDL-CO2(SEQ ID NO：99)
实施例18.通过蛋白质印迹分析来检测合成和分泌的异源蛋白质
通过三氯乙酸(TCA)沉淀的细菌培养液的蛋白质印迹分析来测定 EphA2蛋白的合成和从各种选定的重组利斯特氏菌-EphA2菌株的分 泌。简而言之，将生长于BHI培养基中的对数中期的利斯特氏菌培养 物收集于50mL锥形离心管中，将细菌沉淀，并将冰冷TCA加入细菌培 养物上清液中至[6％]终浓度并在冰上孵育最少90分钟或过夜。通过在 4℃以2400×g离心20分钟来收集TCA沉淀的蛋白质。然后将沉淀物 重悬浮于300-600μl体积的TE(pH8.0，含有15μg/ml酚红)中。 通过涡旋来促进样品溶解。如果需要，通过添加NH4OH来调节样品pH， 直至颜色为粉红色。通过加入100μl4×SDS加样缓冲液并在90℃孵 育10分钟来制得所有样品用于电泳。然后将样品在微型离心机中以 14,000rpm离心5分钟，并收集上清液，存储于-20℃。对于蛋白质印 迹分析，将20μl制得的级分(1-4×109细菌培养液的等价物)加载 于4-12％SDS-PAGE凝胶上，电泳，并将蛋白质转移至PDDF膜上，根 据本领域技术人员常用的方法。通过在PBS中的5％奶粉中室温搅拌孵 育2小时，制得转移的膜用于与抗体一起孵育。在以下PBST缓冲液(PBS 中0.1％吐温20)中的稀释度下使用抗体：(1)1∶10,000的兔抗-myc 多克隆抗体(ICL实验室，Newberg，Oregon)；(2)1∶2,000的鼠抗 FLAG单克隆抗体(Stratagene，La Jolla，CA)；和(3)兔抗EphA2 (羧基末端特异性的)多克隆抗体(sc-924，Santa Cruz Biotechnology，Inc.Santa Cruz，CA)。通过与缀合了辣根过氧化 物酶的山羊抗兔或抗鼠抗体一起的第二次孵育并用ECL化学发光测定 试剂盒(Amersham)检测，并曝光于胶片来评价抗体与蛋白质靶的特 异性结合。
实施例19.编码各种形式EphA2的重组利斯特氏菌对EphA2蛋白 的分泌
A.利斯特氏菌：[菌株DP-L4029(actA)或DP-L4017(LLOL461T)]
表达盒构建体：LLOss-PEST-CO-EphA2
将EphA2 CO结构域的天然序列与天然secA1 LLO序列遗传上融合， 并如上所述在KpnI和SacI位点之间将利斯特氏菌hly启动子控制下 的异源抗原表达盒插入pPL2质粒中。如上所述通过接合至利斯特氏菌 菌株DP-L4029(actA-)和DP-L4017(L461T LLO)中来引入pPL2-EphA2 质粒构建体。图37显示了4029-EphA2 CO和4017-EphA2 CO的TCA 沉淀的细菌培养液的蛋白质印迹分析的结果。该分析证明了经工程化 以含有由对应于secA1和EphA2 CO融合蛋白天然序列组成的异源蛋白 表达盒的重组利斯特氏菌分泌了多个小于52kDa预期分子量的EphA2- 特异性片段，证明了对修饰表达盒的需要。
B.利斯特氏菌：[DP-L4029(actA-)]
表达盒构建体：
1.天然LLOss-PEST-FLAG-EX2_EphA2-myc-CodonOp
2.(CodonOp)LLOss-PEST(CodonOp)FLAG-EX2_EphA2-myc
将天然secA1 LLO信号肽序列或对于在利斯特氏菌中的表达为密 码子最佳化的secA1 LLO信号肽序列与对于在利斯特氏菌中的表达为 密码子最佳化的EphA2 EX2结构域序列遗传上融合，并如上所述在 KpnI和SacI位点之间将利斯特氏菌hly启动子控制下的异源抗原表 达盒插入pPL2质粒中。如上所述通过接合至利斯特氏菌菌株DP-L4029 (actA)中来引入pPL2-EphA2质粒构建体。图38显示了利斯特氏菌 actA的TCA沉淀的细菌培养液的蛋白质印迹分析结果，该利斯特氏菌 actA编码与密码子最佳化的EphA2 EX2结构域融合的天然或密码子最 佳化的secA1 LLO信号肽。该分析证明了结合使用对于单核细胞增生 利斯特氏菌中优选密码子选择最佳化的信号肽和异源蛋白导致期望的 全长EphA2 EX2结构域蛋白质的表达。单独使用EphA2编码序列的密 码子最佳化，全长EphA2 EX2结构域蛋白质的表达是差的。当使用对 于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的单核细胞增 生利斯特氏菌LLO secA1信号肽时，异源蛋白的表达水平(片段或全 长)是最高的。
C.利斯特氏菌：[DP-L4029(actA)]
表达盒构建体：
3.天然LLOss-PEST-(CodonOp)FLAG-EphA2_CO-myc
4.CodonOp LLOss-PEST-(CodonOp)FLAG-EphA2_CO-myc
5.CodonOp PhoD-(CodonOp)FLAG-EphA2_CO-myc
将天然secA1 LLO信号肽序列或对于在利斯特氏菌中的表达密码 子最佳化的secA1 LLO信号肽序列，或者，对于在利斯特氏菌中的表 达密码子最佳化的枯草芽孢杆菌phoD基因的Tat信号肽，与对于在利 斯特氏菌中的表达密码子最佳化的EphA2 CO结构域序列遗传上融合， 并如上所述在KpnI和SacI位点之间将利斯特氏菌hly启动子控制下 的异源抗原表达盒插入pAM401-MCS质粒中。如上所述通过电穿孔将 pAM401-EphA2质粒构建体引入利斯特氏菌菌株DP-L4029(actA)中。 图39显示了利斯特氏菌actA的TCA-沉淀的细菌培养液的蛋白质印迹 分析结果，该利斯特氏菌actA编码与密码子最佳化EphA2 CO结构域 融合的天然或密码子最佳化secA1 LLO信号肽，或密码子最佳化的枯 草芽孢杆菌phoDTat信号肽。该分析再次证明了结合使用对于单核细 胞增生利斯特氏菌中优选密码子选择最佳化的信号肽和异源蛋白导致 期望的全长EphA2 CO结构域蛋白的表达。此外，期望的全长EphA2 CO 结构域蛋白的表达和分泌来自编码与密码子最佳化EphA2 CO结构域融 合的密码子最佳化枯草芽孢杆菌phoD Tat信号肽的重组利斯特氏菌。 该结果证明了新的和预料不到的发现：可以使用来自不同细菌种的信 号肽来执行异源蛋白从重组利斯特氏菌的分泌。只用Eph2A序列的密 码子最佳化，全长EphA2 CO结构域蛋白的表达是差的。当使用对于在 单核细胞增生利斯特氏菌中的表达密码子最佳化的信号肽时，异源蛋 白表达的水平是最高的。
D.用编码全长Eph2A表达盒构建体的pCDNA 4质粒转染293细胞
6.pCDNA4-Eph2A
将天然全长Eph2A基因克隆至基于真核生物CMV启动子的表 达质粒pCDNA4(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。图40显示了从用 pCDNA4-Eph2A质粒转染的293细胞制得的裂解物的蛋白质印迹分析结 果，并证明了全长Eph2A蛋白在哺乳动物细胞中的大量表达。
实施例20.用编码密码子最佳化Eph2A的重组利斯特氏菌免疫带 有编码人Eph2A的CT26肿瘤的Balb/C小鼠的治疗功效
图41-44中呈现的以下数据证明了下列：
用编码OVA.AH1(MMTV gp70免疫显性抗原决定部位)或 OVA.AH1-A5(MMTV gp70免疫显性抗原决定部位，对于提高的T-细胞 受体结合具有不规则的变化)的重组利斯特氏菌来免疫带有CT26.24 (huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小鼠赋予了长期存活(图41)。
EphA2 CO结构域具有强烈的免疫原性，当用编码密码子最佳化或 天然EphA2 CO结构域序列的重组利斯特氏菌免疫时，观察到带有 CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小鼠存活的显著长期提高(图 43)。
EphA2 EX2结构域的免疫原性差，仅当用编码与密码子最佳化 EphA2 EX2结构域序列融合的密码子最佳化secA1信号肽的重组利斯 特氏菌免疫时，观察到带有CT26.24(huEphA2+)肺肿瘤的Balb/C小 鼠的存活提高。当用编码与密码子最佳化EphA2 EX2结构域序列融合 的天然secA1信号肽的重组利斯特氏菌免疫时，在小鼠中没有观察到 治疗功效(图42)。使用密码子最佳化secA1信号肽和EphA2 EX2结 构域序列的合意性得到了统计学显著抗肿瘤治疗功效的支持，如下表 4中所示。
表4.通过图42中所示的存活曲线的对数级测试的比较
实验组 半数存活 (天数) 相对于HBSS群 组的显著性(p 值) 相对于actA-天然 secA1/EphA2 EX2群组的显 著性(p值) HBSS 19 - - actA 20 NS NS actA-天然secA1-EphA2 EX2(天然) 19 NS - actA-天然secA1-EphA2 EX2(CodOp) 24 0.0035 NS actA-CodOp secA1-EphA2 EX2(CodOp) 37 0.0035 0.0162 actA-天然secA1-EphA2 CO(CodOp) ＞99 0.0035 0.0015
显著地，即使pCDNA4-EphA2质粒转染的293细胞产生了非常高水 平的蛋白表达，用pCDNA4-EphA2质粒免疫带有CT26.24(huEphA2+) 肺肿瘤的Balb/C小鼠也没有导致任何治疗性抗肿瘤功效的观察(图 44)。
对于体内肿瘤治疗性研究，给雌性Balb/C小鼠IV植入5×105个 稳定表达EphA2的CT26细胞。三天后，将小鼠随机分组并IV接种各 种编码EphA2的重组利斯特氏菌菌株。一些情况中(图中未标注)， 在胫腓骨前的肌肉内给小鼠接种100μg pCDNA4质粒或pCDNA4-EphA2 质粒。作为阳性对照，给小鼠IV接种编码OVA.AHI或OVA.AH1-A5蛋 白质嵌合体的重组利斯特氏菌菌株。在植入肿瘤细胞后的第3天和第 14天给小鼠接种。将注射了Hnaks平衡盐溶液(HBSS)缓冲液的或未 改变的利斯特氏菌的小鼠作为阴性对照。所有实验群组包含5只小鼠。 对于存活研究，当它们开始显示出紧张或呼吸困难的任何征兆时，将 小鼠处死。
实施例21.疫苗接种后抗原特异性免疫应答的测定
使用多种体外和体内方法来测试本发明的疫苗。一些测定法包括 已接种疫苗的小鼠脾脏的抗原特异性T细胞的分析。该实施例中提供 了测试体外和体内免疫应答方法的非限制性实施例。这些测试具体描 述中所述抗原是模式抗原，不一定是使用在此所述的重组核酸分子， 表达盒和/或表达载体所产生的抗原。本领域技普通技术人员将容易地 认识到该实施例中所述的测试可以容易地应用于测试包括在此所述的 重组核酸分子，表达盒和/或表达载体的细菌的体外或体内免疫应答。
例如，通过静脉内注射0.1 LD50的表达OVA(或其他合适的抗原) 的利斯特氏菌菌株来接种C57B1/6或Balb/c小鼠。接种后七天，通过 将脾放入冰冷的RPMI 1640培养基中并由此制备单细胞悬浮液来收集 小鼠的脾细胞(通常3只小鼠一组)。作为备选的方案，可以相似地 收集小鼠的淋巴结，制成单细胞悬浮液并替代以下所述测试中的脾细 胞。通常，对于疫苗的静脉内或腹膜内给药，测试脾细胞，而对于疫 苗的肌内，皮下或皮内给药，测试脾细胞和淋巴结的细胞。
除非另外指出，这些实施例中所用的所有抗体可以从 Pharmingen，San Diego，CA获得。
ELISPOT测定法：使用具有OVA抗原的利斯特氏菌菌株作为实例， 使用ELISPOT测定法来测试小鼠模型中免疫时产生的抗原特异性T细 胞的定量频率。所评价的抗原特异性T细胞是OVA特异性CD8+或LLO 特异性CD8+或CD4+T细胞。该OVA抗原模型测试了对插入疫苗中的异 源肿瘤抗原的免疫应答并可以用任何目标抗原替代。LLO抗原对利斯 特氏菌是特异性的。通过识别特异性抗原时检测细胞因子(例如，IFN- γ)释放来测试特异性T细胞。用抗鼠IFN-γ单克隆抗体(mAb R4； 5μg/ml)4℃涂敷基于PVDF的96孔平板(BD Biosciences，San Jose， CA)过夜。将平板洗涤并在室温用200μL完全RPMI封闭2小时。以 2×105细胞每孔加入接种的小鼠(或非接种的对照小鼠)的脾细胞， 并在0.01至10μM的各种浓度的肽存在下在37℃孵育20至22小时。 用于OVA和LLO的肽是SL8，OVA的MHCI类抗原决定部位，LLO190(NEKYAQAYPNVS(SEQ ID NO：100)Invitrogen)，利斯特氏菌溶素O (利斯特氏菌抗原)的MHC II类抗原决定部位，LLO296(VAYGRQVYL (SEQ ID NO：101)，利斯特氏菌溶素O的MHC I类抗原决定部位， 或LLO91(GYKDGNEYI(SEQ ID NO：102))，利斯特氏菌溶素O的MHC I类抗原决定部位。LLO190和LLO296用于C57B1/6模型中，而LLO91用于 Balb/c模型中。洗涤后，用稀释于PBS中至0.5μg/ml的IFN-γ (XMG1.2)特异性的二次生物素化的抗体孵育平板。在室温孵育2小 时后，洗涤平板并用稀释于含有1％BSA的PBS中的1nm金山羊抗生物 素缀合物(GAB-1；1∶200稀释度；Ted Pella，Redding，CA)在37 ℃孵育1小时。彻底洗涤后，将平板用产生斑点的底物(银强化试剂 盒；30ml/孔；Ted Pella)在室温孵育2至10分钟。然后用蒸馏水漂 洗平板来停止底物反应。将平板空气干燥后，使用自动化的ELOSPOT 平板阅读器(CTL，Cleveland，OH)将每个孔中的斑点计数。对于OVA 特异性的T细胞或利斯特氏菌特异性的T细胞，将细胞因子响应以每 2×105个脾细胞中IFN-γ斑点形成细胞(SFC)的数量表示。
胞内细胞因子梁色测试(ICS)：为了进一步测试抗原特异性CD8+ 或CD4+T细胞的数量并使结果与ELISPOT测试中获得的结果彼此关 联，进行ICS并通过流式细胞计数分析来评价细胞。用SL8(刺激OVA 特异性CD8+细胞)或LLO190(刺激LLO特异性CD4+细胞)在布雷菲 德菌素A(Pharmingen)存在下将接种组和对照组小鼠的脾细胞孵育5 小时。布雷菲德菌素A抑制T细胞刺激时所产生的细胞因子的分泌。 用无关MHC I类肽孵育的脾细胞用作对照。对于IFN-γ和TNF-α胞内 细胞因子染色，PMA(佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-醋酸酯，Sigma) 20ng/ml和离子霉素(Sigma)2μg/ml刺激的脾细胞用作阳性对照。 为了检测细胞质细胞因子表达，用FITC-抗-CD4 mAb(RM4-5)和PerCP- 抗-CD8mAb(53-6.7)将细胞染色，用Cytofix/CytoPerm溶液 (Pharmingen)固定并渗透化，并用PE缀合的抗-TNF-αmAb (MP6-XT22)和APC-缀合的抗-IFN-γmAb(XMG1.2)在冰上染色30 分钟。通过流式细胞仪(FACScalibur，Becton Dickinson，Mountain View，CA)测定表达胞内IFN-γ和/或TNF-α细胞的百分比和使用 CELLQuest软件(Becton Dickinson，Immunocymetry System)来分 析数据。因为各种抗体上的荧光标记可以全部通过FACScalibur来区 别，通过控制用抗I FN-γ或抗TNF-α中的任一种或两种染色的那些 CD8+和CD4+来鉴定合适的细胞。
受激脾细胞的细胞因子表达：也可以测试对照和接种的C57B1/6 小鼠的小鼠脾细胞分泌细胞因子的水平。用SL8或LLO190刺激脾细胞 24小时。用无关的肽HSV-gB2(Invitrogen，SSIEFARL，SEQ ID NO：4) 刺激用作对照。收集受激细胞的上清液并使用ELISA测定法 (eBiosciences，CO)或Cytometric Bead Array Kit(Pharmingen) 来测定T辅助-1和T-辅助2细胞因子的水平。
细胞毒性T细胞活性的测试：通过体外或直接在C57B1/6小鼠体 内测试它们的细胞毒性活性来进一步评价OVA特异性CD8+T细胞。 CD8+T细胞以抗原特异性方式识别并裂解它们各自的靶细胞。使用铬 释放测定法来测定体外细胞毒性。为了在脾细胞群内扩充OVA特异性 T细胞，以10∶1的比例用照射的EG7.OVA细胞(转染来表达OVA的EL-4 肿瘤细胞系，ATCC，Mannassas，VA)或用100nM SL8来刺激原初和利 斯特氏菌OVA(内部的)接种的小鼠的脾细胞。培养7天后，在标准 4-小时51Cr-释放测试中测定效应细胞的细胞毒性活性，使用EG7.OVA 或SL8脉冲的EL-4细胞(ATCC，Mannassas，VA)作为靶细胞和EL-4 细胞单独作为阴性对照。为了将由于T细胞引起的活性与由于NK细胞 引起的活性区别开来，将YAC-1细胞系(ATCC，Mannassas，VA)用作 测定NK细胞活性的靶。按照100×(实验释放-自发释放)/(最大 释放-自发释放)来计算特异性细胞毒性的百分比。通过靶细胞而无 效应细胞的孵育来测定自发释放。通过用0.1％曲通X-100裂解细胞来 测定最大释放。如果自发释放＜20％的最大释放，则认为实验对于分析 是有效的。
对于体内OVA特异性CD8+T细胞的细胞毒性活性的测试，将原初 C57B1/6小鼠的脾细胞分成两个相等的等分。每组用0.5μg/ml的特 异性肽，靶(SL8)或对照(HSV-gB2)，在37℃脉冲90分钟。然后 将细胞在培养基中洗涤3次，在PBS+0.1％BSA中洗涤两次。将细胞以 1×107每ml再悬浮于温热PBS+0.1％BSA(10ml或更少)中，以便用二 醋酸羧基荧光素琥珀酰酯(CFSE，Molecular Probes，Eugene，OR) 标记。向靶细胞悬浮液中，加入1.25μL的5mM CFSE储液并通过涡旋 来混合样品。将稀释十倍的CFSE储液加入对照细胞悬浮液中，并通过 涡旋来混合样品。将细胞在37℃孵育10分钟。通过加入大量(＞40ml) 冰冷PBS来停止染色。将细胞在室温用PBS洗涤两次，然后重悬浮并 计数。将每种细胞悬浮液稀释至50×106每ml，并将每群的100μL混 合并通过原初或接种小鼠的尾静脉注射。12-24小时后，收集脾脏并 用流式细胞仪来分析总的5×106细胞。计数高(靶)和低(对照)荧 光峰，并将这两个峰的比例用于确立靶细胞裂解的百分比。体内细胞 毒性测试使得可以测量抗原特异性T细胞的裂解活性而不需要体外再 刺激。此外，该测试测定了天然环境中的T细胞功能。
实施例22.通过用表达EphA2的利斯特氏菌接种Balb/c小鼠诱导 的人EphA2特异性免疫性
相隔两周用表达hEphA2胞内结构域(图45中的利斯特氏菌 hEphA2-ICD)的利斯特氏菌L461T或表达来自对于在单核细胞增生利 斯特氏菌中的表达密码子最佳化序列的hEphA2胞外结构域(图45中 的利斯特氏菌hEphA2-ECD)的利斯特氏菌的ΔactA(actA-)菌株来 免疫Balb/c小鼠(n＝3)。(hEphA2的胞内结构域在此备选地称为 hEphA2-ICD，hEphA2 ICD，EphA2 CO或CO。hEphA2的胞外结构域在 此备选地称为hEphA2-ECD，hEphA2 ECD，EphA2 EX2或EX2)。在最 后一次免疫后6天使小鼠安乐死，收集脾脏并集中。对于ELISPOT测 试，用表达全长hEphA2的P815细胞或从这些细胞制得的细胞裂解物 体外再刺激该细胞。亲本P815细胞或细胞裂解物作为阴性对照。还用 重组hEphA2 Fc融合蛋白刺激了细胞。使用96孔斑点阅读器来测量 IFN-γ阳性斑点形成菌落(SFC)。如图45所示，用源自接种了利斯 特氏菌-hEphA2的小鼠的脾细胞观察到增加的IFN-γSFC。表达 hEphA2的细胞或细胞裂解物刺激导致了IFN-γSFC的增加，这表明 了EphA2特异性CD8+以及CD4+T细胞响应。接种了亲本利斯特氏菌对 照的小鼠脾细胞没有显示出IFN-γ SFC的增加。
实施例23.EphA2特异性抗肿瘤功效需要CD4+和CD8+T细胞响应
在第0天给Balb/c小鼠(n＝10)i.v.接种2×105个CT26-hEphA2。
在第1天和第3天通过注射200μg抗-CD4(ATCC杂交瘤GK1.5)或 抗-CD8(ATCC杂交瘤2.4-3)来耗尽CD4+细胞和CD8+T细胞，通过FACS 分析来证实(数据未显示)。然后在第4天用0.1 LD50表达hEphA2 ICD 的利斯特氏菌L461T i.v.免疫小鼠并监控存活。
如图46中所示的，CD4+和CD8+耗尽的组都未能表明在非T细胞 耗尽的动物中所看到的抗肿瘤响应。数据总结于以下的表5中：
表5
接种组 半数存活 (天数) 相对于 HBSS的P #存活者 (第67天) HBSS 17 - 0 利斯特氏菌-hEphA2-ICD ＞67 ＜0.0001 7 利斯特氏菌-hEphA2-ICD+抗CD4 19 0.03 2 利斯特氏菌-hEphA2-ICD+抗CD8 24 0.0002 0
前面的数据表明肿瘤缺失的最佳抑制中需要CD4+和CD8+T细胞。
实施例24.通过等位基因交换从利斯特氏菌中缺失in1B
一些实施方案中，包括在此所述的重组核酸分子和表达盒的细菌 是突变利斯特氏菌。例如，一些实施方案中，包括重组核酸分子和表 达盒的细菌是其中actA基因，in1B基因或两者已经缺失的单核细胞 增生利斯特氏菌菌株。以下描述了一种产生利斯特氏菌缺失突变体的 代表性方法。
可以通过等位基因交换来实现internalin B基因(in1B)从利斯 特氏菌DP-L4029(或从其他选定的突变株或从野生型利斯特氏菌)的 缺失，如Camilli等，Mol.Microbiol.8：143-147(1993)中所述的。 可以使用剪接重叠延伸(SOE)PCR来制备等位基因交换方法中所用的 构建体。Interialin B基因的来源是以GenBank登录号AL591975(单 核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD，完整基因组，节段3/12；in1B基因 区：nts.97008-98963)列出的序列，在此以其整体引入作为参考，和 /或以GenBank登录号NC_003210(单核细胞增生利斯特氏菌菌株EGD， 完整基因组，in1B基因区：nts.457008-458963)列出的序列，在此 以其整体引入作为参考。
在第一个PCR反应中，扩增利斯特氏菌in1B基因5’和3’端上 游和下游的约1000bp序列，使用以下的模板和引物：
模板：DP-L4056或DP-L4029基因组DNA
引物对1(用于in1B 5’端上游区域的扩增)：
Lm-96031F：5′-GTTAAGTTTCATGTGGACGGCAAAG(SEQ ID NO：103) (Tm：72℃)
Lm-(3′in1B-R+)97020R：
5′-AGGTCTTTTTCAGTTAACTATCCTCTCCTTGATTCTAGTTAT(SEQ ID NO：104)(Tm：114℃)
(带下划线的序列与In1B羧基末端的下游区域互补)。
扩增子大小(bp)：1007
引物对2(用于in1B 3’端下游区域的扩增)：
Lm-(5′in1B-F+)98911F：
5′-CAAGGAGAGGATAGTTAACTGAAAAAGACCTAAAAAAGAAGGC (SEQ ID NO：105)(Tm：118℃)
(带下划线的序列与in1B氨基末端的上游区域互补)。
Lm-99970R：5′-TCCCCTGTTCCTATAATTGTTAGCTC(SEQ ID NO：106) (Tm：74℃)
扩增子大小(bp)：1074
第二个PCR反应中，通过SOE PCR融合第一个PCR的扩增子，利 用第1对的反向引物和第2对的正向引物之间的互补性。这导致了 in1B编码序列的精确缺失：nts.97021-98910＝1889bp。在第二个PCR 反应中使用以下的模板和引物：
模板：纯化的第一个PCR的反应物
引物对：
Lm-96043F：5′-GTGGACGGCAAAGAAACAACCAAAG(SEQ ID NO：107) (Tm：74℃)
Lm-99964R：5′-GTTCCTATAATTGTTAGCTCATTTTTTTC(SEQ ID NO： 108)(Tm：74℃)
(扩增子大小(bp)：2033)
完成构建过程的实验方案如下：
使用Vent DNA聚合酶(NEB)和10μl洗涤过的30℃利斯特氏菌 DP-L4056或DP-L4029过夜培养物来进行第一个PCR反应(3个温度循 环)。通过1％琼脂糖凝胶来验证利斯特氏菌扩增子的预期大小(1007bp 和1074bp)。将第一个PCR的反应物凝胶纯化并用GeneClean(BIO101) 来洗脱DNA。
进行第二个PCR反应，使用约等量的每种第一个反应物作为模板 (大约5μl)。通过1％琼脂糖凝胶来验证第二次PCR反应的利斯特氏 菌扩增子的预期大小(2033bp)。用Taq聚合酶在利斯特氏菌d1 in1B 扩增子的3’端添加腺苷残基。
然后将利斯特氏菌d1 in1B扩增子插入pCR2.1-TOPO载体中。用 XhoI和KpnI消化pCR2.1-TOPO-d1 in1B质粒DNA并凝胶纯化2123bp 片段。将KpnI/XhoI2123bp片段插入已经通过用KpnI和XhoI消化并 用CIAP处理制得的pKSV7载体(pKSV7-d1 in1B)中。然后验证pKSV7-d1 in1B中d1 in1B序列的保真度。通过与pKSV7-d1 in1B质粒的等位基 因交换从所需的利斯特氏菌菌株缺失in1B基因。
实施例25.用于构建重组利斯特氏菌的密码子最佳化信号肽
以下表6中提供了一些代表性的可用于重组利斯特氏菌的表达盒 中的密码子最佳化的信号肽
表6.用于构建重组利斯特氏菌的代表性信号肽
分泌 途径 信号肽氨 基酸序列 信号肽 位点(‘) 天然序列 Lm表达中密码子 最佳化的序列 基因 [属/种] secA1 MKKIMLV FTTLILVSL PLAQQTA KDASAFN KENSISSM APPASPPA SPKTPIEK KHAD (SEQ ID NO：109)1 TEA’KD (SEQ ID NO：54) ATGAAAAAAATAATG CTAGTTTTTATTACAC TTATATTAGTTAGTCT ACCAATTGCGCAACA AACTGAAGCAAAGGA TGCATCTGCATTCAAT AAAGAAAATTCAATT TCATCCATGGCACCA CCAGCATCTCCGCCTG CAAGTCCTAAGACGC CAATCGAAAAGAAAC ACGCGGAT(SEQ ID NO：110) ATGAAAAAAATTATGTT AGTTTTTATTACATTAAT TTTAGTTAGTTTACCAAT TGCACAACAAACAGAAG CAAAAGATGCAAGTGCA TTTAATAAAGAAAATAG TATTAGTAGTATGGCACC ACCAGCAAGTCCACCAG CAAGTCCAAAAACACCA ATTGAAAAAAAACATGC AGAT(SEQ ID NO：113) hly(LLO) [单核细 胞增生利 斯特氏 菌] MKKKIISA ILMSTVILS AAAPLSG VYADT (SEQ ID NO：46) VYA’DT (SEQ ID NO：55) ATGAAAAAAAAGATT ATCTCAGCTATTTTAA TGTCTACAGTGATACT TTCTGCTGCAGCCCCG TTGTCAGGTGTTTACG CTGACACA(SEQ ID NO：86) ATGAAAAAAAAATTAT TAGTGCAATTTTAATGAG TACAGTTATTTTAAGTGC AGCAGCACCATTAAGTG GTGTTTATGCAGATACA (SEQ ID NO：87) Usp45 [乳酸乳 球菌] MKKRKVL IPLMALSTI LVSSTGNL EVIQAEV (SEQ ID NO：47) IQA’EV (SEQ ID NO：56) ATGAAAAAACGAAAA GTGTTAATACCATTAA TGGCATTGTCTACGAT ATTAGTTTCAAGCAC AGGTAATTTAGAGGT GATTCAGGCAGAAGT T(SEQ ID NO：111) ATGAAAAAACGTAAAGT TTTAATTCCATTAATGGC ATTAAGTACAATTTTAGT TAGTAGTACAGGTAATTT AGAAGTTATTCAAGCAG AAGTT(SEQ ID NO：114) pag(保护 性抗原) [炭疽芽 孢杆菌] secA2 MNMKKAT IAATAGIA VTAFAAPT IASAST (SEQ ID NO：48) ASA’ST (SEQ ID NO：57) ATGAATATGAAAAAA GCAACTATCGCGGCT ACAGCTGGGATTGCG GTAACAGCATTTGCT GCGCCAACAATCGCA TCCGCAAGCACT (SEQ ID NO：90) ATGAATATGAAAAAAGC AACAATTGCAGCAACAG CAGGTATTGCAGTTCAG CATTTGCAGcACCAACA ATTGCAAGTGCAAGTAC A(SEQ ID NO：91) iap入侵 相关蛋白 p60[单核 细胞增生 利斯特氏菌] Tat MAYDSRF DEWVQKL KEESFQNN TFDRRKFI QGAGKIA GLSLGLTI AQSVGAF (SEQ ID NO：53) VGA’F (SEQ ID NO：62) ATGGCATACGACAGT CGTTTTGATGAATGG GTACAGAAACTGAAA GAGGAAAGCTTCAA AACAATACGTTTGAC CGCCGCAAATTTATTC AAGGAGCGGGGAAGA TTGCAGGACTTTCTCT TGGATTAACGATTGC CCAGTCGGTTGGGGC CTTT(SE ID NO：112) ATGGCATATGATAGTCGT TTTGATGAATGGGTTCAA AAATTAAAAGAAGAAAG TTTTCAAATAATACATT TGATCGTCGTAAATTTAT TCAAGGTGCAGGTAAAA TTGCAGGTTTAAGTTTAG GTTTAACAATTGCACAAA GTGTTGGTGCATTT(SEQ ID NO：115) PhoD 碱 性磷酸酶 [枯草芽 孢杆菌]
1所示的序列包括来自LLO的PEST序列。
实施例26.包括炭疽芽孢杆菌保护性抗原(PA)信号肽的密码子 最佳化表达盒
使用非利斯特氏菌secA1信号肽来设计表达盒用于在单核细胞增 生利斯特氏菌中表达异源抗原。以下显示了炭疽芽孢杆菌(Ba)保护 性抗原(PA)信号肽的氨基酸序列(GenBank登录号NC_007322)，其 天然编码序列，和对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达最佳化的 编码序列。
氨基酸序列：
MKKRKVLIPLMALSTILVSSTGNLEVIQAEV(SEQ ID NO：47)
信号肽酶识别位点：IQA′EV(SEQ ID NO：56)
天然核苷酸序列：
ATGAAAAAACGAAAAGTGTTAATACCATTAATGGCATTGTCTACGATATTAGTTT CAAGCACAGGTAATTTAGAGGTGATTCAGGCAGAAGTT(SEQ ID NO：111)
对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达最佳化的密码子：
ATGAAAAAACGTAAAGTTTTAATTCCATTAATGGCATTAAGTACAATTTTAGTTA GTAGTACAGGTAATTTAGAAGTTATTCAAGCAGAAGTT(SEQ ID NO：114)
图47中显示了包括可操作地连接Ba PA信号肽密码子最佳化编码 序列的单核细胞增生利斯特氏菌hly启动子的部分表达盒序列。该序 列可以和密码子最佳化或非密码子最佳化抗原序列结合来用于表达包 括炭疽芽孢杆菌PA信号肽和所需抗原的融合蛋白。
实施例27.从包括密码子最佳化表达盒的重组利斯特氏菌表达和 分泌抗原
信号肽和肿瘤抗原的密码子最佳化提供了从重组利斯特氏菌的有 效表达和分泌：编码信号肽和异源蛋白的遗传元件的密码子最佳化提 供了含有疏水结构域的人肿瘤抗原从基于重组利斯特氏菌的疫苗中的 最佳分泌。抗原从胞质细菌的有效分泌是通过MHC I类途径和CD8+T 细胞引发的有效呈递所需要的，因此与基于利斯特氏菌的疫苗的效力 直接相关。两种恶性细胞膜结合的人肿瘤抗原，间皮素和NY-ESO-1， 从重组利斯特氏菌的分泌，已经通过结合抗原和信号肽编码序列的密 码子最佳化得到了最佳化，所述的两种抗原是与前列腺癌和卵巢癌(间 皮素)，以及黑素瘤(NY-ESO-1)，连同其它固体肿瘤一道相关的免 疫靶。
构建了多种表达盒，这些表达盒包括与天然或密码子最佳化信号 肽编码序列连接的hly启动子，信号肽与secA1或包括secA2和双-Arg 移位(Tat)的备选分泌途径相关，框内与选定的人肿瘤抗原-人 NY-ESO-1或人间皮素融合。(对于抗原序列和/或信号序列，参见以 上的实施例11-14和25)。TCA-沉淀的BHI肉汤中生长的利斯特氏菌 培养液的蛋白质印迹分析用于测定异源蛋白质从重组利斯特氏菌的合 成和分泌。(类似于以上实施例18中所述那些的方法用于蛋白质印迹 分析)。
这些实验的结果显示于图48A-C中。当信号肽编码序列，包括源 自单核细胞增生利斯特氏菌时，和可操作地连接的外源抗原的编码序 列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的密码子选择是最佳化的时，观 察到全长肿瘤抗原从重组利斯特氏菌的有效表达和分泌。图48A显示 了通过具有包括与人间皮素融合的LLO信号肽的构建体的ΔactA单核 细胞增生利斯特氏菌来表达/分泌人间皮素，对于LLO和间皮素，使用 天然密码子。通过TCA沉淀的细菌培养液的蛋白质印迹分析，使用这 些构建体没有观察到所期望的全长间皮素(61kDa)的分泌，只观察到 几个小片段的分泌(图48A)。
图48B显示了通过包括质粒(pAM401)的单核细胞增生利斯特氏 菌ΔactA表达/分泌人间皮素的蛋白质印迹分析，该质粒含有编码与 人间皮素融合的各种信号肽的构建体。每个构建体中，间皮素编码序 列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。其中 所示的，所用的信号肽编码序列含有天然序列(“天然”)或是对于 在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的(“CodOp”)。 使用亲和纯化的多克隆抗人/小鼠抗体来检测分泌的间皮素，通过给兔 子注射选定的肽和IFA来制备该抗体。
值得注意地，如图48B中泳道3-5和8-9中所示的，只有当信号 肽和间皮素编码序列对于在利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的 时，才观察到全长间皮素(62kDa)的分泌。该观察还显著地包括来自 细菌LLO和p60蛋白质的利斯特氏菌产生的信号肽，其分别与secA1 和secA2分泌途径相关，这两种信号肽都包含不常使用的密码子。(还 包括具有LLO信号肽的LLO PEST序列，其编码序列也是密码子最佳化 的)。当密码子最佳化的利斯特氏菌LLO信号肽与密码子最佳化的间 皮素连接时，观察到全长间皮素(62kDa)的有效分泌(图48B，泳道 8)，但是当使用利斯特氏菌LLO信号肽的天然编码序列时没有观察到 分泌(图48B，泳道7)。此外，当密码子最佳化的利斯特氏菌p60 信号肽与密码子最佳化的间皮素连接时，观察到全长间皮素的分泌 (62kDa)(图48B，泳道3)，但当使用利斯特氏菌p60信号肽的天 然编码序列时，没有观察到分泌(图48B，泳道6)。最终，当来自不 同于单核细胞增生利斯特氏菌的细菌种的密码子最佳化的信号肽可操 作地连接密码子最佳化的间皮素时，观察到全长间皮素的分泌(图 48B)。炭疽芽孢杆菌保护性抗原(Ba PA)的信号肽，或乳酸乳球菌 Usp45蛋白(L1 Usp45)的信号肽执行全长间皮素(62kDa)从重组利 斯特氏菌菌株的有效分泌(图4 8B，泳道4和5)。枯草芽孢杆菌phoD 信号肽(Bs phoD)也执行全长间皮素从利斯特氏菌的有效分泌(图 48B，泳道9)。具有约62,000分子量的条带对应于间皮素且双条带 对可能对应于非切割的加上切割的间皮素多肽(即，对应于部分切割)。
图48C显示了NY-ESO-1从单核细胞增生利斯特氏菌ΔactAΔin1B 的表达/分泌，所述菌株包括与人NY-ESO-1编码序列融合的LLO信号 肽编码序列的构建体，这两个序列对于在利斯特氏菌中的表达都是密 码子最佳化的。使用NY-ESO-1单克隆抗体来检测分泌的NY-ESO-1。
该实施例中，合成信号肽和肿瘤抗原结构域来使用每个氨基酸的 最优选密码子，如通过利斯特氏菌基因组的编码序列中每1000个密码 子的出现率限定的(http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/ showcodon.cgi？species＝Listeria+monocytogenes+[gbbct])。来自 利斯特氏菌和其他革兰氏阳性细菌属的与secA1，secA2或双-Arg移 位(Tat)分泌途径相关的信号肽执行人肿瘤抗原从重组利斯特氏菌的 有效分泌。令人惊讶地，来自利斯特氏菌蛋白LLO和p60的信号肽各 自含有密码子(出现率每1000个密码子＜10个)，且间皮素和NY-ESO-1 从重组利斯特氏菌的有效分泌需要这些序列的最佳化(图48B)。当 连接炭疽芽孢杆菌保护性抗原(pagA)和乳酸乳球菌Usp45的secA1 信号肽，以及枯草芽孢杆菌的磷酸二酯酶/碱性磷酸酶D基因(PhoD) 的Tat信号肽时，也观察到间皮素分泌。
将来自不同分泌途径的信号肽用于测定特定途径是否有利于异源 蛋白的最佳分泌。例如，Tat途径用于分泌细菌内折叠的蛋白，且枯 草芽孢杆菌phoD蛋白通过这种机理分泌。原来已经假定通过转运之前 的折叠可能有助于含有显著疏水结构域的肿瘤抗原，如NY-ESO-1的分 泌。然而，这些结果表明哺乳动物蛋白的有效分泌主要需要信号肽和 肿瘤抗原编码序列的密码子最佳化，而不是分泌途径。
重要地，与亲本利斯特氏菌ΔactA/Δin1B菌株相比较，利用任 何肿瘤抗原分泌途径的重组疫苗的表型没有受到显著影响。利斯特氏 菌ΔactA/Δin1B在C57BL/6小鼠中的半数致死率(LD50)为1×108cfu。 使用pPL2整合载体来完成肿瘤抗原表达盒进入利斯特氏菌 ΔactA/Δin1B染色体上的无害位点的稳定单拷贝位点特异性掺入。 肿瘤抗原编码利斯特氏菌ΔactA/Δin1B的LD50在利斯特氏菌 ΔactA/Δin1B的5倍之内。
实施例28.双顺反子hEphA2表达载体的构建
作为非限制性的实施例，给出了抗原表达盒的构建，其中从双顺 反子信息产生hEphA2的外部(EX2)和内部(CO；激酶死亡)结构域 的表达。通过将Ba PA和Bs PhoD信号肽与EX2和CO结构域分别功能 性连接来完成EX2和CO结构域的分泌。
将密码子最佳化的人EphA2激酶失效的质粒，称为phEphA2KD， 用于双顺反子hEphA2表达载体的构建中。(EphA2是受体酪氨酸激酶， 但是通过在该酶的活性部位从K至M的突变来消除激酶活性)。图49 中显示了phEphA2KD的编码序列。图49中所示的phEphA2KD序列包括 缺失了跨膜结构域的hEphA2的密码子最佳化编码序列，并含有唯一的 5’和3’Bam HI和Sac I限制位点来帮助功能性抗原表达盒的构建。 图49中所示序列中加粗显示的是MluI识别序列。
在两个MluI限制酶识别序列之间合成人EphA2的子片段(跨膜 结构域缺失，激酶失效)(通过本领域已知的基因合成方法，例如， 通过寡核苷酸合成，PCR，和/或Klenow填充，等)。在合成过程中在 由天然蛋白中的疏水跨膜结构域隔开的EphA2胞外和胞内结构域之间 的连接点准确插入actA-plcB基因间隔区。图50中显示了含有 actA-plcB基因间隔区的密码子最佳化人EphA2的MluI子片段的序 列(基因间隔区加粗显示)。此外，将密码子最佳化Bs phoD信号肽 放置于actA-plcB基因间序列的3’端并与下游EphA2 CO结构域编码 区框内融合。
通过用含有actA-plcB基因间隔区和Bs phoD信号肽的MluI片 段替代图49中所示跨膜结构域缺失的激酶失效的人EphA2序列中的对 应区域来装配功能性人EphA2双顺反子盒。该所得到的序列分别在5’ 和3’端含有唯一的Bam HI和Sac I限制酶识别位点，来帮助插入和 功能性连接hly启动子和初始信号肽，例如Ba PA。
因此，双顺反子人EphA2抗原表达盒的七个有序的功能元件如下： hly启动子-Ba PA信号肽-EX结构域EphA2-终止密码子-actA-plcB基 因间隔区(带有SD序列)-Bs PhoD信号肽-CO结构域EphA2-终止密 码子。所有EphA2和信号肽编码序列优选是密码子最佳化的。
通过该申请中所说明的方法，使用pAM401，pKSV7或pPL1和pPL2 整合载体来生产表达和分泌EphA2 EX和CO结构域的重组利斯特氏菌 菌株。使用在此所述的和/或本领域技术人员已知的方法，通过所需细 菌部分的蛋白质印迹分析来检测EphA2蛋白的表达和分泌。
实施例29.从包括抗原-细菌蛋白嵌合体的重组利斯特氏菌表达 和分泌抗原
本发明的一些实施方案中，编码信号肽及其异源蛋白融合伴侣的 序列都是密码子最佳化的。一些实施方案中，理想的是将密码子最佳 化异源蛋白序列置于蛋白的限定区域内，其天然形式是从利斯特氏菌 中分泌的。将异源蛋白序列功能性地放置于选定的分泌的利斯特氏菌 蛋白序列的限定序列内，使得合成并分泌对应于组合分子量的分泌蛋 白质的蛋白质嵌合体。通过利用自体细菌蛋白的最佳分泌所需要的宿 主利斯特氏菌属细菌的系统来促进异源蛋白的分泌。分子伴侣促进选 定的细菌蛋白的分泌。
作为非限制性的实施例，产生单核细胞增生利斯特氏菌蛋白p60 和人肿瘤抗原，间皮素，之间的蛋白质嵌合体。通过将人肿瘤抗原， 间皮素，准确地在氨基酸位置70放入单核细胞增生利斯特氏菌蛋白 p60中来产生蛋白质嵌合体(尽管当然可以选择任何所需的异源蛋白 编码序列来产生蛋白质嵌合体)。蛋白质嵌合体含有最佳化密码子用 于在利斯特氏菌中p60氨基酸1-70和完整的间皮素编码序列的表达。 此外，将p60-人间皮素蛋白质嵌合体功能上连接单核细胞增生利斯特 氏菌hly启动子，掺入pPL2载体中，随后如在此所述的使用该载体来 生产表达和分泌人间皮素的重组单核细胞增生利斯特氏菌菌株。以下 描述了用于构建最佳表达和分泌p60-人间皮素蛋白质嵌合体的重组 利斯特氏菌菌株的实验方法。
一些实施方案中，选定的单核细胞增生利斯特氏菌基因和选定的 异源蛋白质序列之间的蛋白质嵌合体的重要特征是将选定的异源蛋白 质序列合适地功能性放入选定的单核细胞增生利斯特氏菌基因内来保 持蛋白质嵌合体通过单核细胞增生利斯特氏菌表达的蛋白和细菌伴侣 以及分泌装置的彼此作用的最佳分泌，以及维持单核细胞增生利斯特 氏菌蛋白质在蛋白质嵌合体环境中的功能活性。一些实施方案中，单 核细胞增生利斯特氏菌secA2依赖性蛋白NamA和p60内的异源序列的 功能性放置期望的是保持这些所述蛋白质的肽聚糖细胞壁水解酶活 性。(参见，Lenz等，(2003 PNAS，100：12432-12437)，例如，用 于描述SecA2-依赖性NamA和p60蛋白质)。一些实施方案中，希望 将异源蛋白编码序列功能性地放置于信号序列(SS)和细胞壁结合结 构域(LySM)以及催化结构域Lyz-2(NamA)和p60-dom(p60)之间 (Lenz等，(2003))。
一些实施方案中，将抗原或异源蛋白的表达功能上连接prfA-依 赖性启动子。这样，在重组利斯特氏菌感染的细胞的微环境内诱导异 源蛋白的表达。
p60-间皮素蛋白质嵌合体构建的第一步包括功能上连接编码p60 头70个氨基酸的DNA序列的prfA-依赖性hly启动子的DNA合成，使 用利斯特氏菌中最佳分泌的密码子。(一些实施方案中，可以进一步 改变密码子选择来避免过度的RNA二级结构的区域，其可以抑制蛋白 质翻译效率)。合成对应于hly启动子-70N-末端p60氨基酸的DNA 子片段。(这通常可以通过本领域已知的基因合成方法来进行，例如， 通过寡核苷酸合成，PCR，和/或Klenow填充，等)。
单核细胞增生利斯特氏菌菌株10403S p60头70个氨基酸的序列 如下所示：
MNMKKATIAATAGIAVTAFAAPTIASASTVVVEAGDTLWGIAQSKGTTVDAIKKA NNLTTDKIVPGQKLQ(SEQ ID NO：116)
本领域技术人员可以认识到存在多个单核细胞增生利斯特氏菌编 码基因的实验室和现场分离物，包括p60，其可以含有核苷酸序列和 氨基酸水平上的可变性，但却是基本上相同的基因和蛋白质。此外， 本领域技术人员可以认识到可以使用来自单核细胞增生利斯特氏菌的 任何实验室或现场分离物(包括食品传染的或临床的菌株)的基因来 构建嵌合体蛋白质。
图51中显示了对应于hly启动子-70N-末端p60氨基酸的合成的 DNA序列。此外，修饰编码p60氨基酸残基69(L)和70(Q)的密码 子以含有唯一的PstI酶识别序列，来帮助异源序列的功能性插入。 此外，合成的子片段的5’端含有唯一的KpnI酶识别序列。
将447bp KpnI和PstI消化的子片段连接于pPL2载体的相应KpnI 和PstI位点，并通过用KpnI和PstI酶消化和用小牛肠碱性磷酸酶 (CIAP)消化进行处理。该质粒称为pPL2-hlyP-Np60 CodOp。随后， 将天然p60基因的剩余部分在唯一的PstI和BamHI位点之间克隆至 pPL2-hlyP-Np60 CodOp质粒中。通过PCR克隆p60基因的剩余部分， 使用含有热稳定聚合酶的校正，和以下的引物对：
正向引物：
5′-CGC CTGCAGGTAAATAATGAGGTTGCTG(SEQ ID NO：117)
反向引物：
5′-CGCGGATCCTTAATTATACGCGACCGAAG(SEQ ID NO：118)
用PstI和BamHI消化1241bp扩增子，并将纯化的1235bp连接至 pPL2-hlyP-Np60 CodOp质粒中，用PstI和BamHI消化，并用CIAP处 理。该质粒含有完整的单核细胞增生利斯特氏菌p60基因，具有对应 于氨基酸1-77的最佳密码子，和对应于氨基酸78-478的天然密码子， 并功能连接单核细胞增生利斯特氏菌hly启动子。该质粒称为 pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)，图52中显示了含有功能连接p60 编码序列的hlyP的KpnI-BamHI子片段序列。通过测序来证实 pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)质粒的预期序列。
构建的下一步是在质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)唯一的PstI 位点功能性插入异源蛋白编码序列，其位于N-末端信号肽序列和p60 第一个LysM细胞壁结合结构域之间，因此保持单核细胞增生利斯特氏 菌蛋白的正常生物功能。
作为非限制性的实施例，将对于单核细胞增生利斯特氏菌蛋白最 佳表达为密码子最佳化的人间皮素插入pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77) 质粒的唯一PstI位点中。具体地，从实施例中27中所述的含有全长 人间皮素的质粒克隆全长间皮素，或缺失信号肽和GPI衔接结构域的 间皮素(间皮素ΔSP/ΔGPI)，含有用于在单核细胞增生利斯特氏菌 中表达的最佳密码子，使用具有校正活性的热稳定聚合酶，和以下的 引物对：
1.全长
正向引物(huMeso 3F)：
5′-AAACTGCAGGCATTGCCAACTGCACGTCC(SEQ ID NO：119)
反向引物(huMeso 1935R)：
5′-AAACTGCAGAGCTAATGTACTGGCTAATAATAATGCTAAC(SEQ ID NO： 120)
2.Δ信号肽，ΔGPI锚
正向引物(huMeso 133F)：
5′-CGCCTGCAGCGTACATTAGCAGGTGAAACAGG(SEQ ID NO：121)
反向引物(huMeso 1770R)：
5′-CGCCTGCAGGCCTTGTAAACCTAAACCTAATGTATC(SEQ ID NO：122)
纯化1932bp(全长间皮素)和1637bp(间皮素ΔSP/ΔGPI)的 PCR扩增子，用PstI消化，纯化，并连接至质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77)的唯一PstI位点中，通过用PstI消化处理，并用CIAP处理。 通过限制内切核酸酶图谱来证实p60和间皮素结构域一致的N-CO取 向。这些质粒称为pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素和 pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素ΔSP/ΔGPI，并引入选定的 单核细胞增生利斯特氏菌菌株(如ΔactAΔin1B双缺失突变体)，如 贯穿在此所包含的实施例所述的。
图53中显示了含有功能上连接p60-人间皮素蛋白质嵌合体编码 基因的hly启动子的质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素的 KpnI-BamHI子片段序列。
图54中显示了含有功能上连接p60人间皮素ΔSP/ΔGPI蛋白质 嵌合体编码基因的hly启动子的质粒pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77) -间皮素ΔSP/ΔGIP的KpnI-BamHI子片段序列。
p60-间皮素蛋白质嵌合体的表达和分泌的蛋白质印迹分析
如贯穿实施例所述的，选定异源抗原的表达和分泌导致MHC I类 限制的CD8+T细胞反应的有效引发。通过在此所含的实施例中所述的 方法通过蛋白质印迹分析来测试蛋白质嵌合体通过重组单核细胞增生 利斯特氏菌ΔactAΔin1B双缺失突变体的表达和至培养基中的分泌， 该突变体含有通过在此所述的方法产生的pPL2-hlyP-Np60 CodOp (1-77)-间皮素或pPL2-hlyP-Np60 CodOp(1-77)-间皮素ΔSP/ΔGIP 质粒的tRNA-Arg染色体插入，使用间皮素特异性多克隆抗体进行测 试。
一些泳道中所示的蛋白质h间皮素中所示的工程化缺失 (ΔSPΔGPI，在此也称为ΔSSΔGPI，ΔSP/ΔGPI，ΔSS/ΔGPI，等) 如下：缺失的信号肽(ΔSP)对应于h间皮素的N-末端的34个氨基 酸(对于人间皮素的序列，参见，例如，图34或GenBank Acc.No.BC009272)。缺失的GPI(ΔGPI)结构域对应于C-末端的42 个氨基酸，开始于氨基酸残基Gly-Ile-Pro和结束于氨基酸残基 Thr-Leu-Ala(参见，例如，图34)。
该分析的结果说明由具有精确插入人间皮素或人间皮素 ΔSP/ΔGPI(在N-末端信号序列和两个LysM细胞壁结合结构域的第 一个之间在p60的氨基酸70框内插入)的p60组成的蛋白质嵌合体从 重组单核细胞增生利斯特氏菌有效表达和分泌。参见图55。(图55 的Y轴显示了最左边泳道中所跑的阶梯中的蛋白质分子量(以kDa表 示)。具体地，图55中的泳道1-4证明了期望的含有人间皮素或人间 皮素 ΔSPΔ/GPI的蛋白质嵌合体的表达和分泌。人间皮素 ΔSP/ΔGPI相对于全长间皮素的表达和分泌的提高的效率在泳道2和 4中是明显的。泳道3和4中所示的蛋白质嵌合体中，使用了真实的 N-末端p60氨基酸。图55中泳道1和2中所跑的蛋白质嵌合体中，缺 失了分别编码位置29和64上的氨基酸T和V的核苷酸。泳道5显示 了与人ΔSP/ΔGPI-间皮素融合的炭疽芽孢杆菌PA信号肽的表达和分 泌(其中信号肽和间皮素编码序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中 的表达都是密码子最佳化的)，泳道6显示了融合全长人间皮素的LLO 的表达和分泌(其中信号肽和间皮素编码序列对于在单核细胞增生利 斯特氏菌中的表达都是密码子最佳化的)。泳道8显示了J293，人细 胞系，对蛋白的表达，而泳道7显示了由含有编码全长人间皮素质粒 的J293(“J293/全长”)表达和分泌的蛋白。泳道10显示了从已经 缺失了内源p60的利斯特氏菌的蛋白表达和分泌。图55中的下图显示 了单核细胞增生利斯特氏菌p60分泌的蛋白质印迹分析，使用多克隆 的α-p60抗体。结果证明等量的Lm-分泌的蛋白质加载于凝胶上。
结果证明了p60可以用作分泌异源蛋白质和促进对HHC I类途径 的呈递的分子伴侣。
实施例30.通过重组单核细胞增生利斯特氏菌表达和分泌抗原的 其他实施例
A.使用非利斯特氏菌信号肽从双顺反子构建体表达Eph2A的胞内 结构域(ICD)
图56显示了使用非利斯特氏菌，非secA1信号序列，从双顺反子 信息表达和分泌Eph2A胞内结构域(ICD)的蛋白质印迹分析。
Eph2A是由胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)组成的蛋白 质。将利斯特氏菌ΔactAΔin1B工程化以表达双顺反子mRNA，其中双 顺反子mRNA编码作为离散多肽的Eph2A胞外结构域和胞内结构域。构 建体中所用的所有编码信号序列的序列(枯草芽孢杆菌phoD信号肽， 炭疽芽孢杆菌保护性抗原信号肽，和乳酸乳球菌Usp45信号肽)对于 在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。编码ECD和 ICD结构域的序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达也是密码 子最佳化的。来自LLO基因的利斯特氏菌启动子hly用作这些构建体 中的启动子。
使用整合载体pPL2将编码双顺反子mRNA的表达盒整合至利斯特 氏菌的基因组中。使用标准技术的各种细菌级分的蛋白质印迹分析被 用于检测和测量累积的胞内EphA2结构域。结果证明了使用由密码子 最佳化序列编码的非利斯特氏菌信号肽从双顺反子构建体表达和分泌 Epha2的胞内结构域。
表达构建体包括：(1)编码可操作地(功能上)连接EphA2胞外 结构域编码序列的乳酸乳球菌Usp45分泌序列的密码子最佳化序列 (第一个多肽)和编码可操作地连接EphA2胞内结构域的枯草芽孢杆 菌phoD分泌信号的密码子最佳化序列(第二个多肽)(泳道1)；和 (2)编码可操作地连接EphA2胞外结构域编码序列的炭疽芽孢杆菌保 护性抗原分泌序列的密码子最佳化序列(第一个多肽)和编码可操作 地连接EphA2胞内结构域编码序列的枯草芽孢杆菌phoD分泌序列的密 码子最佳化序列(第二个多肽)(泳道2-3(两个不同的克隆)；参 见以上实施例28中该表达盒构建的描述)。使用减毒的亲本利斯特氏 菌ΔactAΔin1B菌株的对照研究(泳道4)证明了一些对照印迹中可 变量的可检测交叉反应性。泳道1-3显示了慢移动条带和快移动条带， 其中快移动条带对应于胞内结构域(ICD)。在所有三个细菌级分中观 察到从所有构建体表达的EphA2胞内结构域(泳道1-3)。泳道4(对 照)只显示了慢移动条带。由于对于胞外结构域没有抗体可获得，所 以没有测定胞外结构域的表达/分泌。
B.鼠间皮素作为与各种密码子最佳化信号肽N-末端融合的函数 基于质粒的表达和分泌
图57显示了从密码子最佳化间皮素编码序列表达的鼠间皮素基 于质粒的表达和分泌，使用各种信号肽，包括非利斯特氏菌信号序列 和非secA1信号序列。鼠间皮素基于质粒的表达和分泌作为与由密码 子最佳化序列编码的各种信号肽N-末端融合的函数来显示。所有情况 中，编码间皮素融合蛋白的信号肽的序列是密码子最佳化的，以及鼠 间皮素编码序列对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最 佳化的。测量了鼠间皮素从单核细胞增生利斯特氏菌的表达和分泌， 其中利斯特氏菌带有pAM401质粒，且其中该质粒编码间皮素。测试基 于各种质粒的构建体，其中信号序列不同。进行蛋白质印迹分析，使 用从选定蛋白质(A)，细胞壁(B)和细胞裂解物(C)各个级分回收 的蛋白质。对于每个级分，泳道1-2显示了作为与炭疽芽孢杆菌保护 性抗原信号序列的融合体表达的鼠间皮素，泳道3-4显示了作为与乳 酸乳球菌Usp45信号序列融合体表达的鼠间皮素，泳道5-6显示了作 为与枯草芽孢杆菌phoD信号序列的融合体表达的鼠间皮素，泳道7-8 显示了作为与p60信号序列的融合体表达的鼠间皮素，泳道9-10显示 了作为与LLO信号肽的融合体表达的鼠间皮素，和泳道11显示了由对 照宿主利斯特氏菌ΔactAΔin1B表达的蛋白。结果证明了当信号序列 包括炭疽芽孢杆菌保护性抗原信号序列(泳道1-2)和枯草芽孢杆菌 phoD信号肽序列(泳道5-6)时，发现了最高的表达和分泌。
C.人间皮素基于单核细胞增生利斯特氏菌染色体的表达和分泌
图58显示了各种细菌细胞级分(即，分泌的蛋白，细胞壁和裂解 物)中人间皮素基于单核细胞增生利斯特氏菌染色体的表达和分泌的 蛋白质印迹分析。当与非利斯特氏菌secA1和非secA1信号肽融合时， 测试人间皮素的表达和分泌。测试的利斯特氏菌属细菌全部是 ΔactAΔin1B利斯特氏菌且如下：利斯特氏菌ΔactAΔin1B(没有工 程化来表达间皮素的对照利斯特氏菌)(泳道1)；编码融合ΔSS/ΔGPI h间皮素的枯草芽孢杆菌保护性抗原信号序列的利斯特氏菌(泳道 2-3)；编码融合ΔSS/ΔGPI h间皮素的枯草芽孢杆菌phoD信号肽的 利斯特氏菌(泳道4-5)；编码融合全长h间皮素的炭疽芽孢杆菌保 护性抗原信号序列的利斯特氏菌(泳道6-7)；编码融合全长h间皮 素的枯草芽孢杆菌phoD信号序列的利斯特氏菌(泳道8-9)。
所有上述利斯特氏菌中编码融合间皮素的信号肽的序列对于在单 核细胞增生利斯特氏菌中的表达都是密码子最佳化的。此外，间皮素 编码序列(ΔSS/ΔGPI和全长)在每个构建体中对于在单核细胞增生 利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。每个上述表达间皮素的利斯 特氏菌中，通过与pPL2整合将间皮素表达盒插入利斯特氏菌染色体 中。
将人间皮素工程化来缺失其信号序列和缺失疏水区(gpi区)时， 使用枯草芽孢杆菌phoD分泌序列产生了最高表达(泳道4-5)。
实施例31.重组单核细胞增生利斯特氏菌疫苗的免疫原性和抗肿 瘤功效的其他实施例
以下实施例公开了接种本发明的利斯特氏菌的结果，例如，细胞 因子表达的疫苗依赖性刺激，具有肿瘤动物的疫苗依赖性存活，肿瘤 转移的疫苗依赖性减少，和肿瘤体积的疫苗依赖性减小。
A.包括P-60-模式抗原嵌合体的利斯特氏菌疫苗的免疫原性
图59A和B显示了通过表达p60抗原嵌合体或LLO信号肽抗原融 合蛋白的利斯特氏菌将异源抗原递送至MHC I类途径中。该实验中所 用的异源抗原是AH1-A5。接种是使用经工程化以包括p60蛋白质嵌合 体表达盒的利斯特氏菌，该表达盒编码插入包括N-端p60信号肽序列 的p6 0多肽序列内的AH1-A5(融合OVA SL8肽)(“基于p60的构建 体”)，或经工程化以编码连接编码相同抗原，包埋于OVA内的AH1-A5 (“基于LLO的构建体”)的核酸的LLO信号肽的利斯特氏菌。这两 种构建体使用利斯特氏菌启动子hly。p60是通过secA2途径分泌的利 斯特氏菌肽聚糖自溶素，而LLO是利斯特氏菌溶素。
为了产生基于p60的构建体，将编码p60的核酸工程化以含有 PstI克隆位点，其中PstI克隆位点表示沉默突变，即导致所编码的 氨基酸序列没有变化。PstI位点位于p60序列中N-末端信号序列和两 个LysM细胞壁结合结构域的第一个之间。编码包括AH1-A5抗原决定 部位(SPSYAYHQF(SEQ ID NO：73))和SL8抗原决定部位(SIINFEKL (SEQ ID NO：123))的异源多肽的多核苷酸框内插入PstI克隆位点 中。这些抗原决定部位的编码序列由唯一的XhoI位点隔开且对于在单 核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的。PstI位点中的插 入出现在p60的核苷酸碱基编号199的等同处。p60编码序列的头1-70 个氨基酸对于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化 的。因此，从用于在单核细胞增生利斯特氏菌中的表达的最佳密码子 表达对应于该信号肽的头27个氨基酸。抗原表达盒进一步含有唯一的 5’和3’KpnI和SacI位点，各自插入pPL2质粒的MCS中，用于邻近 于单核细胞增生利斯特氏菌基因组的tRNAArg基因的位点特异性整合。 基于LLO的构建体包括编码可操作地连接编码OVA内的AH1-A5的核酸 的LLO信号序列的序列(没有使用任何密码子最佳化)。因此，该研 究中，信号肽来自利斯特氏菌LLO或来自利斯特氏菌p60。
将构建体放入pPL2中，pPL2是介导利斯特氏菌基因组的位点特 异性重组的载体，并插入利斯特氏菌基因组中。
图59A和B显示了对接种(尾静脉)表达具有p60信号序列/自溶 素作为p60嵌合体的AH1-A5抗原的利斯特氏菌的免疫应答，和对接种 表达与LLO信号序列连接的AH1-A5抗原的利斯特氏菌的免疫应答。图 的X轴中，“Unstim”意思是没有将肽加入孔中(即，细胞没有受到 刺激)，而“AH1”意思是将AH1九肽加入孔中，且“AH1-A5”意思是 将AH1-A5九肽加入孔中。将所有的细菌疫苗工程化以含有编码AH1-A5 的整合核酸(细菌疫苗没有编码AH1)(参见，例如，Slansky等，(2002) Immunity 13：529-538)。当使用包括基于p60构建体的利斯特氏菌来 进行接种时，菌株在图的x轴上表示为“p60”。当使用包括基于LLO 的构建体的利斯特氏菌来进行接种时，菌株在图的x轴上表示为 “LLO”。
接种表达基于p60构建体的利斯特氏菌的完整实验方案如下：(1) 给小鼠接种含有整合核酸的利斯特氏菌(尾静脉(i.v.))，其中整 合的核酸编码p60，其含有编码在p60的核苷酸199插入的AH1-A5的 核酸。换句话说，将编码AH1-A5抗原的核酸框内连接和可操作地连接 p60信号序列和p60自溶素。编码AH1-A5的核酸对于在单核细胞增生 利斯特氏菌中的表达是密码子最佳化的；(2)感染后七天，取出脾脏； (3)分离脾细胞，放入孔中，并在没有添加的肽(图59A和59B)， 添加AH1(图5 9A)或添加AH1-A5(图59B)的情况下，来孵育脾细胞， 如x轴上所示的；(4)加入肽后，将细胞孵育五小时，接着通过FACS 分析来测试表达IFNγ的CD8+T细胞的百分比。类似的实验方案用于 接种表达基于LLO的构建体的利斯特氏菌。
结果证明了利斯特氏菌疫苗刺激了CD8+T细胞表达IFNγ，其中 加入的肽是AH1(图59A)或其中加入的肽是AH1-A5(图59B)。当整 合的AH1-A5可操作地连接LLO信号序列时，刺激略高，而当整合的 AH1-A5可操作地连接p60信号序列时，刺激略低(图59A和B)。
图60A和B显示了用如上所述的，即如图59A和B中所示的两种 相同利斯特氏菌疫苗进行的实验。图60A显示了给小鼠接种经工程化 以含有基于p60的构建体的利斯特氏菌(“p60”)或接种经工程化以 含有基于LLO的构建体的利斯特氏菌(“LLO”)时的结果。如图60A 的x轴上所示的，基于细胞的测试没有补充肽(未刺激的；“unstim”) 或补充了LLO91-99肽(“LLO91”；Badovinac and Harty(2000) J.Imunol.164：64444-6452)。结果表明了相似的免疫应答(IFNγ表 达)，其中利斯特氏菌疫苗含有基于p60的构建体或基于LLO的构建 体。图60A中的刺激的免疫应答，如基于细胞测试的结果所反映的， 是由于天然LLO的利斯特氏菌内源表达而引起的。
图60B显示了给小鼠接种经工程化以含有基于p60的构建体的利 斯特氏菌时的结果，其中hly启动子和信号肽序列可操作地连接编码 AH1-A5的核酸，或接种经工程化以含有基于LLO的构建体的利斯特氏 菌时的结果，其中hly启动子和信号肽可操作地连接编码AH1-A5的核 酸。加入的肽是没有肽(未刺激的；“unstim”)或p60217-225(“p60-217”； Sijts等(1997)J.Biol.Chem.272：19261-19268)，如x轴上所示的。 图60B中的刺激的免疫应答，如基于细胞测试的结果所反映的，对于 基于LLO的构建体是由于内源p60的利斯特氏菌的表达而引起的，对 于基于p60的构建体是结合内源p60和所表达的p60蛋白嵌合体序列 而引起的。
B.表达人间皮素的利斯特氏菌的治疗功效
图61中所示的结果表明了接种表达人间皮素(hu间皮素)的利 斯特氏菌延长了带有肿瘤小鼠的存活，其中已经将小鼠中的肿瘤细胞 工程化来表达人间皮素。肿瘤细胞是表达人间皮素的CT26细胞，小 鼠是Balb/c小鼠。(在此所述的所有CT26肿瘤研究都涉及Balb/c 小鼠。)一种表达盒中，将编码非利斯特氏菌信号序列的序列可操作 地框内连接编码人间皮素的密码子最佳化序列(缺失了其信号序列和 GPI锚)。在融合蛋白对肿瘤免疫应答效果的研究中，将编码与人间 皮素(ΔGPIΔSS)融合的信号肽的表达盒在利斯特氏菌疫苗中给予带 有肿瘤的小鼠。编码间皮素融合蛋白的表达盒已经整合至利斯特氏菌 染色体中。在第0天，将2×105个表达人间皮素的CT26细胞(CT.26 huMeso+)静脉内注射至Balb/c小鼠中。在尾静脉(i.v.)给小鼠接 种。在第3天接种1e7菌落形成单位(CFU)利斯特氏菌(i.v.)。
图61显示了小鼠对表达人间皮素的CT26肿瘤的百分比存活(显 示于y轴上)，其中疫苗包括Hank’s平衡盐溶液(HBSS)(sham疫 苗；“HBSS”)；从整合的表达盒表达SF-AH1A5的利斯特氏菌 ΔactAΔin1B(阳性对照疫苗；“SF-AH1A5”)；或包括编码与hu 间皮素(由密码子最佳化序列编码)融合的炭疽芽孢杆菌保护性抗原 信号序列(由非密码子最佳化序列编码)的表达盒的利斯特氏菌 ΔactAΔin1B，其中hu间皮素缺失了信号序列和缺失了编码疏水gpi- 锚定肽的区域(“BaPA-huMesoΔgpiΔss”)。带有SF-AH1A5构建 体和BaPA-huMesoΔgpiΔss构建体的利斯特氏菌含有这些构建体作 为染色体整合的构建体。已经使用pPL2将编码SF-AH1A5的核酸分子 和编码BaPA-huMesoΔgpiΔss构建体的核酸分子整合至利斯特氏菌 基因组中。SF是源自卵清蛋白的8个氨基酸的肽的简写，也称为SL8 (参见，例如，Shastri和Ganzalez.(1993)J.Immunol. 150：2724-2736)。缩写“SF-AH1A5”，“SF-AH1-A5”和“OVA/AH1-A5” 指的是连接卵清蛋白支架的AH1-A5。“SF AH1-A5”指的是AH1-A5 (SPSYAYHQF(SEQ ID NO：73))和融合GenBank登录号No.P01012 (卵清蛋白)的氨基酸138至386的N末端的SF肽。该实施例中，编 码“SF-AH1A5”的多核苷酸，包括编码AH1-A5的密码子最佳化核酸和 编码源自卵清蛋白序列的非密码子最佳化核酸。
结果证明了用表达hu间皮素的利斯特氏菌的单次免疫延长了带 有表达hu间皮素肿瘤的小鼠的存活。使用染色体整合的炭疽芽孢杆菌 保护性抗原信号序列融合Δ信号序列/Δgpi hu间皮素(BaPA-hu间 皮素ΔgpiΔss；实心方块)，存活百分比最高。使用对照盐溶液“接 种”时，存活最低。
C.接种了表达人间皮素的利斯特氏菌的带有肿瘤的小鼠由于间皮 素特异性的抗肿瘤功效降低了肺肿瘤节结水平
图62中的数据证明了通过接种表达人间皮素的利斯特氏菌 ΔactAΔin1B降低了肺肿瘤切结的水平，其中将肿瘤细胞工程化来表 达人间皮素。小鼠品系是Balb/c，肺肿瘤细胞是带有表达人间皮素的 载体的CT26细胞。在第0天，将2×105个表达人间皮素的CT26细胞 静脉内给予Balb/c小鼠。将编码各种信号序列的序列在表达盒中可操 作地框内连接编码人间皮素的密码子最佳化序列。将编码与人 mesotehlin融合的各种信号肽的表达盒通过含有表达盒的利斯特氏 菌疫苗给予带有肿瘤的小鼠。在第3天，将1×107CFU/100μL的利斯 特氏菌疫苗静脉内给予带有肿瘤的小鼠。阴性对照接种使用HBSS或利 斯特氏菌ΔactAΔin1B。阳性对照接种使用表达包括AH1A5的OVR融 合蛋白(框内连接OVA序列)的利斯特氏菌。(包括AH1A5的OVA融 合蛋白由非密码子最佳化的表达盒编码。)在第19天，将小鼠处死， 收集肺，并计数肺肿瘤节结。
利斯特氏菌疫苗减少了肺中转移瘤的数目。只涉及HBBS或利斯特 氏菌ΔactAΔin1B的对照疫苗各自导致检测到的一致的每个肺250个 转移瘤和每个肺平均135个转移瘤。带有编码与人间皮素融合的LLO 信号肽的质粒(pAM401)(“pAM-LLO-HuMeso)的利斯特氏菌显示出 每个肺约25个转移瘤。编码LLO信号肽和人间皮素序列的 pAM-LLO-HuMeso质粒的多核苷酸序列对于在单核细胞增生利斯特氏 菌中的表达是密码子最佳化的。带有编码炭疽芽孢杆菌保护性抗原信 号序列(BaPA)融合hu间皮素(Δgpi/Δ信号序列)的整合序列 (“BaPA-HuMesoΔgpiΔss)的利斯特氏菌也显示出每个肺平均约 25个转移瘤。BaPA-HuMesoΔgpiΔss中编码炭疽芽孢杆菌保护性抗 原信号序列的多核苷酸不是密码子最佳化的，而编码缺失了间皮素信 号肽和GPI锚的人间皮素序列的多核苷酸对于在单核细胞增生利斯特 氏菌中的表达是密码子最佳化的。
图63显示了对照研究的结果，使用包括肺肿瘤节结的小鼠，使用 CT.26亲本靶细胞来产生肺肿瘤节结。使用Balb/c小鼠，但替代注射 wt CT26(在第0天2×105个细胞(i.v.)。研究证明接种表达间皮素 融合蛋白的利斯特氏菌疫苗的抗肿瘤功效是间皮素特异性的。将编码 各种信号序列的序列在表达盒中可操作地框内连接编码人间皮素的密 码子最佳化序列。(该实验中所用的构建体与以上实验中所用的来产 生图62中所示数据的那些相同。)将编码与人间皮素融合的各种信号 肽的表达盒通过包括表达盒的利斯特氏菌疫苗给予带有肿瘤的小鼠。 在尾静脉接种(在第3天i.v.1×107CFU/100μL)。该特定研究中， 肿瘤细胞没有表达人间皮素。测定存活。当数据可获得时，还测量了 肺转移瘤的数目。每个接种组总共有五只小鼠。阴性对照接种涉及 HBSS或利斯特氏菌ΔactAΔin1B。阳性对照接种涉及表达包括AH1A5 (非密码子最佳化的)的OVA融合蛋白的利斯特氏菌。
图63中显示了结果。叉表示未能存活，每个接种组包含5只小鼠。 使用阳性对照接种，小鼠存活，肺中检测到的转移瘤数目为平均每个 肺约25个。当没有将肿瘤细胞工程化来表达人间皮素时，接种了带有 表达与人间皮素融合的LLO信号肽的质粒(“pAM-LLO-HuMeso”)的 利斯特氏菌的小鼠没有存活。当给小鼠接种带有染色体整合的与人间 皮素融合(Δgpi/Δ信号序列)的炭疽芽孢杆菌保护性抗原分泌序列 (BaPA，由非密码子最佳化核苷酸序列编码)的利斯特氏菌 (“BaPA-HuMesoΔgpiΔss)时，一些存活，而另一些没有存活。
D.接种表达密码子最佳化人间皮素的利斯特氏菌减小了肿瘤体积
图64显示了接种表达来自包括密码子最佳化间皮素密码子序列 的表达盒的人间皮素的利斯特氏菌(ΔactAΔin1B)减小了肿瘤体积。
将编码各种信号序列的序列在表达盒中可操作地框内连接编码人 间皮素的密码子最佳化序列。将编码与人间皮素融合的各种信号肽的 表达盒通过含有表达盒的利斯特氏菌疫苗给予带有肿瘤的小鼠。该研 究中用于接种带有肿瘤小鼠的表达人间皮素的利斯特氏菌疫苗包括下 列：带有表达和分泌与人间皮素融合的LLO信号肽(由对于在单核细 胞增生利斯特氏菌中的表达密码子最佳化的序列编码)的pAM401质粒 的利斯特氏菌(ΔactAΔin1B单核细胞增生利斯特氏菌)(“pAM opt.LLO-opt.huMeso”)；带有表达与hu间皮素融合的炭疽芽孢杆菌 保护性抗原信号序列(由非密码子最佳化表达盒编码)的pAM401质粒 的利斯特氏菌(“pAM非opt.BaPA-opt.huMeso)；和包括编码与hu 间皮素融合的炭疽芽孢杆菌保护性抗原信号肽(由非密码子最佳化序 列编码)的整合表达盒的利斯特氏菌，其中hu间皮素缺失了信号序列 和缺失了编码疏水gpi-锚定肽的区域 (“Non-opt.BaPA-opt.huMesodelgpi-ss”)。
在该研究中，给Balb/c小鼠皮下植入2×105个经工程化来表达 人间皮素的CT26鼠结肠肿瘤细胞(第0天)。每个接种组包括五只小 鼠。在注射CT26细胞后的第3天，给小鼠静脉内接种非利斯特氏菌对 照或1×107菌落形成单位(CFU)的利斯特氏菌疫苗。阴性对照接种 涉及HBSS。阳性对照接种涉及表达SF-AH1A5的(密码子最佳化的) 利斯特氏菌。(SF是源自卵清蛋白的八个氨基酸的肽，也称为SL8(参 见，例如，Shastri和Ganzalez(1993)J.Immunol.150：2724-2736。) 在不同的时间点，测定平均肿瘤体积。
图64中显示了该研究的结果。结果证明了接种表达与各种信号肽 融合的人间皮素的利斯特氏菌减小了肿瘤体积。接种表达与人间皮素 融合的炭疽芽孢杆菌保护性抗原信号肽的利斯特氏菌是保护性的(虚 线的空心圆)。接种表达编码与LLO信号肽融合的质粒编码的人间皮 素的利斯特氏菌是保护性的(空心三角形)。接种包括编码与人间皮 素(Δgpi/Δ信号肽序列)融合的炭疽芽孢杆菌保护性抗原(非密码 子最佳化核酸)信号肽的染色体整合表达盒的利斯特氏菌也是保护性 的(实线空心椭圆)。关于阳性对照，表达染色体整合的SF-AH1A5 的利斯特氏菌(空心方块)也是保护性的。最大的肿瘤体积，和肿瘤 生长开始的最早时间，出现在接受sham疫苗(HBSS)的小鼠中。
E.表达与非利斯特氏菌信号序列融合的人间皮素的利斯特氏菌疫 苗的免疫原性
图65描绘了利斯特氏菌ΔactAΔin1B-人间皮素菌株的免疫 原性，其中利斯特氏菌含有编码与炭疽芽孢杆菌信号肽融合的人 间皮素(最佳化的Ba PA hMesoΔGPIΔSS)的染色体整合核酸。 ELISPOT测试用于测试免疫应答，其中测试对干扰素γ的表达是 敏感的。
该研究包括以下步骤：(1)给小鼠(Balb/c小鼠或C57BL/6小 鼠)接种(i.v.)利斯特氏菌，该利斯特氏菌包括编码与hu间皮素(由 密码子最佳化序列编码，其中间皮素信号序列和疏水gpi-锚定序列已 经缺失)融合的炭疽芽孢杆菌保护性抗原肽(由非密码子最佳化序列 编码)的整合表达盒；(2)7天后，取出脾；(3)将从脾中取出的 细胞分布于孔中。每个孔接受约200,000个脾细胞；(4)将三种培养 基中的一种加入孔中，如所示的。用Balb/c小鼠研究的脾细胞接受单 独的培养基(“未刺激的“)，间皮素肽集合(“Meso集合”)，或 p60217-225(“p60217”)。用C5 7BL/6小鼠研究的脾细胞接受单独的培 养基(“未刺激的”)，间皮素肽集合(“Meso集合”)，或LLO296-304(“LLO296-304”)；(5)进行ELISPOT测试来测定响应所加入肽的免 疫细胞的数量。间皮素肽集合包括153个不同的肽，其中这些肽跨越 h间皮素的整个序列，其中每个肽是15个氨基酸长，相邻的肽有11 个氨基酸重叠。
图65中显示了ELISPOT测试的结果。该结果表明表达与炭疽芽孢 杆菌信号肽融合的人间皮素的利斯特氏菌疫苗能够诱导Balb/c小鼠 对间皮素的免疫应答。观察到Balb/c小鼠的免疫系统对利斯特氏菌表 达的h间皮素的IFNγ响应比C57BL/6小鼠的免疫系统的高。对p60 或LLO的ELISPOT信号响应利斯特氏菌的天然产生的p60和LLO蛋白。
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