技术领域
本发明涉及天然药物化学，具体涉及刺山柑提取物及其制备方法和在制备治疗风湿 性关节炎、类风湿性炎、肩周炎药物中的应用。
背景技术
刺山柑(Capparis spinosa L.)又称老鼠瓜、野西瓜、槌果藤，维语称“波里克果”或“卡 盘”，为白花菜科(Capparidaceae)山柑属藤本植物，是荒漠、半荒漠、干旱、半干旱地区 极有栽培价值的抗旱植物。该植物主要分布于欧洲、北美、大洋洲、亚洲西部，我国新 疆、甘肃、内蒙古、西藏等省区均有分布。中国沙区仅产1属1种，新疆各沙区有分布， 以吐鲁番盆地沙漠最多。新疆维吾尔族民间常用其鲜果捣碎贴敷治疗关节炎和肩周炎等 疾病，其根皮已收载于中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册 (WS3-BW-0050-98)。
在位于环地中海及西亚的一些国家，如土耳其、意大利、西班牙、摩洛哥、伊朗等， 刺山柑的花蕾被用作烹饪的香料。作为传统药，对刺山柑属植物化学成分的系统研究始 于20世纪50年代，迄今报道的山柑属的化学成分主要有硫苷类、黄酮类、生物碱类、有 机(酚)酸类、挥发油及多糖类等。其药理活性主要包括有抗肝毒素作用、抗高血糖作 用、降血脂作用、抑菌作用、软骨细胞保护作用及抗肿瘤作用等。刺山柑也被用于利尿、 抗高血压、外敷治疗关节炎和强壮制剂。
“野西瓜果实的化学成分研究”[哈尔滨商业大学学报自然科学版，2005，21(6)： 684-686]和文献“1H-Indole-3 acetonitrile glycosides from Capparis spinosa fruits” [Phytochemistry，1999，50：1205-1208]等文献报道，从刺山柑果实中分离得到： 6-Hydroxy-12-carboxy-blumenol A-D-glucopyranoside、1H-吲哚-3-乙腈4-O-β-葡萄糖苷、 (6S)-Hydroxy-3-OXO-α-ionol、3-醛基吲哚、腺苷、次黄嘌呤核苷、对苯甲酸鼠李糖醇苷、 蔗糖、β-谷甾醇和胡萝卜苷等成分。文献“刺山柑化学成分的研究”[中草药，2007，38(4)： 510-512]从刺山柑果实中分离得到汉黄芩素(wogonin)、千层纸素A(oroxylin A)、山柰酚 (kaempferol)、芹菜素(apigenin)、苯甲酸(benzoic acid)、对羟基苯甲酸(p-hydroxy-benzoic acid)、对羟基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、β-胡萝卜苷 (β-daucosterol)等化学成分。
中国专利200610118369.8公开了一种从刺山柑药用部位中获得提取物及其应用，该 方法包括将刺山柑药用部位粉碎，加热回流，冷浸或渗漉提取，减压浓缩，得到粗提物， 将粗提物先用石油醚脱酯，其特征在于脱脂后的残余物用氯仿萃取，得到提取物。该提 取物含有β-谷甾醇、β-谷甾醇葡萄糖苷和1-氢-3-乙腈基-4-甲氧基-吲哚。含有以上3种成 分的提取物对治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎及肩周炎显示良好的效果。
中国专利200310113957.9公开了一种从植物槌果藤实中提取抗关节炎有效部位的 方法，将槌果藤实原料粉碎，用50-90％的乙醇或甲醇加热回流提取，减压浓缩，得到 粗提物，将粗提物用石油醚脱脂，残余物用乙酸乙酯和正丁醇体系洗脱，分别得到含有 一种或几种棕榈酸或咖啡酸、咖啡醛或原儿茶醛的乙酸乙酯和正丁醇有效部位。该有效 部位具有镇痛、抗炎和抑制免疫的作用，用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛 风及肩周炎疾病。
但是，专利200610118369.8和200310113957.9在对化学成分方面的研究不够深入， 本发明对制备得到的3种提取物中治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风及肩周炎 疾病的成分进行了深入的研究，对其有效成分的基础有比较清楚的认识，并从中发现了 5个新的化学成分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究刺山柑提取物，以及使用 温和环保的方法和溶剂系统制备刺山柑提取物的方法。
本发明提供一种刺山柑提取物。本发明提取物包括提取物1、2和3。
本发明的提取物1包括下列成分：刺山柑碱A(1，capparisine A)、刺山柑酸(2， cappariside A)、刺山柑碱B(3，capparisine B)、刺山柑碱C(4，capparisine C)、刺山 柑碱D(5，capparisine D)、对羟基苯甲酸(6，4-hydroxybenzoic acid)、原儿茶酸(7， protocatechuic acid)、香草酸(8，vanillic acid)、原儿醛(9，protocatechuic aldehy)、丁 香酸(10，syringic acid)、3，4-二羟基苯甲酸(11，3，4-dihydroxybenzoate)、反式丁烯二酸 (12，E-butenedioic acid)、乙二酸(13，succinic acid)、5-羟甲基糠醛(14， 5-hydroxymethylfurfural)、5-羟甲基糠酸(15，5-hydroxymethyl furoic acid)、2-糠酸(16， 2-furoic acid)、二氢-4羟基-5-羟甲基-2(3H)呋喃酮(17，4-hydroxy-5-(hydroxymethyl) dihydrofuran-2(3H)-one)、7-hydroxy-2-oxoindolin-3-ylacetic acid(18)、尿嘧啶(19， uracil)、L-内消旋肌醇(20，mesoinositol)、尿苷(21，uridine)、山萘酚芸香苷(22， kaempferol-3-O-rutinoside)、β-胡萝卜苷-6′-硬脂酸酯(23，β-sitosterylglucoside-6′- octadecanoate)、corchoionoside C(24)、spionoside B(25)、白花菜苷(26， glucocapperin)、β-谷甾醇(27，β-sitosterol)、β-胡萝卜苷(28，β-daucosterol)、芦丁(29， rutin)、吲哚-3-甲醛(30，1H-indole-3-carbaldehyde)，其中包括5个新化合物，即化合 物1、2、3、4和化合物5。
本发明的提取物2包括下列化学成分：化合物6，7，8，9，10，11，12，13， 17，18，19，22，23，25，27，28，29，30等18个化合物。
本发明的提取物3包括下列化学成分：化合物1，2，3，4，5，14，15，16， 20，21，24和26等12个化合物，其中化合物1，2，3，4，5为新化合物。 本发明的另一目的是提供一种刺山柑提取物的制备方法。
该方法包括下列步骤：
(1)将刺山柑药材粉碎，用药材5～10倍W/W水煎煮2～3次，或用药材5～8 倍W/W的乙醇(50～95％)加热回流提取2～3次，合并各次提取液；；
(2)水煎液的浓缩液，加入乙醇(使溶液中含醇量为60～80％)沉淀杂质，醇 沉2次，除去沉淀，上清液减压浓缩(温度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)， 回收乙醇后得浓缩液(密度1.03-1.1)；
或将步骤(1)的乙醇提取液减压浓缩(温度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)， 得浓缩液(密度1.03-1.1)；
(3)浓缩液经减压干燥(温度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)或冷冻干燥后 得粗提取物1；
(4)粗提取物1用粗提取物1～3倍量W/W水，分散溶解后，用1～1.5倍量 V/V石油醚脱酯2～3次，用1～1.5倍量V/V乙酸乙酯萃取经脱酯后的水溶液2～ 3次，得乙酸乙酯部分和水溶性部分，这两部分液体分别经减压浓缩(温度30～ 50℃，压力0.08～0.1MPa)后，再经减压(真空)或冷冻干燥后，制成乙酸乙 酯提取物2和水溶性部位提取物3。
本发明的提取物1、提取物2和提取物3均具有较好的抗炎、镇痛活性，抗炎 活性的强弱顺序为提取物2＞提取物3＞提取物1；中枢性镇痛活性的强弱顺序为 提取物2≥提取物1＞提取物3，而外周性镇痛活性的强弱顺序为提取物3≥提取 物1＞提取物2。
化学成分的分离与结构鉴定
乙酸乙酯提取物2(60g)经硅胶(200～300目)柱分离，以二氯甲烷-丙酮(100∶ 0～5∶1)，再用二氯甲烷-丙酮(20∶1～0∶100)依次冲洗，将分得的样品经合并后 得到10个部分A1～10。将A2，A3，A4和A5采用拌样法上硅胶(200～300目)柱， 石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脱，分别分离得到化合物6，7，8，9。A6部分采用拌样 法上硅胶(200～300目)柱，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脱，再经反复柱层析和 重结晶，得到化合物10，11，12，13，14，17，18和19。另外，A7部分采用硅胶柱 层析，以二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脱，再经反复柱层析得到化合物22，23和25。 A7部分采用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱，再经反复柱层析得到化合 物17，28，29。
水溶性提取物3(100g)上C-18反相柱，以甲醇-水(0∶1，1∶3，1.5∶1，和95∶ 5)洗脱，分别得到B1～B4个部分，其中B2再经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20，ODS 柱色谱分离纯化，得到化合物14，15，16，20，21，26。B3经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20， ODS柱色谱分离纯化，得到化合物24，1，2，3，4，5。其中化合物1，2，3，4，5 为新化合物。
30种化合物的结构式如下：
30种化合物的波谱数据
编 号 名称 波谱数据 1 刺山柑碱A (capparisine A) 1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ(ppm)：11.34bar(COOH)， 9.34(1H，s，CHO)，7.13(1H，d，J＝3.8Hz，H-8)，6.29(1H， d，J＝3.9Hz，H-9)，5.64(1H，m，H-5)，5.40m(1H，s， NH)，3.08(1H，dd，J＝9.2Hz，17.0Hz，H-4a)，2.63(1H， dd，J＝6.6Hz，17.0Hz，H-4b)；13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ(ppm)：179.0(C-11)，175.2(C-12)，175.1(C-3)，125.8(C-8)， 144.9(C-10)，131.3(C-7)，109.7(C-9)，54.8(C-1)，54.7(C-5)， 37.3(C-4)。 2 刺山柑酸 (cappariside)， 1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)：7.93(1H，s，H-2)， 2.31(3H，s，CH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)： 170.6(COOH)，152.2(C-4)，146.1(C-3)，143.2(C-5)， 140.7(C-2)，14.8(CH3)。 3 刺山柑碱B (capparisine B) 1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)：9.54(1H，s，CHO)， 6.98(1H，d，J＝4.01Hz)，6.21(1H，d，J＝3.78Hz)，5.84(1H， q，J＝7.24Hz)，5.48(1H，d，J＝14.13Hz)，5.39(1H，d， J＝14.93Hz)，1.72(3H，d，J＝7.27Hz CH3)；13C-NMR (CD3OD，125MHz)δ(ppm)：179.7(C-11)，168.1(C-3)，
130.8(C-6)，120.3(C-9)，124.0(C-7)，106.5(C-6)，63.3(C-1)， 53.8(C-4)，19.1(C-10)。 4 刺山柑碱C (capparisine C) 1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)：9.46(1H，s，CHO)， 6.93(1H，d，J＝3.69Hz，H-3)，6.03(1H，d，J＝3.52Hz， H-4)，4.96(1H，d，J＝15.35Hz，H-7a)，4.76(1H，d，J＝15.29 Hz，H-7b)，4.66(1H，d，J＝14.01Hz，H-6a)，4.34(1H，d， J＝13.58Hz，H-6b)，4.34(1H，m，H-5′)，4.25(1H，m，H-4′)， 3.77(1H，dd，J＝2.49，12.29Hz，H-3′a)，3.69(1H，dd，J ＝3.64.49，11.87Hz，H-3′b)，2.27(1H，m，H-6′)；13C-NMR (CD3OD，125MHz)δ(ppm)：178.9(C-8)，134.6(C-5)， 131.2(C-2)，124.2(C-4)，105.0(C-3)，104.1(C-1′)，89.7(C-1′)， 72.9(C-5′)，62.9(C-3′)，58.0(C-7)，50.3(C-6)，44.9(C-6′)。 5 刺山柑碱D (capparisine D) 1H-NMR(DMSO，500MHz)δ(ppm)：9.45(1H，s，CHO)， 6.92(1H，d，J＝3.80Hz，H-7′)，6.01(1H，d，J＝3.46Hz， H-8′)，4.82(1H，d，J＝15.18Hz，H-1′a)，4.74(1H，d，J ＝15.67Hz，H-1′b)，4.70(2H，d，J＝14.37Hz，H-4′a)，4.02 (1H，d，J＝13.82Hz，H-4′b)，4.17(1H，m，H-4)，3.88(1H， s，H-5)，3.89(1H，d，J＝12.07Hz，H-6a)，3.81(1H，d，J＝12.07 Hz，H-6b)，2.04(1H，dd，J＝5.32，12.82Hz，H-3a)，1.91 (1H，t，J＝12.43Hz，H-3b)；13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ(ppm)：178.8(C-10′)，134.1(C-9′)，131.2(C-6′)，124.0(C-7′)， 104.8(C-8′)，95.4(C-2)，67.4(C-5)，65.1(C-4)，64.5(C-6)， 57.8(C-1′)，52.2(C-4′)，35.8(C-3)。 6 对羟基苯甲酸 (p-hydroxybenzcic acid) 1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)：7.78(2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5)，6.72(2H，d，J＝8.8Hz，H-2，6)，为邻位酚 羟基氢信号；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)：170.4 (C-7)，163.6(C-4)，133.3(C-2，C-6)，123.0(C-1)，116.3(C-3， C-5)。 7 原儿茶酸 (protocatechuic acid) 1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)：7.31(1H，d，J＝1.7 Hz，H-2)，7.2(1H，dd，J＝8.1，1.7Hz，H-6)，6.9(1H，d， J＝8.1Hz，H-5)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)： 170.7(COOH)，151.8(C-4)，46.3(C-3)，124.2(C-6)， 123.5(C-1)，118.1(C-2)，116.1(C-5)。 8 香草酸 (vanillic acid) 1H-NMR(CD3COCD3，500MHz)δ(ppm)：12.44(1H，br.s， COOH)，9.81(1H，br.s，OH)，7.46(1H，dd，J＝8.2，1.7 Hz，H-6)，7.43(1H，d，J＝1.7Hz，H-2)，6.77(1H，d，J＝8.2 Hz，H-5)，3.79(3H，s，OCH3)；13C-NMR(CD3COCD3， 125MHz)δ(ppm)：167.5(C-1)，152.1(C-4)，148.1(C-5)， 124.9(C-7)，122.9(C-2)，115.5(C-3)，113.5(C-6)，56.4 (OCH3)。 9 原儿茶醛 (protocatechuic aldehyde) 1H-NMR(CD3COCD3，500M Hz)δ(ppm)：9.67(s，1H)， 8.64(2H，br.s，OH)，7.24(1H，d，J＝1.84Hz，H-2)，7.22 (1H，dd，J＝8.03，1.86Hz，H-6)，6.87(1H，d，J＝8.01 Hz，H-5)。
10 丁香酸 (syringic acid) 1H-NMR(500MHz，CD3OD)δ(ppm)：7.20(2H，s，H-2，)， 3.76(6H，s，OCH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)： 167.5(COOH)，148.4(C-3，5)，141.6(C-4)，121.5(C-1)， 108.2(C-2，6)，56.7(OCH3)。 11 3，4-二羟基苯甲酸 乙酯 (3，4-Ethyl Hydroxybenzoate) 1H-NMR(MeOD，500MHz)δ(ppm)：7.37(1H，d，J＝2.0 HzH-2)，7.31(1H，dd，J＝2.0，8.3Hz，H-6)，6.76(1H，d， J＝8.3Hz，H-5)，4.13(2H，q，OCH2)，1.19(3H，t，-CH3)； 13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)：166.6(C＝O)，150.7 (C-4)，145.6(C-3)，123.3(C-1，6)，122.9(C-2，1)，117.2 (C-5)，115.7(C-2)，60.8(OCH2)，14.6(CH3)。 12 富马酸 (fumaric acid) 1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)：6.81(1H，d，J＝15.8 Hz，H-2)，6.48(1H，d，J＝15.8Hz，H-3)；13C-NMR(CD3OD， 125MHz)δ(ppm)：134.8(C-2，C-3)，166.1(C-1，C-4)。 13 丁二酸 (butanedioic acid) 1H-NMR(CD3OD，500MHz)δ(ppm)：2.5(4H，d，J＝15.8Hz， H-2，3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)：176.5(C-1， C-4)，30.1(C-2，C-3)。 14 5-羟甲基糠醛 (5-hydroxymethyfu rfural) 1H-NMR(MeOD，400MHz)δ(ppm)：11.16(1H，s，COOH)， 7.78(1H，d，J＝0.82Hz，H-3)，7.22(1H，dd，J＝3.32，0.36 Hz，H-5)，6.62(1H，dd，J＝3.33，1.73Hz，H-4)；13C-NMR (MeOD，125MHz)δ(ppm)：159.4(C-1′)，147.6(C-5)，145.9 (C-2)，118.6(C-3)，112.7(C-4)。 15 5-羟甲基糠酸 (5-hydroxymethyl furoic acid) 1H-NMR(CD3OD，500M Hz)δ(ppm)：7.06(1H，d，J＝3.42 Hz，H-3)，6.36(1H，d，J＝3.43Hz，H-4)，4.47(3H，s，H2)； 13C-NMR(CD3OD，125MHz)δ(ppm)：162.08(C-2′)，160.99 (C-2)，45.99(C-5)，120.28(C-3)，110.51(C-4)，57.8(C-5′)。 16 2-糠酸 (2-furoic acid) 1H-NMR(MeOD，400MHz)δ：11.16(1H，s，COOH)，7.78(1H， d，J＝0.82Hz，H-5)，7.22(1H，dd，J＝3.32，0.36Hz，H-3)， 6.62(1H，t，J＝3.33，1.73Hz，H-4)；13C-NMR(MeOD， 125MHz)δ：159.41(s，C-1′)，147.61(s，C-5)，145.96(s，C-2)， 118.62(s，C-4)，112.71(s，C-3)。 17 二氢-4 羟基-5-羟 甲基-2(3H)呋喃酮 (4-hydroxy-5-(hydr o-xymethyl)dihydro furan-2(3H)-one) 1H-NMR(MeOD，500MHz)δ：4.42(1H，m，5-H)；4.36(1H， t，J＝2.2Hz，J＝3.5Hz，4-H)；3.76(1H，dd，J＝12.4Hz，J＝3.3Hz 6-H)；3.68(1H，dd，J＝12.5Hz，J＝3.6Hz，6-H)；2.91(1H， dd，J＝18Hz，J＝6.8Hz，3-H)；2.37(1H，dd，J＝17.8Hz， J＝2.6Hz，3-H)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ：178.9(C-2)， 90.5(C-5)，69.9(C-4)，62.8(C-6)，39.4(C-3)。 18 7-hydroxy-2-oxoin dolin-3-ylacetic acid 1H-NMR(MeOD，500MHz)δ：6.76(1H，t，J＝7.67，H-5)； 6.72(1H，dd，J＝1.1，7.52Hz，H-4)；6.66(1H，dd，J＝7.69， 1.5Hz，H-6)；3.81(1H，dd，J＝3.45Hz，6.41Hz，H-3)； 2.75(1H，dd，J＝16.44，J＝3.46Hz，H-11)；2.66(1H，dd， J＝16.44，J＝6.57Hz，H-11)；13C-NMR(MeOD，125MHz)δ： 175.9(C-11)，172.0(C-2)，145.8(C-7)，126.8(C-8)，124.6(C-5)， 123.5(C-9)，121.0(C-4)，115.8(C-6)，44.0(C-3)，34.4(C-10)。 19 尿嘧啶 1H-NMR(DMSO d6，500MHz)δ：13.11(1H，s)，12.43(1H，
(uracil) s)，7.59(1H，d，J＝7.56Hz)，5.88(1H，d，J＝7.57Hz)。 13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)δ：165.9(C-4)，153.3(C-2)， 101.4(C-5)，142.2(C-6)。1H-NMR上的质子信号δH13.11(1H， s)，12.43(1H，s)为活泼质子的信号，δH 7.59(1H，d， J＝7.5H7)，5.40(1H，d，J＝7.5Hz)为烯质子信号。13C-NMR 谱显示4个碳信号：165.9，153.3，142.2，101.4分别归属 为不饱和酰胺、脲基和双键的碳信号。 20 内消旋肌醇 (mesoinositol) 13C-NMR(DMSO，400MHz)δC：74.3，72.4，72.2，71.1， 都是连氧碳，δC：72.4，71.1两个碳信号峰较高，说明它们 分别为两个碳信号，化合物应为六元环醇。 1H-NMR(DMSOO，400MHz)：δ4.52(1H，d，J＝3.72Hz) δ4.46(1H，d，J＝4.19Hz)，δ4.44(2H，d，J＝3.07Hz)，δ4.32(2H， d，J＝5.43Hz)，δ3.70(1H，d，J＝2.68Hz)，δ3.37(1H，dd， J＝2.68.9.34Hz)，δ3.11(2H，m)，2.90(1H，td，J＝9.1，4.07 Hz)从它们的偶合常数看，有一个氢处在e键，其它五个氢 都处于a键。 21 尿苷 (uridine) 1H-NMR(DMSO d6，400MHz)δ：7.98(1H，d，J＝8.1Hz， H-6)，5.89(1H，d，J＝4.6Hz，H-1′)，为糖端基氢信号，因 偶合常数为4.6，表明为α构型，5.69(1H，d，J＝8.1，H＝8.1Hz， H-5)，3.7～4.2，均为糖上的氢信号。13C-NMR(DMSO-d6. 400MHz)δ：166.5(C-4)，152.8(C-2)，143.0(C-6)，91.0(C-5)， 为尿嘧啶的碳信号，102.9为糖端基碳信号，另外的δ86.6， 76.0，71.6，62.6均为糖的碳信号，为五碳糖。 22 山萘酚3-O-芸香苷 (kaempferol-3-O- rutinoside) 1H-NMR(DMSO-d，500MHz)δ：12.56(5OH)，10.80(1H， br s，OH)，10.09(1H，br s，OH)，7.98(2H，d，J＝8.6Hz， IH-2′，6′)，6.87(2H，d，J＝8.6Hz，H-3′，5′)，6.41(1H，s， H-8)，6.20(1H，s，H-6)，5.31(1H，d，J＝7.3Hz，H-1″， of glucose)，4.38(1H，brs，H-rhamnose)，0.99(3H，d，J＝6.1Hz， rha-CH3)；13C-NMR(DMSO-d，125MHz)δ：177.3(C-4)， 164.1(C-7)，161.2(C-5)，159.8(C-4′)，156.8(C-9)，156.4(C-2)， 133.1(C-3)，130.8(C-2′，6′)，120.9(C-1′)，115.0(C-3′，5′)， 103.9(C-10)，101.3(C-1″)，100.7(C-1″′)，98.7(C-6)，93.7(C-8)， 76.3(C-3″)，75.7(C-5″)，74.1(C-2″)，71.8(C-4″′)，70.6(C-3″′)， 70.3(C-4″)，69.9(C-2″′)，68.2(C-5″′)，66.8(C-6″)，17.7(C-6″′)。 23 β-胡萝卜苷-6′-硬 脂酸酯 (β-sitosterylglucosi de-6′-octadecanoate ) 1H-NMR(CDCl3，500MHz)δ：0.65(3H，s，C 18-H)，0.80-0.98 (m，CH3)，1.25(bra，CH2)，1.47-2.00(CH2和CH)，2.34(2H， t，J＝7.5Hz，CH2COO)，3.36(1H，m，C3-H)，3.51-4.37(m， 糖上的氢)，5.34(1H，m，C6-H)。13C-NMR(CDCl3，125MHz) δ：174.2，140.4，122.1，101.3，79.8，76.2，73.8，73.4， 70.5，63.6，56.8，56.2，50.2，45.9，42.4，39.8，38.9，37.3， 36.7，36.2，34.3，33.9，31.9，31.9，29.7-29.8，29.5，29.34， 29.34，29.3，29.2，28.3，26.3，25.0，24.32，23.1，22.7， 21.1，19.8，19.05，18.80，14.10，11.98，11.87。 24 6，9-Dihydroxy-4，7- 1H-NMR(MeOD-d6，500MHz)δ：5.78(1H，s，H-5)，5.70(2H，
megastigmadien-3- onel m，H-6，7)，4.22(1H，dq，J＝6.4，4.4Hz，H-9)，2.41(1H， d，J＝16.8Hz，H-a)，2.06(1H，d，J＝16.9Hz，H-2β)，1.82 (1H，d，J＝1.2Hz，H-13)，1.14(3H，d，J＝6.5Hz，H-10)， 0.94(3H，s，H-11)，0.91(3H，s，H-12)。13C-NMR δ：201.5(C-3)， 167.7(C-5)，137.3(C-7)，130.4(C-7)，130.3(C-8)，127.4(C-4)， 80.3(C-6)，69.0(C-9)，51.1(C-2)，42.7(C-1)，24.8(C-12)， 24.1(C-11)，23.8(C-4)，19.8(C-13)。 25 spionoside B 1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：6.26(1H，d，J＝15.26Hz， H-7)，5.94(1H，dd，J＝15.25，6.11Hz，H-8)，4.75(OH)， 4.48(1H，dq，J＝6.27，6.36Hz，H-9)，4.14(1H，d，J＝7.64 Hz，H-1′)，3.75(2H，dd，J＝7.32，2.49Hz，H-11a)，3.49(1H， d，J＝7.39Hz，H-11b)，3.63(1H，m，H-6′a)，3.38(1H，m， H-6′b)，2.9～3.1(4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.27(d，J＝17.47 Hz，H-4a)，2.71(d，J＝17.2Hz，H-4b)，2.67(dd，J＝16.78， 1.54Hz，H-2a)，2.22(d，J＝17.59Hz，H-2b)，1.22(d，J＝6.49 Hz，H-10)，1.07(3H，s，H-13)，0.85(3H，s，H-12)。 13C-NMR(DMSO，125MHz)δ：208.1(C-3)，134.9(C-8)， 127.6(C-7)，99.8(C-1′)，85.6(C-5)，80.8(C-6)，77.1(C-5′)， 76.9(C-3′)，76.5(C-11)，73.4(C-2′)，71.7(C-9)，70.2(C-4′)， 61.1(C-6′)，52.9(C-4)，47.7(C-1)，51.8(C-2)，22.2(C-10)， 15.2(C-12)，18.9(C-13)。 26 白花菜苷 (glucocaapperin) 1H-NMR(DMSO d6，500MHz)δ：5.47(1H，d，J＝5.86Hz， H-8)，5.11(1H，d，J＝4.77Hz，H-8)，5.02(1H，d，J＝5.25 Hz，H-8)，4.75(1H，d，J＝9.79Hz，H-8)，4.72(1H，t， J＝5.56Hz，H-8)，3.68(1H，dd，J＝11.16，5.29Hz，H-8)， 3.19(1H，m，H-8)，3.17(1H，d，J＝4.98Hz，H-8)，3.063.17(2H， m，H-8)，2.23(3H，s，H)。13C-NMR(DMSO，125MHz)δ： 154.2(C-1)，82.0(C-1′)，81.1(C-5′)，78.1(C-2′)，72.8(C-3′)， 70.0(C-4′)，61.1(C-6′)，18.2(C-2)。 27 β-谷甾醇 (β-sitosterol) 略 28 β-胡萝卜苷 (daucosterol) 略 29 芦丁(rutin) 略 30 1H-indole-3-carbal- dehyde 1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δ：7.09～7.15(2H，overlap， 5，6-H)，7.41(1H，d，J＝7.7Hz，7-H)，8.05(1H，d，J＝2.9 Hz-H)，8.09(1H，d，J＝7.3Hz，4-H)，9.94(1H，s，10-H)， 11.02(1H，bar，N-H)；13C-NMR(DMSO-d6，125MHz)8： 111.6(C-7)，118.7(C-3)，120.8(C-9)，121.6(C-4)，123.1(C-5)， 124.1(C-6)，136.6(C-2)，136.9(C-8)，183.9(C-10)。
本发明的另一目的是提供刺山柑提取物所述的1、2和3提取物在制备治疗风湿性 关节炎、类风湿性炎、肩周炎药物中的应用。
通过本发明方法得到的刺山柑提取物，经药效实验证明具有良好的镇痛、抗炎活性。 可用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、痛风及肩周炎疾病。并经急性毒性试验证 明，该提取物毒性很低。
本发明的提取物1、提取物2和提取物3均具有较好的抗炎、镇痛活性，抗炎 活性的强弱顺序为提取物2＞提取物3＞提取物1；中枢性镇痛活性的强弱顺序为 提取物2≥提取物1＞提取物3，而外周性镇痛活性的强弱顺序为提取物3≥提取 物1＞提取物2。
本发明的刺山柑提取物可与药用辅料制成片剂、胶囊剂、膏剂(巴布剂)、涂膜剂、 喷剂等。
附图说明
图1.刺山柑果实不同提取部位对小鼠痛阈提高百分率
横坐标：痛阈提高百分率(％)
竖坐标：时间(分钟)
具体实施方式
实施例1：取刺山柑干燥果实，粉碎，称取11.5kg，用95％乙醇加热回流提取3次， 每次3h，第一次7倍量95％乙醇，后两次均为5倍量溶剂。合并回流液，减压回收温 度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)至浓浸膏(比重为1.1～1.4)，冷冻干燥，得粗提取 物干膏(2.40kg)。
粗提物用水(1～4倍)分散溶解后用石油醚(1～4倍)萃取2～3次，减压浓缩(温 度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)，冷冻干燥，得石油醚提取物(100g)。然后用 乙酸乙酯(1～4倍)萃取，经减压浓缩(温度30～60℃，压力0.08～-0.1MPa)后再经 冷冻干燥后，分别制成乙酸乙酯提取物2(60g)和水溶性活性部位提取物3(1.81kg)。
实施例2：取刺山柑干燥果实，粉碎，称取11.5kg，用85％乙醇加热回流提取3次， 每次3h，第一次7倍量85％乙醇，后两次均为5倍量溶剂。合并回流液，减压回收温 度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)至浓浸膏(比重为1.1～1.4)，冷冻干燥，得粗提取 物干膏(2.45kg)。
粗提物用水(1～4倍)分散溶解后用石油醚(1～4倍)萃取2～3次，减压浓缩(温 度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)，冷冻干燥，得石油醚提取物(103g)。然后用 乙酸乙酯(1～4倍)萃取，经减压浓缩(温度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)后再经 冷冻干燥后，分别制成乙酸乙酯提取物(64g)和水溶性活性部位提取物(1.9kg)。
上述粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑碱A (Capparisine A)等30种化学成分。
实施例3：取刺山柑干燥果实，粉碎，称取11.5kg，用80％乙醇加热回流提取3次， 每次3h，第一次7倍量80％乙醇，后两次均为5倍量溶剂。合并回流液，减压回收温 度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)至浓浸膏(比重为1.1～1.4)，冷冻干燥，得粗提取 物干膏(2.5kg)。
粗提物用水(1～4倍)分散溶解后用石油醚(1～4倍)萃取2～3次，减压浓缩(温 度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)，冷冻干燥，得石油醚提取物(106g)。然后用 乙酸乙酯(1～4倍)萃取，经减压浓缩(温度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)后再经 冷冻干燥后，分别制成乙酸乙酯提取物(66g)和水溶性活性部位提取物(1.87kg)。 上述粗提物，乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑碱A (Capparisine A)等30种化学成分。
实施例4：取刺山柑干燥果实，粉碎，称取11.5kg，用60％乙醇加热回流提取3次， 每次3h，第一次7倍量60％乙醇，后两次均为5倍量溶剂。合并回流液，减压回收(温 度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)至浓浸膏(比重为1.1～1.4)，冷冻干燥，得粗提取 物干膏(2.6kg)。
粗提物用水(1～4倍)分散溶解后石油醚(1～4倍)萃取2～3次，减压浓缩(温度 50～80℃，压力0.08～0.1MPa)，冷冻干燥，得石油醚提取物(113g)。然后用乙酸 乙酯(1～4倍)萃取，经减压浓缩(温度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)后再经冷冻 干燥后，分别制成乙酸乙酯提取物(69g)和水溶性活性部位提取物(1.96kg)。上述 粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑碱A(Capparisine A) 等30种化学成分。
实施例5：取刺山柑干燥果实，粉碎，称取11.5kg，用水加热煎煮提取3次，每次 3h，第一次7倍量水，后两次均为5倍量溶剂。过滤后合并煎煮液，减压(温度50～ 80℃，压力0.08～0.1MPa)浓缩至浓浸膏(比重1.1-1.2)，加入乙醇使含醇量达到65％ 以上，静置冷藏12h，过滤，滤液减压(温度50～80℃，压力0.08～0.1MPa)浓缩到 稠膏(比重1.3-1.4)，冷冻干燥，得粗提物干膏(2.8kg)。
粗提物用水(1～4倍)分散溶解后用石油醚(1～4倍)萃取2～3次，减压浓缩(温度 30～60℃，压力0.08～0.1MPa)，冷冻干燥，得石油醚提取物(117g)。然后用乙酸 乙酯(1～4倍)萃取，经减压浓缩(温度30～60℃，压力0.08～0.1MPa)后再经冷冻干 燥后，分别制成乙酸乙酯提取物(70g)和水溶性活性部位提取物(2.20kg)。
上述粗提物、乙酸乙酯提取物和水溶性活性部位提取物含有所述刺山柑碱A (Capparisine A)等30种化学成分。
实施例6乙酸乙酯提取物2(60g)经硅胶(200～300目)柱分离，以二氯甲烷-丙酮 (100∶0～5∶1)，再用二氯甲烷-丙酮(20∶1～0∶100)依次冲洗，将分得的样品经 合并后得到10个部分A1～10。将A2，A3，A4和A5采用拌样法上硅胶(200～300目) 柱，石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脱，分别分离得到化合物6，7，8，9。A6部分采用拌 样法上硅胶(200～300目)柱，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脱，再经反复柱层析和 重结晶，得到化合物10，11，12，13，14，17，18和19。另外，A7部分采用硅胶柱层 析，以二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脱，再经反复柱层析得到化合物22，23和25。A7部分 采用硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇(10∶1)洗脱，再经反复柱层析得到化合物17，28， 29。
水溶性提取物3(100g)上C-18反相柱，以甲醇-水(0∶1，1∶3，1.5∶1，和95∶ 5)洗脱，分别得到B1～4个部分，其中B2再经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20，ODS 柱色谱分离纯化，得到化合物15，14，16，20，21，26。B3经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20， ODS柱色谱分离纯化，得到化合物24，1，2，3，4，5。
实施例7本发明涉及的刺山柑提取物的药效实验结果如下：
供试品溶液的制备：分别取实施例2中所列各提取物适量，用水配制成高低两个剂 量的药液备用，所本配浓度分别如下：提取物1高剂量(CT-H)(0.131g/ml)，提取物1低剂 量(CT-L)(0.066g/ml)；提取物2高剂量(CE-H)(0.0043g/ml)，提取物2低剂量(CE-L)(0.002 g/ml)；提取物3高剂量(CW-H)(0.122g/ml)，提取物3低剂量(CW-L)(0.060g/ml)；石油醚 提取物高剂量(CP-H)(0.0076g/ml)，石油醚提取物低剂量(CP-L)(0.0037g/ml)。溶解时， 提取物2(CE)和石油醚提取物(CP)采用1％的吐温-80水溶液溶解，其余均用NS溶解。
称取阿斯匹林(ASP)1.0g于250ml的容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容至刻度，配成 浓度为0.004g/ml的溶液，作为阳性对照药。
给药剂量经急性毒性实验测定刺山柑乙醇总提取物1的半数致死量(LD50)为154.3 g/kg(当于原药材)。乙醇总提取物1按LD50的1/10和1/20给药，其余各部均按所占浸膏的 比例计算其给药量。
抗炎实验(一)：二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验
取雄性小鼠100只，体重25±2g，称重标记后随机分为10组，分别为按高、低2个剂 量分为CT-H和CT-L、CE-H和CE-L、CP-H和CP-L、CW-H和CW-L实验组及空白对照组 (NS)和阳性对照组(ASP)。各实验组分别按CT-H 3.280g/kg、CT-L 1.640g/kg、CE-H 0.108 g/kg、CE-L 0.054g/kg、CW-H 0.190g/kg、CW-L 0.095g/kg、CP-H 3.000g/kg、CP-L 1.500 g/kg剂量灌胃给药(0.2ml/10g体重)，阳性对照组给予ASP 0.080g/kg，空白对照组给予 相同体积的NS。每d1次，连续给药7d。分别于末次给药1h后，将30μl二甲苯均匀涂布 于小鼠右耳，左耳不涂作为对照。致炎20min后，脱颈椎处死小鼠，剪下左右两耳片， 用直径8mm的打孔器冲下左右耳廓，分别在电子天平上称重，左右耳片重量之差为肿胀 度，计算各实验肿胀抑制率(％)＝[(致炎耳片重-未致炎耳片重)/未致炎耳片重]×100％。 结果见表1。
刺山柑不同提取部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响，如表1所示。经t检验分析可 以看出，阳性对照药ASP、乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提取物3)与空白 对照NS组相比，对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抑制率的差异具有统计学意义(p＜0.05或 p＜0.01)，石油醚部位和乙醇总提物(提取物1)也表现出一定的抑制作用(p＜0.05)。其 中乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提取物3)两组与ASP组的抑制效果无显著 差异(p＞0.05)。
表1刺山柑不同提取部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(Mean±s)
注：*与NS组比较(P＜0.05)；**与NS组比较(P＜0.01)；a与ASP组比较(P＞0.05)。
抗炎实验(二)：小鼠腹腔毛细血管通透性的实验
取小鼠100只，体重20±2g，雌雄各半，称重标记后随机分为10组，每组10只。实 验分组及给药剂量和方法与二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验相同。分别于末次给药1h后， 尾静脉注射0.5％伊文思兰0.1ml/10g，立即腹腔注射0.6％醋酸溶液0.3ml/只，20min后， 脱颈椎处死小鼠，剪开腹腔，用5ml NS冲洗腹腔数次，收集洗涤液于5ml量瓶中，用 NS定至刻度，3000r/min离心5min，以NS为空白，用752型分光光度计于608nm波长处 测定上清液的吸收度(OD值)，记录结果，按下式计算毛细血管通透性抑制率。毛细血 管通透性抑制率(％)＝[(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值]×100％，结 果见表2。
刺山柑不同提取部位对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响，如表2所示。经t检验分析 可见，刺山柑果实乙醇提取物的乙酸乙酯部位(提取物2)高剂量组和阳性对照ASP组 对小鼠腹腔毛细血管通透性的抑制作用与空白对照NS组比较有显著性差异(P＜0.05)。而 且，乙酸乙酯部位(提取物2)高剂量组与阳性对照药ASP组比较无显著性差异(p＞0.05)。
表2刺山柑不同提取部位对小鼠毛细管通透性的影响(Mean±s)
注：*与NS组比较(P＜0.05)；a与ASP组比较(P＞0.05)。
镇痛实验(一)：热板法实验
取雌性小鼠若干，于正式实验前先逐只用YLS-6B智能热板仪(温度调至55±0.5℃) 进行筛选。筛选时每次取小鼠1只，记录小鼠足底接触热板至舔后足所需时间(s，热板 反应潜伏期)作为痛阈指标(共测定2次，求出2次测定的平均值)，先剔除反应潜伏期大于 30s的或小于5s的反应迟钝或过敏的小鼠。将筛选合格的动物(由150只小鼠筛选出合格 动物100只)随机分为10组，每组10只，体重20±2g，称重后标记。实验分组及给药剂量 和方法与二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验相同。分别于末次给药后30、60、90、120min按 上述基础痛阈值测定法分别测定痛阈值，如痛阈超过60s，即停止测试而按60s计，以 免烫伤足部。并按下式计算其痛阈提高百分率。痛阈提高百分率(％)＝[(给药后平均痛 阈值-给药前平均痛阈值)/给药前平均痛阈值]×100％。结果见表3和图1。
刺山柑不同提取部位对小鼠热板法镇痛实验痛阈的影响，如表3和图1所示。以痛阈 提高百分率大于50％时有镇痛效力来说，乙醇总提物(提取物1)、乙酸乙酯部位(提 取物2)和石油醚部位的高、低剂量组均能明显提高小鼠热板法实验的痛阈(痛阈提高百 分率＞50％)，并且随着作用时间的延长，镇痛作用有增强的趋势，表现出较好的镇痛效 果。而水溶性部位(提取物3)的痛阈提高百分率虽然也大于50％，但相比之下作用较 其它部位弱。
表3刺山柑不同部位对不同时间段小鼠痛阈及痛阈提高率的影响(Mean±s)
注：括号内数字为痛阈提高百分率(％)
镇痛实验(二)：醋酸扭体法实验
取小鼠100只，体重18～22g，雌雄各半，称重标记后随机分为10组，每组10只。实 验分组及给药剂量和方法与二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验相同。分别于末次给药后1h， 腹腔注射0.6％醋酸溶液0.1ml/10g(醋酸溶液临用前配制)。5min后观察并记录15min内 出现扭体反应(腹部收缩内凹，伸展后肢，臀部抬高，蠕行)的次数，按下式计算扭体反 应抑制率。扭体反应抑制率(％)＝[(对照组平均扭体次数-给药组平均扭体次数)/对照 组平均扭体次数]×100％。结果见表4。
刺山柑不同提取部位对醋酸扭体反应的镇痛实验的影响，如表4所示。从表4可以看 出，乙醇总提物(提取物1)、石油醚部位、乙酸乙酯部位(提取物2)和水溶性部位(提 取物3)均可以明显减少醋酸注入腹腔内引起的脏层和壁层腹膜较大面积较长时间的炎 性疼痛，其中乙醇总提物(提取物1)的高剂量组和水溶性部位的高剂量组的镇痛效果 最好。
表4刺山柑不同部位对醋酸致小鼠扭体反应的影响(Mean±s)
注：*与NS组比较(P＜0.05)