本申请要求2006年10月24日提交的美国临时申请顺序 号60/854,312和2007年4月23日提交的美国临时申请顺序号 60/925,914的优先权，其全部内容通过引用结合到本文中。
背景
健康的骨连续地进行重建过程，其中通过活性骨细胞，即 形成骨的成骨细胞和再吸收骨的破骨细胞的协调作用，在骨再吸收和 骨形成之间达到平衡。骨的重建过程开始于覆盖未矿化的骨的细胞即 衬细胞的活化。衬细胞再吸收未矿化的骨，然后回缩并为再吸收旧的、 矿化的骨的破骨细胞留出空间，并创造吸引成骨细胞至相同位置的环 境。然后成骨细胞沉降有机基质，该有机基质随后矿化以形成新骨。 因此骨量(bone mass)取决于破骨细胞的骨再吸收与成骨细胞的骨形成 之间的平衡。
骨中矿物质的量主要负责其硬度，而如结构蛋白胶原的物 质也促成骨的机械强度。致密的最外面的骨称为骨皮质，而更具多孔 性的内部形式称为骨松质或骨小梁。
大多数骨疾病归因于骨重建过程的平衡的受破环。一般 地，该破裂为骨再吸收的增加。例如，骨质疏松症，最常见骨疾病中 的一种，其特征为：伴随骨显微结构变化的骨量下降，但对引起骨折 易感性增加的骨本身的化学成分没有影响。具体地说，骨皮质变薄且 多孔，同时骨小梁变薄、穿孔、和分离。骨质疏松症可认为是骨重建 循环中负平衡的结果，即形成的骨少于再吸收的骨。
因此，用于治疗骨病症的治疗剂针对抑制骨再吸收和增加 骨形成。骨的重建过程涉及许多不同的分子和途径，当前可用的各种 治疗剂靶向不同的分子和途径。例如，双膦酸盐(如阿仑膦酸盐和利塞 膦酸盐)通过阻断破骨细胞的活性而抑制骨再吸收。其它治疗剂设法通 过阻断与TNF受体/配体家族的成员的结合来抑制骨再吸收，所述成 员例如作为活化破骨细胞的细胞因子的细胞核因子κB受体激活蛋白 配体(Receptor Activator for Nuclear Factor κB Ligand)(RANK-L)，而破 骨细胞是与骨再吸收有关的细胞。抑制RANK-L的释放可防止骨矿物 质流失。
还有其它治疗剂以增加骨形成为目标。例如，已知激活的 骨形态发生蛋白基因对引发成骨细胞分化和促进骨形成有直接作用。 业已显示重组骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的释放诱导骨或软骨的形 成。然而，药物制剂和生物制剂，例如重组BMP-2的全身用药，可对 肠和其它组织产生有害作用。因此，在本领域中需要可用于食物增补 剂介入以通过抑制骨再吸收和/或增加骨形成来预防和/或治疗骨病症 的天然的和植物来源的提取物。
概述
本发明基于以下发现：各种天然的和植物来源的提取物的 新组合可以(1)通过抑制、减少、或预防RANK-L的表达和/或释放， 和/或通过预防钙从骨释放而抑制骨再吸收；(2)通过增加或刺激 BMP-2的基因和/或蛋白表达而增加骨生长；和(3)改善或维持骨强度。
在一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组 合物，该组合物包含天然的、植物来源的提取物，该提取物包括以下 中的至少两种的组合：二水合槲皮素、脱水槲皮素、地黄(Rehmannia sp.) 提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参(Siberian ginseng) 提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophorajaponica) 提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2的基因或 蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提 取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的组合，其中该组 合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、 约100-800mg的西伯利亚人参提取物、和约10-500mg的甘草提取物 的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
在又一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、 和约10-500mg的甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因 或蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含约10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素、 和约100-800mg的西伯利亚人参提取物的组合，其中该组合增加 BMP-2的基因或蛋白表达。
在又一个实施方案中，本发明为在受试者中增加或刺激骨 生长的方法，该方法包括将包含以下中的至少两种的组合的组合物给 予该受试者：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取 物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加受试者 中的BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的又一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素 或二水合槲皮素、约100-800mg的西伯利亚人参提取物、和约10-500 mg的甘草提取物的组合的组合物，其中该组合增加受试者中的 BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的另一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素 或二水合槲皮素、和约10-500mg的甘草提取物的组合的组合物，其 中该组合增加受试者中BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的另一个实施方案为在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-1000mg的脱水槲皮素 或二水合槲皮素、和约10-800mg的西伯利亚人参提取物的组合的组 合物，其中该组合增加受试者中BMP-2的基因或蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明可为用于抑制、减少、或预 防骨再吸收的组合物，该组合物包含与以下中的一种或多种组合的石 榴提取物、安石榴甙(punicalagin)、或两者：二水合槲皮素、脱水槲皮 素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯 利亚人参提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中石榴提取物、安石 榴甙、或两者抑制RANK-L的表达、产生和/或释放。
在一个实施方案中，本发明的组合物和方法使用含有称为 安石榴甙的化合物的石榴(Punica granatum)果实和果皮提取物，以抑 制或减少骨再吸收。本发明使用的石榴提取物，例如包含安石榴甙的 石榴提取物，可以在用于抑制、减少、或预防骨再吸收的组合物和方 法中使用，其中该石榴提取物抑制、减少或预防RANK-L的表达、产 生、和/或释放。因此，在一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、 或预防骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、至少一种安石 榴甙、或两者。备选地，本发明考虑抑制、减少、或预防骨再吸收的 方法，该方法包括给予包含石榴提取物、至少一种安石榴甙、或两者 的组合物，其中该组合物抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放中 的一个。
在还另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预 防骨再吸收的组合物，该组合物包含天然的、植物来源的提取物，该 提取物包括以下中的至少两种的组合：优选包含安石榴甙的石榴提取 物、橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、 绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannua sp.)提取物、 葡萄籽提取物、当归(Dong Quai)提取物、和依普黄酮，其中该组合抑 制RANK-L的表达、产生、和/或释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普 黄酮、和绿茶提取物的组合，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、 和/或释放。
在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含约10-2000mg的石榴提取物、约 35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮的组合，其 中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。
在还另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预 防骨再吸收的组合物，该组合物包含约10-2000mg的石榴提取物、约 35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依普黄酮，其中该组 合物抑制钙从骨释放。
本发明的另一个实施方案为在受试者中抑制、减少、或预 防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含天然的、植物来源 的提取物的组合物，该提取物包括以下提取物中的至少两种：石榴提 取物、橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、 绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、 葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L 的表达、产生、和/或释放。
在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、 或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含石榴提取物、 葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物的组合的组合物，其中该组 合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放。
在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、 或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-2000mg 的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依 普黄酮的组合的组合物，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和 /或释放。
在还另一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、 或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含约10-2000mg 的石榴提取物、约35-250mg的葡萄籽提取物、和约400-700mg的依 普黄酮的组合的组合物，其中该组合抑制钙从骨释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长和 抑制、减少、或预防骨再吸收的食物增补疗法，该疗法包括第一组合 物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两种的组合：二水 合槲皮素、脱水槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘 草提取物、和依普黄酮，其中该第一组合物的组合增加BMP-2的表达 和/或活性；该第二组合物包含以下中的至少两种的组合：石榴提取物、 橄榄提取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶 提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡 萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该第二组合物的组合抑 制RANK-L的表达。
详述
应理解：本发明不限于本文描述的具体组合物、方法、或 方案。此外，除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如 本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。还应理解的 是，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，不意欲限制本 发明的范围，本发明的范围将仅由权利要求书限定。
本发明基于令人意想不到的发现：下文更充分描述的包括 以下中的两种或多种的成分的独特组合通过增加或刺激BMP-2的启 动子、基因、和/或蛋白质的表达和/或活性而增加骨生长，或者通过 抑制、减少、或预防RANK-L的表达、产生、或释放，或通过抑制、 减少、或预防钙从骨的释放而抑制骨再吸收：脱水槲皮素、二水合槲 皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西 伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普 黄酮提取物、石榴提取物、橄榄提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、 绿茶提取物、葡萄籽提取物、和当归提取物。
BMP-2是骨形态发生蛋白家族的成员，骨形态发生蛋白是 扩展的转化生长因子B超家族中的新因子。当局部注入大鼠的皮下组 织时，重组BMP-2和BMP-4可以诱导新骨形成(Wozney J. Molec(1992)32：160-67)。BMP-2和BMP-4随着正常的成骨细胞的分 化而被表达，其已显示在体外刺激成骨细胞分化和骨小结(bone nodule) 形成以及在体内刺激骨形成。因此，通过增加或刺激BMP-2的启动子 活性、基因表达、和/或蛋白表达，本发明的独特组合物用于增加或刺 激骨生长和治疗或预防各种骨病症。
肿瘤坏死因子(TNF)家族成员RANK-L，即细胞核因子 (NF)-κB受体激活蛋白配体(也作为：护骨蛋白配体，OPGL)，是成熟 破骨细胞形成的主要刺激因子，对其生存必不可少，破骨细胞是帮助 骨再吸收的骨细胞。RANK-L由成骨细胞的谱系细胞(osteoblastic lineage cell)和活化的T淋巴细胞产生。它激活位于破骨细胞和树突状 细胞上的特异性受体RANK。本发明制剂的一种策略为当用IL-1刺激 时直接抑制RANK-L表达。当用IL-1刺激时，RANK-L的激活可以 直接触发破骨细胞形成(从而触发骨再吸收)。因此，通过抑制、减少、 或预防RANK-L表达、产生、或释放，本发明的独特组合物用于抑制、 减少、或预防骨再吸收和治疗或预防包括骨丢失、骨质疏松症、溶骨 等各种骨病症。
槲皮素，涉及槲皮素提取物和各种形式的槲皮素，例如二 水合槲皮素、脱水槲皮素等，是用于本发明的独特组合物中的一种化 合物。槲皮素是形成许多其它类黄酮，包括柑橘类黄酮芸香苷、橙皮 苷、柚皮苷和柑桔黄酮的″骨架″的类黄酮。在研究中发现槲皮素是最 具活性的类黄酮，许多药用植物的大部分活性归因于其高槲皮素含 量。槲皮素因为对炎症的几个初始过程的直接抑制已显示出显著的抗 炎活性。例如，它同时抑制组胺和其它过敏性/炎性介体的产生和释放。 此外，它产生有效的抗氧化剂活性和节省维生素C的作用。
槲皮素也在对抗或帮助预防癌症、前列腺炎、心脏病、白 内障、变态反应、炎症、和呼吸系统疾病例如支气管炎和哮喘有积极 的作用。此外，依照美国专利第5,478,579号，当按50-1500mg/天的 量使用时，脱水槲皮素和/或二水合槲皮素可以增强钙进入骨组织的吸 收。
富含槲皮素的食物包括苹果、红茶和绿茶、洋葱、覆盆子、 红酒、红葡萄、柑橘类水果、青花椰菜、蚕豆、其它多叶青菜、和樱 桃。
如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：槲皮素是 BMP-2启动子活性和蛋白表达的有效激活剂。此外，下文论述的试验 结果表明：当将二水合槲皮素与西伯利亚人参、甘草、或两者联合给 药时，达到意想不到的协同作用，引起超过任何成分所单独能达到的 BMP-2启动子活性和蛋白表达。
用于本发明的槲皮素成分可市购自各种来源，包括例如 Twinlab(American Fork，Utah)、Jarrow Formulas(Los Angeles， California)、Natural Factors(Coquitlam，British Columbia，Canada)、 和NOW Foods(Bloomingdale，Illinois)。此外，槲皮素可由下文更充 分讨论的、或在本领域中描述的或已知的任何提取方法来获得。
地黄(Rehmannia)，用于本发明的独特组合物中的另一植 物，是中国特有的唇形目(Lamiales)中六个种的有花植物的属。在中文 称为dihuang(地黄)，该草药用于许多种疾病例如贫血、眩晕和便秘。 地黄(Rehmannia)包含维生素A、B、C、和D，以及其它有用的化合 物。
地黄(Rehmannia sp.)提取物即地黄(Rehmannia sp.)的提取 物包括地黄(Rehmannia sp.)根提取物即地黄(Rehmannia sp.)根的提取 物，可购自各种来源，包括EUL Herb Manufacturing(La Verne， California)和NuPharma Neutraceuticals(Miami Beach，Florida)。此外， 地黄(Rehmannia sp.)提取物可由下文更充分讨论的、或在本领域中描 述的或已知的任何提取方法来获得。
西伯利亚人参，用于本发明的独特组合物的化合物中的一 种，也称为刺五加(Eleutherococcus senticosus)，是原产于东北亚的五 加科(Araliaceae)中的一类小的、木质灌木。西伯利亚人参是具有许多 健康益处的有效滋补药草。例如，西伯利亚人参具有抗乳(乳腺)癌、 胃癌、口腔癌、皮肤黑素瘤和卵巢癌的免疫保护性作用。发现它对T 淋巴细胞，主要是辅助型/诱导型T淋巴细胞有显著影响，而且还对细 胞毒细胞和自然杀伤细胞有显著影响。此外，已知西伯利亚人参具有 抗骨质疏松症的保护作用。见，例如，Kropotov等，″西伯利亚人参 提取物和依普黄酮对糖皮质激素诱导的骨质疏松症发展的作用 ″(“Effects of Siberian ginseng extract and ipriflavone on the development of glucocorticoid-induced osteoporosis.”)Bull Exp Biol Med.， 2002.133(3)：252-4。
如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：西伯利亚 人参的提取物(即西伯利亚人参提取物)是BMP-2的启动子活性、 BMP-2的基因表达和BMP-2的蛋白表达的有效激活剂。此外，下文 论述的试验结果表明，当将西伯利亚人参提取物与二水合槲皮素联合 给药时，这样的组合获得意想不到的协同作用，引起超过任一成分所 单独达到的BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达。
西伯利亚人参提取物可购自多个供应商例如Xi′an Tianxingjian Natural Bio-products Group(Xi′an，Shaanxi，China)。此外， 西伯利亚人参(Rehmannia ginseng)提取物可使用下文更充分讨论的、 或在本领域中描述的或已知的任何提取技术获得。在一个实例中，西 伯利亚人参提取物可作为西伯利亚人参根和/或根茎的醇提取液而获 得。
槐(Sophora japonica)、或槐角(Sophora fructus japonica)， 用于本发明的独特组合物中的另一种化合物，也称为Pagoda Tree，原 产于东亚。芸香苷，可在槐(Sophora japonica)提取物中找到的活性化 合物，可用于增加毛细血管的通透性(例如，扩张的再溶解和多孔性)。 除芸香苷之外，可从自槐(Sophora japonica)植物，包括叶、茎、花、 种子、根等中提取脱水槲皮素和二水合槲皮素。
如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：槐 (Sophora japonica)的提取物(即槐(Sophora japonica)提取物)是BMP-2 的启动子活性、基因表达和蛋白表达的有效激活剂。
槐(Sophora japonica)提取物可购自各种供应商例如 NuPharma Nutraceuticals(Miami Beach，Florida)。此外，槐(Sophora japonica)提取物可使用下文更充分讨论的、或在本领域中描述的或已 知的任何提取技术获得。在一个实施方案中，可使用槐(Sophora japonica)的成熟种子来获得用于本发明的槐(Sophora japonica)提取 物。
用于本发明的独特组合物的甘草提取物，一般广泛地用于 治疗支气管问题例如卡他、支气管炎和咳嗽。甘草也在控制消化性溃 疡生成、胃炎和溃疡中形成重要的成分。依照日本专利2002179585 和美国专利20020009506，当按50-100mg/日给药时，甘草可以用于 治疗骨质疏松症、改善骨代谢、和促进钙化。
如下文更充分地论述，本发明部分地基于发现：甘草提取 物(即甘草的提取物)，例如甘草的乙醇提取物和乙醇-水提取物，是 BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达的有效激活剂。此外，下 文讨论的分析结果表明：当将甘草提取物与二水合槲皮素联合给药 时，这样的组合达到意想不到的协同作用，引起超过任一成分所单独 达到的BMP-2的启动子活性、基因表达和蛋白表达。
甘草提取物可购自多个供应商例如Herbs Forever，Inc.(Los Angeles，California)。此外，甘草提取物可使用下文更充分讨论的或 在本领域中已知的任何提取技术获得。在一个实施方案中，甘草提取 物可以是得自洋甘草(Glycyrrhiza glabra)的根、长匐茎、和/或根茎的 甘草的乙醇提取物。
依普黄酮，用于本发明的独特组合物中的另一化合物是异 黄酮。虽然可在豆科植物例如苜蓿中发现少量的依普黄酮，但是依普 黄酮一般使用多酚类作为起始材料，合成制备为7-异丙氧基异黄酮。
如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：依普黄 酮是RANK-L表达的有效抑制剂。依普黄酮可购自各种来源。例如， 是得自Technical Sourcing International，Inc.(Missoula， Montana)的合成的依普黄酮化合物。
可以提取石榴，以产生用于本发明的独特组合物的石榴提 取物(石榴提取物)。当提取时，石榴，称为Punica granatum，一般被 标准化为鞣花酸或安石榴甙含量。安石榴甙以2，3，六羟基二苯甲酰基- 没食子酸基-D-葡萄糖的异构体存在。例示性结构显示如下：
石榴提取物还可富含多酚类，例如可水解的鞣质，特别是 安石榴甙，安石榴甙可为造成石榴汁的自由基清除能力的原因。
在日本，石榴已被用于抑制骨量减少。见日本专利1999 0049884。本发明部分基于发现：石榴提取物是RANK-L表达、产生、 或释放的有效抑制剂。在一个实例中，于石榴提取物中存在的安石榴 甙抑制或减少RANK-L的表达。因此，包含安石榴甙、鞣花酸或两者 的石榴提取物在用于抑制、减少、或预防RANK-L的产生、释放、和 /或表达的组合物和方法中使用。
石榴提取物可购自各种来源，包括Nature′s Way (Springville，Utah)、Nature′s Herbs(AmericanFork，Utah)，Swansen′s Health Products(Fargo，North Dakota)和Doctor′s Trust Vitamins (Orlando，Florida)。此外，石榴提取物可使用下文更充分讨论的或在 本领域中已知的任何提取技术获得。
银杏(Ginkgo biloba)的提取物(即银杏(Ginkgo biloba)提取 物)，用于本发明的独特组合物的另一提取物，已知具有三种作用：(1) 改善血液流到大多数组织和器官(包括小毛细血管中的微循环)；(2)防 止自由基损害氧化细胞(抗氧化剂)；和(3)阻断血小板聚集和血液凝固 的作用。
银杏(Ginkgo biloba)提取物可购自各种来源，包括Puritan′s Pride(Long Island，New York)。此外，银杏(Ginkgo biloba)提取物可使 用本文公开的或在本领域中已知的任何提取方法获得。例如，银杏 (Ginkgo biloba)提取物可使用本文公开的或在本领域中已知的任何提 取方法提取银杏(Ginkgo biloba)的干燥或新鲜叶子、或种子获得。
绿茶，可经提取以产生用于本发明的独特组合物中的一种 化合物，一直就被中国人用作药物来治疗头痛、身体疼痛、消化不良、 促进健康和延年益寿。绿茶提取物富含生物类黄酮，包括抗氧化剂表 没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。绿茶提取物中的EGCG防止消化 道和呼吸道感染，阻断致癌物质的作用，可以起抗菌剂的作用，也可 以帮助降低胆固醇含量。
如下文所更充分地讨论，本发明部分地基于发现：绿茶提 取物(或绿茶的提取物)是RANK-L表达的有效抑制剂。绿茶提取物可 购自各种来源，包括Life Extension(Fort Lauderdale，Florida)。此外， 绿茶提取物可使用下文更充分讨论的或在本领域中已知的任何提取 技术获得。
葡萄籽提取物(或葡萄籽的提取物)，用于本发明的独特组 合物中的另一种化合物，含有在人体内充当抗氧化剂(自由基清除剂) 的被称为低聚原花色素或OPC的一类类黄酮复合物。OPC可帮助防 止内部应激和环境应激(即，吸烟、污染、和支持正常的身体代谢过程) 的作用。
用于本发明的葡萄籽提取物可得自市售的来源。例如，葡 萄籽提取物可得自Kikkoman Corporation(Tokyo，Japan)、Polyphenols， Inc.(Madera，California)、Bio Serae Laboratories SA(Bram，France)、 OptiPure(Los Angeles，California)、Dry Creek Nutrition，Inc.(Modesto， California)、或其它合适的来源。此外，可使用下文更充分讨论的、或 在本领域中已知的或描述的那些提取技术以产生用于本发明的葡萄 籽提取物。
当归，用于本发明的独特组合物中的一种提取物，也称为 Angelica sinensis或″femail ginseng″，是伞形科(Apiaceae)的草药，原产 于中国。它的根中文通常称为当归或danggui(中文：当归；拼音： dāngguī)，并被广泛地用于中国传统医学中以治疗妇科疾病、疲劳、 轻度贫血和高血压。当归具有止痛、抗炎、止痉和镇静作用。该植物 的植物化学成分包含香豆素、植物甾醇、多糖、阿魏酸盐、和类黄酮。
当归提取物(即当归的提取物)可购自各种不同来源，包括 Capricorns Lair(Ogden，Utah)。此外，当归可使用下文更充分描述的 任何提取技术、或在本领域中已知的任何提取技术提取。
虽然用于本发明的每一提取物均为市售，但有许多提取方 法可以用来制备用于本发明提取物而不需要市购该提取物。可用来产 生用于本发明提取物的提取方法的一些实例在下文描述。其它实例为 已知的，在本领域包括各种出版物和专利中描述。下文更充分地描述 的提取方法为例示性的，本领域的普通技术人员应理解可以使用其它 提取技术和方法来获得用于本发明提取物。
用于本发明提取物可从许多来源中获得，包括不同的品种 和物种。例如，得自任何颜色或品种的葡萄的葡萄籽均可用来获得葡 萄籽提取物。此外，可提取植物的任何部分，包括果实、果皮、种子、 茎、叶、根、茎皮、根茎、长匐茎等。
在一个实施方案中，可使用有机溶剂萃取技术获得用于本 发明的独特组合物提取物。更具体地讲，用于本发明提取物，例如甘 草提取物或甘草根提取物，可以通过用有机溶剂，例如己烷、醋酸乙 酯、乙醇、或水-乙醇提取甘草或甘草根来制备。
在另一个实施方案中，可用溶剂顺序分级分离法(solvent sequential fractionation)获得用于本发明的独特组合物提取物。例如， 使用该技术，可用己烷、醋酸乙酯、乙醇、和水-乙醇相继提取葡萄籽 来获得葡萄籽提取物。在所述顺序的每一步之后获得的提取物(级分 (fraction))将会含有极性类似于用来提取它们的溶剂且极性次序递增 的化合物。将所述级分干燥以蒸发溶剂，得到葡萄籽提取物。本领域 的那些技术人员应理解许多其它溶剂可用于实行溶剂顺序分级分离 提取法。
也可使用总水-乙醇提取技术(total hydro-ethanolic extraction technique)以获得用于本发明的独特组合物提取物。总而言 之，这称为一次性提取(lump-sum extraction)。该方法所产生的提取物 包含在提取材料中存在的多种植物化学成分，包括脂溶物和水溶物。 在收集提取溶液之后，将溶剂蒸发，得到提取物。在一个实施方案中， 可使用该技术提取石榴。
总乙醇提取法也可用于本发明。该技术使用乙醇作为溶 剂，而不是水-乙醇(hydro-ethanol)。该提取技术产生的提取物除包括 水溶性化合物之外还可包括脂溶性的和/或亲脂化合物。绿茶提取物可 使用该技术获得。
可用来获得用于本发明提取物的提取技术的另一实例是 超临界流体二氧化碳萃取法(SFE)。在该提取方法中，被提取材料不暴 露于任何有机溶剂。相反，提取溶剂为超临界条件(＞31.3℃和＞73.8 巴)下的二氧化碳，含或不含改性剂。本领域技术人员应理解可改变温 度和压力条件以获得最好提取物产量。该技术产生脂溶性的化合物和 /或亲脂化合物提取物，类似于上述总己烷和醋酸乙酯提取技术。
本领域的那些技术人员应理解：有许多其它提取方法，在 本领域中已知的和在各种专利和出版物中描述的提取方法都可用来 获得用于实践本发明提取物。例如，在以下文献中描述的提取方法可 用于实践本发明：Murga等，″使用超临界的二氧化碳和乙醇的混合 物从葡萄籽中提取天然复合酚类和鞣质。″(“Extraction of natural complex phenols and tannins from grape seeds by using supercritical mixtures of carbon dioxide and alcohol.”)J.Agric Food Chem.2000年8 月：48(8)：3408-12；Hong等，″葡萄籽中酚类化合物微波辅助提取。 ″(“Microwave-assisted extraction of phenolic compounds from grape seed.”)Nat Prod Lett.2001；15(3)：197-204；Ashraf-Khorassani等，″ 通过使用基于CO2流体的单一系统将葡萄籽顺序分级分离成油、多酚、 和原花青素。″(“Sequential fractionation of grape seeds into oils， polyphenols，and procyanidins via a single system employing CO2-based fluids.”)J.Agric Food Chem.，2004年5月；52(9)：2440-4，这些文献 通过引用结合到本文中。
本发明的组合物
本发明的组合物可在可接受的载体中配制，并可制备、包 装和贴签，用于增加或刺激骨生长，抑制、减少、或预防骨再吸收， 增加骨强度，改善骨结构，改善骨构造，或各种骨病症的治疗、预防 或处理，所述骨病症包括但不限于骨折、骨质疏松症、牙周病、转移 性骨病、和溶骨性骨病。
在一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的组 合物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合 槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2 的基因或蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加骨生长的组合 物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二水合槲 皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加BMP-2 的基因或蛋白表达，并还其中，假如存在下列组分的话，那么：脱水 槲皮素或二水合槲皮素，则占约10-1000mg，更优选占约200-750mg， 更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg； 地黄(Rehmannia sp.)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg， 更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600 mg，更优选占约500mg；西伯利亚人参提取物占100-800mg，更优 选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg， 更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取物占10-1000mg，更优 选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg， 更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；甘草提取物占约10-500 mg，更优选占约25-450mg，更优选占约50-400mg，更优选占约75-350 mg，更优选占约100-300mg，更优选占约125-250mg，更优选占约 25-175mg；而依普黄酮占200-700mg，更优选占约250-650mg，更 优选占约300-600mg，更优选占约400-500mg，更优选占约600mg。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含脱水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亚人参提 取物、槐(Sophora japonica)提取物、和甘草提取物的组合，其中该组 合增加BMP-2的基因或蛋白表达，并还其中脱水槲皮素或二水合槲皮 素占约10-1000mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg， 更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；西伯利亚人参提取物占 约100-800mg，更优选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更 优选占约400-600mg，更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取 物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg， 更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg； 而甘草提取物占10-500mg，更优选占约25-450mg，更优选占约50-400 mg，更优选占约75-350mg，更优选占约100-300mg，更优选占约 125-250mg，更优选占约25-175mg。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素、二 水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约 400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素、二水合槲皮素；约 100-800mg的西伯利亚人参，更优选约200-750mg，更优选约300-700 mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人参；和约 10-500mg的甘草提取物，更优选约25-450mg，更优选约50-400mg， 更优选约75-350mg，更优选约100-300mg，更优选约125-250mg， 更优选约25-175mg的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或 蛋白表达。
在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提 取物、和甘草提取物的组合，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表 达，并还其中脱水槲皮素或二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、和 甘草提取物占等份量，更优选其中西伯利亚人参提取物以脱水槲皮素 或二水合槲皮素量的1/2的量存在，甘草提取物以脱水槲皮素或二水 合槲皮素量的1/10的量存在。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含脱水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亚人参 提取物的组合，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素占该组合物的约 10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w，西伯利亚人参提取物 占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w，其 中脱水槲皮素或二水合槲皮素和西伯利亚人参提取物的组合增加 BMP-2的基因或蛋白表达。
在还另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长 的组合物，该组合物包含以下中的至少两种的组合：脱水槲皮素、二 水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、和 甘草提取物，其中假如存在下列组分的话，那么脱水槲皮素或二水合 槲皮素占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该组合物的约50％ w/w；西伯利亚人参提取物占该组合物的约10-75％w/w，更优选占该 组合物的约50％w/w；槐(Sophora japonica)提取物占该组合物的约 1-50％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物 的约5-10％w/w；而甘草提取物占该组合物的约1-50％w/w，更优选 占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w，还 其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素或二 水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约 400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约 10-500mg的甘草提取物，更优选约20-125mg，更优选约20-100mg， 更优选约25-75mg，更优选约50mg的甘草提取物，其中该组合增加 BMP-2的基因或蛋白表达。
在另一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长的 组合物，该组合物包含以下的组合：约10-1000mg的脱水槲皮素或二 水合槲皮素，更优选约250-750mg，更优选约300-700mg，更优选约 400-600mg，更优选约500mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素；和约 100-800mg的西伯利亚人参提取物，更优选约200-750mg，更优选约 300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的西伯利亚人 参提取物，其中脱水槲皮素或二水合槲皮素、和西伯利亚人参提取物 的组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
在还一个实施方案中，本发明为在受试者中增加或刺激骨 生长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下中的至少两种的组合 的组合物：脱水槲皮素、二水合槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、 地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、和依普黄酮，其中该组合增加受试者 的BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的还一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约 10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更 优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水 槲皮素或二水合槲皮素；约100-800mg的西伯利亚人参提取物，更优 选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更 优选约500mg的西伯利亚人参提取物；和约10-500mg的甘草提取物， 更优选约25-450mg，更优选约50-400mg，更优选约75-350mg，更 优选约100-300mg，更优选约125-250mg，更优选约25-75mg的甘 草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的另一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约 10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更 优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水 槲皮素或二水合槲皮素；和约10-500mg的甘草提取物，更优选约 20-125mg，更优选约20-100mg，更优选约25-75mg，更优选约50mg 的甘草提取物，其中该组合增加BMP-2的基因或蛋白表达。
本发明的还一个实施方案是在受试者中增加或刺激骨生 长的方法，该方法包括给予该受试者包含以下组合的组合物：约 10-1000mg的脱水槲皮素或二水合槲皮素，更优选约250-750mg，更 优选约300-700mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的脱水 槲皮素或二水合槲皮素；和约100-800mg的西伯利亚人参提取物，更 优选约200-750mg，更优选约300-700mg，更优选约400-600mg， 更优选约500mg的西伯利亚人参提取物，其中脱水槲皮素或二水合 槲皮素、和西伯利亚人参提取物的组合增加受试者的BMP-2基因或蛋 白的表达和/或活性。
在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物和以下天然的、植物来 源的提取物中的至少一种：西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba) 提取物、绿茶提取物、槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.) 提取物、葡萄籽提取物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合物抑 制RANK-L的表达、产生、和/或释放，并还其中石榴提取物占约 10-2000mg，更优选占约300-1700mg，更优选占约400-1500mg，更 优选占约500-1250mg，更优选占约600-1000mg，更优选占约700-900 mg；更优选占约500mg；并且假如存在下列组分的话，那么：西伯 利亚人参提取物占约100-2000mg，更优选占约300-1700mg，更优选 占约400-1500mg，更优选占约500-1250mg，更优选占约600-1000mg， 更优选占约700-900mg；更优选占约500mg；银杏(Ginkgo biloba)提 取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800 mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约 500mg；绿茶提取物占约300-700，更优选占约350-650mg，更优选 占约400-600mg，更优选占约500mg；槐(Sophora japonica)提取物占 10-1000mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优 选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg； 地黄(Rehmannia sp.)提取物占约10-1000mg，更优选占约100-900mg， 更优选占约200-800mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600 mg，更优选占约500mg；葡萄籽提取物占35-250mg，更优选占约 50-150mg，更优选占约75-125mg；当归提取物占约10-1000mg，更 优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约300-700 mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg；而依普黄酮占约 400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg，更优 选占约600mg；其中该组合抑制RANK-L的表达、产生和/或释放或 抑制钙从骨的释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-2000mg的石榴 提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约 600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提 取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-150mg，更优选 约75-125mg的葡萄籽提取物；约400-700mg的依普黄酮，更优选 约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄酮； 和约300-700mg的绿茶提取物，更优选约350-650mg，更优选约 400-600mg，更优选约500mg的绿茶提取物，其中该组合抑制 RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。
在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含以下的组合：约10-2000mg的石 榴提取物，更优选约400-1700mg，更优选约500-1500mg，更优选约 600-1250mg，更优选约700-1000mg，更优选约800-900mg的石榴提 取物；约35-250mg的葡萄籽提取物，更优选约50-150mg，更优选 约75-125mg的葡萄籽提取物；和约400-700mg的依普黄酮，更优 选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优选约600mg的依普黄 酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙 从骨的释放。
在另一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、和依 普黄酮的组合，其中葡萄籽提取物占约1/10，石榴提取物和依普黄酮 占约400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg， 更优选占约600mg，其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或 释放或者抑制钙从骨的释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于抑制、减少、或预防 骨再吸收的组合物，该组合物包含石榴提取物、葡萄籽提取物、依普 黄酮、和绿茶提取物中的至少两种的组合，其中，假如存在下列组分 的话，那么：石榴提取物占该组合物的约25-100％w/w，更优选占该 组合物的约30-90％w/w，更优选占该组合物的约40-80％w/w，更优 选占该组合物的约45-60％w/w，更优选占该组合物的约50％w/w； 葡萄籽提取物占该组合物的约1-25％w/w，更优选占该组合物的约 2-15％w/w，更优选占该组合物的约5-10％w/w；依普黄酮占该组合 物的约25-100％w/w，更优选占该组合物的约30-90％w/w，更优选占 该组合物的约40-80％w/w，更优选占该组合物的约45-60％w/w， 更优选占该组合物的约50％w/w；而绿茶提取物占该组合物的约 1-25％w/w，更优选占该组合物的约2-15％w/w，更优选占该组合物 的约5-10％w/w，还其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释 放或者抑制钙从骨的释放。
本发明的另一个实施方案是在受试者中抑制、减少、或预 防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含天然的、植物来源 的提取物的组合物，该提取物包括以下提取物中的至少一种：石榴提 取物、西伯利亚人参提取物、银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、 槐(Sophora japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、葡萄籽提取 物、当归提取物、和依普黄酮，其中该组合物抑制RANK-L的表达、 产生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。
在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、 或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含以下的组合的 组合物：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优 选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg， 更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物， 更优选约50-150mg，更优选约75-125mg的葡萄籽提取物；约400-700 mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg，更优 选约600mg的依普黄酮；和约300-700mg的绿茶提取物，更优选约 350-650mg，更优选约400-600mg，更优选约500mg的绿茶提取物， 其中该组合抑制RANK-L的表达、产生、和/或释放或者抑制钙从骨 的释放。
在还一个实施方案中，本发明为在受试者中抑制、减少、 或预防骨再吸收的方法，该方法包括给予该受试者包含以下的组合的 组合物：约10-2000mg的石榴提取物，更优选约400-1700mg，更优 选约500-1500mg，更优选约600-1250mg，更优选约700-1000mg， 更优选约800-900mg的石榴提取物；约35-250mg的葡萄籽提取物， 更优选约50-125mg，更优选约75-100mg的葡萄籽提取物；和约 400-700mg的依普黄酮，更优选约450-650mg，更优选约500-600mg， 更优选约600mg的依普黄酮，其中该组合抑制RANK-L的表达、产 生、和/或释放或者抑制钙从骨的释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于增加刺激骨生长并抑 制、减少、或预防骨再吸收的食物增补剂疗法，该食物增补剂疗法 包括第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两种 的组合：二水合槲皮素、脱水槲皮素、西伯利亚人参提取物、甘草提 取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中该第一组合物的组合增加 BMP-2的表达和/或活性；该第二组合物包含以下中的至少两种的组 合：石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、和绿茶提取物，其中该 第二组合物的组合抑制RANK-L的表达或者抑制钙从骨的释放。
在还一个实施方案中，本发明为用于增加或刺激骨生长并 抑制、减少、或预防骨再吸收的食物增补剂疗法，该食物增补剂疗 法包括第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含以下中的至少两 种的组合：脱水槲皮素、二水合槲皮素、西伯利亚人参提取物、甘草 提取物、和槐(Sophora japonica)提取物，其中，假如存在的话，则脱 水槲皮素或二水合槲皮素占约10-1000mg，更优选占约200-750mg， 更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg； 其中，假如存在的话，则西伯利亚人参提取物占约100-800mg，更优 选占约200-750mg，更优选占约300-700mg，更优选占约400-600mg， 更优选占约500mg；其中，假如存在的话，则甘草提取物占10-500mg， 更优选占约25-450mg，更优选占约50-400mg，更优选占约75-350mg， 更优选占约100-300mg，更优选占约125-250mg，更优选占约25-175 mg；和其中假如存在的话，则槐(Sophora japonica)提取物占约10-1000 mg，更优选占约100-900mg，更优选占约200-800mg，更优选占约 300-700mg，更优选占约400-600mg，更优选占约500mg，并还其中 该第一组合物的组合增加BMP-2的表达和/或活性；该第二组合物包 含以下中的至少两种的组合：石榴提取物、葡萄籽提取物、依普黄酮、 和绿茶提取物，其中，假如存在的话，则石榴提取物占约10-2000mg， 更优选占约400-1700mg，更优选占约500-1500mg，更优选占约 600-1250mg，更优选占约700-1000mg，更优选占约800-900mg；其 中，假如存在的话，则葡萄籽提取物占约35-250mg，更优选占约50-150 mg，更优选占约75-125mg；其中，假如存在的话，则依普黄酮占约 400-700mg，更优选占约450-650mg，更优选占约500-600mg，更优 选占约600mg；和其中，假如存在的话，则绿茶提取物占约300-700 mg，更优选占约350-650mg，更优选占约400-600mg，更优选占约 500mg，并还其中该第二组合物的组合抑制RANK-L的表达或者释放 或抑制钙从骨的释放。
给药方式
本发明的组合物可全身给药或局部给药。对于全身使用， 本发明的组合物经配制用于依照常规方法的胃肠外(例如，静脉内、皮 下、肌内、腹膜内、鼻内或经皮)递药或肠内(例如，经口或直肠)递药。 静脉内给药可以通过一系列的注射或通过较长时间内的连续输注。注 射给药或其它途径的分开间隔给药可以按从每周一次到每天三次的 间隔来进行行。备选地，本文所公开的组合物可以以循环的方式(给予 所公开的组合物；随后不给药；随后再给予所公开的组合物；等)来给 予。可以连续进行治疗直至达到所需效果。备选地，本发明的组合物 的给药可以是持续的，因此它是预防性给药，而不是用于治疗的给药。
一般而言，本发明的组合物可以包括化妆品上或药学上可 接受的载体，例如盐水、缓冲盐水、5％葡萄糖水、含有痕量金属的硼 酸-缓冲盐水等。本发明的组合物还可包括一种或多种辅料，例如，维 生素A、维生素D、或钙；防腐剂；增溶剂；缓冲剂；白蛋白以预防 小瓶表面上的蛋白质损失；润滑剂；填充剂；稳定剂；等。配制方法 为本领域熟知的，在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences， Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中公开，该文献通过 引用结合到本文中。
本发明内使用的组合物可为无菌的、无热原的液体溶液或 混悬液、包衣的胶囊、栓剂、冻干粉剂、透皮贴剂的形式或本领域已 知的其它形式。局部给药可通过在受伤或损伤部位注射、或通过在该 部位的固体载体的插入或附着、或通过粘性液体的直接、局部施用等 来进行。对于局部给药，递药载体优选提供用于使骨或软骨生长的基 质，并更优选为可以被受试者吸收而没有不良反应的载体。
水悬浮液可包含本发明提取物成分与以下物质的混合物： 药理学上可接受的赋形剂例如维生素A、维生素D、和钙；悬浮剂例 如甲基纤维素；和润湿剂例如软磷脂、溶血卵磷脂或长链-脂肪醇。所 述水悬浮液还可包含依照工业标准的防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味 剂等。
优选地，本发明的组合物以丸剂、片剂、粉末、条、食 物、饮料、锭剂等形式口服。另外，本发明的组合物可作为干燥的或 粉状的制品存在，以在使用之前用水或其它合适的溶媒重新配制。可 用以下药学上可接受的添加剂通过常规方法制备液体制剂：例如悬浮 剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如， 卵磷脂或阿拉伯胶)；无水载体(例如，扁桃仁油、油酯、或经分馏的 植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯酸甲酯或对羟基苯酸丙酯或山梨 酸)。
当以饮料的形式给药时，本发明的组合物可基于水、基 于奶、基于茶、基于果汁、或它们的一些组合。
本发明的组合物也可以通过常规方法用以下药学上可接 受的赋形剂制备的固体形式口服：例如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀 粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖，微 晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解 剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基 硫酸钠)。可通过本领域熟知的方法包衣该固体。在优选的实施方案中， 本发明的组合物可采取双片型硬壳胶囊(two-piece hard shell capsule)、 软胶胶囊、或粉末的形式，以溶于用于口服的液体中。可适当地配制 用于口服的制剂，以实现活性化合物的控释。
口服给药的本发明组合物还可包含增稠剂，所述增稠剂 包括黄原胶、羧甲基-纤维素、羧乙基-纤维素、羟丙基-纤维素、甲基 -纤维素、微晶纤维素、淀粉、糊精、发酵乳清、豆腐、麦芽糖糊精、 多元醇包括糖醇(例如，山梨醇和甘露醇)、碳水化合物(例如乳糖)、藻 酸丙二醇酯、结冷胶(gellan gum)、瓜尔豆胶(guar)、果胶、黄蓍胶、 阿拉伯胶、槐豆胶、阿拉伯胶、明胶，以及这些增稠剂的混合物。这 些增稠剂典型地以至多约0.1％的水平包含在本发明的制剂中，视所包 含的具体增稠剂和所需粘性效果而定。
口服给药的本发明组合物可以，且典型地将会，含有有效 量的一种或多种甜味剂，包括碳水化合物甜味剂和天然的和/或人造的 无/低热量甜味剂。用于本发明的制剂的甜味剂的量将有所不同，但通 常取决于使用的甜味剂的类型和所需的甜度。
除先前描述的制剂之外，该化合物也可配制为持续的和/ 或定时释放的制剂。常见的定时和/或控释释放系统包括，但不限于： 淀粉、渗透泵、或明胶微胶囊。
若有需要，所述组合物可存在于包装或分配装置中，该 包装或分配装置可包含一个或多个含本发明的组合物的单位剂型。所 述包装可例如包含金属或塑料薄片，例如泡罩包装。包装或分配装置 可附有给药说明书。
局部(topical and local)施用的本发明组合物的制剂包括在 化妆品上或药学上合适的载体中的气溶胶喷雾剂、洗剂、凝胶剂和软 膏剂，所述载体可包含低级脂族醇、聚乙二醇类(polyglycol)例如甘油、 聚乙二醇、脂肪酸酯、油和脂肪、和硅酮。该制剂还可包含抗氧化剂 例如抗坏血酸或生育酚，和防腐剂例如对羟基苯甲酸酯。
胃肠外制剂尤其包含无菌的或已灭菌的制品。
可提供包含本发明提取物和任何已知的可注射载体的组 合的可注射组合物。这些组合物可含有调节渗透压的盐。
其它有用的剂型可以通过本领域的那些技术人员充分了 解的方法和技术制备，并可包括在制备片剂、胶囊、或液体剂型时使 用的附加成分。虽然本文讨论了例示性的剂量、给药频率、和给药方 法，但这些仅仅是例示性的，并且应理解的是，剂量、给药频率、和 给药方式可依照个体消费者或患者的年龄、体重、条件和反应、及所 使用的本发明的具体组合物而改变。
实施例
进行动物试验不是申请人的策略。然而，申请人通过本 发明的组合物和方法所使用的潜在成分的体外试验得到了显著结果， 虽然体外试验可以提供有用的信息，但是这样的试验不能代替动物研 究，因为骨作为器官连同控制它的复杂机制不能在实验室中被模仿。 因此，申请人进行了如下所述的几个动物研究，以确定用于本发明的 组合物和方法的活性。在进行所有的动物研究中，申请人遵循如以下 文献所概述的对动物的操作和人道处理的指南：例如，由Food and Drug Administration在1994年4月公布的Guidelines for Preclinical and Clinical Evaluation of Agents Used in the Prevention or Treatment of Postmenopausal Osteoporosis，Division of Metabolic and Endocrine Drug Products，其全部内容通过引用结合到本文中。也见World Health Organization在1998年公布的Guidelines for Preclinical Evaluation and Clinical Trials in Osteoporosis(ISBN号9789241545228)和Wark，John D.和Westmore，Ann的Studies of drugs and other measures to prevent and treat osteoporosis；可在www.who.int/entity/ageing/publications/ noncommunicable/alc_osteoporosis_bhef.pdf-(最后访问时间：2007年10 月21日)得到为非专家提供的指南，其全部内容通过引用结合到本文 中。
实施例1：BMP-2的启动子、基因、和蛋白质的表达/活 性
使用具有1％青霉素/链霉素和1％谷酰胺的10％FCS的 α-MEM培养2T3-BMP2-萤光素酶细胞，并每周分出1/5一次，所述细 胞为转染有与萤光素酶标记基因连接的BMP-2启动子的鼠成纤维细 胞。以5×103细胞/100μl/孔的细胞密度将该细胞接种到微量滴定板中。 经过5％CO2 37℃下的24小时预孵育期允许细胞粘附和稳定。去除培 养基，用50μl的4％FCS的α-MEM代替。将包含待测试化合物或因 子(2x)的50μl无血清培养基(Serum Free)(0.1％BSA)加入每个孔中。最 终体积为100ul，最终血清浓度为2％FCS。使用的常规阳性对照是以 重组人BMP2(″rhBMP2″)或中国仓鼠卵巢-BMP2(″CHO-BMP2″)为条 件的培养基。然后在37℃、5％CO2下将所处理的细胞孵育48小时。 然后去除培养基，用PBS将细胞洗涤3次。将过量的PBS从孔中去 除，将100μl的细胞培养物溶解剂(Promega#E153A)加入到每一孔中， 并孵育至少10分钟。将10μl的细胞溶解产物加入到含100μl有底物 (Promega#E152A)的萤光素酶测定缓冲液的96孔白色发光测定板 (Dynatech Labs#0010107100)中。使用Dynatech ML2250自动96孔发 光计读取萤光素酶活性。然后将该数据表示为萤光素酶活性/孔的百分 数或者萤光素酶活性/μg蛋白质的百分数。
测试以下化合物激活BMP-2的启动子的能力：槲皮素、 地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取物、西伯利亚 人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、依普黄酮、 和cal-z-bone。测试的结果和浓度报道于下面的表1中： 表1：BMP2的启动子分析(与对照的比例)
在表1中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2 ＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黄(Rehmannia sp.)根 (NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SJ＝槐(Sophora japonica)(NuPharma)，SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄 酮，L＝甘草，CZB＝Cal-Z-bone。*注意：如果倍数值为2或更大， 那么该处理显著地激活BMP-2启动子。如果倍数值小于2，那么该处 理对BMP-2启动子无效。因此，依照该试验，二水合槲皮素和依普黄 酮是BMP-2启动子的最有效激活剂。
也可能使用类似于上述用于测试BMP-2启动子活性的那 些测定法来测试BMP-2基因表达和蛋白表达。具体而言，对于基因表 达而言，在37℃和5％CO2下将人骨肉瘤细胞系，MG-63(ATCC# CRL-1427)维持在含酚红的MEM(如由ATCC所推荐的)中。在实验之 前24小时，将3×105个细胞接种到不含酚红的MEM中的12孔板中。 对于每一实验，按10、1、和0.1μg/ml的处理浓度，用试验提取物处 理细胞。经过夜孵育之后，使用常规的基于trizol/异硫氰酸胍的溶胞 作用提取RNA。分离得到的RNA用不含RNA酶的DNA酶I消化， 以去除任何DNA污染物，然后依照制造厂家(Stratagene)的说明书， 使用随机六聚体以及寡脱氧胸苷(oligo(dT))引物逆转录形成cDNA。使 用对BMP-2的FAM-标记的特异性引物和对18S rRNA的HEX-标记 的特异性引物(Invitrogen)进行定量实时PCR测定。所有的反应进行三 个重复，并使用Applied Biosystems(2001)建立的比较Cτ方法，计算 处理的样品中的mRNA与未处理的样品中的mRNA比较的相对量。2 倍或更大的基因表达变化被认为是显著的。
为了测量BMP-2蛋白表达，以1×104细胞/孔的密度将 Hu09细胞接种到96孔培养板中，用补充了10％FCS的α-MEM培养 24小时。用不同的蛋白酶体抑制剂将细胞处理24小时。在孵育之后， 将经以上条件处理的培养基转移入微量离心管中，于14,000rpm离心 2-3分钟，以去除细胞碎屑。然后使用标准BMP-2酶联免疫吸附测定 试剂盒(R&D ELISA KIT DBP200)测定上清液中BMP-2蛋白的浓度。 将重组体hBMP-2(R&D)用作标准。
测试以下化合物增加BMP-2的基因表达和蛋白表达的能 力：槲皮素、地黄(Rehmannia sp.)提取物、地黄(Rehmannia sp.)根提取 物、西伯利亚人参提取物、槐(Sophora japonica)提取物、甘草提取物、 依普黄酮、和cal-z-bone。在蛋白表达测定中测试的结果和浓度报道 于下面的表2中。 表2：BMP-2的蛋白表达分析
在表2中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL)，R-2 ＝地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco)，R-3＝地黄(Rehmannia sp.)根 (NuPharma)，SFJ＝槐角(Sophora fructus japonica)，SJ＝槐(Sophora japonica)(NuPharma)，SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄 酮，L＝甘草，CZB＝CaI-Z-bone。*注意：如果倍数值为2或更大， 那么该处理显著地激活BMP-2蛋白表达。如果倍数值小于2，那么该 处理对BMP-2的蛋白表达无效。
在基因表达测定中测试的结果和浓度于下面的表3中列 出。2倍变化或更多的基因表达增加被认为是显著的。 表3：BMP-2的基因表达分析，10μg/ml 试验成分： 基因表达中的倍数变化： 地黄(Rehmannia sp.)提取物(EUL) 28倍增加 地黄(Rehmannia sp.)提取物(Draco) 11.7倍增加 地黄(Rehmannia sp.)根(NuPharma) 6.3倍增加 槐角(Sophora fructus japonica) 49倍增加 槐(Sophora japonica)(NuPharma) 8.3倍增加 西伯利亚人参 27倍增加 槲皮素 2.6倍增加 依普黄酮 无效 甘草 45倍增加
基因表达测定的另外结果于下面的表4中列出。在表4 中，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亚人参，SJ＝槐(Sophora japonica)，L ＝甘草。2倍的基因表达增加或更多被认为是显著的。发现在槲皮素 对甘草的比值为10∶5即2∶1和10∶10即1∶1时超过单独的槲皮素，起 协同作用。 表4：BMP-2的基因表达分析 成分(剂量)： N BMP-2表达(倍数变化) Q(100μg/ml) 1 14 Q(20μg/ml) 2 4.61±0.07 Q(10μg/ml) 1 5 Q(10μg/ml) 2 3.48±0.08 成分(剂量)： N BMP-2表达(倍数变化) Q(10μg/ml) 2 3.54±0.12 Q(10μg/ml) 2 3.52±0.12 Q(5μg/ml) 2 2.51±0.14 Q(1μg/ml) 1 2 Q(1μg/ml) 1 2.03 Q(0.1μg/ml) 1 无变化(-1.06) SG(10μg/ml) 2 11.26±0.14 SG(10μg/ml) 2 12.38±1.00 SG(1μg/ml) 2 5.61±1.45 SG(0.1μg/ml) 2 2.58±0.38 SJ(10μg/ml) 2 29.10±2.71 SJ(10μg/ml) 2 32.45±0.32 SJ(10μg/ml) 2 32.80±1.12 SJ(5μg/ml) 2 23.43±0.23 SJ(2.5μg/ml) 2 14.89±0.95 SJ(1μg/ml) 2 11.64±2.04 SJ(0.1μg/ml) 2 3.72±0.37 L(100μg/ml) 1 29 L(10μg/ml) 1 8 L(1μg/ml) 1 4 Q+SG(各10μg/ml) 2 无变化 (0.07±1.82) Q+SG(各10μg/ml) 1 无变化 (1.36) Q+SJ(各10μg/ml) 2 12.01±0.76 Q(10μg/ml)+SJ(1μg/ml) 2 7.09±0.75 Q(10μg/ml)+SJ(0.1μg/ml) 2 2.63±0.15 Q(1μg/ml)+SJ(10μg/ml) 2 无变化 (1.30±0.17) Q(5μg/ml)+SJ(2.5μg/ml) 2 4.07±0.02 Q(10μg/ml)+SJ(5μg/ml) 2 13.86±1.22 Q(20μg/ml)+SJ(10μg/ml) 2 16.86±0.41 SG(10μg/ml)+SJ(10μg/ml) 2 1.97±0.62 SG(10μg/ml)+SJ(1μg/ml) 2 3.36±0.04 SG(10μg/ml)+SJ(0.1μg/ml) 2 4.57±0.87 Q(100μg/ml)+L(100μg/ml) 1 38 Q(100μg/ml)+L(10μg/ml) 1 252 Q(100μg/ml)+L(1μg/ml) 1 35 Q(10μg/ml)+L(100μg/ml) 1 92 成分(剂量)： N BMP-2表达(倍数变化) Q(10μg/ml)+L(10μg/ml) 1 71 Q(10μg/ml)+L(1μg/ml) 1 15 Q(1μg/ml)+L(100μg/ml) 1 31 Q(1μg/ml)+L(10μg/ml) 1 37 Q(1μg/ml)+L(1μg/ml) 1 6 Q+SG+SJ(各10μg/ml) 2 无变化 (1.39±0.26) Q(0μg/ml) 3 1.01±0.05 Q(10μg/ml) 3 7.22±0.51 L(0μg/ml) 3 1.01±0.05 L(1μg/ml) 3 1.34±0.12 L(5μg/ml) 3 0.81±0.03 L(10μg/ml) 3 1.04±0.04 Q(10μg/ml)+L(1μg/ml) 3 8.54±2.19 Q(10μg/ml)+L(5μg/ml) 3 13.50±4.49 Q(10μg/ml)+L(10μg/ml) 3 14.77±3.04
实施例2：测量骨生长的颅盖分析
从4天大的瑞士白鼠上切除新生鼠颅盖，放入BGJ培养 基(Sigma)，沿中缝(midline suture)切成两半。将一毫升补充了0.1％牛 血清白蛋白(BSA)的BGJ培养基加入到12孔组织培养板(Costar)的每 一孔，其中添加了相关的因子或载体。将每一半颅盖放在位于培养基 上方的培养基/空气接触面上的不锈钢网格(stainless steel grid)上。通常 每个实验组使用4块骨头。可以用重组BMP-2(5μg/ml)、FGF(100ng/ml) 或胰岛素(10μg/ml)作为骨形成的阳性刺激物。在第0天(解剖那天)加 入待测试的因子，在24和96小时时改变培养基(如果需要7天的试验)。 将颅盖保持在37℃的湿润空气(5％CO2)中。在培养期之后，然后将颅 盖取出，在10％福尔马林中固定(fixed)过夜。然后在14％EDTA中将 颅盖脱钙过夜，然后包埋在石蜡中。然后使用标准切片机，沿中缝进 行切片，以显示冠缝和在该缝后方的区域。最初在两个连续的400nm 深处取四微米切片。将切片置于涂布的载玻片上(Superfrost plus，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，用苏木精和曙红染色。在矢状缝后方的 切片中测定总骨面积和新骨面积(表示为mm2)、缝厚度(mm)、和衬在 骨表面的细胞数目。使用Osteomeasure系统(Osteometries INC，Atlanta， GA)进行组织形态计量学分析。
在该测定中测试的提取物包括槐角(Sophora fructus japonica)提取物、西伯利亚人参提取物、二水合槲皮素、脱水槲皮素、 依普黄酮、甘草、和Cal-Z-bone。颅盖试验中提取物的测试结果于下 面的表5和表6中报道。在表5中，SJ＝槐角(Sophora fructus japonica)， SG＝西伯利亚人参，Q＝槲皮素，I＝依普黄酮，L＝甘草，CZB＝ Cal-Z-Bone。BMP-2和辛伐他汀(Simvastatin)被用作阳性对照。在下面 的表格中，上标a(a)指该结果显著不同(p＜0.05)于空白试样(浓度为0 μg/ml)。p＜0.05的差异(即其中误差界限小于或等于5％)被认为是显著 的。表5中的前四行数据基于各种比值的成分的混合物，例如″Q∶SG″ 下的1∶1表示二水合槲皮素和西伯利亚人参以相同的量存在于该混合 物中。 表5：颅盖分析结果-骨形成
显然，上述结果表明：槲皮素和提取物之间的协同作用 不止是累加的。具体而言，假定是累加作用，那么预期在1μg/ml的浓 度下有约12mm2×10-3的新骨形成。因此，在50％浓度的槲皮素和西 伯利亚人参提取物时，预期结果为约6mm2×10-3，但上述结果显示： 槲皮素和西伯利亚人参提取物的组合实现约13mm2×10-3的新骨形成。
使用用于本发明组合物提取物的各种组合重复上述颅盖 试验。对于表6，Q＝槲皮素，SG＝西伯利亚人参，L＝甘草。在下 面的表格中，上标a(a)指该结果显著不同(p＜0.05)于空白试样(浓度为0 μg/ml)。p＜0.05的差异被认为是显著的。每一制剂的结果于下面的表 6中报道。 表6：颅盖分析结果-由提取物组合激发的骨形成
实施例3：测量骨生长的体内研究
在涉及约12-14周龄、近似体重为200-250克的雌性、完 整大鼠的体内试验中测试三种不同的配方。配方1包括以下剂量的脱 水槲皮素和甘草，250mg槲皮素：250mg甘草的乙醇提取物和500 mg槲皮素：500mg甘草的乙醇提取物。配方2包括以下剂量脱水槲 皮素和甘草，250mg槲皮素：125mg甘草的乙醇提取物；500mg槲 皮素：250mg甘草的乙醇提取物；和1000mg槲皮素：500mg甘草 的乙醇提取物。配方3包括以下剂量的脱水槲皮素和甘草，1000mg槲 皮素：200mg甘草的乙醇提取物。该研究持续35天。试验了八个单 独组别的大鼠，每组15只大鼠。试验的八组大鼠中的两组为作对照 组进行检测。一组是安慰剂对照组，另一组接受50μg/kg(10μg/200g)/ 每周3次的甲状旁腺素。甲状旁腺素，被称为同化激素类药，用作阳 性对照。见，例如，Turner等，″Disuse in adult male rats attenuates the bone anabolic response to a therapeutic dose of parathyroid hormone.″J. Appl Physiol.2006，第101卷：881-886，其全部内容通过引用结合到 本文中。
下面的表7标明给予8个试验组中每一组的配方。表7 中的剂量基于推荐的人每日剂量。使用FDA剂量换算公式(人等效剂 量(HED，mg/kg)＝大鼠剂量mg/kg×(大鼠重量kg/人重量kg)0.33)，以将 人剂量转换至大鼠剂量。 HED＝大鼠NOAEL×(W-大鼠/W-人)(1-b)，b＝0.67。
在表7中，Q＝槲皮素，L＝甘草。 表7：在体内研究中测试的配方 组编号： 配方： 人每日剂量(mg)： 1 Q+L(配方1)-1∶1 Q＝250，L＝250 2 Q+L(配方1)-1∶1 Q＝500，L＝500 3 Q+L(配方2)-2∶1 Q＝250，L＝125 4 Q+L(配方2)-2∶1 Q＝500，L＝250 5 Q+L(配方2)-2∶1 Q＝1000，L＝500 6 Q+L(配方3)-5∶1 Q＝1000，L＝200 7 安慰剂(无治疗) 8 阳性对照(甲状旁腺素-50μg/kg (10μg/200g)/每周3次)
使用雌性、Sprague Dawley大鼠(每只200-250gm，约 12-14周龄)。以15gm/天喂养动物，包括安慰剂饮食或上述配方中的 一种，从实验的开始持续35天。每天早上以15克/大鼠/天的比例对 大鼠喂食。在整个实验过程中，允许大鼠自由获取水，并将其关养在 合适的笼子中。在整个实验期间允许无限制的活动，持续35天。
通过测量结果评估所述配方对骨形成的作用，该测量结 果包括生物力学测量(以评估骨强度与功能信息)、微-CT(以分析实际 的骨质量(bone quality)和功能信息)、和组织形态学测量(以分析骨质量 和功能信息)。实施组织形态学测量的方法在Pa Revell，″骨的组织形 态学″(“Histomorphometry of Bone”)J.Cline.Pathol.，1983年，第36 卷：1321-1331中描述，其全部内容通过引用结合到本文中。使用的 术语和单位是由the Histomorphometry Nomenclature Committee of the American Society for Bone and Mineral Research推荐的。实施微CT测 量的方法在以下文献中描述：Jiang等，″动物骨骼3D结构的微CT 和微MR影像″(“Micro CT and Micro MR imagining of 3D architecture of animal skeleton.”)，J.Musculoskel Neuron Interact.2000.第1 卷：45-51，其全部内容通过引用结合到本文中。在处理35天之后测定 这些测量结果。
在处理之后的第35天处死每一组中的六只动物。股骨用 于组织形态学分析。为了测定不同配方对骨形成的作用，通过组织形 态学技术评估骨小梁体积(trabecula bone volumn)、小梁细胞数目 (trabecular cell number)和小梁间距(trabecular separation)。在下面的表8 中，上标a(a)指该结果显著不同于(p＜0.05)安慰剂组(空白处理)。 p＜0.05的差异被认为是显著的。如下面的表8所示，与安慰剂组相比， 阳性对照组即PTH(旁甲状腺素)显示：在用PTH处理之后骨体积显著 增加(55.83％)、梁细胞数目显著增加(19.57％)、小梁间距减少(38.30％)。 同样地，与安慰剂组相比，给予组3的配方表明：骨体积显著增加 (47.59％)、小梁细胞数目显著增加(24.19％)、小梁间距减少(23.52％)， 其效果可比得上PTH处理。 表8：组织形态学测量结果 组编号 ％骨体积 小梁 数目 小梁 间距 骨小梁 厚度 骨矿物质 沉积率 骨形成率 1 3.01％ 7.42％ -8.18％ -6.83％ -0.23％ 4.14％ 2 -6.44％ 2.06％ -8.51％ -11.47％ -2.81％ 15.82％ 3 47.59％a 24.19％a -23.52％ 13.04％ 26.60％a 51.37％a4 11.23％ 4.71％ -7.26％ -6.14％ 9.19％ 16.61％ 5 29.01％a 4.96％ -9.07％ -8.95％ 3.18％ 20.28％ 6 -6.63％ -8.33％ -7.35％ 5.36％ 9.59％ 3.20％ PTH 55.83％a 19.57％a -38.30％ 7.35％ 28.51％a 45.83％a
表8说明：给予组5的配方与安慰剂相比显示骨小梁骨 体积有显著的差异(P＜0.05)。
此外，表8报道了对骨小梁骨厚度的测量。数值更高的 骨厚度表明骨中有更大量的矿物质沉积，可以引起骨量增加。与安慰 剂组相比，给予组3的配方显著地增加骨小梁厚度(13.04％)，其效果 可比得上PTH处理(7.35％)。
骨矿物质沉积率(bone mineral apposition rate)(MAR)，也 在表8中报道，通过测量平均标记间距除以两次给予flurorchrome之 间的时间间隔(5天)来测定。更大的骨矿物质沉积率(或矿化表面)意味 着有更多的新骨沉积。该结果应与骨小梁厚度结果相对应。实际上， 经35天的处理之后，与安慰剂组相比，给予组3的配方显示骨矿物 质沉积率显著增加(26.60％)，其效果可比得上PTH处理(28.51％)。
表8另外提供骨形成率(BFR)的值。BFR由用四环素(使 用表面荧光观察)标记的骨表面的范围和其中2种标记(钙黄绿素和四 环素)所存在的区域中的标记之间的距离计算，它表示为平方微米每立 方微米每天(μm2/mm3/天)。较高的骨形成率意味着可以形成较多的新 的骨组织。骨形成率的结果与观察到的骨矿物质沉积率的变化一致。 与安慰剂组相比，给予组3的配方显示骨形成率显著增加(51.37％)， 其效果可比得上PTH处理(45.83％)。
用于本研究的另一效能测定技术是微-CT测量，微-CT测 量可提供实际的骨质量、结构和功能信息。该分析的结果于下面的表 9中报道。
对于定量和定性的骨结构评估，从许多参数例如骨矿物 质密度(BMD)、骨体积(％骨体积/总体积)、小梁数目、和小梁间距获 取信息是关键的。在这些参数中，骨体积、小梁数目、和小梁间距的 结果与骨健康有关。
表9中报道的结果表明，与安慰剂组相比，给予组2和 组5的配方有效地增强成骨细胞发生，显著地增加骨矿物质密度 (BMD)，且它们的效果可比得上PTH处理。结果还表明，与安慰剂组 相比，给予组1、2、和5的配方显著增加骨体积和小梁细胞数目，减 少小梁间距，且它们的效果可比得上PTH处理。在表9中，上标a(a) 表示该结果显著不同(p＜0.05)于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显 著的。 表9：微-CT测量结果 组编号 骨矿物质密度 (BMD) ％骨体积/总体积 小梁数目(N/6 mm2) 小梁间距(mm) 1 17％ 32％a 15％a -22％a 2 71％a 33％a 14％a -22％a 3 20％ 15％ 7％ -9％ 4 31％ 13％ 5％ -8％ 5 74％a 25％a 14％a -19％a 6 20％ 9％ 4％ -4％ PTH 86％a 32％a 25％a -28％a
除了骨量和骨体积评价之外，使用两个不同的参数对骨 强度进行力学测试。一个参数测量使骨断裂所需要的最大力，另一个 测定骨的刚度(弹性)。测定骨强度和刚度的方法在Sturmer等，″正常 的和骨质疏松的大鼠干骺端胫骨的标准化弯曲试验和断裂试验：雌二 醇、睾酮、和雷洛昔芬的作用″(“Standardized Bending and Breaking Test for the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat：Effect of Estradiol，Testosterone，and Raloxifene”)J. Bone and Mineral Research，2006，第21卷(1)：89-96中描述，其全部内容通过引用结合 到本文中。
在表10中，结果表明：在使骨断裂所需要的最大力和骨 的刚度方面，在包括阳性对照组(PTH)和安慰剂组在内的任何处理组 之间没有统计学差异。阳性对照组没有起作用可能是因为仅以3次/ 周的频率施用相对低剂量的PTH。虽然PTH是强效的同化激素类药， 但PTH剂量是经过特别地选择，以提供对骨形成的适度作用而不诱导 任何不良反应。 表10：生物力学测量结果 组编号 使骨破裂所需的最大力 骨刚度 1 -0.1％ -0.1％ 2 -0.1％ 0.0％ 3 0.0％ 0.0％ 4 0.0％ 0.0％ 5 -0.1％ -0.1％ 6 0.0％ 0.0％ PTH 0.0％ 0.0％
实施例4：RANK-L的抑制研究
称重150-250mg的每一成分，放入15ml锥形底管。使 其溶于50％DMSO：30％乙醇：20％水的溶液，以得到50μg/ml的最 终储液。对于溶剂对照，混合1.5ml DMSO、0.9ml乙醇、和0.6ml 水。充分涡旋混匀。在室温下在水浴中声处理10分钟。再次充分涡 旋混匀。在新鲜的不含酚红的培养基中稀释成分储液。
在37℃和5％CO2时将人骨肉瘤细胞系，MG-63(ATCC# CRL-1427)维持在含有酚红的MEM(如ATCC推荐)中。在实验之前 24小时，将3×105个细胞接种到不含酚红的MEM中的12孔板中。将 消耗的培养基从孔中去除，在37℃、5％CO2下用1、0.1、0.01μg/ml 的各测试成分或30ng/ml的TGF-β(阳性(+)对照)将MG-63细胞 (ATCC编号CRL-1427)预处理4小时。TGF-β的储液为30μg/ml(得自 R&D Systems，目录编号100-B-001)。
在预处理培养期之后，将10μg/ml的IL-1b(Calbiochem (目录编号407615)和10μg/ml的储液，目录编号407615)加入到细胞培 养物中，37℃18小时。去除经处理和刺激的细胞的上层培养基，如 制造厂商(来自APOTECH，目录编号APO-54N-016-k101)所述，使用 RANK-L ELISA(重复三次)测量总RANK-L蛋白。将得到的蛋白量与 经培养基(空白)处理刺激的细胞的蛋白量相比，以测定总RANK-L蛋 白减少的百分数。
上述测定方法用于测定以下提取物抑制RANK-L的表达、产 生、或释放的能力：银杏(Ginkgo biloba)提取物、绿茶提取物、槐角 (Sophora fructus japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、石榴提 取物、西伯利亚人参提取物、依普黄酮、葡萄籽提取物、当归提取物、 和槐(Sophora japonica)提取物。该测定的结果于下面的表11中报道。 10％或更多的减少被认为是显著的。 表11：RANK-L蛋白的产生/释放(相对于未处理的对照) 成分(在1μg/ml下测试)： 产生/释放水平的％变化 (与未处理的对照比较) 银杏 减少31％ 绿茶 减少19％ 槐角(Sophora fructusjaponica) 减少45％ 地黄(Rehmannia sp.). 减少74％ 石榴 减少20％ 石榴(Naturex) 减少14％ 西伯利亚人参 减少50％ 依普黄酮 无效 葡萄籽提取物 减少11％ 当归(20∶1提取率) 减少16％ 槐(Sophora japonica)(NuPharma) 减少42％
基于表11报道的结果，可确定石榴提取物、依普黄酮 (Ostivone)、葡萄籽提取物(40％原花色素)和绿茶提取物(40％EGCG) 显示对RANK-L产生/释放的抑制有积极效应。因此，使用如上所述 的RANK-L抑制试验测试这些成分的各种组合，以确定可以获得什么 水平的RANK-L产生/释放抑制。结果于下面的表12中报道。如这些 报道说明，发现10μg/ml的石榴提取物、10μg/ml依普黄酮、1μg/ml 葡萄籽提取物、和1μg/ml绿茶提取物的组合是使对响应成骨细胞 IL-1B蛋白质刺激的RANK-L合成的抑制最大化的配方。该结果也显 示：具有石榴的任何组合一般均效果良好。此外，在该成分之中没有 发现主要干扰(major interference)。 表12：RANK-L抑制 成分(剂量)： n RANK-L 抑制(％) 有机橄榄汁粉(100μg/ml) 2 41.5±4.0 有机橄榄汁粉(10μg/ml) 6 19.7±2.2 有机橄榄汁粉(1μg/ml) 6 无抑制 有机橄榄汁粉(0.1μg/ml) 3 无抑制 石榴提取物(30μg/ml) 2 58.6±1.5 石榴提取物(20μg/ml) 2 56.2±2.6 石榴提取物(10μg/ml) 3 48.3±3.1 石榴提取物(10μg/ml) 2 46.9±10.7 石榴提取物(10μg/ml) 2 48.4±1.1 石榴提取物(10μg/ml) 3 49.4±3.3 石榴提取物(1μg/ml) 3 19.3±2.1 石榴提取物(0.1μg/ml) 3 4.7±4.2 依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) 3 0±4.3 依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) 3 2.8±3.9 依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) 3 0±2.5 依普黄酮(Ostivone)(1μg/ml) 2 0.8±0.3 葡萄籽提取物(40％OPC)(10μg/ml) 3 18.7±6.9 葡萄籽提取物(40％OPC)(10μg/ml) 2 21.9±0.6 葡萄籽提取物(40％OPC)(5μg/ml) 3 13.1±3.4 葡萄籽提取物(40％OPC)(2μg/ml) 2 10.3±1.6 葡萄籽提取物(40％OPC)(1μg/ml) 3 8.0±2.2 葡萄籽提取物(40％OPC)(1μg/ml) 2 10.7±1.0 葡萄籽提取物(40％OPC)(0.1μg/ml) 2 0±4.3 绿茶提取物(40％EGCG)(10μg/ml) 3 23.9±1.4 绿茶提取物(40％EGCG)(10μg/ml) 3 22.6±7.5 绿茶提取物(40％EGCG)(1μg/ml) 3 10.2±1.6 绿茶提取物(40％EGCG)(0.1μg/ml) 3 0±2.6 石榴+依普黄酮(Ostivone)(各10μg/ml) 2 45.7±2.4 成分(剂量)： n RANK-L 抑制(％) 石榴+依普黄酮(Ostivone)(各10μg/ml) 2 48.0±2.8 石榴+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml each) 3 46.9±5.3 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(1μg/ml) 2 48.3±3.5 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(0.1μg/ml) 2 45.6±4.0 石榴(1μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) 3 21.6±5.2 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(10μg/ml) 2 63.3±0.7 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(1μg/ml) 2 64.6±4.9 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(0.1μg/ml) 2 49.9±2.5 石榴+依普黄酮(Ostivone)+葡萄籽提取物(各10μg/ml) 2 42.8±8.9 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +绿茶提取物(10μg/ml) 3 39.0±2.9 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +绿茶提取物(1μg/ml) 2 54.6±1.1 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +绿茶提取物(0.1μg/ml) 2 37.5±8.1 石榴+依普黄酮(Ostivone)+绿茶提取物(10μg/ml each) 3 23.5±2.3 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(10μg/ml)+绿茶提取物(10μg/ml) 3 42.9±1.1 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(10μg/ml)+绿茶提取物(0.1μg/ml) 2 60.8±0.9 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(1μg/ml)+绿茶提取物(0.1μg/ml) 3 55.1±1.8 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(1μg/ml)+绿茶提取物(1μg/ml) 3 68.6±2.6 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(1μg/ml)+绿茶提取物(10μg/ml) 3 65.2±1.1 石榴(10μg/ml)+依普黄酮(Ostivone)(10μg/ml) +葡萄籽提取物(0.1)+绿茶提取物(1μg/ml) 3 52.3±0.7 石榴+依普黄酮(Ostivone)+葡萄籽提取物 +绿茶提取物(各10μg/ml) 3 38.0±3.5 成分(剂量)： n RANK-L 抑制(％) 依普黄酮(Ostivone)+葡萄籽提取物+绿茶提取物(各10μg/ml) 3 9.7±2.8 石榴+葡萄籽提取物+绿茶提取物(各10μg/ml) 3 26.9±4.8 石榴(10μg/ml)+葡萄籽提取物(1μg/ml) 2 52.7±1.0 石榴(10μg/ml)+葡萄籽提取物(1μg/ml) 2 51.1±1.8 石榴(20μg/ml)+葡萄籽提取物(2μg/ml) 2 58.2±0.5 石榴(30μg/ml)+葡萄籽提取物(1μg/ml) 2 64.3±2.1 石榴(30μg/ml)+葡萄籽提取物(2μg/ml) 2 59.9±1.2 石榴(30μg/ml)+葡萄籽提取物(5μg/ml) 2 57.2±3.1
实施例5：从石榴分离安石榴甙
将新鲜石榴剥皮以使种子和果皮分离。使用水和乙醇组 合(80∶20)分别提取种子、果皮、和果肉。果皮、种子、和果肉中的每 一种都产生有安石榴甙提取物，但石榴果皮提取物得到最高水平的安 石榴甙。此外，水显示为用于提取安石榴甙的最好提取溶剂。
实施例6：安石榴甙对RANK-L的抑制
使用100％DMSO以100mg/ml从石榴，包括从石榴果 皮、外壳、肉果、和种子提取安石榴甙试样。不去除提取物中的颗粒 物质。在不含酚红(雌激素)的MEM和0.1％FBS中稀释安石榴甙试样， 以降低本底信号至十倍最终浓度。使最终DMSO浓度保持低于0.2％， 在处理期间保持恒定。在未处理组中使用DMSO溶剂对照。
以200,000细胞每孔将MG63细胞(ATCC编号 CRL-1472)，来源于人的骨肉瘤细胞系接种到10％FBS的不含酚红的 MEM的12孔板中。第二天将培养基改为0.1％FBS的不含酚红的 MEM。将细胞孵育四小时，然后以1、10、和100μg/ml的安石榴甙 浓度处理试样。
在四小时的处理之后，将加入IL-1b(Calbiochem(目录编 号407615)，10μg/ml的储液，目录编号407615)至3ng/mL的最终浓 度。然后允许处理的细胞和刺激物IL-1b在37℃下孵育16小时。
在16小时之后将细胞溶解，用RNasy纯化试剂盒(Qiagen) 从细胞提取RNA。将RNA逆转录形成cDNA，使用2-步骤qRT-PCR 试剂(Invitrogen)和4μl的纯化的RNA通过qPCR定量。在50μL反应 中，在具有1μl的RANK-L基因特异性引物的Stratagene Mx4000中 退火温度为57℃(初始浓度10μM；HLUX3013920，Invitrogen Inc.)。
获得RANK-L和GAPDH基因表达Ct数据。用对GAPDH 表达的调节来定量RNA。使用RANK-L表达的未处理对照值来评估 处理影响。结果于下面的表13中报道。 表13：安石榴甙对RANK-L表达的影响 成分 N RANk-L表达(增加倍数) 未处理的 2 1.0±0.1 IL1B(3μg/ml) 2 3.3±0 安石榴甙1μg/ml 2 2.6±0.5 安石榴甙10μg/ml 2 1.9±0.4 安石榴甙100μg/ml 2 0.7±.02
如表13所示，从石榴提纯的安石榴甙以剂量依赖的形式 抑制IL-1b刺激的RANK-L基因表达，在100μg/mL时完全抑制 RANK-L表达。
实施例7：石榴的安石榴甙对IV型胶原酶(MMP9)蛋白 表达的抑制。
在含有0.5％BSA的DMEM中共培养角质形成细胞和成 纤维细胞。将共培养物暴露于各种浓度的从石榴中提取的安石榴甙 (0.1％-10％)中。具体地说，测试浓度为1.0μg/ml、10μg/ml、和100μg/ml 的石榴提取物抑制IV型胶原酶蛋白(基质金属蛋白酶-9/MMP9)表达的 能力。在暴露于石榴提取物之后，用10ng/ml的IL-1B刺激共培养细 胞18小时。在用IL-1B刺激18小时之后，测定培养基中的MMP9浓 度，如下面的表14所示。 表14：石榴提取物对MMP9(IV型胶原酶)蛋白表达的影响 试验的石榴提取物 N MMP9的抑制 未处理的 2 1.0±0.1 IL1B(10ng/ml) 2 1.65 安石榴甙1μg/ml 4 1.5±.06 安石榴甙10μg/ml 4 1.2±.04 安石榴甙100μg/ml 4 1.0±0.1
表14报道的结果说明：在体外，石榴的安石榴甙抑制 IL-1B刺激的胶原酶(MMP9)从角质形成细胞释放。这些结果表明， 安石榴甙抑制炎症-刺激的胞外基质的分解。激活的破骨细胞通过分泌 基质溶解酶(MMP)降低骨强度并增加骨丢失，以分解骨的胶原/磷酸钙 构架。期望阻断对骨胶原/钙结构的破坏，以维持/改善骨强度和骨结 构。增加的骨强度和骨结构的特点在于增加骨矿物质密度、增加骨体 积、增加小梁细胞数目、减少小梁间距、改善骨构造、增加使断裂骨 所需的最大力、和增加骨的刚度。 实施例8：葡萄籽提取物和石榴提取物对溶组织梭菌胶原酶活性 的抑制
通过量取100mg的粉末制备样品。然后通过按顺序加入 5∶3∶2比值的DMSO∶乙醇∶水制备50mg/ml的总样品提取物。因此 对于100mg的粉末，可使用1ml DMSO、0.6ml乙醇、和0.4ml水。 通过涡旋将溶液充分混合，然后在有声水浴中孵育10分钟。将样品 由50mg/ml的储液浓度稀释至测试浓度。
使用市售的试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)测定 对胶原酶活性的抑制。该试剂盒基于消化用荧光标签标记的胶原底物 的能力。在消化之前，将底物的荧光猝灭(quench)。在暴露于胶原酶 之后，底物被切割，猝灭效应终止，结果荧光增强。首先将样品(依照 上述方法制备)加入到试剂盒提供的胶原酶(0.2单位/ml)中。然后加入 荧光底物(50μg/ml)，在室温下反应孵育1小时。在光吸收酶标仪(plate reader)上在495/515nm的激发/发射波长处读取荧光。将数据表示为与 不添加任何抑制剂的MMP相比的％对照。100％总的酶活性降低被认 为是阳性反应。
对于石榴提取物和葡萄籽提取物，均观察到趋向于胶原 酶活性减小的剂量依赖性反应(Table 15)。
激活的破骨细胞通过分泌基质消化酶(MMP)而降低骨强 度和增加骨丢失，以分解骨的胶原/磷酸钙构架。依据本文提出的机制， 发现特别是葡萄籽和石榴提取物为胶原酶活性的有效抑制剂。依据该 活性，可获得胶原产生的净正平衡，引起骨强度和骨完整性的维持或 改善。 表15：葡萄籽提取物和石榴提取物对C.溶组织胶原酶活性的抑制
实施例9：测量骨再吸收的抑制的颅盖分析
为了在子宫内标记新生小鼠的细胞，用45Ca(25uCi/小鼠) 注射怀孕的CD-1雌性小鼠(在按时间计算的第15天)。对4天大的小 鼠进行解剖，取出颅盖(颅骨)，切成两半。将切开的一半颅盖置于1ml 的BGJ生长培养基(Sigma)中的金属网格(在表面)上，该BGJ生长培养 基包含0.1％BSA且添加有谷氨酰胺和青霉素/链霉素。在37℃下在 5％CO2增湿培养器中使骨孵育24小时，然后转移至含有1ml培养基 且加有因子(IL-1、PTH和/或化合物)的孔中。在上述条件下将处理过 的骨再孵育72小时。在该孵育期之后，取出骨，并放置在含20％TCA 的闪烁瓶中1.5小时(以测量保留在骨中的标记的钙)，然后用闪烁液计 数。此外，也对0.4ml的培养基计数(以测定从骨释放的标记的钙的量)。 将结果表示为45Ca释放的％，并还可以报道为T/C比值。
对于一些因子和化合物，可以使用该方法的修改。因为 大部分破骨细胞在预孵育期之后在颅盖中形成，所以影响破骨细胞形 成的因子在预孵育期间可能具有更大的作用。因此，对于许多化合物 而言，将它们包括进预孵育培养基中。
在该试验中测试提取物包括银杏(Ginkgo biloba)提取物、 绿茶提取物、槐角(Sophora fructus japonica)提取物、地黄(Rehmannia sp.)提取物、石榴提取物、西伯利亚人参、依普黄酮、葡萄籽提取物、 和当归提取物。在颅盖试验中测试这些提取物的结果于下面的表16 中报道。
在表16中，R-1＝地黄(Rehmannia sp.)(EUL)，SFJ＝槐 角(Sophora fructus japonica)，SG＝西伯利亚人参，SJ＝槐(Sophora japonica)(NuPharma)，I＝依普黄酮，GB＝银杏(Ginkgo biloba)，GT ＝绿茶，P-1＝石榴提取物，P-2＝石榴提取物(Naturex)，GS＝葡萄 籽，DQ＝当归提取物。在下面的表中，上标a(a)指该结果显著不同 于(p＜0.05)空白试样(浓度为0μg/ml)结果。p＜0.05的差异(即其中误差 界限小于或等于5％)被认为是显著的。如表16所显示，石榴、依普黄 酮、绿茶提取物、和葡萄籽提取物抑制IL-1b诱导的骨再吸收/钙释放。 表16：颅盖的数据-骨再吸收/Ca2+释放的抑制
用本发明的组合物中有用的提取物的各种组合重复上述 颅盖试验。每一制剂的结果于下面的表16中报道。
在表17中，P＝石榴，I＝依普黄酮，GS＝葡萄籽，GT ＝绿茶。阿伦膦酸盐用作阳性对照。在下面的表中，上标a(a)指该结 果显著不同于(p＜0.05)空白试样(浓度为0μg/ml)的结果。p＜0.05的差 异(即其中误差界限小于或等于5％)被认为是显著的。如表17所示， 所有的测试组合抑制IL-1b诱导的骨再吸收/钙的释放。 表17：颅盖的数据-提取物的组合对骨再吸收/钙释放的抑制
实施例10：测量对RANK-L的抑制和对骨再吸收的抑制 的体内研究
在涉及约12-14周龄、近似体重为200-250克的雌性、完 整大鼠的体内研究中，试验两种不同的配方。配方1包括不同剂量的 依普黄酮、石榴提取物、和葡萄籽提取物，如在表18中所报道。配 方2包括不同剂量的石榴提取物和葡萄籽提取物和固定剂量的依普 黄酮，如在表18中所报道。对于每个配方试验三个剂量。该研究使 用8组大鼠、每组15只大鼠，持续约35天。
下表18标明给予8个试验组中的每一个的配方。表18 中的剂量基于推荐的人剂量，使用FDA换算公式：人等效剂量(HED， mg/kg)＝大鼠剂量mg/kg x(大鼠重量kg/人重量kg)0.33，以转换成合适 的相应大鼠剂量。 HED＝大鼠NOAEL x(W-大鼠/W-人)(1-b)，b＝0.67。
在表18中，I＝依普黄酮，P＝石榴提取物，GS＝葡萄 籽提取物。 表18：用于体内分析的剂量和配方 组编号： 配方： 剂量(mg)： 1 P+GS P＝500，GS＝50 2 P+GS P＝1250，GS＝125 3 P+GS P＝2000，GS＝200 4 P+GS+I P＝0，GS＝0，I＝600， 5 P+GS+I P＝500，GS＝50，I＝600， 6 P+GS+I P＝1250，GS＝125，I＝600， 7 安慰剂 8 阳性对照(阿伦膦酸盐-0.5 mg/天)
为了引入由雌激素禁断(estrogen withdrawal)引起的快速 骨再吸收，在该研究中使用切除卵巢的(OVX)大鼠模型。见，例如Alam 等，″红花籽油在诱导骨质疏松症的切除卵巢的大鼠中的作用″ (“Effects of Safflower Seed Oil in Osteoporosis-induced Ovariectomized Rats，”)Am.J.Chinese Medicine，2006，第34卷(4)：601-612，其内容通 过引用结合到本文中。重要的是评估由卵巢切除步骤引起的骨再吸收 的作用，因此在该研究中还包括假手术对照(n＝6)，一组没有经过卵巢 切除术的雌性大鼠。
该研究使用随机化安慰剂作对照的剂量响应设计。将总 共120个12-14周龄、体重约200-250克的大鼠(n＝15每组)随机分配 到各组，持续35天。以15克/天喂养动物，包括安慰剂饮食或上述配 方中的一种，从实验的开始持续35天。每天早上以15克/大鼠/天的 比例对大鼠喂食。对于整个实验过程，允许大鼠自由获取水，将其关 养在适当的笼子中。在整个实验期间允许无限制的活动。
通过测量结果评价该配方对抗再吸收的效果，所述测量 结果包括DEXA扫描(以测定骨矿物质密度)、生物力学测量(以收集骨 强度和功能信息)、微-CT测量(以评估实际的骨质量和功能信息)、和 组织形态学测量(以评估骨质量和功能信息)。Pa Revell，″骨的组织形 态测定术，″(“Histomorphometry of Bone，”)J.Clin.Pathol.，1983.第36 卷：1321-1331描述了进行组织形态学测量的方法，其全部内容通过引 用结合到本文中。使用的术语和单位是由the Histomorphometry Nomenclature Committee of the American Society for Bone and Mineral Research推荐的。在以下文献中描述了进行微-CT测量的方法：Jiang 等，″动物骨骼3D结构的微CT和微MR影像″(“Micro CT and Micro MR imagining of 3D architecture of animal skeleton.”)，J.Musculoskel Neuron Interact.2000.第1卷：45-51，其全部内容通过引用结合到本文 中。在35天的处理之后测定这些测量结果。
DEXA扫描和微-CT测量结果都表明与假手术对照的(不 切除卵巢的)大鼠相比，切除卵巢的(OVX)大鼠中的骨矿物质密度大量 损失。如使骨断裂的最大力和骨刚度测量值所表明，骨强度也显著地 降低，OVX大鼠的骨体积/总体积％和小梁细胞数目也降低。此外， 在OVX大鼠中也观察到小梁间距(小梁彼此之间的平均距离)明显增 加。用阿伦膦酸盐药物(已知减少破骨细胞发生的有效的抗再吸收剂) 处理阳性对照组ALD。见，例如，Iwamoto等，″切除卵巢的大鼠中 阿伦膦酸盐和阿法骨化醇对骨松质和骨密质质量和骨力学性质的影 响的比较″(“Comparative effects of alendronate and alfacalcidol on cancellous and cortical bone mass and bone mechanical properties in ovariectomized rats.”)Exp.Anim.2006.第55卷(4)：357-67，其全部内容 通过引用结合到本文中。阳性对照组(ALD)的骨矿物质密度、骨体积/ 总体积％、和小梁数目得到增加，小梁间距得到显著减小。
用于本研究的一种效能测定技术是微-CT测量，微-CT测 量提供实际的骨质量、结构和功能信息。如下面表19所示，在35天 的处理之后，在预防骨再吸收上，给予组2、3、4、5、和6的配方比 安慰剂(空白处理)更有效。骨矿物质密度(BMD)、骨体积、小梁数目 和小梁间距的结果与骨健康有关。上标a(a)指该结果显著不同于安慰 剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。 表19：组织形态学测量结果 组编号 骨矿物质密度 ％骨体积/总体积％ 小梁数目 (N/6mm2) 小梁间距 1 21％ 107％a 58％a -47％a 2 32％a132％a 99％a -52％a 3 32％a145％a 122％a -64％a 4 25％a137％a 117％a -58％a 5 22％ 156％ 96％ -42％ 6 1％ 11％ 14％ -18％ ALD 124％a632％a 313％a -88％a 假手术 41％a374％a 281％a -82％a
在表20中，骨矿物质密度的结果表明：给予组2、3、和 4的配方有效地降低破骨细胞发生和增加骨矿物质密度。结果还表明： 给予组1、2、3、和4的配方有效地减少破骨细胞发生、增加骨体积、 增加小梁细胞数目和减小小梁细胞间距。上标a(a)指该结果显著不同 于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。 表20：DEXA测量结果 组编号 骨矿物质密度 1 0％ 2 7％a 3 10％a 4 5％a 5 5％a 6 3％a ALD 35％a 假手术 14％a
组织形态学测量也用作测定配方1和2的效能的工具， 其中定量来自每组的骨小梁体积。该分析的结果报道于表21中。上 标a(a)表明该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著 的。
如表21所示，与安慰剂组相比，配方1引起骨小梁体积 显著增加(61.4％)。在组2(13.5％)和组3(13.1％)中虽然观察到骨小梁 体积增加，但幅度较小。 表21：组织形态学测量结果 组编号 ％骨体积 1 61.4％a 2 13.5％ 3 13.1％a 4 -12.9％ 5 6.4％ 6 41.7％ ALD 214.1％a 假手术 127.9％a
除了骨量和骨体积评价之外，依据两个不同的参数对骨 强度进行力学测试。一项测试用以测定使骨断裂所需的最大力，另一 项测试用以测定骨的刚度(弹性)。在Sturmer等，″用于正常的和骨质 疏松的大鼠干骺端胫骨的标准化弯曲试验和断裂试验：雌二醇、睾酮、 和雷洛昔芬的作用″“Standardized Bending and Breaking Test for the Normal and Osteoporotic Metaphyseal Tibias of the Rat：Effect of Estradiol，Testosterone，and Raloxifene，”J.Bone and Mineral Research， 2006.第21卷(1)：89-96中描述了测定骨强度和刚度的方法，其全部内 容通过引用结合到本文中。该分析结果于下面的表22中报道。上标a (a)指该结果显著不同于安慰剂组。p＜0.05的差异被认为是显著的。
表22中列出的结果表明：根据与安慰剂组相比，给予组 2和3的配方1致使断裂骨所需的最大力增加8.3％和8.1％。相对于安 慰剂处理，给予组3的配方1致使骨刚度增加16.0％。 表22：生物力学测量结果 组编号 使骨断裂所需的最大力 骨刚度 1 -0.4 4.9 2 8.3a 0.6 3 8.1a 16.0a 4 -0.6 4.6 5 0.9 10.2 6 3.0 3.3 ALD -0.4 0.2 假手术 -0.3 6.0
得自DEXA扫描、生物力学测量、微-CT测量、和组织 形态学测量的结果清楚地说明：在雌激素禁断期间，由石榴和葡萄籽 提取物组成的配方1显示出改善骨结构和构造并增加骨强度的能力。
意欲：将以上详细描述视为例证性的而非限制性，并理 解以上的权利要求，包括所有的同等物，意欲定义本发明的精神和范 围。