描述
本发明涉及式A-R-X的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物 制剂中的用途，所述药物制剂用于预防或治疗疾病或不希望的状况， 特别是在人中；本发明还涉及此类制剂本身。
过量且长期的酒精消费常常导致肝脏疾病，即所谓的脂肪肝，它 能进一步发展成肝脏炎症，或者更准确地说肝炎，以及在晚期发展成 肝硬化。因此，各自的肝损伤的风险和程度直接取决于酒精消费的量 和持续时间，从而风险是因人而异的。酒精引起的肝脏炎症(酒精性 肝炎)是一种可能威胁生命的疾病，其可伴有发热、黄疸以及白血球 增加。此类酒精引起的肝脏炎症通过完全的酒精禁戒是可以治愈的， 除了在肝硬化情况下的瘢痕外。
除了这种酒精诱导的所谓的脂肪肝肝炎(Fettleberhepatitis) 或酒精性脂肪性肝炎(alkoholischen Steato-Hepatitis，ASH)之 外，肝炎也在并不沉溺于酒精滥用或根本不摄取任何酒精的人中发生。 此类肝炎例如由环境毒物(例如在漆工厂工作的情况下)和/或也由药 物诱导。
已知，代谢中的氧化过程借助于细胞色素来进行。细胞色素是许 多不同的酶，其活性中心具有血红素结构，该结构在许多氧化反应和 羟基化反应中催化电子转移至受体。
例如，P450-家族的细胞色素(CYP-450)起着重要的作用。在此 涉及单加氧酶，其普遍存在并且属于用于疏水性外源物质的代谢和疏 水性激素(即类固醇)的修饰的最重要的酶。
细胞色素-P450-酶的主要任务之一是通过羟基化来溶解外源物 质，并以这种方式将外源物质引向肾脏排泄。因此，细胞色素-P450- 酶在解毒作用中起着重要作用。
据估计，大约一半的所有目前药物是被肝脏的细胞色素-P450-酶 羟基化的。因此，许多药物在体内的停留时间由于细胞色素-P450-酶 的活性而在一定程度上显著地减少。在哺乳动物中在肝脏中存在占优 势量的细胞色素P450，这是因为肝脏是首要解毒器官。细胞色素P450 通常以结合在内质网膜上的形式存在。
在昆虫对于杀虫剂和植物对于除草剂的抗性的介导中，细胞色素 -P450-酶也起着关键作用。
在它的基本结构中，细胞色素P450具有六配位的血红素基团，在 该血红素基团上催化下面模式的反应
RH+O2+2H++2e-→ROH+H2O。
在此，该反应所必需的两个电子例如由NADPH-细胞色素P450还原酶提 供，所述电子与酶复合物相结合。以这种方式，尤其是在P450上还产 生具有细胞毒性的活性氧类别(ROS)。
已知，不仅在酒精消费的情况下，而且在非酒精性脂肪肝肝炎的 情况下以及在胰腺炎的情况下，都诱导了细胞色素P450-2E1的合成。 例如M.H.Wang等人(Archives of Biochemistry and Biophysics， (1995)Vol.317，第299至304页)描述了这种与其他细胞色素非常 不同的同种型的功能和作用机制。根据这篇文章，该酶具有一个长度 为大约15的通道，在其末端存在着具有有着中央铁原子的血红素环 的反应中心。
长期以来推测，化学治疗剂，例如那些在癌症治疗中所使用的化 学治疗剂，也是经由细胞色素P450-酶降解的。
然而，在Jiang等人的一篇近期论文(“Cytochrome P450 2J2 Promotes the Neoplastic Phenotype of Carcinoma Cells and is Up-regulated in Human Tumors”，Cancer Res.2005，65：4707-4715) 中首次表明，细胞色素P450甚至具有促癌作用。
已证明，在人类肿瘤中细胞色素P450 2J2的基因表达被上调。细 胞色素P450 2J2为环氧合酶(Epoxygenase)，其将底物花生四烯酸转 变成四种不同的异构的环氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoide ，EET)。在该论文中进一步显示，EET具有抑制凋亡的作用， 因为它保护肿瘤细胞不受肿瘤坏死因子的影响，并且以这种方式延长 癌细胞的存活期。此外，它还促进肿瘤细胞的有丝分裂以及增殖。
同样地，还能够证明，EET促进血管发生，即新血管的形成。该过 程在肿瘤的生长中起着重要的作用(Pozzi A.等人， “Characterization of 5，6-and 8，9-Epoxyeicosatrienoic Acids (5，6-and 8，9-EET)as Potentin“Vivo Angiogenic Lipids”，J. Biol.Chem.280：27138-27146，2005)。
然而，在Schattenberg等人的一篇文章(“Hepatocyte CYP2E1 overexpression and steatohepatitis lead to impaired hepatic insulin signalling”，J.Biol Chem.2005；280：9887-9894)中 首次将细胞色素P450的过表达和糖尿病联系了起来。
Müller-Enoch等人(Z.Naturforsch.(2001)56c，1082-1090) 描述了借助于溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰肌醇以及花生四烯酸和油 酸，或借助于单酰基甘油、单油酰基甘油、单棕榈酰基甘油来抑制大 鼠的细胞色素P450 2B1。
此外，T.Haehner，D.Müller-Enoch等人(Z.Naturforschung (2004)59c，第599-605页)描述了单链脂质分子对于大鼠的细胞色素 P450 2B1这种同种型的活性的影响。
本发明的目标是提供用于制备药物制剂的药剂，所述药物制剂适 合用于预防和治疗癌症、酒精滥用的病理学后遗症、病毒性肝炎、脂 肪性肝炎、急性和慢性胰腺炎、中毒性肾病、在糖尿病情况下的肝胰 岛素抵抗、在威尔逊病和铁质沉着情况下的肝损伤、缺血-再灌注损伤； 用作针对环境毒物和药物中毒的解毒剂；用于延长药物在机体内的停 留时间；或者用于对抗在施用化学治疗剂时的毒性副作用。
这个目标用具有在权利要求书中所定义的特征的化合物来实现。
换句话说，令人吃惊地发现，上述疾病可以用此类化合物来治疗。 这些化合物抑制活性氧类别(ROS)，特别是氧自由基如超氧阴离子 (O2·-)以及过氧化氢(H2O2)的形成，它们在细胞色素P450上不在直 接的氧化还原反应中被消耗，特别是在基因家族2的同种型，尤其是2E1 以及2J2上。
同样地，发现该化合物还抑制花生四烯酸转变成异构的环氧二十 碳三烯酸。进一步还显示，在给予此类化合物的情况下，还能够抑制 外源物质的羟基化。
根据本发明所使用的化合物具有下式
A-R-X。
备选地，也可以使用其药学上可接受的盐。
在此，R表示优选地具有6至40个碳原子的脂肪族或芳香族烃残基， 其具有特别是末端的残基A，所述残基A是亲水性的或者是氢；和X表示 具有至少一个自由碳原子或杂原子电子对和/或π电子的残基。特别 地，残基R是亲脂性的。
残基R通常为烷基。因而，它可以是直链的或支化的，具有单键、 双键或三键，和可以是经取代的。通常，它具有有着6至26个，特别是 8至22个碳原子的脂肪族主链。具有有着10至15个，特别是10至13个碳 原子的主链的烃链是适宜的。如果R为脂肪族或芳香族烃残基(其可以 是稠合的和/或经亲脂取代的)，那么它通常具有至少5或6个以及至多 40或至多25个碳原子。
其他适宜的最小长度为7或8个C-原子，和其他适宜的最大长度为 22或20个C-原子。
适宜的残基X为杂环，以及炔烃残基。所述杂环特别为包含氮、氧 和/或硫的杂环。所述杂环可以是芳香族的和/或非芳香族的，并且通 常具有5或6个环原子。在合适的情况下，X也可以是稠合的杂环。例如 此类杂环为咪唑、吡咯、吡唑、吡啶、吡嗪、吲哚、异吲哚、吲唑。 优选的杂环为具有6个和特别是5个原子并且有着一个、两个或三个杂 原子的环。其他合适的杂环为例如噻唑、三唑、呋喃。
优选的炔烃具有-C≡C-R12这样的结构，其中R12为氢原子或任选地 经取代的C1-至C25-或最大C10-烷基，所述烷基本身可以任选地具有双键 或三键。然而，R12通常具有最大5个，特别是最大3个C-原子。在进一 步的适宜的本发明实施方案中，残基X表示例如：
-伯胺、仲胺和叔胺，
-取代的或未取代的重氮官能团，例如肼和腙，
-腈、异腈，
-含S的官能团，例如硫氰酸盐和异硫氰酸盐、烷基硫、亚砜、 硫醇基团，
-亚甲二氧基官能团，
-烷基醚和烷基硫醚。
适宜地，残基X为与辅基血红素基团相配位的残基。
根据本发明待使用的分子的亲水性末端A可以是任何药学上合适 的亲水性官能团，特别是-OH、-COOH、磷酸盐基团(Phosphatgruppe)、 磷酸酯、硫酸盐基团(Sulfatgruppe)、氨基、SH，以及氨基酸或多 元醇、肉碱(γ-N-三甲基氨基-β-羟基-丁酸)、鞘氨醇头 (Sphingosin-Kopf)(1，3-二羟基-2-氨基-丙基残基)。如果A是氢， 那么虽然A不是亲水性末端，但该化合物还是可以用作根据本发明的药 物制剂。优选的氨基酸特别是具有带正电荷或负电荷的残基的那些， 例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、高半胱氨酸，丝氨酸、高丝氨酸和/或瓜氨酸。优选的多元醇特 别是甘油。甘油以及糖类都可以任选地被取代。一种适宜的取代为例 如用氨基基团或SH基团，或者更确切地说磷酸盐基团或硫酸盐基团， 来替换OH-基团。在一个特别适宜的实施方案中，A是下式的甘油残基：
其中，残基R2至R4中的至少一个为前面定义的残基RX，和B为氧、硫、 硒或硒酸盐(Selenat)、氨基、磷酸盐基团或硫酸盐基团。在根据本 发明的另一个实施方案中，R2至R4中的另外的残基为磷脂酰胆碱残基、 磷脂酰乙醇胺残基、磷脂酰丝氨酸残基或磷脂酰肌醇残基。其他合适 的残基为例如前面提及的氨基酸，特别是具有带正电荷或负电荷的残 基的那些。
在1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸衍生物的情况下，根据本发明的化 合物也包含脑磷脂、神经酰胺、卵磷脂和相应的磷脂的基本结构，其 具有如前面所定义的末端X。
非支化的、饱和的和非取代的典型代表X-R或BR2-4例如具有下式：
a)链烷醇残基：HO-CH2-(Ch2)a-X
b)烷基硫酸盐残基(Alkylsulfatrest)：-O3SO-CH2-(CH2)a-X
c)烷基-CoA残基：CoA-S-CO-(CH2)a-X
d)链烷酸残基：HOOC-(CH2)a-X
其中，a优选地表示至少6和特别是至少7。特别优选的是至少8，其中9 是十分特别优选的。a的优选的最大值为40，特别是26，其中优选的是 22，特别是12。11和尤其是10是特别优选的。
对于本领域技术人员而言，支化的、不饱和的或取代的典型代表 的相应的式是容易推断出的，因此不需要另外加以描述。
脂肪族残基R的其他例子是例如十二烷残基、十八烷醇残基、十一 烷基硫酸盐残基、棕榈基-CoA残基或月桂酸残基。
在一个备选的实施方案中，残基X的π电子特别是来自烯属，尤其 是炔属的双键和/或三键，所述双键和/或三键通常位于末端。特别适 宜的残基是通过氮原子进行结合的咪唑残基或乙炔残基(-C≡C-)。
已经证明，在根据本发明使用前面所定义的化合物(特别是包含 咪唑化或乙炔化的脂肪酸作为X的化合物，以及经证明在体外特别有效 的化合物，例如17-十八炔基-1-酸)的情况下，通过用例如硫酸盐残 基替代此类分子的羧基末端，或通过经添加2个甲基或1个脂肪族或芳 香族环来取代脂肪族主链的邻近羧基末端的原子，即1-3C-原子(α， β，γ-位置)，可以显著地延长许多活性物质在血液中的停留时间。 以这种方式，与体外活性相应地，还改善了体内活性。
因此，例如2，2-二甲基-11-十二炔酸和10-十一炔基-硫酸盐在体 外具有如10-十一炔酸一样高的细胞色素-P450活性的抑制作用，然而 在体内它们远比10-十一炔酸占优。
在此，优选地规定，当R1为咪唑残基时，脂肪族主链的长度包含6 至26个，特别是9至20个或者19个碳原子。该优选基团的一个典型代表 是例如12-咪唑基-十二烷醇或1-咪唑基-十二烷。关于这些以及其他物 质的相关的结构式，可参见附图。
此外，根据本发明的一个实施方案规定，当R1为乙炔残基时，脂 肪族主链的长度包含6至26个碳原子。该优选基团的一个典型代表是例 如17-十八炔基-1-酸。
根据另一个实施方案，当R1为乙炔残基时，脂肪族主链的长度包 含9-13个碳原子。该优选基团的典型代表是例如2，2-二甲基-11-十二 炔酸、10-十一炔基-硫酸盐、10-十一炔酸或10-十一炔醇。
这些化合物具有一系列优点。首先，它们对于β-氧化代谢过程的 酶不是可直接接近的，因此不会立即被这些酶所代谢。
根据上述定义的磷酸甘油酯以及甘油三酯(其在甘油残基的两个 位置处被式-R-X的残基，例如乙炔化或咪唑化的脂肪族化合物残基 (Aliphatrest)所取代)在吸收后首先在肠中被水解，也就是说是这 样的，即两个脂肪族残基中的一个被解离。以这种方式，产生乙炔化 或咪唑化的甘油单酯，由于其溶解度，所述甘油单酯也被称为“溶血 脂质(Lysolipoide)”，并且其借助于脂蛋白而被运送至体内的作用 位点，所述脂蛋白因而是由脂质和蛋白质组成的非共价聚集体，该非 共价聚集体形成微团样颗粒并用于血液中水不溶性脂质的运输。
此外，这一点也适用于根据上面定义的乙炔化或咪唑化的甘油单 酯，其已经被如此地施用。
由于特定的致病组织例如肿瘤具有高的能量更新并且通过释放生 长因子(VEGF、PDGF)来促进其自身的血管化，所以负载有所述乙炔 化或咪唑化甘油单酯的脂蛋白优选地随血流迁移到这些组织中。因此， “溶血脂质”形式的乙炔化或咪唑化的脂肪族化合物(Aliphate)的 “包装”使得能够将其靶向运输至所述的致病组织。
在根据本发明的应用的情况下，这些化合物在癌症治疗中显示出 效用，其中它们尤其抑制花生四烯酸转变成环氧二十碳三烯酸。后者 促进细胞分裂和细胞增殖并且抑制肿瘤细胞的凋亡。同样地，在应用 这类化合物时，抑制了化学治疗剂的羟基化，而化学治疗剂的羟基化 最终导致所述化学治疗剂的分泌并从而导致其失活。因此，这类化合 物不仅可用于直接的而且可用于辅助性的肿瘤治疗。由于这个原因， 上述的优选实施方案是特别有成功希望的，其使得能够靶向运输至致 病组织中。
进一步地，本发明提供了药物制剂，其在药学上可接受的载体中 包含根据本发明的化合物。
此外，根据本发明的化合物或其药物制剂的可能的适应症在于治 疗酒精滥用的后遗症。它们特别是肝损伤或者其他酒精引起的炎症过 程。除了纯粹由酒精引起的肝损伤之外，饮食引起的和内分泌的因素 (例如肥胖)以及糖尿病和高脂血症也同样可以不依赖于酒精地造成 严重的肝损伤，肝损伤可以是从脂肪肝肝炎(非酒精性脂肪性肝炎 ＝NASH)直到肝硬化。这类酒精性和非酒精性脂肪肝疾病经常伴随有肝 脏的病毒感染。在这种情况下，疾病会非常迅速地发展。已经证明， 所有上述疾病或者其原因或后遗症用根据本发明的化合物都是可治疗 的。
还发现，这些物质非常适合用于治疗胰腺的炎症。除了酒精滥用 外，此类炎症或胰腺炎还可由毒性物质引起。属于所述毒性物质的特 别包括，环境毒物，例如职业化学药品或者药物。此外，病毒感染或 代谢-内分泌因素也能导致此类胰腺炎症，其中，在所有的情况下，活 性氧类别都参与了疾病的产生和疾病的发展。
此外，在治疗糖尿病(包括2型和1型糖尿病)的情况下，根据本 发明的药剂也被证实是合适的。
此外，用根据本发明的药物还可以治疗中毒性肾病，以及其他疾 病，例如那些由于施用化学治疗剂(特别是细胞毒素，例如金属络合 物如顺铂、卡铂、二氯化二茂钛或金络合物)的副作用而引起的疾病。 在此，特别地证明，能够抑制金属络合物或者其他毒性试剂的器官毒 性，所述其他毒性试剂例如为卤代烃，更确切地说单卤代烃和多卤代 烃，其中还包括氟烷类型的气体麻醉药(Dampfnarkotika)，以及相 应的芳香族烃，亚硝胺类，丙烯酰胺，或药物，如对乙酰氨基酚、氨 甲蝶呤、异烟肼或氨基糖苷类抗生素，或者X-射线造影剂。因此，根 据本发明的药物也适合用于治疗环境毒物的器官毒性，特别是在器官 如肝脏、肾脏、中枢神经系统、胰脏等中作为环境毒物的解毒剂。
因此，还使得能够例如在癌症治疗中给予更高剂量的细胞生长抑 制剂，并且在这种背景下，还可能作为辅助性治疗来提高化疗的成功 前景。
已证明十分特别适合于避免由于生物组织的再灌注而出现的损 伤，例如在器官梗塞后，尤其是在心脏梗塞以及脑梗塞(心肌梗死， 中风)后。因此，例如在动物实验中已证明，这样的再灌注损伤贡献 了60-80％的组织破坏，或者说组织坏死的扩散可以减少这样的倍数。 长期以来已知，再灌注损伤的主要原因是在缺血期间形成的氧自由基。
因此，根据本发明的药剂也特别适合用于避免在移植的器官情况 下的再灌注损伤。将这样的器官保持在经冷却的营养液中，直至将其 移植入新的受者体内。在移植后，在接通受者的循环系统后体液流过 这些器官，这导致再灌注损伤。通过在储存之前和期间以及在移植入 受者机体内之前不久施用根据本发明的药剂，也可解决这个重要的移 植问题。
铁(或者在威尔逊病的情况下，铜)这种过渡金属的积累造成由 细胞色素P450导致的氧化损伤的扩大。除了在铁沉着病范围内的铁过 载之外，已知在缺血-再灌注损伤的情况下也出现游离铁的细胞内浓度 的显著上升。细胞内铁上升也可由毒性化合物例如顺铂或卤代烃或者 由病毒性肝炎造成。首先是肝脏受到影响，但例如在通过肾脏消除的 顺铂的情况下，也可以是肾脏受到影响。由过渡金属铁(或者在威尔 逊病的情况下，铜)造成的氧化损伤的生物化学基础是芬顿反应。
H2O2+Fe2+→Fe3++HO·+HO-
在此，在细胞色素P450反应循环的范围内所产生的H2O2(氧化还原电位 +0.32伏)转变成有极强氧化性的羟基自由基HO·(氧化还原电位+2.31 伏)。
在由顺铂引起的肾病的范围内游离铁浓度的增加在Baliga等人的 文章(“Role of cytochrome P450 as a source of catalytic iron in cisplatin-induced nephrotoxicity”，Kidney Int.1998；54： 1562-1569)中作了描述。在缺血-再灌注损伤的情况下或在病毒性肝 炎的情况下的铁增加由例如Paller等人(“Cytochrome P450 mediates tissue damaging hydroxyl radical formation during reoxygenation of the kidney”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994； 91：7002-7006)或者由Chapoutot等人(“Liver iron excess in patients with hepatotocellular carcinoma developed on viral C cirrhosis”，Gut 2000；46：711-714)作了描述。
特别地，根据本发明的物质被证明是细胞色素P450的基因家族2 的人同种型，或者更确切地说尤其是同种型2E1和2J2，以及由其造成 的疾病的抑制剂。
在本发明的一个特别适宜的实施方案中规定，将所述药物制剂包 入脂质体中。由于该制剂所基于的化合物具有长的脂肪族残基，因此 将其包入脂质体中是非常合适的施用形式。这样的脂质体适于静脉内、 肌内、腹膜内、经皮或口服施用。同样地，作为气雾剂进行施用也是 合适的。
然而，也可以就这样直接施用根据本发明的化合物。在这种情况 下，上述施用方式也是合适的。
合成方法
下面说明了用于合成各种不同的根据本发明的化合物的几种方 法：
1.12-咪唑基-1-十二烷酸的合成
a)12-咪唑基-1-十二烷酸根据在Alterman等人的文章(“Fatty acid discrimination and omega-hydroxylation by cytochrome P450 4A1 and a cytochrome P4504A1/NADPH-P450 reductase fusion protein”，Archives of Biochemistry and Biophysics 1995，320： 289-296)中所描述的方法来合成。
为此，用琼斯试剂将12-溴-1-十二烷醇氧化成12-溴-1-十二烷酸。 然后，用重氮甲烷将白色的固体酸酯化成相应的甲酯。将所述甲酯直 接与咪唑相混合，并在80℃下反应5个小时，从而形成12-咪唑基-1- 十二烷酸甲酯。将如此获得的浓稠物料在水和二氯甲烷之间进行分配， 有机相通过Na2SO4进行干燥并蒸发浓缩。将油状残留物在硅胶上进行色 谱法纯化，然后溶解在甲醇和四氢呋喃(3∶4)的混合物中，掺入 LiOH·H2O，并将混合物回流加热2小时。在使溶剂蒸发后，将白色残留 物再次溶解在水中，用二氯甲烷萃取，酸化至pH5-6，并用乙酸乙酯 再次萃取。将乙酸乙酯-萃取物通过Na2SO4进行干燥，过滤，并蒸发浓 缩。从甲醇/乙醚中重结晶出白色固体残留物，从而得到12-咪唑基-1- 十二烷酸。
b)12-咪唑基-1-十二烷醇和1-咪唑基十二烷根据在Lu等人的文 章(“Heme-coordinating analogs of lauric acid as inhibitors of fatty acidω-hydroxylation”，Archives of Biochemistry and Biophysics，1997，337：1-7)中所描述的方法来合成。
为此，以1∶3的摩尔比将12-溴-1-十二烷醇和咪唑在80℃下加热5 个小时。将粗产物在水和二氯甲烷之间进行分配。有机相通过Na2SO4进行干燥并蒸发浓缩。从苯/正己烷中重结晶出12-咪唑基-1-十二烷 醇。
c)通过在85℃下进行搅拌并加热而从摩尔比为1∶3的1-溴-十二 烷和咪唑中制备1-咪唑基-十二烷。将粗产物溶解在二氯甲烷中，并用 水振摇洗涤三次。将有机相通过Na2SO4进行干燥，过滤，并蒸发浓缩。 使油状蒸发残留物从正己烷中进行结晶，从而得到1-咪唑基-十二烷。
2.12-咪唑基-1-磷脂酰胆碱的合成
在酸性条件下，在二环己基碳二亚胺存在下将磷脂酰胆碱反应成 O-磷酰基异脲。向反应混合物中添加12-咪唑基-1-十二烷醇，后者亲 核攻击磷酰基基团并与之形成酯键，从而形成12-咪唑基-1-磷脂酰胆 碱。如此，二环己基脲析出。为了使该反应成功，作为催化剂的4-二 乙基氨基-吡啶是必需的。
反应机理与Steglich酯化相似，在所述Steglich酯化中使用二环 己基碳二亚胺，以使有机酸与醇进行酯化。
3.1-棕榈酰基-2-咪唑基-甘油基-3-磷脂酰胆碱的合成
合成磷脂酰胆碱-甘油二酯的原理由Eibl等人作了描述 (“Synthesis of labeled phospholipids in high yield”，Methods Enzymol.1983；98：623-32)，所述磷脂酰胆碱-甘油二酯携带未修 饰的脂肪酸和经标记的(在本情况下即乙炔化或咪唑化的)脂肪酸。
3a.1，2-二棕榈酰基-3-苄基-甘油酯的合成
为此，将1，2-异亚丙基-sn-甘油溶解在对二甲苯中，并在添加叔 丁基钾和苄基氯的情况下进行搅拌。在反应完成后，加入等份额的水 以及二异丙基醚，并进行相分离。通过蒸发获得在上层相中所包含的 3-苄基-sn-甘油，并使其经历进一步的纯化步骤。
然后，将纯化的3-苄基-sn-甘油与脂肪酸例如棕榈酸盐一起溶解 在四氯化碳中。在添加4-二乙基氨基-吡啶和二环己基碳二亚胺的情况 下，在3-苄基-sn-甘油的醇基团和脂肪酸的羧基基团之间形成酯键， 其中二环己基脲析出。该反应机制也称为“Steglich酯化”。
除去析出的二环己基脲，并蒸发掉溶剂。在进一步的纯化步骤后， 获得了作为产物的1，2-二棕榈酰基-3-苄基-sn-甘油酯。
3b.1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯的合成
将1，2-二棕榈酰基-3-苄基-sn-甘油酯溶解在四氢呋喃中，并在催 化剂(10％Pd/C)存在下用元素氢进行氢解。如此，苄基被氢原子取 代，从而产生1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯。
3c.1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯的磷酸化
向磷酰三氯中掺入溶解在四氢呋喃中的三乙胺，并在冰中搅拌。 然后，向其中逐滴添加溶解在四氢呋喃中的1，2-二棕榈酰基-sn-甘油 酯。如此，首先产生1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酰二氯。
然后，再次向其中添加溶解在四氢呋喃中的三乙胺，逐滴添加溶 解在四氢呋喃中的溴乙醇，并将温度升至25℃。如此，主要产生1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-溴乙基酯-单氯化物，只有少量的作 为副产物的相应的二溴乙基酯。
将该混合物纯化，冷却，掺入碳酸钠和己烷，并振摇。如此，磷 酸基团和氯之间的键被水解。产生作为产物的1，2-二棕榈酰基-sn-甘 油酯-3-磷酰基-溴乙基酯的钠盐。
以相似的方式制备1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-(N-丁 氧基羰基)-乙醇胺酯以及1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-(N- 丁氧基羰基)-叔丁基丝氨酸酯的钠盐。
3d.1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酸烷基酯的水解
将1，2-二棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-溴乙基酯，或前面提及 的、备选地制备的磷酸烷基酯之一溶解在含有CaCl2·2H2O的乙醚和蒸馏 水的混合物中。
通过添加Palitzsch缓冲液来将pH调节至7.5。然后，添加磷脂酶 A2并在35℃下搅拌60分钟。如此，甘油残基的位置2处的酯键被水解， 并产生在位置2处携带有OH-基团的相应的1-棕榈酰基-sn-甘油酯-3- 磷酸烷基酯，以及游离的脂肪酸。
现在，可以用经标记的脂肪酸，例如咪唑化或乙炔化的脂肪酸， 靶向性地在甘油残基的位置2处使所获得的分子酯化。同样地，可以用 合适的醇，例如胆碱、丝氨酸、乙醇胺或肌醇，在位置3处使该磷酸烷 基酯再酯化。
3e.在位置2处用经标记的脂肪酸进行酯化
将获得的1-棕榈酰基-sn-甘油酯-3-磷酸烷基酯溶解在四氯甲烷 中，向其中添加咪唑化或乙炔化的脂肪酸，并搅拌该混合物。
所添加的脂肪酸可以是例如17-十八炔酸，其可获自Sigma Aldrich。同样地，其也可以是12-咪唑基-1-十二烷酸，其可以如在1. 中所描述的进行合成。
然后再次进行“Steglich酯化”，向该混合物中添加4-二乙基氨 基吡啶和二环己基碳二亚胺。如此，在甘油残基的其余OH-基团和经标 记的脂肪酸的羧基之间形成酯键。
除去析出的二环己基脲，并蒸发掉溶剂。在进一步的纯化步骤后， 获得了作为产物的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷酸烷基酯。
3f.在甘油残基的位置3处进行磷酸烷基酯的再酯化
将1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-溴乙基酯溶解在氯 仿中。然后添加2-丙醇-三甲胺。将反应容器在50℃下进行温育，随后 用氮气来蒸发掉溶剂。纯化反应产物，并以这种方法获得了经标记的 1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷脂酰胆碱。
为了制备经标记的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷脂酰丝氨 酸，将如上所述进行制备的经标记的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯 -3-磷酰基-(N-丁氧基羰基)-乙醇胺酯溶解在CH2Cl2中，并添加三氟乙 酸和高氯酸。然后，在冷的状态下进行搅拌，并用水和甲醇进行洗涤。 在相分离后，用Na2CO3萃取下层相，并进行蒸发。在加入甲醇后，形成 晶体，它就是经标记的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷脂酰乙醇 胺。
用于制备经标记的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷脂酰丝氨 酸的方法是相似的。在这个情况下，起始材料是如上所述进行制备的 经标记的1-棕榈酰基-2-酰基-sn-甘油酯-3-磷酰基-(N-丁氧基羰基)- 叔丁基丝氨酸酯。
表格
在所附的表格中列出了几个示例性的根据本发明的化合物。
表1至3示例性地显示了根据本发明进行使用的根据权利要求1的 式A-R-X的化合物。
在这方面，本领域技术人员会立即意识到，许多其他的化合物可 被包括在所述的权利要求中。这样，脂肪族残基可以是直链或支化的， 具有单键、双键或三键，和经取代的，并且具有有着9至19个碳原子的 脂肪族主链。同样地，烃主链可以用脂环烃和/或芳香族烃来形成，其 中在此，由于环结构而可能需要高至40个的碳原子。
作为亲水性残基，还可以考虑其他醇例如肌醇或乙醇胺或者其甘 油酯。
毒性
在雄性CD大鼠中测试了12-咪唑基-1-十二烷醇(物质1)和12-(1)- 咪唑基-十二烷(物质2)的急性毒性。结果如下：对于12-咪唑基-1- 十二烷醇，LD50(14天)为1000mg/kg b.w.，p.o.；而对于12-(1)- 咪唑基-十二烷，LD50(14天)为1000mg/kg b.w.，p.o.。
首次不耐受反应： 物质1：1000mg/kg b.w.，p.o.
物质2：500mg/kg b.w.，p.o.
在下列剂量大小时无效应：物质1：500mg/kg b.w.，p.o.
物质2：250mg/kg b.w.，p.o.
12-咪唑基-1-十二烷醇的抗肿瘤作用的测定
为此，各在“24孔平板”中接种4个癌细胞系，并让其生长24小时。 然后，向细胞悬浮液中添加不同浓度的溶解在DMSO中的待测试物质12- 咪唑基-1-十二烷醇。细胞培养基中的DMSO浓度各为0.1％。这个DMSO 浓度在对照实验中被证明是无毒性的，各在4天温育期之后进行细胞计 数。在所有情况下，都测到对于癌细胞增殖的强烈抑制。
测定了下面的12-咪唑基-1-十二烷醇的半最大抑制浓度，IC50值：
HepG2(肝细胞) 50nM
Panc-1(胰腺细胞) 50nM
PC-3(前列腺细胞) 50nM
SW620(结肠细胞) 100nM。
在所有癌细胞系中都测到了所述抑制剂的强烈的抗肿瘤效应。
12-咪唑基-1-十二烷醇的细胞毒性的评价
用LDH细胞毒性试验测定12-咪唑基-1-十二烷醇的半最大细胞毒 性。
在这方面，测得下面的值：
MRC-5(肺成纤维细胞) ＝500μM
Panc-1(胰腺细胞) ＝500μM。
关于对于Panc-1的500μM的半最大细胞毒性与半最大抑制常数 IC50＝50μM所进行的比较给出了10,000的差别系数 (Differenzfaktor)。从中得出结论，12-咪唑基-1-十二烷醇是一种 高度有效的癌细胞增殖抑制剂，并具有相对较低的细胞毒性。
换句话说，根据本发明的物质具有宽的治疗窗。
12-咪唑基-1-十二烷醇对于HepG2细胞的移动活性的抑制
迁移测试的条件：将HepG2肝癌细胞包埋入胶原基质中。通过照相 术对30个单个细胞连续监控900分钟。测定迁移细胞的平均百分比。
结果1：未处理的对照HepG2细胞具有15％的平均迁移活性。在向基 质介质中添加1μM或10μM的12-咪唑基-1-十二烷醇时，细胞的迁移活 性分别下降50％和75％。
结果2：由于HepG2细胞具有强的胰岛素受体表达，所以在有和没 有12-咪唑基-1-十二烷醇的情况下测定了胰岛素对于迁移活性的影 响。
HepG2细胞 平均迁移活性 对照 15％ 添加胰岛素(100ng/ml) 38％ 添加胰岛素(100ng/ml)和 12-咪唑基-1-十二烷醇(10μM) 15％
胰岛素导致迁移活性增加至2.5倍。在450分钟的观察时间(观察 时间的前一半)后，活性物质完全阻断了这种增加。在900分钟(观察 时间的后一半)后，所述增加是负的。那时，平均迁移活性位于对照 之下13％。