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本发明为非临时申请，根据美国法典第35条119(e)款要求2006年4 月17日申请的临时申请US第60/792553号的优先权，其完整内容在本文 中引用作为参考。
技术领域
本发明涉及减毒梭状芽孢杆菌(Clostridium)生物体、其制备及使用 方法、及α-毒素突变蛋白和其编码核酸。
背景技术
厌氧细菌病原体是农业生产的严重经济负担。梭状芽孢杆菌家族 细菌代表一类特殊的负担，因为这些细菌可致使家禽及其它有经济价 值的饲养动物患严重疾病。控制这些生物体的先前努力依赖于卫生处 理及在动物饲料中施用抗生素。
具体地说，产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)是一种发现于土 壤、腐败有机物质中的厌氧细菌，且是人类及动物的肠道菌丛的一部 分。根据其产生的毒素谱，将产气荚膜梭状芽孢杆菌的不同菌株标识 为生物型A至生物型E[Justin等人，Biochemistry 41，6253-6262(2002)； McDonel(1986)，细菌毒素的药理学(PHARMACOLOGY OF BACTERIAL-TOXINS)；F.Dorner及J.Drews(编辑)Pergamon Press， Oxford]。生物型A菌株作为各类别坏疽及肠道疾病的病原具有特别重 要性。一种由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的特别严重的肠道疾病是坏 疽性肠炎(本领域也称作“坏死性肠炎”)，一种可导致人类及饲养动物 二者患坏死病、败血症及溶血病的肠坏疽[参见，Pearson等人，J.Am.Vet. Med.188(11)：1309-10(1986)；Al-Sheikhy及Truscott，Avian Dis.21 (2)：256-63(1977)]。对于禽类，例如鸡(红原鸡(Gallus gallus))而言，坏 疽性肠炎是一个非常严重的问题。A型或C型产气荚膜梭状芽孢杆菌可 引起重大的损失，尤其在肉用仔鸡生产中[Ficken及Wages，Necrotic Enteritis，In Diseases of Poultry，第10版，第261-264页(1997)]。除与坏 死性肠炎暴发相关的损失外，据报导，产气荚膜梭状芽孢杆菌相关性 疾病也会损害畜群的生产能力[Lovl及Kaldhusdal，Avian Pathology 30：73-81(2001)]。如上所述，在动物饲料中加入抗菌剂是最常见的控制 方法。然而，抗菌剂(例如，抗生素)成本较高且人们对细菌抗性提高的 担心日盛。
近来，人们已试图提供可抵抗有害梭状芽孢杆菌菌种的疫苗。举 例而言，Lovland等人[Avian Pathology 33(1)：83-92(2004)]阐明了与氢 氧化铝佐剂一起使用的基于产气荚膜梭状芽孢杆菌A型及C型类毒素的 候选疫苗。据报导，对母鸡进行接种可产生特异性抗体以保护子代免 受由产气荚膜梭状芽孢杆菌亚临床攻击引起的肠道损伤。由脱毒产气 荚膜梭状芽孢杆菌毒素制备的其它基于类毒素的疫苗已为人们所知[参 见，例如，美国专利第4,292,307号，其阐述了如下的毒素：A型、B型 及D型产气荚膜梭状芽孢杆菌、水肿梭菌(Cl.Oedematiens)及腐败梭菌 (Cl.Septicum)]。
也建议使用重组类毒素制剂。举例而言，Titball等人[美国专利第 5,851,827号、第6,403,094号及第5,817,317号]报导了编码抗原性产气荚 膜梭状芽孢杆菌肽的核酸、这些肽自身、以及由这些肽制备的疫苗。 例如，阐述了具有天然产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的氨基酸残基261 至300，但缺少天然毒素的磷脂酶C和鞘磷脂水解酶(hydrolyzins)结构域 的肽。也报导了这些肽可诱导抵抗该天然毒素的免疫保护。另外，美 国专利第6,610,300号描述了基于产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素突变蛋 白的抗原性片段的疫苗。
然而，无论类毒素疫苗是源自天然生物体或以重组方式获得，制 备及向有免疫接种需要的动物施用类毒素蛋白均被视为沉重的经济负 担，特殊环境下(例如，治疗可能对整个有机体疫苗的其它组份过敏 或敏感的人)除外。而且，基于蛋白/类毒素的疫苗通常需要重复加强 免疫以维持完全效能。
另一建议解决方案是改造可产生代替野生型毒素的α-毒素突变蛋 白的抗原活性病毒。举例而言，Bennett等人[Viral Immunol.12(2)：97-105 (1999)]已阐明表达产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的无毒性C结构域的 重组牛痘病毒载体。遗憾的是，尽管在过去20年里建议使用若干重组 牛痘疫苗，但对安全性(向环境中释放活的感染性牛痘病毒，其可传 播给对该病毒无抗性的人)的担心仍长期存在。
已知产气荚膜梭状芽孢杆菌的α-毒素(plc基因)具有若干生物活性， 包括溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、磷酸二酯酶活性及致死 活性。在本技术领域中，有许多关于可降低毒性的此α-毒素变突的报导。 Schoepe等人[Infect.and Immun.69(11)：7194-7196(2001)]阐述一种可 产生无毒性α-毒素的天然产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株。然而，修饰此菌 株以产生抵抗除毒性野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌菌种外的其它变异 体的免疫保护将比较困难。
Williamson及Titball[Vaccine 11(12)：1253-1258(1993)]证实该毒素 自氨基酸残基247至氨基酸残基370的单独区域足以免疫小鼠抵抗由产 气荚膜梭状芽孢杆菌实验性诱导的气性坏疽。等人[Eur.J. Biochem.267：5191-5197(2000)]已经报导替换Asp269、Asp336、Tyr275、 Tyr307及Tyr331可减少α-毒素毒性。Nagahama等人[Infect.and Immun. 65：3489-3492(1997)]报导替换Asp-56、Asp-130或Glu-152可减少α-毒素 毒性。Nagahama等人[J.Bacteriology 177：1179-1185(1995)]报导在产气 荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素中使用中性氨基酸(例如甘氨酸)替换68位处 的组氨酸可导致该α-毒素突变蛋白的溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂 酶活性以及致死活性的完全丧失。据信，此单一氨基酸变化可灭活该 蛋白的3个锌结合结构域中的一个。后来，将由替换His68所灭活的锌结 合结构域表示为Zn2[Justin等人，Biochemistry 41：6253-6262(2002)]。
尽管有上述说明，但本技术领域中仍需要一种可广泛地保护饲养 动物(包括禽类，例如鸡)免受梭状芽孢杆菌菌种(包括产气荚膜梭 状芽孢杆菌)感染的安全、经济且有效的方法。
不应将本文任一参考文献的引用诠释为认可此参考文献作为本申 请的“现有技术”使用。
发明简述
为了克服本领域技术中的上述缺点，本发明提供编码产气荚膜梭 状芽孢杆菌α-毒素的基本上(substantially)无毒性突变蛋白的核酸分子。 在一个这种实施方案中，该核酸分子编码包含减去至少18个连续氨基 酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列的α-毒素突变蛋白，其中所缺失氨基 酸残基之一是His68。在另一实施方案中，该核酸分子编码包含减去至 少12个连续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列的α-毒素突变蛋白， 其中所缺失氨基酸残基之一是His68。在又一实施方案中，该核酸分子 编码包含减去至少9个连续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列的 突变蛋白，其中所缺失氨基酸残基之一是His68。在再一实施方案中， 该核酸分子编码包含减去至少6个连续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨 基酸序列的突变蛋白，其中所缺失氨基酸残基之一是His68。在又一实 施例中，该核酸分子编码包含减去至少3个连续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列的突变蛋白，其中缺失氨基酸残基之一是His68。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码从SEQ ID NO：3氨基酸 序列缺失不多于48个连续氨基酸残基的突变蛋白。在另一实施方案中， 核酸分子编码从SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失不多于36个连续氨基酸 残基的突变蛋白。在再一实施方案中，核酸分子编码从SEQ ID NO：3 氨基酸序列缺失不多于24个连续氨基酸残基的突变蛋白。在又一实施 方案中，本发明的核酸分子编码从SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失不多 于18个连续氨基酸残基的突变蛋白。
在一特定实施方案中，本发明提供编码从SEQ ID NO：3氨基酸序列 缺失9个连续氨基酸残基(其中一个是His68)的突变蛋白的核酸分子。在 一具体的该类实施方案中，该核酸分子编码其中所缺失的9个连续氨基 酸残基是介于SEQ ID NO：3的Tyr62至Trp70之间的突变蛋白。在一更特 定实施方案中，该核酸分子编码其中所缺失的9个连续氨基酸残基是由 单一亮氨酸残基替换的突变蛋白。
在另一实施方案中，该核酸分子包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列， 其中核苷酸268-294缺失。在一个具体的该类实施方案中，SEQ ID NO：2 核苷酸序列的核苷酸268-294由编码单一亮氨酸残基的3个核苷酸替换。
本发明也提供产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的基本上无毒性突变 蛋白。在一个该类实施方案中，该α-毒素突变蛋白包含减去至少18个连 续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸残基之 一是His68。在另一实施方案中，该突变蛋白包含减去至少12个连续氨 基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸残基之一是 His68。在又一实施方案中，该突变蛋白包含减去至少9个连续氨基酸残 基的SEQ ID NO：3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸残基之一是His68。 在再一实施方案中，该突变蛋白包含减去至少6个连续氨基酸残基的 SEQ ID NO：3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸残基之一是His68。在又 一实施方案中，该突变蛋白包含减去至少3个连续氨基酸残基的SEQ ID NO：3氨基酸序列，其中所缺失氨基酸残基之一是His68。
在一个实施方案中，本发明的突变蛋白包含不大于48个自SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失的连续氨基酸残基。在另一实施方案中，该突变 蛋白包含不多于36个自SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失的连续氨基酸残 基。在再一实施方案中，该突变蛋白包含不多于24个自SEQ ID NO：3氨 基酸序列缺失的连续氨基酸残基。在又一实施方案中，该突变蛋白包 含不多于18个自SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失的连续氨基酸残基。
在一特定实施方案中，本发明提供自SEQ ID NO：3氨基酸序列缺失 9个连续氨基酸残基(其中一个是His68)的基本上无毒性突变蛋白。在一 个更具体的该类实施方案中，所缺失的9个连续氨基酸残基介于SEQ ID NO：3的Tyr62至Trp70之间。在又一更特定实施方案中，所缺失的9个连 续氨基酸在该突变蛋白的氨基酸序列中由单一亮氨酸残基替换。
本发明进一步提供减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体，其具有整 合入减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体染色体的编码产气荚膜梭状芽 孢杆菌α-毒素的基本上无毒性突变蛋白的核酸分子。此整合核酸分子 优选位于与编码野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体中野生型α-毒素 的核酸分子位置同源的染色体位置。因此，本发明的减毒产气荚膜梭 状芽孢杆菌生物体因缺少功能性野生型plc基因而为基本上无毒性的。 如本文所例示，该减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体可为A型产气荚膜 梭状芽孢杆菌。
在本发明的一个特定实施方案中，该减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌 生物体是产气荚膜梭状芽孢杆菌CPERF/ΔαToxin 365-054(ATCC保藏 号PTA7364)。在本发明的另一特定实施方案中，该减毒产气荚膜梭状 芽孢杆菌生物体是产气荚膜梭状芽孢杆菌CPERF/ΔαToxin 365-053 (ATCC保藏号PTA7365)。
可自哺乳动物或禽类的宿主动物分离由本发明方法减毒的产气荚 膜梭状芽孢杆菌生物体。这些哺乳动物可包括：牛、羊及猪。适当的 禽类的实例包括鸡、火鸡、鸭、家鸽(pigeon)、鹅、野鸽(dove)、天鹅、 山鹑(partridge)及松鸡。
本发明也提供疫苗。这些疫苗可包含本发明的减毒产气荚膜梭状 芽孢杆菌生物体。本发明的疫苗也可包含药学上可接受的缓冲剂、赋 形剂和/或佐剂。
另外，本发明提供在动物中诱导针对产气荚膜梭状芽孢杆菌的免 疫性的方法。一个这种实施方案包括对该动物施用免疫有效剂量的本 发明疫苗。本发明的疫苗可由许多途径施用，包括：经口、肌内、静 脉内、皮内、皮下及鼻内。可将本发明的疫苗施于动物饲料的表面上 和/或喷洒于该动物上以便于经口施用。本发明进一步提供包含本发明 疫苗的动物饲料。
本发明也提供另外表达至少一种基因(编码非产气荚膜梭状芽孢杆 菌多肽)的本发明减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体。在一个这种实施 方案中，一个或多个非产气荚膜梭状芽孢杆菌多肽是细菌多肽，例如， 来自大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(salmonella)、劳森氏菌(lawsonia)、或 弯曲杆菌(campylobacter)等的抗原性蛋白和/或其组合。另一选择为，或 与之组合，非产气荚膜梭状芽孢杆菌多肽可为非细菌多肽。这些非细 菌多肽的实例包括哺乳动物或禽类蛋白，例如，细胞因子(cytokine)， 如鸡IL-18；病毒，如轮状病毒或冠状病毒；及寄生虫，如艾美球虫 (eimeria)、等孢子球虫(isospora)、及隐孢子虫(cryptosporidium)。
在另一方面中，本发明提供一种选择性地与抗原决定部位(epitope) 结合的抗体，所述抗原决定部位从产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的基本 上无毒性突变蛋白缺失。这些抗体可区分该基本上无毒性突变蛋白与 野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素。
本发明也提供包含本发明的抗体的检测试剂盒，其可用于识别动 物个体是否已接种疫苗或者已天然感染产气荚膜梭状芽孢杆菌生物 体。
因此，本发明也提供识别和/或区分已天然感染产气荚膜梭状芽孢 杆菌生物体的动物与已接种减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体的动物 的方法。在一个这种实施方案中，该方法具体包括使来自该动物的流 体(fluid)试样与抗体接触，该抗体可选择性地结合至发现于野生型产气 荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素中的抗原决定部位，所述抗原决定部位从本发 明产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的基本上无毒性突变蛋白缺失。因此， 该抗体可区分那些已经接种本发明产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的基 本上无毒性突变蛋白(和/或表达该突变蛋白的减毒产气荚膜梭状芽孢 杆菌生物体)的动物与那些感染或曾感染野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌 α-毒素的动物。下一步骤是测定该抗体是否与该流体试样反应，例如， 结合至该流体试样所含抗原。当该抗体与该流体试样反应时，可将该 动物识别为已经天然感染产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体的个体。
附图说明
图1显示产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素编码区的基因组图。图中显 示用于构建CPERF001的两个大片段(1182碱基对及1746碱基对)各自的 位置。图中也指出所形成的27碱基对缺失的定位。＂Yplc＂表示yplc基因 (CPE0035)；＂plc＂表示编码α-毒素(磷脂酶C)的基因且＂CobW＂表示下游 基因。
图2A显示产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株CP6的plc基因一部分的序列 [SEQ ID NO：4；此为CP6的plc基因片段的SEQ ID NO：22的一部分(即， 核苷酸262-300)]及对应肽序列(SEQ ID NO：5)，其中下划线表示用于形 成该缺失的BamH1内切核酸酶限制酶切位点。
图2B显示用于在母体产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株1240中形成缺失 的引物的序列(SEQ ID NO：6)，此形成缺失体CPERF001。下划线表示 该引物中所含BamH1限制酶切位点以便于构建该缺失。图中也显示对 应肽(SEQ ID NO：7)。
图2C显示CPERF001(SEQ ID NO：8；核苷酸103-117)中及对应肽 (SEQ ID NO：9)中所形成缺失的序列。下划线表示复原BamH1内切核酸 酶限制酶切位点。
图3A再次显示产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株CP6的plc基因的一部分 的序列[SEQ ID NO：4，核苷酸262-300]及对应肽序列(SEQ ID NO：5)， 其中下划线表示用于形成该缺失的BamH1内切核酸酶限制酶切位点。
图3B显示用于在母体产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株29中形成缺失的 引物的序列(SEQ ID NO：10)，此形成缺失体CPERF002。图中也显示对 应肽(SEQ ID NO：11)。
图3C显示CPERF002中所形成缺失的序列(SEQ ID NO：12)及对应 肽(SEQ ID NO：13)。
发明详述
因此，本发明提供以相对于天然或野生型梭菌属毒素具有不可检 测的毒性和/或基本上低毒性的突变蛋白形式表达一种或多种梭菌 (Clostridia)毒素(例如α-毒素)的经改造的梭菌生物体及培养物。优选地， 本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌突变型生物体可作为活疫苗容易地施 用给动物。也提供本发明的突变蛋白产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素以及 编码该突变蛋白的核酸分子、用于表达α-毒素的载体、及使用它们的方 法。
为了清楚地阐述本发明，可定义如下若干术语。疫苗是一种包含 免疫原及其它药学上可接受的可选成份(在某些实施例中，包括适宜佐 剂)的组合物。本文所用术语“免疫原”描述一种在被导入动物中时激 发免疫应答的组合物、物质或载体。出于本发明的目的，免疫原包含 任一能够表达本发明α-毒素突变蛋白或将本发明α-毒素突变蛋白导入 拟免疫接种动物中的载体的。载体包括，例如，在将该载体导入动物 中时可表达本发明α-毒素突变蛋白的本发明产气荚膜梭状芽孢杆菌或 其它适宜微生物。载体也包括本领域已知核酸分子，例如，质粒等， 其在直接导入动物中时可通过(例如)进入动物细胞并在动物中表达α- 毒素突变蛋白来表达本发明的α-毒素突变蛋白。免疫原也可为单独或作 为适宜疫苗组合物的一部分使用的蛋白，例如本发明的α-毒素。
除非另有说明，否则本文所用术语“免疫”及“接种”是同义的 且可互换使用以描述将免疫原导入动物从而在该动物中产生免疫应 答。所产生免疫应答可为被治疗动物提供保护免疫性，此可限制或减 少已接种动物的临床病状，例如，气性坏疽和/或死亡率，然后用毒性 剂量的产气荚膜梭状芽孢杆菌菌种(对其而言，本发明的疫苗是保护 性的)刺激已接种动物。
术语“佐剂”被定义为可刺激免疫系统的一种或多种物质。在本 文中，佐剂可用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离物的免疫应答。可 在施用该疫苗之前、同时或之后对靶动物施用佐剂。本发明的佐剂可 自许多来源的任一个获得，这些来源包括天然来源、重组体来源和/或 以化学方式合成等。用作佐剂的化学化合物的实例包括但不限于含铝 化合物；可代谢及不可代谢的油；嵌段聚合物；ISCOM(免疫刺激复合 物)；维生素及矿物质(包括但不限于维生素E、维生素A、硒及维生素 B12)；Quil A(皂苷)；以不同水平与聚烯基聚酯交联的基于交联丙烯酸 的聚合物(例如丙-2-烯酸聚合物)，如以商标出售的；和/ 或均匀分布于水中的微米级油滴的乳液，例如，以商标出 售的。
有时被明确称作免疫刺激剂的佐剂的其它实例包括：细菌及真菌 细胞壁组份(例如，脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β-1，3/1，6-葡 聚糖)、源自植物的各种复杂的碳水化合物(例如，聚糖、醋孟南 (acemannan))、源自动物的各种蛋白及肽(例如，激素、细胞因子、协同 刺激因子)、及源自病毒及其它来源的核酸(例如，双链RNA、CpG)。 另外，任一数量的各上述物质的组合可提供佐剂效果，因此，其可形 成本发明的佐剂。
本文所用术语“抗体”欲涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和/或其片 段或重组体衍生物，包括掺入抗体可变结构域的经改造结合蛋白。
如本文所用，本发明α-毒素蛋白的氨基酸残基的残基编号及位置是 基于产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13使用的编号系统。产气荚膜梭状芽 孢杆菌菌株13的α-毒素由GenBank登记编号NC 003366报导，如由SEQ ID NO：1所示。该完整的蛋白的长度是398个氨基酸。由下文所例示的 突变蛋白载体编码的α-毒素对应于具有氨基酸残基90-98缺失的SEQ ID NO：1蛋白。在该蛋白突变中有一28个氨基酸信号序列裂解。因此，所 例示缺失对应于长度为370个氨基酸的成熟蛋白的氨基酸残基 62-70(SEQ ID NO：3)。
编码本发明α-毒素蛋白的DNA的密码子编号基于产气荚膜梭状芽 孢杆菌菌株13的plc基因，如GenBank登记编号NP 560952中所报导及如 SEQ ID NO：2所示。α-毒素的编码序列在产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13 中为自核苷酸48590至49786。本文所例示的两个构建体中的密码子缺 失对应于NP560952基因的核苷酸48857至(且包括)48883。此缺失发现 于α-毒素基因内且对应于SEQ ID NO：2的编码序列中的核苷酸 268-294。
此外，为方便说明而使用单数术语，但并不受限于此。因此，举 例而言，当提及包含一种产气荚膜梭状芽孢杆菌细胞的组合物时包括 所提及的一种或多种这些细胞。也应理解，本发明并不限于本文所揭 示的特定构型(configuration)、过程步骤及材料，这些构型、过程步骤 及材料可有少许变化。也应理解，本文所用专业术语仅出于阐述特定 实施例的目的而使用且并非受限于此，因为本发明的范围仅受限于随 附的权利要求及其等同物。
在本发明的一个特定方面中，提供“基本上无毒性”的产气荚膜 梭状芽孢杆菌的非逆转性突变体，即，可表达具有极小或无毒性的免 疫原性α-毒素进而使其适于用作保护性疫苗的生物体。因此，本发明的 产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体相对于野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌生 物体具有充分减少的毒性，以致在接种此疫苗的动物中可有效诱导抗α- 毒素或抗产气荚膜梭状芽孢杆菌免疫应答的条件下使用时，可用作疫 苗或抗原。因此，本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体相对于野生 型产气荚膜梭状芽孢杆菌是“减毒的”。
短语“基本上无毒性”亦欲用于具有充分低或无毒性的上述免疫 原性α-毒素突变蛋白，进而也使其适用作保护性疫苗。
例如，由下列本领域已知检测中的一种来测定毒性减少：试验动 物组中的溶血活性、磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性、磷酸二酯酶活性及 一般致死活性。一般而言，由这些标准检测不可检测残余毒性。尽管 如此，相对于衍生突变蛋白的野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的相 等数量感染性单位的毒性，可证明最小量(例如自约10-4至约10-2)的一种 或多种这类活性的存在在兽医环境中是可接受的。
在一个实施方案中，采用产气荚膜梭状芽孢杆菌的生物型A菌株实 施本发明，其作为各类别坏疽及肠道疾病的病原具有特别的重要性。 具体地说，产气荚膜梭状芽孢杆菌的α-毒素是缺失-减毒的目标，因为 此毒素的减毒足以致使产气荚膜梭状芽孢杆菌相对于野生型菌株不具 有致死性。
概言之，本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌plc基因表达α-毒素突变 蛋白。α-毒素突变蛋白具有包含Zn2环的His以及侧接(flanking)残基在内 的缺失以大大地降低任一回复突变至毒性形式的可能性。现在已发现： Zn2环His残基(例如，SEQ ID NO：3的His68)的缺失以及侧接Zn2环His 残基的额外残基的缺失可提供保留足够免疫原性的α-毒素以在接种本 发明产气荚膜梭状芽孢杆菌的动物中诱导保护免疫性同时也不可能回 复突变至编码野生型α-毒素。可能缺失的额外残基相对于His68在C-末 端方向和/或在N-末端方向上缺失，且在这些方向的任一个上，这些额 外残基的数量可介于约4个至约60个残基之间。或者，His148及侧接残基 可类似地缺失。
相对于SEQ ID NO：3，除包含His68缺失之外，本发明α-毒素突变蛋 白的一个实施方案也包含来自His68位置的任一侧(在C-末端或N-末端 方向上)的至少30个氨基酸残基缺失。在另一实施方案中，相对于SEQ ID NO：3，除包含His68缺失之外，本发明α-毒素突变蛋白也包含来自 His68的任一侧的至少20个氨基酸残基缺失。在又一替代实施方案中， 相对于SEQ ID NO：3，除包含His68缺失之外，本发明α-毒素突变蛋白也 包含来自His68的任一侧的至少5个氨基酸残基缺失。在再一实施方案 中，相对于SEQ ID NO：3，本发明的α-毒素突变蛋白包含自约残基62至 约残基70的缺失。视情况，这些缺失氨基酸残基可由一个或多个其它 残基(例如，单一亮氨酸残基)替换。
在又一实施方案中，产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素突变蛋白产生或 分离自产气荚膜梭状芽孢杆菌或者替代重组生物体，其被用作研究试 剂和/或用于诊断试剂盒或检测中，作为(例如)抗α-毒素抗体的靶。 产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素突变蛋白的又一用途是用于不能够接受 接种本发明减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体的动物(例如，人类) 的特殊疫苗中。
另外，本发明提供相对于本发明α-毒素突变蛋白可特异性地与野生 型α-毒素结合的抗体。
在另一实施方案中，提供一种优选与野生型产气荚膜梭状芽孢杆 菌α-毒素蛋白结合同时对本发明α-毒素突变蛋白呈现最小结合或不结 合(例如，避免与具有如上文所详述缺失的α-毒素突变蛋白结合)的抗 体。因此，所提供抗体可用于区分该α-毒素缺失突变蛋白与野生型α- 毒素，从而也可用于区分接种本发明疫苗的动物与已感染野生型产气 荚膜梭状芽孢杆菌的动物。产生及筛选这些选择性抗体的方法为本领 域所知。类似地，也可产生可识别本发明α-毒素突变蛋白但不识别野生 型蛋白的抗体。本发明的抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体(＂mAb＂)或 保留选择性结合性质的这些抗体的片段或改造片段或衍生物。
用于制备及筛选单克隆抗体的技术已经被详尽地阐述[参见，例如， Stites等人(编辑)Basic and Clinical Immunology(第4版)，Lange Medical Publications，Los Altos，California(1988)；Harlow及Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，CSH Press(1988)；Goding，Monoclonal Antibodies： Principles and Practice(第2版)，Academic Press，New York(1986)；及 Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975)，所有这些文献的全文均以 引用方式并入本文中]。
例如，但不限于此，通过使用经纯化野生型产气荚膜梭状芽孢杆 菌α-蛋白(例如与适宜佐剂的组合)进行接种可在诸如小鼠或鸡等适宜 动物中产生免疫应答。举例而言，为了免除野生型α蛋白的毒性，该免 疫原可为对应于缺失残基的肽，且若需要可通过与适宜佐剂组合或通 过与适宜载体蛋白偶联来增强该肽的免疫原性。与载体蛋白的偶联为 本领域所知，且可由(例如)提供具有末端半胱氨酸的肽并使用马来酰亚 胺偶联化学或磺基琥珀酸亚氨基4-[N马来酰亚氨基]环己烷-1-羧酸酯 连接子(来自Pierce)将该肽偶联至钥孔血兰素(KLH)或牛血清白蛋白 (BSA)来完成。在不需要末端半胱氨酸时也可采用碳化二亚胺连接子。
对于单克隆抗体制备而言，可从被免疫接种动物获得脾淋巴细胞， 从这些淋巴细胞制备杂交瘤，可获得一种或多种表达抗α蛋白的潜在的 适宜杂交瘤。筛选抵抗突变蛋白及野生型α-蛋白的杂交瘤，并识别、克 隆及使用表达仅结合野生型α-毒素的抗体的杂交瘤以产生仅结合野生 型α蛋白的单克隆抗体。任选地，获得来自经识别的杂交瘤无性繁殖系 的cDNA，且在其它本领域已知的表达系统中产生重组抗体或抗体片 段。
如上文所述，一般而言，接种的一个潜在缺点是在使用抗天然菌 株的抗体测试感染时，所得被接种动物可能产生假阳性从而阻碍感染 动物的识别。因此，本发明提供一种用于区分已经感染天然产气荚膜 梭状芽孢杆菌生物体的动物个体与使用本发明α-毒素突变蛋白接种的 动物的检测试剂盒。
这种检测试剂盒包括一定量的对本发明α-毒素突变蛋白呈现最小 结合或不结合的选择性抗野生型α-毒素抗体。该检测试剂盒也可包括足 以进行至少一次诊断试验的其它适宜试剂。在另一实施方案中，使用 易于检测的标记部分(例如，任何本领域已知的酶标记，如过氧化物 酶；荧光标记物，如荧光素；珠体，包括磁性小珠；及诸如此类)对该 抗体进行标记(tagged或labeled)。任选地，该试剂盒可进一步包括选择 性地与选择性抗野生型α-毒素抗体结合的标记抗体。免疫分析法为本技 术领域所熟知，包括三明治型免疫分析法、竞争性免疫分析法、酶联 免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)及其它。
本发明也提供用于识别及区分感染天然(即野生型)产气荚膜梭状 芽孢杆菌生物体的动物与使用包含本发明减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌 生物体的疫苗接种的动物的方法，其按照(例如)下列步骤进行：
(a)使来自该动物的流体试样与上述选择性抗野生型α-毒素抗体接 触，该选择性抗野生型α-毒素抗体对本发明α-毒素突变蛋白呈现最小结 合或不结合；及
(b)测定该抗体是否与该流体试样反应；
其中当该抗体与该流体试样反应时，该动物被识别为已经天然地 感染产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体的动物。
制备减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株
可按照下述实施将野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌分离物转化成适 于作为疫苗施用的减毒或基本上无毒性菌株的方法。可使用仅编码α- 毒素突变蛋白的基因替换位于细菌染色体上的α-毒素(plc)基因，从而使 该产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体不能够产生野生型α-毒素。概言之，产 生疫苗生物体的方法包括但不限于下列常用步骤，不必按下列顺序。
(1)识别欲通过接种加以保护的动物类别及所获得的一种或多种用 于筛选目的的临床分离物。对于α-毒素而言，此步骤通常为可选步骤， 因为来自某一动物物种的分离物不可能为其它动物物种提供保护。
(2)由(例如)PCR或其它本领域已知核酸扩增技术并使用适宜侧接 引物以扩增来自产气荚膜梭状芽孢杆菌分离物的plc基因，并使用适宜 引物进行扩增以产生所期望的缺失突变。或者，可探测适当文库。
(3)形成包含缺失plc基因的自杀载体，其中产气荚膜梭状芽孢杆菌 复制起点已经移除，和/或可在产气荚膜梭状芽孢杆菌中复制的复制起 点完全不存在；且在任一情况下，包含毗邻突变plc基因的适宜选择性 标记，例如，抗生素标记。随后可由(例如)电穿孔或其它本领域已知方 法将此载体插入产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体中。
(4)筛选其中已经将突变蛋白plc基因成功地整合入细菌染色体中的 产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体。可通过在选择性试剂(例如，对应于 选择性标记的抗生素)存在下培养步骤(3)的产气荚膜梭状芽孢杆菌生 物体来进行。举例而言，可在抗生素选择下生长的唯一产气荚膜梭状 芽孢杆菌生物体可为那些已通过同源重组将自杀载体及其抗生素抗性 基因直接整合入细菌染色体中的。因此，这些生长的产气荚膜梭状芽 孢杆菌生物体可具有两个毗邻plc基因，一个是野生型而另一个可能具 有缺失突变。
(5)筛选已进行了另一重组事件(event)的产气荚膜梭状芽孢杆菌生 物体，该重组事件可移除选择性标记(例如抗生素标记)以及野生型plc 基因。这可通过在不存在选择性试剂(例如抗生素)时培养(4)的生物体并 在血琼脂上选择非溶血性克隆来进行。
由于突变蛋白核酸的插入是通过同源重组完成的，因此编码该α- 毒素突变蛋白的核酸分子是在与编码野生型α-毒素的核酸分子的位置 同源的染色体位置整合的，该野生型α-毒素存在于未减毒产气荚膜梭状 芽孢杆菌中。
更具体而言，可从患病动物或其它来源获得产气荚膜梭状芽孢杆 菌的野外分离物。首先，将从相关野外分离物获得的基因组DNA插入 适宜的双重微生物穿梭载体(例如具有选择性标记(如抗生素标记)的穿 梭质粒)中以评定其可转化性。概言之，适宜穿梭载体可包含1个、2个、 3个或更多个下列特征：克隆位点、产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点、 大肠杆菌复制起点及抗生素抗性基因和/或选择性标记。适用于此目的 或容易地适应于此目的的本领域已知载体包括(例如)Roberts等人所 述重组穿梭质粒pHR106[Appl Env Mircobiol 54：268-270(1988)]； Bannam等人所述pJIR 750及pJIR 751质粒[Plasmid 29：233-235(1993)]； Matsushita等人的无启动子pPSV启动子选择载体[1994，Plasmid 31， 317-319]；Lyras等所述穿梭质粒pJIR1456及pJIR1457[1988，Plasmid 39， 160-164]；及Kim等人所述pAK201穿梭载体[1989，Appl Environ Microbiol 55，360-365]，这些文献的内容全部以引用方式并入本文中。 产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点的移除可将穿梭载体转变成自杀载 体。
举例而言，一种穿梭质粒是pJIR418，由Sloan等人在1992，Plasmid 27，207-219阐述，该文献以引用方式并入本文中。
可产生≥104转化体/微克质粒DNA且对抗生素标记(例如氯霉素或 红霉素)敏感的分离物是缺失的潜在候选者。来自候选菌株的基因组 DNA随后用作候选菌株的plc(α-毒素)基因及侧接序列的长程PCR的模 板。举例而言，如下文所例示，使用产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13染 色体以识别用于扩增编码该α-毒素的基因的引物。随后使用这些引物以 自另一菌株克隆α-毒素基因，所述另一菌株是CP6家禽分离物。
在对PCR产物进行亚克隆后，对α-毒素基因及侧接区进行测序并绘 制限制性内切酶图谱。通过侧接限制酶切位点合成新的寡核苷酸引物 并将两次独立扩增的产物克隆至适宜的自杀质粒(已经移除产气荚膜梭 状芽孢杆菌复制起点)，例如下文所例示质粒1192-23.1中，以形成具有 该缺失的期望的疫苗菌株。
通过任一本领域已知标准方法将所提供的对分离物具有特异性的 自杀载体插入对应动物的产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株中。举例而言， 这可通过电穿孔完成。当将该自杀载体被插入产气荚膜梭状芽孢杆菌 (不具有产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点)中时，该自杀载体不能够 在细胞质中复制，且除非其成功地整合入细菌染色体中，否则不可存 活。成功的整合体是可在抗生素(对应于刚刚导入的抗生素标记基因) 存在下生长的生物体。
尽管在下文所例示载体中采用氯霉素和/或红霉素标记，但可采用 任一本领域已知的选择性标记基因。
这些重组事件由野生型plc基因与缺失plc基因质粒DNA的同源性 形成。将所得重组细菌称为整合体。该整合体含有在plc基因基因座受 到整合的导入同源性载体的拷贝。因此，所得整合体包括plc基因的两 个拷贝：原来的正常拷贝及导入的缺失版本。所导入抗生素抗性基因 位于plc基因的两个拷贝之间。在plc基因的两个拷贝之间可能发生极少 的随机重组事件。此重组事件可能产生两种结果中的一种。在这两种 情形中，均已经移除介入两个plc基因(包括抗性基因)拷贝之间的DNA。 在第一种结果中，回复该正常的或野生型plc基因进而重新得到不具有 抗生素标记的初始母体菌株。在第二种结果中，野生型plc基因被缺失 拷贝替换，产生不具有抗生素标记的期望的α-毒素缺失体构建体。
从培养基中移除抗生素可使那些已经重组的细菌存活并复制。随 后，通过不存在表达野生型α-毒素的产气荚膜梭状芽孢杆菌通常所呈现 溶血现象时血琼脂上的生长状况来识别缺失重组克隆。
接受接种的动物
概言之，可产生减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗并可自其分离有 用的产气荚膜梭状芽孢杆菌野生型菌株的动物包括任一对其而言产气 荚膜梭状芽孢杆菌感染是一问题的动物。相关脊椎动物包括禽类、哺 乳动物及鱼，且具体而言是具有经济和/或农业重要性的动物。下文所 列举动物是那些预期可受益于产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗和/或自其可 获得有用的产气荚膜梭状芽孢杆菌野生型分离物者。尽管可能的情形 时常是任一此疫苗包含最初自拟接受接种的动物种属或物种分离的组 份，但此并非必需条件。
这些动物的非限制性列表包括那些禽类、牛、羊等家族以及水生 动物(例如，可进行水产养殖和/或自野外捕获并在销售前于容纳槽中保 持存活一段时间)。这些包括鱼，例如，鳟鱼或鲑鱼、及其它出于经济 效益而养殖或捕获的物种。非脊椎动物水生动物包括龙虾、螃蟹、软 件动物类，例如鱿鱼、章鱼、蛤、牡蛎、muscles、扇贝等。应理解： 禽类可包括(例如)鸡、火鸡、鹅、鸭等。应理解：牛可包括(例如)畜牛、 肉牛、小菜牛等。应理解：羊可包括(例如)羔羊(lamb)等。
出于本发明的目的，应理解：术语“鱼”可包括但不限于鱼的Teleosti 分组，即，硬骨鱼类。Teleosti分组包括鲑目(Salmoniformes order)(其包 括鲑科(Salmonidae)及鲈形目(Perciformes order)(其包括刺臀鱼科 (Centrarchidae))。
潜在鱼受试者的实例包括鲑科、科(Serranidae)、鲷科(Sparidae)、 慈鲷科(Cichlidae)、刺臀鱼科(Centrarchidae)、三线石鲈(three-Line Grunt)(三线鸡鱼(Parapristipoma trilineatum))、及蓝眼豹(Blue-Eyed Plecostomus)(琵琶鱼(Plecostomus spp))。
鲑科
科的某些成员
鲷科的某些成员
慈鲷科的某些成员
刺臀鱼科的某些成员
分类群名称 常用名
岩钝鲈(Ambloplites rupestris) 岩鲈
太阳鲈(Centrarchus macropterus) 日鲈(Flier)
埃弗格来兹小太阳鱼
黑斑小日鲈(Elassoma evergladei)
(Everglades pigmy sunfish)
奥克小太阳鱼(Okefenokee
小日鲈(Elassoma okefenokee)
pigmy sunfish)
横带小日鲈(Elassoma zonatum) 带状小太阳鱼
蓝点九刺日鲈(Enneacanthus
蓝点太阳鱼
gloriosus)
暗色九刺日鲈(Enneacanthus
带状太阳鱼
obesus)
红胸太阳鱼(Lepomis auritus) 红腹太阳鱼
蓝太阳鱼(Lepomis cyanellus) 蓝绿鳞鳃太阳鱼(Green sunfish)
蓝太阳鱼X驼背太阳鱼 蓝绿鳞鳃太阳鱼X瓜仁太阳鱼
驼背太阳鱼(Lepomis gibbosus) 瓜仁太阳鱼(Pumpkinseed)
太阳鱼(Lepomis gulosus) 贪食太阳鱼(Warmouth)
橙点太阳鱼(Orange-spotted
橙点太阳鱼(Lepomis humilis)
sunfish)
蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus) 蓝鳃鱼
长耳太阳鱼(Lepomis megalotis) 长耳太阳鱼(Longear sunfish)
红眼黑鲈(Micropterus coosae) 浅滩鲈(Shoal bass)
小口黑鲈(Micropterus dolomieui) 小嘴鲈
斑点黑鲈(Micropterus punctulatus) 斑点鲈
大口黑鲈(Micropterus salmoides) 大嘴鲈
白刺盖太阳鱼(Pomoxis annularis) 刺盖太阳鱼(White crappie)
黑刺盖太阳鱼
暗刺盖太阳鱼(Black crappie)
(Pomoxis nigromaculatus)
在另一实施例中，动物是伴侣动物或人。出于本发明的目的，应 理解：术语“伴侣动物”包括所有动物—马(马科)、猫(猫科)、狗(犬科)、 及啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔)、及禽类(例如，家鸽、鹦 鹉)等。
接受此接种的鸟类可与商业性家禽业或非商业性家禽业相关。这 些包括(例如)鸭科(Anatidae)，例如天鹅、鹅、及鸭；鸽科(Columbidae)， 例如野鸽及家鸽(如驯养家鸽)；雉科(Phasianidae)，例如山鹑、松鸡及 火鸡；Thesienidae，例如家鸡；鹦鹉科(Psittacine)，例如长尾鹦鹉、金 刚鹦鹉(macaws)、及普通鹦鹉(例如作为宠物饲养或用于收集销售)。鸡 例示于下文中。
野生型分离物的来源
一般而言，可使用最初自任一如上文所述相关感染动物和/或自环 境分离的野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌开始制备本发明的减毒产气荚 膜梭状芽孢杆菌生物体。该环境包括任一含有可存活产气荚膜梭状芽 孢杆菌生物体和/或可存活产气荚膜梭状芽孢杆菌孢子的材料，包括(例 如)受污染食物、土壤、水、动物垫料、粪便等。
Justin等人[Biochemistry 41，6253-6262(2002)]对来自在序列及生物 化学性质方面几乎一致的不同产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株的α-毒素进 行了特征分析。然而，Justin等人也阐述自禽类来源(天鹅)分离的菌株， 该菌株与其它菌株相比具有呈现大程度的序列变异及底物特异性改变 的α-毒素。出于此原因，相信大多数分离物当转化成减毒形式时可产生 抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌的许多其它天然菌株的α-毒素的保护免疫 性。然而，若两分离物间的α-毒素可能发生变异，则较佳情形经常为对 来自需要抗产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗的动物物种的产气荚膜梭状芽 孢杆菌生物体进行分离及减毒。下文所例示分离物是从鸡分离的并在 此物种中测试。
疫苗
本发明的减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌生物体通常配制成药学上可 接受的疫苗组合物。这些疫苗组合物是依照给药途径配制且可与活性 抗原剂相容。该活性抗原剂为例如本发明的减毒产气荚膜梭状芽孢杆 菌A型生物体的一种或多种菌株。视情况，该疫苗组合物也可包含一种 或多种无毒性α-蛋白与这些减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌A型生物体组 合。
举例而言，该疫苗组合物中所含的减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌A型 生物体基本上上均为活的且可存活的，虽然对于某些特定情况，例如 为使某些人或免疫缺陷(immune-compromised)动物免疫，该疫苗只含杀 死的减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌A型生物体。
该疫苗组合物包含生理学上相容的缓冲剂和/或盐，视情况与佐剂 和/或任选的免疫增强剂或刺激剂组合(共同施用或者连续施用，例如 在接种疫苗之前或之后)。
适合的免疫刺激剂包括，但不限于，细胞因子、生长因子、趋化 因子(chemokines)、来自淋巴细胞、单核细胞、淋巴器官细胞的细胞培 养物的上清液、细胞制剂或细胞提取物(例如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)或脂多糖制剂)、促细胞分裂剂(mitogens)、或佐 剂(包括小分子量药物)。免疫刺激剂可在培育期间任何时刻卵内施用。 在特定方面中，该免疫刺激剂可在含有减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌A型 生物体的培养基中进行施用。
施用疫苗的方法
上述本发明疫苗由例如下列途径之一或其组合注射或接种而施 用：经口、鼻内、非经肠、皮下、划破、和/或肌内，以本领域已知的 任何适合制剂，例如相容的缓冲剂和/或生理学上可接受的盐水，视情 况与佐剂和/或任选的免疫增强剂或刺激剂组合施用(共同施用或者连 续施用，例如在接种疫苗之前或之后)。对于经口服用疫苗/接种疫苗方 法，可轻易地采用本技术领域中已知的任何生理学上适宜的缓冲剂或 悬浮剂。另外，可将该组合物掺入(例如混合入)饮用水中或喷涂至食物 颗粒上、撒施于或喷涂于玉米或其它谷物上，等等。
胃肠道是产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的常见位点，且因此口服也 属于一种接种方法。预计，胃肠道中本发明活减毒产气荚膜梭状芽孢 杆菌生物体的存在可在胃肠道的粘膜层产生局部保护免疫应答且也可 以竞争方式用于防止野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌的后续定居。
对于禽类(例如家禽，包括鸡、鸭、鹅等)而言，口服方法或卵内注 射是特别有用的接种途径。卵内途径例示于下文中且自激发孵化鸡来 产生自动免疫及保护。
由产气荚膜梭状芽孢杆菌表达的外源基因
通过上述实例中所发展技术，将任一非天然基因(即产气荚膜梭状 芽孢杆菌的外源基因)视情况插入产气荚膜梭状芽孢杆菌的染色体 DNA中。对于异种蛋白表达而言，可进行基因融合，保留侧接α-毒素 基因的序列、α-毒素启动子及其信号序列。在一个实施方案中，可使用 外源基因替换大部分plc基因编码序列。插入基因下游的plc基因的其余 核苷酸是在阅读框外，且因此不产生功能性α-毒素。或者，可将外源基 因于阅读框内插入至编码α-毒素突变蛋白的核苷酸序列，形成α-毒素- 异种蛋白融合蛋白。
可通过(例如)N-末端FLAG标记序列及适当的限制酶切位点合成外 源基因的寡核苷酸引物。可将该PCR产物克隆至自杀载体中；将FLAG 标记及外源基因插入具有α-毒素信号序列的阅读框内。该异种蛋白是在 α-毒素启动子控制下表达且由plc信号序列靶向分泌。可由蛋白质印迹 法(Western blot)使用抗FLAG抗体监测上清液培养基中所分泌异种蛋 白。
可将任一适宜外源基因以此方式插入产气荚膜梭状芽孢杆菌基因 组中。这些包括(例如)来自胃肠道病原体的DNA编码抗原，包括(例如) 诸如大肠杆菌、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、劳森氏菌属等细菌的抗原 性蛋白；诸如艾美球虫属、等孢子球虫属、隐孢子虫属等寄生虫的抗 原性蛋白；及诸如轮状病毒、冠状病毒等病毒的抗原性蛋白，以免疫 接种经此重组产气荚膜梭状芽孢杆菌治疗的动物。可由此重组产气荚 膜梭状芽孢杆菌表达的其它蛋白包括治疗性蛋白或肽。视情况，这些 包括胃肠道的内源性肽，包括三叶因子或任一类别的本领域已知细胞 因子，例如鸡IL-18等。
一种此产气荚膜梭状芽孢杆菌构建体表达鸡IL-18蛋白。含有基因 融合的活细菌的施用可递送治疗剂量的IL-18至肠且因不产生α-毒素而 对宿主动物相对无害。也可使用此系统表达其它治疗剂。
本文引用了许多参考文献，各文献的全部内容以引用方式并入本 文中。出于说明目的，本发明包括下列具体实施例且除非另有说明， 否则这些实施例并非欲限制本发明的范围。
实施例1
产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素缺失体同源载体
制造用于构建产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素缺失体的同源质粒载 体1162-55-20。将该质粒掺入若干重要的元件；大肠杆菌质粒pUC18的 复制区；产气荚膜梭状芽孢杆菌氯霉素(catP)及红霉素(ermBP)抗性基 因(二者也在大肠杆菌中表达)；及由特定9个氨基酸缺失灭活的产气荚 膜梭状芽孢杆菌α-毒素基因(plc)。按照下列以若干步骤制造质粒 1162-55-20。
首先，自产气荚膜梭状芽孢杆菌(菌株CP6)的近期禽类分离物克隆 plc基因。使用产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13的序列(Genbank NC 003366；SEQ ID NO：2)设计拟用于克隆plc基因的寡核苷酸引物。自 Sigma Genosys，Woodlands，TX购得这些及所有后续引物。定位于yplc 基 因 (CPE0035) 内 的 上 游 引 物 ， 即 5′ AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC3′(SEQ ID NO：14)对应于菌 株13的核苷酸47675-47700(SEQ ID NO：2)。定位于cobW基因(CPE0037) 内的下游引物，即5′GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3′(SEQ ID NO：15)是与菌株13的核苷酸50597-50629互补。在长程聚合 酶链反应(PCR)中一起使用这些引物及来自产气荚膜梭状芽孢杆菌菌 株CP6的基因组DNA。可自菌株13的已知序列(如图1中所示)预知自上 游yplc基因至下游cobW基因的2955个碱基对的产物。α-毒素启动子、 信号序列及plc基因(CPE0036)编码序列包含于此片段中，即，介于上游 yplc基因与下游cobW基因之间。随后将PCR2955个碱基对片段克隆至 产生质粒1162-52.1的克隆用载体pCR-Blunt(Invitrogen公司，Carlsbad， CA)中。自此片段(SEQ ID NO：22；且对应多肽是SEQ ID NO：23)测定 菌株CP6的2955个碱基对片段的plc编码区的核苷酸序列且证实该核苷 酸序列与产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13的plc基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)基本上同源。
接下来，自穿梭质粒pJIR418克隆大肠杆菌复制区及产气荚膜梭状 芽孢杆菌抗性基因(Sloan等人，1992，Plasmid 27，207-219；Genebank M77169)。使用限制酶Bam HI及Spe I消化质粒pJIR418并用Klenow聚合 酶填充末端。大片段的连接反应产生质粒1162-45.1并恢复Bam HI限制 酶切位点。此质粒保留大肠杆菌复制区，但不同于pJIR418，其不含有 产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点。因此，该质粒能够在大肠杆菌中但 不可在产气荚膜梭状芽孢杆菌中自主复制。
在下一步骤中，将plc基因的C-末端部分亚克隆至中间体质粒 1162-45.1。使用Bam HI及Eco RI消化质粒1162-52.1释放一1742个碱基 对片段，其含有α-毒素基因的C-末端部分，自定位于plc基因下游的唯 一Bam HI位点经由cobW基因至定位于母体质粒多克隆位点的Eco RI 位点内的。在定位于质粒1162-45.1多克隆位点内的Bam HI位点与Eco RI位点之间克隆该1742个碱基对片段。在所得质粒1162-53.7中，plc基 因的C-末端部分与亲本质粒的catp及ermBP基因是在相同转录取向上。
在最后一步中，将该plc基因的N-末端部分克隆至质粒1162-53.7的 唯一Bam HI位点。这可通过制造源自在质粒1162-52.1中亚克隆的α-毒 素基因的PCR片段来完成。上游引物，即5′ ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC3′(SEQ ID NO：16)与 先前所述yplc引物(SEQ ID NO：4)是一致的，只是包含侧接Bam HI位点 (小 写 字 母)。定 位 于 α- 毒 素 基 因 内 的 下 游 引 物，即 5′ ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3′(SEQ ID NO：17)与菌株13的核苷酸48824-48857互补且包含侧接Bam HI限制 酶切位点及间隔子核苷酸以保持阅读框架(小写字母)。将自PCR与这些 引物及质粒1162-52-1模板DNA形成的Bam HI片段克隆至质粒 1162-53.7的唯一Bam HI位点。分离在相同转录取向上含有两个plc基因 区的质粒。此质粒1162-55.20含有具有期望的9个氨基酸缺失并在野生 型毒素的ala61与asp71之间添加有一leu残基的plc基因(参见图2)。该质 粒的DNA测序确认该阅读框架及24个密码子(编码8个氨基酸残基)净缺 失。
实施例2
产气荚膜梭状芽孢杆菌重组体CPERF001的构建
使用下列策略将在实施例1中所构建plc基因的缺失形式导入产气 荚膜梭状芽孢杆菌。该同源载体1162-55.20被称为产气荚膜梭状芽孢杆 菌“自杀质粒”，因为其产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点已经移除。
当将此质粒转化成产气荚膜梭状芽孢杆菌时，其不能够复制且不 可存活。然而，倘若将经转化细菌置于氯霉素和/或红霉素选择下，则 质粒DNA可能因与plc基因的同源性而被迫重组至细菌基因组中。所得 重组细菌被称为整合体。该整合体含有在plc基因基因座受到整合的导 入同源载体的拷贝。因此，所得整合体含有两个plc基因拷贝：原来的 正常拷贝及导入缺失形式。所导入抗性基因定位于两个plc基因拷贝之 间。当自该整合体去除抗生素选择时，在两个plc基因拷贝之间发生重 组。此重组事件可能产生两种结果中的一种。在这两种情形中，均已 经移除介入两个plc基因(包括抗性基因)拷贝间的DNA。在第一种结果 中，回复该正常的plc基因从而可回收初始母体菌株。在第二种结果中， 正常的plc基因经缺失拷贝替换，产生期望的α-毒素缺失体构建体。由 于缺失体菌株的α-毒素经灭活，所以此菌株是非溶血性的。因此，可由 在血琼脂平板上筛选非溶血性克隆来识别期望的缺失体整合体。
由于期望形成所需整合体的重组事件以低频率发生，因此关键是 使用具有高转化效率的母体产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株。因此，分析 产气荚膜梭状芽孢杆菌的若干近期禽类分离物的转化效率。使用经轻 微修饰(阐述于下文中)的如Allen及Blaschek(Applied and Environmental Microbiology 54：2322(1988))所述穿梭质粒pJIR418转化这些分离物。菌 株1240呈现最高转化效率(参见表1)，9.2 x 106个转化体/微克pJIR418质 粒DNA。选择此菌株作为构建缺失体CPERF001的亲本菌株。选择菌株 29作为CPERF002的亲本菌株。
上文所列举野生型菌株的来源是Dr.J.Glenn Songer，
Dept.of Veterinary Sciences and Microbiology，
University of Arizona，Tucson，Arizona 85721
以1:25稀释来自TSYC培养基(30克/公升胰酶大豆肉汤，5克/公升酵 母菌提取物，0.5克/公升半胱氨酸)的过夜厌氧培养物的产气荚膜梭状芽 孢杆菌菌株1240个细胞并使的生长至A600＝0.5436。在将100毫升细胞以 18,000×克离心10分钟后，由将细胞重新悬浮于等体积的预还原蔗糖磷 酸镁(＂SMP＂，以270mM蔗糖，1mM MgCl2，7mM NaPO4，pH7.3制 备)缓冲液中两次继而形成具有0.5毫升SMP的最终再悬浮液来制备电 穿孔感受态细胞。此形成约2.0毫升最终体积。
在0.2厘米吸收池中使用4微克质粒1162-55.20对若干等份的100微 升细胞进行电穿孔。在1.37千伏、100奥姆电阻及50微法拉电容下使用 Bio-Rad Gene Pulser II。在电穿孔后，立刻使用2.0毫升预还原胰酶大豆 酵母菌半胱氨酸培养基(＂TSYC＂是以30克胰酶大豆肉汤、5克酵母菌提 取物、0.5克半胱氨酸、950毫升水制备)稀释细胞并在37℃下将其在厌 气瓶中培养3个小时。在回收期后，将细胞稀释物置于TSYC+25微克/ 毫升氯霉素平板上。将这些平板在37℃下，于厌气瓶中培育过夜。
在过夜生长之后，观测到每微克1162-55.20 DNA平均有50个氯霉 素抗性菌落。使7个推定的整合体的各菌落在非选择性TSYC培养基中 生长至出现4个连续出芽并将其置于非选择性血琼脂平板上。这些非选 择性原液之一即1192-31.7呈现若干非溶血性菌落。将21个这些非溶血 性菌落补接(patch)于非选择性主平板并将复制物(replica)置于TSYC+氯 霉素平板上。21个菌落中有2个对氯霉素敏感。
使1个氯霉素敏感性推定缺失体，即1192-32.14与1240野生型及整 合体1192-31.7一起生长并置于血琼脂平板上。1240野生型菌株显示清 晰的β溶血区而1192-32.14缺失体是非溶血性菌落的纯净培养物并将其 重命名为CPERF001。
其它血液平板用作主平板并将复制物置于非选择性及选择性培养 基上。1240野生型及CPERF001均对氯霉素及红霉素敏感。正如我们所 预期，整合体1192-31.7对氯霉素及红霉素二者均具有抗性。
为了排除抗生素抗性基因存在但不在CPERF001中表达的可能性， 合成用于PCR反应的对氯霉素及红霉素基因具有特异性的PCR引物。自 野生型菌株、整合体菌株及CPERF001菌株制备基因组DNA并将其用作 抗生素基因引物的PCR反应的模板。PCR分析的结果显示正响应仅来自 自杀质粒及整合体而非母体1240或缺失体CPERF001。此确认抗性基因 序列的预期损失。
为了确认α-毒素基因内的缺失，由PCR使用适当的α-毒素特异性引 物扩增围绕该缺失的1086bp区。对经扩增片段进行克隆并测序。测序 结果确认自α-毒素基因的tyr 62至trp 70有9个氨基酸缺失及单一leu插入 (参见图2A-2C)。
分析CPERF001的灭活α类毒素蛋白表达。在无氧生长6个小时以 后，收集若干等份1毫升细胞并离心之。由聚丙烯酰胺凝胶电泳分析15 微升未经浓缩上清液培养基并使用针对重组α-毒素蛋白的兔子多克隆 抗体对其进行蛋白质印迹法分析(Vaccine 11(12)：1253-1258(1993))。结 果显示：对于α类毒素蛋白而言，特异性抗体可与期望大小的蛋白反应。
CPERF001是产气荚膜梭状芽孢杆菌A型菌株的经基因改造缺失 体。此菌株分泌产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的灭活类毒素形式。由于 此菌株不再表达活性α-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫 苗以防止由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的疾病。
实施例3
产气荚膜梭状芽孢杆菌重组体CPERF002的构建
为了补偿产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株29的较低转化效率(参见上表 1)，构建新的同源载体。将该新的载体掺入直接自菌株29基因组克隆的 产气荚膜梭状芽孢杆菌序列中。预计，此可产生更有效的重组步骤。 该新的载体系按照下列制造的1192-38.3。
在第一步骤中，自穿梭质粒pJIR418克隆大肠杆菌复制区及产气荚 膜梭状芽孢杆菌抗性基因(Sloan等人，Plasmid 27，207(1992)；Genebank M77169)。使用限制酶NdeI消化质粒pJIR418。大片段的连接反应产生 质粒1192-23.1。此质粒缺少产气荚膜梭状芽孢杆菌复制起点，但不同 于实施例1中所构建质粒1162-45.1，其保留pJIR418的完整的多克隆位 点。
在下一步骤中，将plc基因的C-末端部分亚克隆至中间体质粒 1192-23.1中。来自菌株29的基因组DNA用作长程PCR的模板。扩增自 Bam HI位点至CPE0038基因的一部分的plc基因(α-毒素)区域。上游plc 引物，即5′CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3′ (SEQ ID NO：18)对应于菌株13的核苷酸48880-48916(Genbank NC 003366)。CPE0038 基 因 内 的 下 游 引 物，即 5′ actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC3′(SEQ ID NO：19)与菌株13的核苷酸51244-51275互补且含有包含Pst I限制酶切 位点在内的侧接核苷酸(小写字母)。获得2402个碱基对的产物并用限制 酶Bam HI及Pst I消化。使用经Bam HI及Pst I消化的1192-23.1的大片段 连接此片段以产生质粒1192-36.10。
在最后一步骤中，由PCR克隆plc基因的N-末端部分。上游引物， 即5′actgagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3′(SEQ ID NO：20)对应于菌株13的核苷酸46513-46540且包含侧接核苷酸及Sac I 位 点 (小写字母)。 下 游 引 物 ， 即 5′ actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3′(SEQ ID NO：21)与菌株13的核苷酸48824-48855互补且包括侧接核苷酸及Bam HI位点。产生2363个碱基对产物并使用Sac I及Bam HI限制酶消化此产 物。将经消化片段与经Sac I及Bam HI消化的1192-36.10的大片段连接以 产生质粒1192-38.3。侧接1192-38.3中plc Bam HI位点之区的后续测序确 认了自tyr62至trp70的9个氨基酸缺失。
使用质粒1192-38.3对产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株29细胞进行电穿 孔。上文显示菌株29是以3.6×104个转化体/微克pJIR418质粒DNA的效 率转化。使菌株29细胞生长并按照实施例2中对其进行电穿孔，只是在 3小时回收期后使用液体选择技术。不是平板接种而是以12毫升 TSYC+25微克/毫升氯霉素稀释若干等份的0.67毫升细胞并使其在37℃ 下于厌气瓶中生长过夜。使用此修饰是因为菌株29相对于1240具有较 低转化及平板接种效率之故。在过夜生长之后，再次在选择培养基中 稀释细胞。随后使来自二次出芽的细胞在无选择时传代5次，然后将其 平板接种于血琼脂平板上。来自血琼脂平板的菌落均为溶血性的。随 后将2个血液平板一式两份平板接种至TSYC、TSYC+25微克/毫升氯霉 素及TSYC+50微克红霉素平板。所有菌落均对红霉素敏感但130个菌落 中仅有1个对氯霉素敏感。将此菌落1192-45.4B重命名为CPERF002。使 用α-毒素特异性引物对来自CPERF002的基因组DNA进行PCR分析，显 示α-毒素阳性带。此带较来自野生型菌株29DNA的对应带更小。对氯 霉素及红霉素抗性基因具有特异性的引物不能够扩增CPERF002DNA 但自质粒1192-38.3显示强阳性带。对CPERF002 α-毒素进行测序，确认 9个氨基酸缺失(参见图3)。
分析CPERF002的灭活α类毒素蛋白表达。在无氧生长6个小时以 后，收集若干等份的1毫升的细胞并离心。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分 析15微升未经浓缩上清液培养基并使用针对重组α-毒素蛋白的兔多克 隆抗体对其进行蛋白质印迹法分析(Vaccine 11(12)：1253-1258(1993))。 结果显示：对于α类毒素蛋白而言，特异性抗体可与期望大小的蛋白反 应。
CPERF002是产气荚膜梭状芽孢杆菌A型菌株的经基因改造缺失 体。此菌株分泌产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的灭活类毒素形式。由于 此菌株不再表达活性α-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫 苗以防止由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的疾病。
实施例4
产气荚膜梭状芽孢杆菌缺失体疫苗
评定实施例2及实施例3中所述CPERF001及CPERF002缺失体疫苗 菌株提供针对野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌攻击的保护的能力。将该 研究的第一部分设计为测定所施用活疫苗菌株对孵化蛋的孵化率是否 具有任何不利影响。实验组的分配及安全性结果阐述于表2中。
表2
安全性结果
*每组20个蛋
**在孵化18天时以卵内方式施用100微升剂量(IM)
x以菌落形成单位(＂cfu＂)量测每个剂量的效价。
在施用103或更少剂量(组1、2、5及6)时，这些组并非较仅接种培 养基的组(组11)或未经接种的组(组12)具有明显更低的孵化率。在最低 剂量时，CPERF001显示与培养基对照相同且较未经接种对照组更佳的 孵化率。
由于较高剂量的缺失体可对蛋孵化率具有不利影响，因此该研究 的有效部分仅包含每一缺失体的2个最低剂量的组。使用(野生型)产气 荚膜梭状芽孢杆菌菌株激发这些组以及培养基对照鸟类(组11)，该菌株 CP6是在鸟有20、21及22天大时以约108cfu/毫升/只鸟经口施用。在25 天大时对所有鸟进行尸体检剖并使有下文所概述坏死性肠炎评定量表 对小肠内损伤进行打分。
可依照Charles Hofacre，D.V.M.，M.A.M.，Ph.D.，University of Georgia，Poultry Diagnostic and Research Center，953 College Station Road，Athens，GA 30602对记分进 行较小改动。
在研究结束时对来自未经接种对照组(未受激发)的五(5)只鸟进行 尸体检剖以确认在研究过程中未暴露于产气荚膜梭状芽孢杆菌。结果 示于表3中。
表3
*在25日龄时进行尸体检剖
与组11相比，组1及组2各自的记分在统计学上明显更低(Wilcoxon Exact Rank Sum Test p≤0.0250)。组5及组6的平均记分较组11更低但在 统计学上无不同(Wilcoxon Exact Rank Sum Test p≥0.2177)。依照David Siev所述程序[Journal of Modern Applied Statistical Methods，第4卷，No. 2，500-508(2005)]对疫苗效率进行评定。当与组11对比时，将疫苗在降 低疾病严重性方面的效率评定为54％(组1)、65％(组2)、20％(组5)及 27％(组6)。
实施例5
产气荚膜梭状芽孢杆菌猪缺失体的构建
使用上文实施例1及实施例2中所用策略来自产气荚膜梭状芽孢杆 菌猪菌株构建α-毒素缺失突变体。开始，使用质粒pJIR418对来自患病 猪的野外分离物进行电穿孔以评定其可转化性。产生≥104个转化体每微 克质粒DNA并对氯霉素或红霉素敏感的分离物是缺失的候选者。
来自候选菌株的基因组DNA用作plc(α-毒素)基因及侧接序列的长 程PCR的模板。在亚克隆PCR产物之后，对α-毒素基因及、侧接区进行 测序并绘制限制性内切酶图谱。通过侧接限制酶切位点合成新的寡核 苷酸引物并将2次独立扩增的产物克隆至自杀质粒1192-23.1以制造如 实施例1中所述27个碱基对缺失。
将该猪自杀载体电穿孔至对应产气荚膜梭状芽孢杆菌的猪菌株并 使用上文实施例2中所述方法分离缺失突变体。由血琼脂平板上不存在 β溶血作用及由对α-毒素基因进行DNA测序来确认缺失突变体。
此构建体是产气荚膜梭状芽孢杆菌A型菌株的经基因改造缺失体。 此菌株分泌产气荚膜梭状芽孢杆菌α-毒素的灭活类毒素形式。由于此菌 株不再表达活性α-毒素但保留大部分毒素抗原性，因此其可用作疫苗以 防止猪患由产气荚膜梭状芽孢杆菌引起的疾病。
生物保藏
下列生物材料的培养物已经由下列国际保藏机构保藏：
美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 University Boulevard， Manassas，Va.20110-2209，U.S.A.，在满足国际认可用于专利程序目的 的布达佩斯微生物保藏条约要求的条件下保藏。
生物体 登记编号 保藏日期
产气荚膜梭状芽孢杆菌 PTA7364 2006年2月7日
CPERF/ΔαToxin 365-054
产气荚膜梭状芽孢杆菌 PTA7365 2006年2月7日
CPERF/ΔαToxin 365-053
序列表
<110>Cochran，Mark D
Petersen，Gary R
Lair，Stephen V
Synenki，Richard M
<120>重组减毒梭状芽孢杆菌生物体和疫苗
<130>AH06175WO
<140>PCT/US2007/009135
<141>2007-04-12
<150>US 60/792,553
<151>2006-04-17
<160>23
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>398
<212>PRT
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13
<400>1
Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Thr Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys
20 25 30
Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Val Ser
35 40 45
Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys
50 55 60
Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His
85 90 95
Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp
100 105 110
Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys
115 120 125
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln
130 135 140
Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His
165 170 175
Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp Ile Leu
195 200 205
Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe
210 215 220
Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His
225 230 235 240
Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser
245 250 255
Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser
260 265 270
Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala
275 280 285
Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met
290 295 300
Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met
305 310 315 320
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr
325 330 335
Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met
340 345 350
Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro
355 360 365
Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp
370 375 380
Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys
385 390 395
<210>2
<211>1197
<212>DNA
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13
<400>2
atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgctacgc tagcaactag cctatgggct 60
ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaagattg atggaacagg aactcatgct 120
atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtccaaaaa tgaaccagaa 180
agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240
acttatccag attatgataa gaatgcatat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300
gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 360
acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420
aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480
actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggacatgt taagtttgaa 540
acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600
gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaggatttta atgcatggtc aaaagaatat 660
gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720
agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 780
gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840
aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900
gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960
gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 1020
gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080
gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1140
gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa 1197
<210>3
<211>370
<212>PRT
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株13
<400>3
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1 5 10 15
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Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu
35 40 45
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu
50 55 60
Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys
65 70 75 80
Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser
85 90 95
Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly
100 105 110
Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe
115 120 125
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130 135 140
Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu
145 150 155 160
Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr
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Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr
180 185 190
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Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr
210 215 220
Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu
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275 280 285
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Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp
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Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val
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370
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<212>DNA
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌
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<212>PRT
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌
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<211>14
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>6
aatgcattgg atcc 14
<210>7
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>缺失后蛋白所含的或插入蛋白的氨基酸序列。可被化学合成。
<400>7
Asn Ala Leu Asp
1
<210>8
<211>15
<212>DNA
<213>人工的
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<211>4
<212>PRT
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<220>
<223>缺失后蛋白所含的或插入蛋白的氨基酸序列。可被化学合成。
<400>11
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
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<211>4
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>15
gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc 33
<210>16
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>16
ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 32
<210>17
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>17
ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>18
ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>19
actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 40
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>20
actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 37
<210>21
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>化学合成的
<400>21
actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41
<210>22
<211>1197
<212>DNA
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株CP6
<400>22
atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgctgcgc tagcaactag cctatgggct 60
ggggcatcaa ctaaagtcta cgcttgggat ggaaaaattg atggaacagg aactcatgct 120
atgattgtaa ctcaaggggt ttcaatctta gaaaatgatc tgtctaaaaa tgaaccagaa 180
agtgtaagaa aaaacttaga gattttaaaa gagaacatgc atgagcttca attaggttct 240
acttatccag attatgataa gaacgcctat gatctatatc aagatcattt ctgggatcct 300
gatacagata ataatttctc aaaggataat agttggtatt tagcttattc tatacctgac 360
acaggggaat cacaaataag aaaattttca gcattagcta gatatgaatg gcaaagagga 420
aactataaac aagctacatt ctatcttgga gaggctatgc actattttgg agatatagat 480
actccatatc atcctgctaa tgttactgcc gttgatagcg caggacatgt taagtttgag 540
acttttgcag aggaaagaaa agaacagtat aaaataaaca cagcaggttg caaaactaat 600
gaggattttt atgctgatat cttaaaaaac aaagatttta atgcatggtc aaaagaatat 660
gcaagaggtt ttgctaaaac aggaaaatca atatactata gtcatgctag catgagtcat 720
agttgggatg attgggatta tgcagcaaag gtaactttag ctaactctca aaaaggaaca 780
gcaggatata tttatagatt cttacacgat gtatcagagg gtaatgatcc atcagttgga 840
aagaatgtaa aagaactagt agcttacata tcaactagtg gtgaaaaaga tgctggaaca 900
gatgactaca tgtattttgg aatcaaaaca aaggatggaa aaactcaaga atgggaaatg 960
gacaacccag gaaatgattt tatgactgga agtaaagaca cttatacttt caaattaaaa 1020
gatgaaaatc taaaaattga tgatatacaa aatatgtgga ttagaaaaag aaaatataca 1080
gcattcccag atgcttataa gccagaaaac ataaagataa tagcaaatgg aaaagttgta 1140
gtagacaaag atataaatga gtggatttca ggaaattcaa cttataatat aaaataa 1197
<210>23
<211>398
<212>PRT
<213>产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株CP6
<400>23
Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Ala Leu Ala Thr
1 5 10 15
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys
20 25 30
Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Val Ser
35 40 45
Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys
50 55 60
Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His
85 90 95
Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp
100 105 110
Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys
115 120 125
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln
130 135 140
Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp
145 150 155 160
Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His
165 170 175
Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile
180 185 190
Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp Ile Leu
195 200 205
Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe
210 215 220
Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His
225 230 235 240
Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser
245 250 255
Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser
260 265 270
Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala
275 280 285
Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met
290 295 300
Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met
305 310 315 320
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr
325 330 335
Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met
340 345 350
Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro
355 360 365
Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp
370 375 380
Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys
385 390 395