本发明涉及胸腺素α-1在制备用于预防和治疗自身免疫性疾病的药物中的 应用。具体地说，本发明涉及胸腺素α-1在制备用来预防和治疗自身免疫性疾 病如多发性硬化症(MS)以及炎性肠病如克罗恩病或溃疡性结肠炎的药物中 的应用。
与基于炎症的神经性疾病的抗争，是人类在世界范围的主要科学性、社会 性和经济性命题之一。在过去数年里逐渐显现，大量中枢神经系统病症如多发 性硬化症(MS)、感染性和感染后继发的脑脊髓炎和脑炎、自身免疫性疾病的 神经性综合症、Rasmussen脑炎、缺血以及创伤性脑损伤是由炎症过程导致的， 这些炎症过程与神经和轴索损伤密切相关。神经退化是永久性神经功能缺损的 主因。神经炎症疾病给社会造成经济负担，因为它伴随着严重的残障，如感觉 -动作功能缺陷、认知能力退化、失禁和行为问题。在西方国家，MS是年轻成 人发生神经障碍的主要原因。MS是一种中枢神经系统的慢性炎性疾病，其病 因不明，可能与潜在遗传和环境因素都有关。正如前面曾提及的，它是西方国 家年轻成人发生神经性障碍的主要原因，在欧洲中部和北部发生率最高(每10 万居住人口中超过30例)。多数患者从发生神经功能障碍开始起病，然后完全 或部分缓解(复发性-间歇性MS)，再后来表现出进展趋势，障碍程度加重(次 发进展性MS)。一些患者则很快表现出进展趋势(首法进展性MS)，而疾病 的急性趋势则较少见。病理学上，MS是根据磁共振影像确定的白质损伤来界 定的。炎性浸润、髓鞘质(富含脂质的膜覆盖的轴索)脱失、少突神经胶质细 胞(髓鞘质生成细胞)和轴索损伤以及活动性神经胶质增生在病灶或斑块部位 都可看到。近来，更加详尽的神经病理学研究和先进的磁共振影像技术揭示白 质中存在有更广泛分布的炎性损伤，以及大脑皮质灰质有病灶存在，这些都与 神经退化过程有关，而且决定着疾病进展的形式。尽管已开展了大量的临床和 实验性研究，髓鞘质和神经元损伤背后的免疫病理学的复杂机制仍然未能被了 解。当原本正常情况下保护人体免受疾病和感染侵害的免疫系统攻击自身时， 便发生了自身免疫性疾病。它可攻击人体许多部位如神经或肌肉，还能导致严 重的慢性病症和功能丧失。关于这种疾病的认识大部分来自于实验性自身免疫 性脑炎(EAE)的研究，采用的是模拟人体发生脱髓鞘的动物模型。在实验中， 针对动物髓鞘质某些蛋白进行致敏处理使其发生类似于多发性硬化症的症状， 然后用实验性治疗手段进行试验以评价其功效。细胞疗法采用某种类型的细胞 (称为树突状细胞)，当被注射入患有这些病症的动物的体内时，可产生调节 性T细胞(Treg)以维持免疫耐受性。最近的研究显示树突状细胞在接受治疗的 动物中可导致新的Treg细胞的生长，这些细胞特异性中和了攻击包裹在神经 外髓鞘质的免疫细胞。如此的处理手段对体外产生Treg细胞也有效。最近的 研究显示胸腺素α-1(一种已被广泛用于多种病症临床实践的胸腺激素 (Goldstein，A.L.Badamchian，M.Thymosins：chemistry and biological properties in health and disease(胸腺素在健康和疾病中的化学与生物特性).Expert Opin Biol Ther.2004，4：559-73))能在体外通过选择性作用于树突状细胞而诱导Treg 细胞(romani L，Bistoni F，Perruccio K，Montagnoli c，Gaziano R，bozza S，Bonifazi P，Bistoni G，Rasi G，Velardi A，Fallarino F，Garaci E，Puccetti P.Thymosin alpha 1 activates dendritic cell tryptophan catabolism and establishes a regulatory environment for balance of inflammation and tolerance(胸腺素α-1激活树突细胞 色氨酸分解代谢并为平衡炎症和耐受力建立调节环境).Blood.2006/6/1；[印刷 前电子出版])。
炎性肠病(IBD)可涉及到小肠和大肠。克罗恩病和溃疡性结肠炎是IBD的 最知名的两种形式，由于病因不明，两者均属自发性炎性肠病。病理学检测往 往针对性不足，哪怕结果推测是某一种特定形式的IBD。“活动性”IBD的特征 是急性炎症。“慢性”IBD的特征是结构变形和肠隐窝损伤。隐窝脓肿(由腺腔 内活化的中性粒细胞构成)在多种形式的IBD中出现。
溃疡性结肠炎(UC)主要是后段粘膜性炎症。最终常会累及直肠。UC的病 因不明。UC在高加索妇女和年轻成人中更常见(20-25岁年龄段最高发)。临 床表现包括腹泻，伴有或不伴有里急后重。持续的UC症状患者有发展成恶性 肿瘤的高度风险。可采用结肠镜检查确定异型增生-----预示粘膜恶性肿瘤的高 度可能。US患者还有发展肝脏疾病的危险，包括硬化性胆管炎以及胆管癌。
克罗恩病可影响肠道任何部位，但大多涉及较细的后段。炎症一般是穿壁 性的，在淋巴样滤泡表面形成小溃疡状，或是在穿壁处和慢性炎症部位生成深 度溃疡。三分之一的病例在结肠以外处有肉芽肿发生，如淋巴和肝脏。穿壁性 炎症导致肠与其他组织之间形成瘘。炎症一般为节段性的。病因不明，虽然有 着感染和免疫机制的说法。在女性和高加索人群中有双峰和高发现象。临床表 现有差别，可有腹泻、发热和疼痛，还有相同于由关节炎、葡萄膜炎、结节性 红斑、强直性脊柱炎引起的非肠道症状。
溃疡性结肠炎与克罗恩病的比较
特征溃疡性结肠炎克罗恩病分布范围弥散性，后段为主节段性或弥散性为主，也常发生在近端直肠总是涉及到通常不涉及显微镜检分布弥散性常为局灶性炎症程度粘膜性穿壁性乳房症状和肠瘘无常有肠腔狭窄无常有肉芽肿无常有
IBD感染源一般作用更快持续较短。可引起IBD的细菌包括志贺氏菌、沙 门氏菌、弯曲杆菌以及部分大肠埃希氏菌。细菌是不会发生慢性改变的自限性 结肠炎的常见病因。病毒性病因包括诺瓦克病毒、轮状病毒和巨细胞病毒。其 他致病原有砂眼衣原体感染和阿米巴感染。与使用抗生素相关的IBD主要是继 发于广谱抗生素疗法后由于艰难梭菌(Clostridium difficile)或其他微生物如白色 念珠菌的过度生长。IBD还可次发于缺血。
药物治疗是缓解溃疡性结肠炎与克罗恩病症状的主要手段。用以IBD治疗 的药物开发已经获得了长足进步。包括：
·抗炎药，用以减轻疾病导致的炎症；
·免疫抑制药物，以阻碍免疫系统对机体本身组织的攻击从而造成炎症的恶性 循环。
如IBD病人对这些药物没有反应，则需要进行外科手术。不过UC和克罗 恩病的手术流程大不相同。由于克罗恩病易复发的特点，医生必须尽可能避免 手术。另外，对克罗恩病作激进的外科处理被认为会造成进一步的并发症如短 肠综合症，进而影响生长和降低营养摄取能力。对于UC，可能有必要手术切 除结肠(大肠)，称为回肠肛管吻合术(也称为回肠肛管拖出术)，手术医生在 小肠内造袋以储存粪便。这样能使粪便从肛门排出。
近期的发现表明IBD可能是免疫失调的结果，涉及免疫效应物和调节细胞 (Treg)。在IBD实验模型上，可能与IBD状况相关联的三种情况有：
a.平衡的效应和调节反应＝炎症的控制，无IBD症状
b.效应物反应强于调节反应＝炎症和IBD
c.无调节作用＝炎症失控和严重的IBD
治疗IBD的药物从1993年的3个产品、1个靶标发展到2005年的超过30 个产品、超过10个靶标。作为有用的临床前模型，来自TNBS的结肠炎模型 (见下面)被用来检测克罗恩病的新疗法。这些包括：应用结肠5-氨基唾液酸 和白三烯拮抗剂，释放一氧化氮的泼尼松龙衍生物、趋化因子拮抗剂，以及抗 粘附小分子。从临床角度而言，对于克罗恩病某些亚型患者有希望的抗-TNF 疗法，在慢性TNBS结肠炎也显示有益效果。针对IBD病因研发之中的产品数 量，更凸现了加强IBD临床研究力度的必要性。最近的研究显示胸腺素α-1----- 一种已被广泛用于多种病症临床实践的胸腺激素，能在体外通过选择性作用于 树突状细胞而诱导Treg细胞。
直到今日，自身免疫性疾病用免疫抑制剂或抗炎性药物如皮质激素来治 疗。然而这些药物可产生甚至很严重的副作用，如免疫抑制和高血糖。
综上，显然需要得到克服了现有药物缺点的新的药物来治疗和预防自身免 疫性疾病。
本发明的作者已经发现胸腺素α-1能预防病有效治疗自身免疫性疾病，而 不对机体造成任何毒性作用。
胸腺素α-1(Tα1)作为一个自然界中发现的胸腺肽，已被熟知运用于某些 病毒感染的治疗上，或是单一疗法，或是作为免疫佐剂与INF-α合用(Goldstein A等，2004 Expert Opin.Biol.Ther.4：559-573)。
已知的胸腺素α-1其他适应症还有如免疫缺陷、肿瘤和艾滋病的治疗。最 近研究显示Tα1通过TLR9调节树突状细胞发挥功能，从而起到先天免疫和继 承免疫系统内源调节剂的作用。(Romain L等，2004，Blood103：4232-4239)。
已知胸腺素α-1还作为生物应答的调节因子，与INF-α联合使用于某些病 毒感染治疗，还可作为免疫佐剂(Goldstein A等，2004 Expert Opin.Biol.Ther. 4：559-573)。
本发明的目的是用胸腺素α-1制备药物，来预防和治疗自身免疫性疾病， 特别是多发性硬化症(MS)和像炎性肠病这样的内脏炎症，例如溃疡性结肠 炎和克罗恩病。
下面将根据较优实施方式和特定的附图，以示例对本发明加以描述，但非 仅限于这些实例：
图1表示小鼠的平均临床评分(n＝5)与MOG肽免疫的时间(天)的相对关 系。
图2显示用四氧化锇着色的半精制脊髓切片的组织分析，并特别标示出经 MOG处理后小鼠的脱髓鞘区域，而经胸腺素α-1处理过的小鼠中没有明显的脱 髓鞘迹象。黑箭头表示完整的髓鞘。
图3显示胸腺素α-1对诱导而来的结肠炎严重程度的影响，以DAS、MAS 和MPO来衡量。结果显示胸腺素α-1使所有与结肠炎相关或可关联的参数都 大幅降低。对照小鼠未接受任何处理。
图4显示了分离自对照动物、结肠炎动物(TNBS)和经胸腺素α-1处理动物 (TNBS+Tα1)肠粘膜固有层的CD4+CD25+中细胞因子的产生。
实施例1：评价胸腺素α-1对EAE的功效
为此目的经常使用EAE模型来了解给易感动物施用髓鞘质衍生肽对疾病 的诱导。以胸腺素α-1处理模型动物，根据临床和组织学参数来评价其功效。
方法
EAE的诱导
用以下步骤对C57BL6小鼠进行EAE诱导：在尾根部注射100微升用弗 氏佐剂配制的含有100微克MOG35-55(一种髓鞘质糖蛋白的肽片段)的乳剂。 在免疫当天和三天后以每只小鼠200ng剂量腹膜内注射博托斯克毒素(pertoxic toxin)会有利于EAE的诱导。按照两种实验方案设计，腹膜内注射200ng/Kg 剂量的胸腺素α-1。第一个方案，胸腺素从给予MOG的当天开始给药，并在此 后连续给药3天(Tα1+MOG)。第二个方案，胸腺素从给予MOG后第10天 开始给药，并在此后连续给药3天(MOG+Tα1)。
EAE的评价
按照以下参数每天对小鼠作出临床评价：0，正常；1，尾松垂或后腿无力； 2，尾松垂并伴有后腿无力；3，后肢局部瘫痪；4，后肢完全瘫痪；5，垂死状。 采用半精制脊髓切片四氧化锇染色进行组织学分析。
结果
结果(图1)显示胸腺素α-1能明显降低MOG处理小鼠中EAE的比重(评 分)和发病率。当胸腺素注射与MOG诱导伴随进行或在MOG诱导以后进行的 情况下，这种效应尤其明确。
图2显示用四氧化锇着色的半精制脊髓切片的组织学分析，其中特别标示 出经MOG处理后小鼠的脱髓鞘区域，而经胸腺素α-1处理过的小鼠中没有明 显的脱髓鞘迹象。黑箭头表示完整的髓鞘。这些结果说明胸腺素α-1对EAE发 生及其神经病理学严重程度有保护作用。
实施例2：评价胸腺素α-1在IBD实验模型上的功效(Fiorucci S，Antonelli E， Distrutti E，Del Soldato P，Flower RJ，Clark MJ，Morelli A，Perretti M，Ignarro LJ. NCX-1015，a nitric-oxide derivative of prednisolone，enhances regulatory T cells in the lamina propria and protects against 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in mice(泼尼松龙的氧化氮衍生物在固有层中能增强调节T细胞并保护 小鼠不发生2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎).Proc Natl Acad Sci USA.2002， 99：15770-5)。
为此目的经常使用IBD模型来了解结肠内给予三硝基苯磺酸(TNBS)的半 抗原衍生物对疾病的诱导。动物用胸腺素α-1处理，以临床、组织学和免疫学 指标评价其功效。
方法
结肠炎模型
结肠内使用TNBS半抗原对啮齿动物造成急性和慢性结肠炎(Riorucci S， Antonelli E，Distrutti E，Del SoldatoP，Flower RJ，Clark MJ，Morelli A，Perretti M， Ignarro LJ.NCX-1015，a nitric-oxide derivative of prednisolone，enhances regulatory T cells in the lamina propria and protects against 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in mice(泼尼松龙的氧化氮衍生物在固有层中能增 强调节T细胞并保护小鼠不发生2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎).Proc Natl Acad Sci USA.2002，99：15770-5)。
TNBS诱导的粘膜炎症有中性粒细胞浸润，但还包括有巨嗜细胞和单核细 胞富集以及T淋巴细胞活化(Th1)。对于男性而言，克罗恩病的组织病理学特 性与穿壁性炎症、肉芽肿、溃疡及跳跃性病变(粘膜溃疡区域与正常区域相间 分布)类似(Morris GP，Beck PL，Herridge MS，Depew WT，Szewczuk MR，Wallace JL.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon(大鼠结肠慢性炎症和溃疡的半抗原诱导模型).Gastroenterology.1989， 96：795-803)。
每天监测动物发生腹泻、减重、便血的情况并检查存活数(与疾病的活动 程度相关)。实验结束时处死存活的动物，切取结肠显微检查评价损害情况(称 为粘膜活性评分-MAS)。然后取组织部分用以测定髓过氧化酶(MPO)活性(一 个炎症指数)。
结肠炎的显微分级
结肠切片在显微镜下(×5)进行微观病变分级，以反映炎症的指征如充血、 肠壁增厚和溃疡扩散为衡量对象，评分从0到10。
MPO测定按照以往报道的方法(Fiorucci S，Antonelli E，Distrutti E，Del Soldato P，Flower RJ，Clark MJ，Morelli A，Perretti M，Ignarro LJ.NCX-1015，a nitric-oxide derivative of prednisolone，enhances regulatory T cells in the lamina propria and protects against 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in mice(泼尼松龙的氧化氮衍生物在固有层中能增强调节T细胞并保护小鼠不发 生2，4，6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎).Proc Natl Acad Sci USA.2002， 99：15770-5)，以三甲基联苯胺(TMB)作为底物通过分光光度法测定MPO活性， 来监测结肠的中性粒细胞浸润。酶活以每毫克蛋白的活性单位来表示。
用胸腺素α-1处理Tα1(购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma， St.Louis，MO，USA)；产品编号T3410；分子式C129H215N33O55)和肽以无菌干 粉形式提供。干粉用无菌水重建(内毒素含量<0.03pg/ml，标准鲎试剂法)。胸 腺素α-1以200微克/公斤的剂量腹膜内注射给药，从TNBS诱导当天起连续6 天。
细胞因子测定该测定在CD4+CD25+表型淋巴细胞培养物上清液上通过 特定ELISA试验(ELISA试剂盒，明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司 (R&D Systems Inc，Minneapolis，MN))进行，所述细胞培养物分离自肠粘膜固 有层并用抗淋巴细胞上表达的CD3和CD28分子的抗体体外刺激48小时(加州 帕洛阿托的PM公司(PharMingen，BD，Palo Alto，California))。
所有炎症和细胞因子评价都在胸腺素α-1处理结束后的一天进行。
图3显示胸腺素α-1对诱导而来的结肠炎严重程度的影响(以DAS、MAS 和MPO来衡量)。结果显示胸腺素α-1使所有与结肠炎相关或可关联的参数都 大幅降低。对照小鼠未接受任何处理。
图4显示了分离自对照动物、结肠炎动物(TNBS)和经胸腺素α-1处理动物 (TNBS+Tα1)肠粘膜固有层的CD4+CD25+中细胞因子的产生。结果显示结肠炎 动物体内炎症前细胞因子如IFN-γ和IL-17的明显升高，以及非显著程度的抗 炎性IL-10产生。炎性/抗炎性细胞因子的产生模式受到胸腺素处理的显著干 扰，使IL-10产生明显增强。
这些结果显示胸腺素α-1在结肠炎实验模型中对IBD的严重程度有保护作 用。