含有烟酸或其衍生物作为有效成分用于预防和治疗癌症的治疗剂
【技术领域】
本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物 作为有效成分，更具体地，本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的药剂， 其含有烟酸或其衍生物作为有效成分，所述烟酸或其衍生物增强RUNX3 基因，一种被甲基化作用灭活的癌症抑制基因的表达，并且通过防止 RUNX3蛋白的脱乙酰基作用(deacethylation)抑制RUNX3蛋白的分解 而激活所述基因。
【背景技术】
现今，癌症的3种主要治疗方法，为外科手术、化学疗法和放射疗法。 并且实际上，正在实行将上述方法与激光治疗等组合的多元方法。考虑到 治疗的疼痛或转移的可能性，在它们之中化学疗法是最受期望的。因此， 已经研发了各种抗癌药剂并且将它们临床上用于辅助化学治疗。基于选择 性杀死活跃分裂的细胞的原理，已经研发了那些药剂。然而，那些药剂不 但杀死癌细胞还杀死活跃分裂的正常细胞，诸如免疫细胞、毛囊细胞等， 引起严重的副作用，以致长期施用那些药剂是不可行的。因此，基于癌症 起因的根本治疗来研发新的抗癌药剂是重要的。
尽管癌基因的激活诱导细胞的异常增殖，但是肿瘤抑制基因抑制细胞 的异常增殖，并且有时通过运行细胞死亡程序破坏特异的靶细胞而阻碍肿 瘤细胞的产生。即使当在细胞中包含异常激活的癌基因时，通过肿瘤抑制 基因的正常作用所述细胞不能长成肿瘤细胞。因此，为了产生肿瘤细胞， 癌基因的激活和肿瘤抑制基因的灭活应该在细胞中同时发生。
不恰当的细胞增殖，肿瘤细胞的一种特征，被确定是由癌基因的激活 和肿瘤抑制基因的灭活同时引起。特别地，正常细胞中的TGF-β依赖的 程序性细胞死亡在抵御肿瘤细胞中起重要作用。此时，肿瘤抑制基因的灭 活促进细胞分裂，并且抑制TGF-β依赖的程序性细胞死亡，这导致肿瘤 细胞的产生。
引起肿瘤抑制基因灭活的一种关键观点是在CpG岛的异常DNA甲基 化作用(Jones和Laird，Nature genet.21，163-167，1999)。在CpG岛中的甲 基化作用由DNA甲基化酶诱导。当这样的甲基化作用进行时，MeCP2蛋 白结合于甲基化的DNA，导致组蛋白脱乙酰酶(deacethylase)的集中。然 后，组蛋白脱乙酰酶移除连接在组蛋白上的乙酰基(acethyl group)，并且因 此，周围的DNA结构更加致密，这导致基因表达的抑制。由DNA甲基 化作用抑制的基因可以通过DNA甲基化酶抑制剂或组蛋白脱乙酰酶抑制 剂的活性而重新表达。
乙酰化作用/脱乙酰基作用不仅在组蛋白中而且在一些转录因子，诸 如p53、RUNX3等中发生。例如，当在RUNX3中的乙酰化作用被诱导 时，抑制了通过遍在蛋白化作用的蛋白分解作用，但是促进了RUNX3的 活性(Jin等.，J.Biol.Chem.2004，279卷，第29409-17页)。即，RUNX3活 性的促进由脱乙酰化作用的抑制引起。因此，乙酰化作用/脱乙酰基作用 是一种调控蛋白功能的非常重要的机制。
事实上，最近已经报道，RUNX3，其为本发明人早先确定的肿瘤抑 制基因，其表达在许多人类癌症中通过DNA甲基化作用而被抑制，例如， 按照那些报道，RUNX3的表达在胃癌中60％被抑制(Li QL等.，Cell.2002 109(1)：113-24；Oshimo Y.等.，Pathobiology.2004，71(3)：137-43)，在肺癌中 25-40％被抑制(LI QL等.BBRC.2004，314(1)：223-8；Kim TY等.，Lab Invest. 2004，84(4)：479-84)，在喉癌中62％被抑制，在乳腺癌中25％被抑制(Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，在胰腺癌中70％被抑制(LiJ等.，J Clin Patho1.2004 57(3)：294-9；Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)： 2401-7)，在肝细胞癌中73％被抑制(Xiao WH和Liu WW， World J Gastroenterol.2004，10(3)：376-80；Kim TY等.，Lab Invest.2004， 84(4)：479-84)，在胆管癌中75％被抑制(Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)： 2401-7)，在前列腺癌中23％被抑制(Kang GH等.，J.Pathol.2004， 202(2)：233-40；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84)，和在结肠癌中 45％被抑制(Ku JL等.，Oncogene，2004，23，6736-6742)。
另外，证明RUNX3基因的激活显著地抑制肿瘤细胞增殖(Li等.，Cell， 109(1)，113-24，2002；Balmain，Nature 417(6886)，235-7，2002)。基于这一证 明，用于预防和治疗癌症的药剂的研发已经集中在RUNX3基因激活的研 究上。
因此，本发明人尝试找出能够激活RUNX3的因子，所述RUNX3为 一种肿瘤抑制基因，其在体内在癌症细胞中被灭活。因此，本发明人发现 这样的事实，即，烟酸及其衍生物可以激活被甲基化作用灭活的RUNX3 基因，并且增加RUNX3蛋白的量。并且此外，本发明人通过确定烟酸及 其衍生物可以有效地用于预防和治疗癌症而完成本发明。
【公开内容】
【技术问题】
本发明的目的是提供含有烟酸或其衍生物作为有效成分用于预防和 治疗癌症的药剂，其能够激活RUNX3基因，一种在肿瘤细胞中通过甲基 化作用被灭活的肿瘤抑制基因，并且促进源自所述基因的RUNX3蛋白的 活性。
【技术方案】
为了实现上述目的，本发明提供用于预防和治疗癌症的药剂，其含有 烟酸或其衍生物作为有效成分。
在下文中，详细地描述本发明。
本发明提供用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为 有效成分。
本发明人期望能够在体内再激活被灭活的肿瘤抑制基因RUNX3的药 剂具有抗癌作用。因此，本发明人已经找到一种能够激活RUNX3基因的 物质，并且结果已经确定烟酰胺可以激活RUNX3。
本发明人研究，RUNX3，一种肿瘤抑制基因，是否在肿瘤组织中被 甲基化，以检验癌症患者中肿瘤发展和甲基化作用的关系。结果，在癌症 患者的组织中RUNX3基因常常被甲基化，并且证明显示出RUNX3甲基 化的那些患者组具有高比例的癌症复发和转移(参见表1-表3)。
上述结果表明，再激活被甲基化作用灭活的RUNX3是预防癌症发展 的一种方法。并且这一想法促使本发明人寻找能够激活RUNX3基因的物 质，作为检测阻碍癌症发生和发展的药剂的努力。结果，确定烟酰胺可以 再激活被甲基化作用灭活的RUNX3(参见图2)。
还研究了烟酰胺是否能够增加RUNX3蛋白的量。结果，由于RUNX3 通过由组蛋白脱乙酰酶诱导的脱乙酰基作用所分解，RUNX3蛋白的量减 少，然而，烟酰胺的施用引起RUNX3蛋白乙酰化的增加，这导致所述蛋 白的量的增加(参见图3和图4)。
为了确定烟酰胺的体内抗癌作用，在患有由致癌物诱发的癌症的小鼠 中观察到肿瘤形成的抑制。本文将N-丁基-N-4-(羟丁基)-亚硝胺(BBN)用 作致癌物，并且通过比较被提供以BBN溶液作为饮用水持续20周的小鼠 与被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的小鼠之间的肿瘤发 生，来分析肿瘤形成的抑制(参见图5和图6)。结果，在BBN处理组， 在RUNX3外显子1区域的CpG岛中诱导甲基化，意味着RUNX3的活性 被抑制。因此，在所述组中100％发展了膀胱癌，并且它们中80％为浸润 癌和23％为浅表癌。与之相反，在BBN和烟酰胺处理组中，在RUNX3 外显子1区域的CpG岛中，甲基化作用被显著地减少，这导致膀胱癌发 生的减少(58％)，并且癌症的恶性也减少了。因此，它们中只有23％为浸 润癌，并且它们中77％为浅表癌。上述结果表明，烟酰胺抑制由BBN引 起的RUNX3的灭活，这表明它可以抑制BBN引起的肿瘤发生。
从上述结果，证实本发明的烟酰胺可以再激活被甲基化灭活的 RUNX3，并且因此显著地抑制肿瘤生长。
按照上述结果，发现肿瘤抑制基因RUNX3，事实上，在各种人类癌 症，诸如胃癌、肺癌、喉癌、乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管癌、前列 腺癌、结肠癌等中，通过甲基化作用被灭活(Li QL等.，Cell.2002 109(1)：113-24；Oshimo Y.等.，Pathobiology.2004，71(3)：137-43)；LI QL等. BBRC.2004，314(1)：223-8；Kim TY等.，Lab Invest.2004，84(4)：479-84；Li J 等.，J Clin Pathol.2004 57(3)：294-9；Wada M等.，Oncogene.2004，23(13)： 2401-7；Xiao WH和Liu WW World J Gastroenterol.2004，10(3)：376-80； Kang GH等.，J.Pathol.2004，202(2)：233-40；Ku JL等.，Oncogene，2004，23， 6736-6742)，并且证明RUNX3基因的激活显著地抑制癌细胞的增殖(Kim 等.，Lab Invest.84(4)，479-84，2004；Wada等.，Oncogen，23(13)，2401-7， 2004；Li等.，Biochem Biophys Res Commun，314(1).223-8，2004；Li等.， Cell，109(1)，113-24，2002；Li等.，Cell，109(1)，113-24，2002；Balmain， Nature，417(6886)，235-7，2002)。因此，本发明的包含烟酸或其衍生物作为 有效成分的药物组合物，可以再激活RUNX3基因，因此所述组合物可以 有效地用于预防和治疗许多由RUNX3的灭活所诱导的癌症，例如胃癌、 肺癌、肝细胞瘤、喉癌、结肠直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫 癌或乳腺癌。
烟酸或其衍生物可以用作本发明用于预防和治疗癌症的药剂的有效 成分，并且所述烟酸衍生物可以包括烟酰胺、烟酸、6-氨基烟酰胺、异烟 酰胺、异烟酰肼(isonicotinohydrazide)、N-甲基烟酰胺、尼可地尔 (nicorandil)，吡啶-2-羧酰胺(pyridine-2-carboxamide)、硫代烟酰胺 (thionicotin amide)或6-氯烟酰胺。
本发明的含有烟酸衍生物作为有效成分的药物组合物可以口服或肠 胃外给药，并且可以以药物制剂的一般形式应用。
本发明的药物组合物可以通过与通常所用的填充剂、补充剂、粘合剂、 湿润剂、崩解剂、稀释剂诸如表面活性剂或赋形剂混合而制备，用于口服 或肠胃外给药。用于口服给药的固体制剂为片剂、丸剂、扑粉、颗粒剂和 胶囊。这些固体制剂通过将一种或多种适当的赋形剂，诸如淀粉、碳酸钙、 蔗糖、乳糖、明胶等混合进行制备。除了所述简单的赋形剂之外，可以应 用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石等。用于口服给药的液体制剂为混悬液、 溶液、乳剂和糖浆，并且上文提到的制剂除了含有通常所用的简单的稀释 剂，诸如水和液体石蜡之外，可以包含各种赋形剂，诸如湿润剂、甜味剂、 芳香剂和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂为无菌水性溶液、水不溶性赋形 剂、混悬液、乳剂和栓剂。水不溶性赋形剂和混悬液除了含有一种或多种 活性化合物之外，可以含有丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射 的酯，如油酸乙酯(ethylolate)，等。除了一种或多种活性化合物之外，栓 剂可以包含witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂精脂，甘油胶冻 (glycerogelatin)等。
本发明的烟酸衍生物的有效剂量为1～50mg/kg，并且更加优选地 10～30mg/kg，并且给药频率为每天1～3次。
在小鼠中进行用烟酸衍生物进行的急性毒性测试。在用烟酸衍生物处 理的组中，直到2g/kg的剂量，没有观察到任何变化，并且，与仅施用水 的组相比较，也没有观察到任何显著的副作用。
本发明还提供对于癌症的预防和/或治疗方法，其包括将烟酸衍生物 施用给目标受试者的步骤。本发明还提供将烟酸衍生物用于制备预防和/ 或治疗癌症的药剂的应用。
【附图描述】
图1A是显示通过PCR证实RUNX3基因在正常组织中没有被甲基化 的电泳照片，，
M：甲基化的DNA U：未甲基化的DNA
图1B是显示通过PCR证实RUNX3基因在膀胱癌组织中被甲基化的 电泳照片，，
M：甲基化的DNA U：未甲基化的DNA
图2是显示通过烟酰胺处理将甲基化的RUNX3激活的电泳照片，
图3是显示通过组合组蛋白脱乙酰酶(Sirt2)将RUNX3蛋白的量减少 的照片，
图4是这样的照片，其显示，由组蛋白脱乙酰酶(Sirt2)引起的RUNX3 蛋白的减少与RUNX3乙酰化作用的抑制相关，并且相反地，细胞内 RUNX3蛋白的乙酰化和由此导致的RUNX3蛋白的增加是由施用烟酰胺 诱导的，
图5是由肉眼观察到的膀胱癌组织的照片，其显示在被提供以一种致 癌物质N-丁基-N-4-(羟丁基)-亚硝胺(BBN)溶液作为饮用水持续20周的 组，与被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的另一组之间肿 瘤发生的比较，
图6A是显示被提供以BBN溶液，一种致癌物质，作为饮用水持续 20周的小鼠的膀胱组织的显微照片，
图6B是显示被提供以BBN和烟酰胺溶液作为饮用水持续20周的小 鼠的膀胱组织的显微照片。
【最佳方式】
本发明实用的和目前优选的实施方案如在下述实施例中所显示的那 样进行举例说明。
然而，应该理解，考虑到本发明公开内容，本领域的那些技术人员可 以在本发明的精神和范围之内进行各种更改和改进。
<实施例1>RUNX3甲基化和肿瘤发生之间的相互关系
为了确定RUNX3基因在癌症患者组织中是否被甲基化，提取膀胱癌 患者的组织并且研究其中的甲基化。具体地，从正常膀胱组织和膀胱癌组 织中提取基因组DNA，然后将其纯化，接着用3M NaSO2(重亚硫酸钠， (sodium bisulfite))在50℃处理16小时。在上述处理过程中，DNA中的胞 嘧啶变成未被甲基化的尿嘧啶。
处理之后，再次纯化DNA。然后，应用基于RUNX3基因组DNA的 CpG岛的序列制备的两组引物进行PCR；由SEQ.ID.No 1和SEQ.ID.No 2组成的一组引物用于扩增甲基化的DNA，由SEQ.ID.No 3和SEQ.ID. No 4组成的另一组引物用于扩增未甲基化的DNA。PCR按下述进行；94℃ 变性14秒，60℃退火50秒，72℃聚合58秒，从变性到聚合进行40个循 环。
应用上述引物的PCR可以确定RUNX3基因是否被甲基化灭活。如 果DNA是用引物组SEQ.ID.No 1和SEQ.ID.No 2扩增的，那么意味着 RUNX3被甲基化灭活。同样地，如果DNA是用引物组SEQ.ID.No 3和 SEQ.ID.No 4扩增的，那么意味着RUNX3没有被甲基化。
如在图1中所示，在从20名正常个体中提取的正常膀胱组织中的 RUNX3基因的启动区，没有观察到甲基化作用。同时，在膀胱癌患者组 织中观察到74％的甲基化作用(119名个体中有88名)。关于膀胱癌复发 率，在他们的癌组织中使得RUNX3基因未被甲基化的患者显示出61.11 ％的复发率，而那些在他们的癌组织中使得RUNX3基因被甲基化的患者 显示出88％的复发率。即，在那些具有甲基化的RUNX3基因的患者中， 癌症复发的机会是很高的(表1)。
【表1】
RUNX3甲基化和癌症复发率之间的相互关系
未甲基化 甲基化 没有复发(％) 14(38.89) 6(12.00) 复发(％) 22(61.11) 44(88.00)
p＝0.0036，OR＝4.6667，95％CI＝1.5774-13.8064
如在表2中所示，在其中RUNX3被甲基化的癌组织中癌症的进展是 快速的。94.74％的患有晚期癌症的患者具有甲基化的RUNX3基因，这表 明RUNX3基因的甲基化在癌症的进展中起着重要作用。
【表2】
RUNX3甲基化和癌症进展之间的相互关系
未甲基化 甲基化 没有进展(％) 21(33.33) 42(66.67) 进展(％) 1(5.26) 18(94.74)
p＝0.0155，OR＝9.00，95％CI＝1.1236-72.0598
总之，与其中RUNX3基因的甲基化作用没有被诱导的癌症细胞相比 较，癌症细胞中RUNX3基因的甲基化作用将肿瘤发生增加109倍，并且 还将癌症复发率和癌症进展分别增加5倍和9倍。
<实施例2>烟酰胺对RUNX3的激活
基于从上述<实施例1>所获得的结果，本发明人寻找能够抑制肿瘤抑 制基因RUNX3的甲基化作用的物质，并且结果，本发明人确定了烟酰胺 及其衍生物能够抑制RUNX3基因的甲基化作用。
用烟酰胺处理癌症细胞系的培养物溶液，其中RUNX3基因被DNA 甲基化作用灭活。这种处理持续4天，并且将终浓度调整到1mg/ml。应 用由SEQ.ID.No 5代表的Ps-CA和由SEQ.ID.No 6代表的Ps-CB的引物 组进行逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCT)，以检测RUNX3基因的表达。 如在图2中所示，在胃癌细胞系SUN16和MKN74，肺癌细胞系NCl-H226， NCl-H460和Sq-1，和膀胱癌细胞系T24中，证实烟酰胺再激活由甲基化 作用灭活的RUNX基因。
<实施例3>通过脱乙酰基作用分解RUNX3蛋白
为了研究脱乙酰基作用和RUNX3蛋白分解之间的相互关系，将分别 表达Sirt2(III型组蛋白脱乙酰酶)和RUNX3的基因独立地或一起插入到 表达Sir2和RUNX3的细胞系中。进行免疫沉淀和蛋白质印迹，以研究所 述插入的作用(Janeway等.，Immunobiology.第5版.Garland Publishing， 2001)。
结果，Sirt2蛋白从用RUNX3进行的免疫沉淀(IP：RUNX3，IB：Sirt2) 中检测到，并且RUNX3蛋白从用Sirt2进行的免疫沉淀(IP：Sirt2，IB： RUNX3)中检测到(图3)，这表明RUNX3和Sirt2在物理上是相关的。 还证实RUNX3蛋白的量被Sirt2减少(图3，IB：RUNX3)。
<实施例4>通过烟酰胺增加RUNX3蛋白的量
诱导RUNX3、乙酰转移酶(p300)和脱乙酰酶(Sirt2)的细胞内表达， 并且将烟酰胺添加到细胞培养基中，以研究由烟酰胺引起的RUNX3蛋白 水平的变化。为了研究，进行免疫沉淀和蛋白质印迹。结果，由Sirt2表 达引起的RUNX3蛋白的减少(图4，泳道1和2)通过施用烟酰胺而被 恢复了(图4，泳道3，4和5)。
<实施例5>烟酰胺的体内抗癌效果
为了确定烟酰胺的抗癌效果，通过应用患有由致癌物诱导的癌症的小 鼠，进行肿瘤发生抑制测试。将小鼠分成2组：给一组提供0.05％(w/w)N- 丁基-N-4-(羟丁基)-亚硝胺(BBN)溶液，一种致癌物，作为饮用水持续20 周，给另一组提供0.05％BBN和1％(w/w)烟酰胺(10mg/ml)溶液作为 饮用水持续20周。并且在这2组之间进行比较。在这里，将6周龄的 C3H/HE雌性小鼠用作测试动物。给对照组小鼠提供水或1％(W/W)烟酰 胺溶液持续20周。在实验的最后一天，将小鼠处死，并且提取膀胱，以 研究RUNX3基因的甲基化作用和肿瘤的形成与大小。
通过肉眼和显微镜观察实验组中膀胱癌的发展，如在图5和图6A中 所示。确切地，BBN在RUNX3外显子1区域的CpG岛中诱导甲基化， 这导致对RUNX3活性的抑制。因此，在用BBN处理的组中，100％发展 了膀胱癌。特别地，由BBN诱导的癌症中的80％是浸润癌，它们中20 ％是浅表癌(表3)。
【表3】
0.05％BBN处理组的致癌模式
个体 肿瘤数目 肿瘤大小(mm) 恶性 1 1 4×3 浸润性 2 全部 6×5 浸润性 3 1 5×5 浸润性 4 1 1×3 浸润性 5 全部 5×5 浸润性 6 4 小 浅表性 7 1 5×3 浸润性 +浅表性 2 1×1 8 小 浅表性 9 全部 7×6 浸润性 10 1 3×2 浅表性 11 全部 6×5 浸润性 12 全部 9×8 浸润性 13 1 4×3 浸润性 14 1 3×2 浸润性 15 1 3×2 浸润性 16 全部 10×9 浸润性 17 全部 5×4 浸润性
18 全部 4×4 浸润性 19 1 2×2 浅表性 20 1 2×2 浸润性
在用BBN和烟酰胺一起处理的组中，在RUNX3外显子1区域CpG 岛中的甲基化作用显著地减少了。在所述组中，膀胱癌的发展率低至58％ (图5和图6B)，并且恶性也降低了(23％的癌症为浸润性的和77％为浅 表性的)(表4)。上述结果表明，烟酰胺抑制BBN对RUNX3的灭活，这 意味着烟酰胺可以抑制由BBN诱发的肿瘤发生。
【表4】
0.05％RRN和烟酰胺处理组的致癌模式
个体 肿瘤数目 肿瘤大小(mm) 恶性 1 1 3×3 浅表性 2 0 3 0 4 0 5 1 2×2 浅表性 6 0 7 1 5×5 浸润性 8 0 9 1 1×1 浅表性 10 0 11 小 1×1 浅表性 12 4 1×1 浅表性 13 0 14 1+小 7×5 浸润性/ 浅表性 15 1 3×1/1×1 浅表性 16 0
17 1 1×1 浅表性 18 2 1×1 浅表性 19 1 3×2 浅表性 20 0 21 0 22 0 23 0 24 1+小 3×3/1×1 浅表性 25 0 26 1 3×3 浅表性 27 2 2×2 浅表性 28 1 1×1 浅表性 29 3 2×1/1×1 浅表性 30 4/5 6×5 浸润性 31 3 4×2/1×1 浸润性/ 浅表性 32 1 3×3 浅表性 33 1 4×4 浸润性 34 0 35 1 2×1 浅表性 36 1 2×1 浅表性 37 0 38 0 39 0 40 0
<实施例6>通过烟酸及其衍生物抑制体内甲基化作用
本发明人研究烟酸及其衍生物对体内甲基化作用的抑制，并且结果如 下。
【表5】
烟酸衍生物对体内甲基化作用的抑制
组 个体数目 甲基化 未甲基化 BBN+烟酰胺 28 5(17.9％) 23(82.1％) BBN+烟酸 28 8(28.6％) 20(71.4％) BBN+氨基烟酰胺 27 7(25.9％) 20(74.1％) BBN+异烟酰胺 27 11(40.7％) 16(59.3％) BBN+异烟酰肼 29 15(51.7％) 14(48.3％) BBN+甲基烟酰胺 26 6(23％) 20(77％) BBN+尼可地尔 27 18(66.7％) 9(33.3％) BBN+吡啶-2-羧酰胺 28 10(35.7％) 18(64.3％) BBN+硫代烟酰胺 28 15(53.6％) 13(46.4％) BBN+吡啶羧酸 27 16(59.3％) 11(40.7％) BBN+氯烟酰胺 30 8(26.7％) 22(73.3％)
在用BBN处理的组中，RUNX3基因的甲基化作用被100％地诱导， 但是在用BBN和烟酸或其衍生物一起处理的组中，所述甲基化作用被抑 制，如在表4中所示。因此，认为烟酸或其衍生物具有抗癌活性。
<实施例7>通过口服施用在小鼠中的急性毒性测试
进行下述实验，以观察本发明的含有烟酸或其衍生物作为有效成分的 药物组合物在小鼠(C3H/HE6)中是否具有急性毒性。将本发明的药物组合 物口服施用给每组2只小鼠，作为饮用水，以每天2g/kg的剂量持续5个 月。观察小鼠的死亡、临床症状和体重变化，进行血液的血液学测试和生 化测试，并且在尸体解剖过程中，用眼睛检测胸腔和腹腔的胃肠器官中的 任何异常迹象。结果表明，本发明的药物组合物在鼠中没有引起任何特别 的临床症状、重量变化或死亡。在血液的血液学测试、生化测试和尸体解 剖中没有观察到任何变化。因此，由于在小鼠中所述药物组合物多达2 g/kg的水平没有引起任何毒性变化，并且其估计的LD50值在小鼠中远大 于5g/kg，评价本实验中所用的药物组合物为安全物质。
【工业适用性】
本发明涉及用于预防和治疗癌症的药剂，其含有烟酸或其衍生物作为 有效成分，更确切地，本发明涉及用于预防和治疗癌症的药剂，其含有能 够再激活被甲基化灭活的RUNX3基因的烟酸及其衍生物作为有效成分。 本发明的用于预防和治疗癌症的药剂可以有效地用于治疗和预防与 RUNX3基因的灭活相关的实体癌症，诸如胃癌、肺癌、肝细胞瘤、喉癌、 结肠直肠癌、膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫癌或乳腺癌。与被设计成 杀死表现出十分活跃的细胞分裂的细胞的常规抗癌剂不同，本发明的药剂 是基于激活癌细胞中的肿瘤抑制基因的原理开发的，这使得其成为一种具 有更少的副作用的新型抗癌剂的有希望的候选物。
【序列表文本】
SEQ.ID.No 1和SEQ.ID.No 2是用于扩增甲基化DNA的引物，
SEQ.ID.No 3和SEQ.ID.No 4是用于扩增未甲基化DNA的引物，
SEQ.ID.No 5是Ps-CA引物，
SEQ.ID.No 6是Ps-CB引物。
本领域的那些技术人员应该理解，可以容易地将在前述详述中公开的 构思和具体的实施方案用作修改或设计实行本发明相同的目的其它实施 方案的基础。本领域的那些技术人员还应该理解，这些等价的实施方案没 有背离如在后附的权利要求中提出的本发明的精神和范围。
序列表
<110>生物如恩克斯株氏会社
<120>含有烟酰胺或其衍生物作为有效成分用于预防和治疗癌症的治疗剂
<160>6
<170>Kopatent In 1.71
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于甲基化DNA扩增的引物
<400>1
ttacgagggg cggtcgtacg cggg 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于甲基化DNA扩增的引物
<400>2
aaaacgaccg acgcgaacgc ctcc 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于未甲基化DNA扩增的引物
<400>3
ttatgagggg tggttgtatg tggg 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于未甲基化DNA扩增的引物
<400>4
aaaacaacca acacaaacac ctcc 24
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Ps-CA
<400>5
gagtttcacc ctgaccatca ctgtg 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Ps-CB
<400>6
gcccatcact ggtcttgaag gttgt 25
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于预防和治疗由肿瘤抑制基因RUNX3的失活导致的癌症的药 剂，其包含具有下式的烟酸、其衍生物或其药用盐作为有效成分：
其中，R1是氧或硫，R2是H，OH，C1～C10烷基，NH2，NH-NH2， NH-C2H4-O-NO2-或OR3，R3是C1～C5烷基，X是H，NH2或卤素原子， 并且Y是H或CH3。
2.按照权利要求1的药剂，其中所述R2是C1～C5烷基。
3.按照权利要求1的药剂，其中所述卤素原子是F或Cl。
4.按照权利要求1的药剂，其中所述R2是CH3或C2H5。
5.按照权利要求1的药剂，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的 组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺(isonicotinamide)，异烟 酰肼(isonicotinohydrazide)，N-甲基烟酰胺，尼可地尔(nicorandil)，吡啶 -2-羧酰胺(pyridine-2-carboxamide)，硫代烟酰胺(thionicotin amide)和6- 氯烟酰胺。
6.按照权利要求1的药剂，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃 癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌， 子宫癌，食管癌和乳腺癌。
7.一种预防和/或治疗由肿瘤抑制基因RUNX3的失活导致的癌症的方法， 其包括给目标受试者施用烟酸、其衍生物或其药用盐。
8.按照权利要求7的方法，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的 组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺，异烟酰肼，N-甲基烟 酰胺，尼可地尔，吡啶-2-羧酰胺，硫代烟酰胺和6-氯烟酰胺。
9.按照权利要求7的方法，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃 癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌， 子宫癌，食管癌和乳腺癌。
10.烟酸、其衍生物或其药用盐用于制备预防和/或治疗由肿瘤抑制基因 RUNX3的失活导致的癌症的药剂的应用。
11.按照权利要求10的应用，其中所述烟酸衍生物选自由下列各项组成的 组：烟酰胺，烟酸，6-氨基烟酰胺，异烟酰胺，异烟酰肼，N-甲基烟 酰胺，尼可地尔，吡啶-2-羧酰胺，硫代烟酰胺和6-氯烟酰胺。
12.按照权利要求10的应用，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃 癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌， 子宫癌，食管癌和乳腺癌。
13.一种用于激活RUNX3或编码RUNX3的基因的方法，其包括给受试者 施用烟酸、其衍生物或其药用盐，所述患者患有由肿瘤抑制基因 RUNX3的失活导致的癌症。
14.按照权利要求13的方法，其中所述患有癌症的受试者具有脱乙酰基 (deacethylated)的RUNX3。
15.按照权利要求13的方法，其中肿瘤抑制基因RUNX3的失活由所述基 因RUNX3的甲基化作用导致。
16.按照权利要求13的方法，其中所述癌症选自由下列各项组成的组：胃 癌，肺癌，肝细胞瘤，喉癌，结肠直肠癌，膀胱癌，胰腺癌，胰腺癌， 子宫癌，食管癌和乳腺癌。