九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910117940.8

申请日:

20090222

公开号:

CN101601760B

公开日:

20130814

当前法律状态:

有效性:

有效

法律详情:

IPC分类号:

A61K36/75,A61P3/10,A61K127/00

主分类号:

A61K36/75,A61P3/10,A61K127/00

申请人:

长春瑞德医药科技有限公司

发明人:

金永日,睢大员,李绪文,于晓风,桂明玉,曲绍春

地址:

130012 吉林省长春市高新开发区硅谷大街4000号创业大厦322号

优先权:

200810091362.0

专利代理机构:

代理人:

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内容摘要

本发明公开了九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。从中药九里香叶中提取分离的九里香叶总黄酮,主要含有5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮。动物实验结果表明,九里香叶总黄酮能够明显降低T2DM大鼠的血糖,改善T2DM大鼠的脂代谢紊乱,升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量,提高胰岛β细胞分泌指数,降低胰岛素抵抗指数,改善IR,降低T2DM大鼠的血清MDA含量,升高SOD活性,降低T2DM大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。证明九里香叶总黄酮对糖尿病具有显著的治疗作用。

权利要求书

1.九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。 2.权利要求1所述的应用,其特征在于其中九里香叶总黄酮至少含有5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。 3.权利要求1所述的应用,其特征在于在九里香叶总黄酮中5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%。 4.权利要求1所述的应用,其特征在于在九里香叶总黄酮中5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮的含量之和大于50%。

说明书

本发明涉及对糖尿病具有治疗作用的中药有效部位,属于中医中药领域。

背景技术

目前糖尿病发病率和病死率逐渐上升,已成为继肿瘤、心脑血管疾病之后,危害人类健 康的第三大病种,我国糖尿病的发病率与国外发达国家相比虽然并不算高,但我国人口众多, 病人的绝对人数却居世界首位。因此,寻找安全有效的药物用于防治糖尿病成为医学研究的 重要课题之一。目前用于治疗2型糖尿病的口服降糖药包括:磺酰脲类、双胍类、胰岛素增 敏剂、促胰岛素分泌药、醛糖还原酶抑制剂等。而这些口服降糖药存在低血糖症、胃肠道反 应等副作用,同时随着治疗时间的延长,降糖效果呈降低趋势。

九里香[Murraya paniculata(L.)Jack]为芸香科九里香属植物,主要产自我国云南、贵 州、湖南、广东、广西、福建、台湾等地。到目前为止从九里香[Murraya paniculata(L.)Jack] 叶中共分得9个黄酮类化合物,分别是3,5,6,7,8,3′,4′,5′-八甲氧基黄酮 (3,5,6,7,8,3′,4′,5′-octamethoxyflavone)、3,5,6,7,3′,4′,5′--七甲氧基黄酮 (3,5,6,7,3′,4′,5′-heptamethoxyflavone)(江苏新医学院,中药大辞典,上册,上海人民 出版社,1977:44-45);5,7,8,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮 (5,7,8,3′,4′,5′-hexamethoxyflavone)、3,5,7,8,3′,4′,5′-七甲氧基黄酮 (3,5,7,8,3′,4′,5′-heptamethoxyflavone)(植物学报1984,26(2):184-186);5,7,3′, 4′,5′-五甲氧基黄酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)(化学学报1984,42,1308-1311) 以及5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′- 六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮以及3′-羟基-5,7,4′-三甲氧基黄酮(中 国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》,申请号200710147357.2)。

发明内容

本发明提供的是一种植物提取物的新的医药用途,即九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病 药物中的应用。所述九里香叶总黄酮其特征在于其中至少含有5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、 5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′- 六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。而且其中5,7,3′, 4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5, 6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮的含量之和大于50%或 者5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮的含量之和大于50%。本 发明所述的药物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等口服剂型,也可以是注射剂等非口 服剂型。另外本发明所述的九里香叶总黄酮可以与其他药物包括化学药、中药以及天然药物 组成复方药物用于糖尿病的治疗。

本发明是通过如下创新性研究完成的。(1)通过对九里香叶化学成分的提取分离,从九 里香叶中分得了6种黄酮类化合物,并通过NMR等波谱数据的分析鉴定了其结构,它们分别 是5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲 氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮以及3′- 羟基-5,7,4′-三甲氧基黄酮(2)通过提取纯化工艺的研究,完成了九里香叶总黄酮的制备 工艺,所得九里香叶总黄酮以5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄 酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7-羟基-5,3′, 4′-三甲氧基黄酮为主要成分(3)建立了5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′- 五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮、7- 羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮的HPLC含量测定方法,测定结果表明九里香叶总黄酮中上述 黄酮类化合物的含量之和在50%至100%之间(4)通过动物实验发现了九里香叶总黄酮对糖 尿病的治疗作用(5)对以九里香叶总黄酮为活性成分的药物制剂进行了研究,从而完成了本 发明。具体如下。

1、九里香叶化学成分的提取分离及结构鉴定(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备 方法及应用》,申请号200710147357.2)。

2、九里香叶总黄酮的制备工艺(中国专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及应用》, 申请号200710147357.2)。

3、九里香叶总黄酮中黄酮含量测定

(1)仪器、试剂、对照品

Agilent1100Series高效液相色谱仪

ZORBAX Extend-C184.6×250mm ODS,5μm色谱柱

VWD可变波长自外检测器

色谱甲醇、二次蒸馏水

(2)色谱条件

色谱柱用Zorbax Extend ODS柱,4.6×250mm,5μm;柱温为25℃;流动相为甲醇∶ 水=58∶42;流速为1.2mL/min;检测波长为337nm;进样量为20μl。

(3)对照品溶液的制备

分别取5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′, 4′-五甲氧基黄酮、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮和7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮 适量,精密称定,加甲醇溶解,制成每1毫升分别含0.4、0.3、0.03、0.03、0.04毫克的溶 液,摇匀,即得。

(4)供试品溶液的制备

取九里香叶总黄酮100mg,精密称定,加甲醇溶解,超声提取3次,每次加甲醇15ml, 超声时间均为20min,合并提取液,蒸干溶剂,加甲醇溶解并定容至100ml,滤过,取续滤液 作为供试品溶液。

(4)测定方法

分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各20μl,注入高效液相色谱仪,记录峰面积,利 用外标一点法进行含量计算。

具体实施方式

实施例1

取九里香叶2公斤,85%乙醇回流提取3次,乙醇量分别为10、8、6倍,回流时间分别 为60、45、30分钟,滤过,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,加水稀释,过AB-8大孔吸 附树脂吸附,50升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗,水洗至中性,85%乙醇洗脱至薄层层析检 测不到JA(5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮)为止,洗脱液减压回收乙醇,得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析,乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮部分,回收溶剂,得九里香叶总黄酮38克。经HPLC检测,其中5,7,3′,4′-四 甲氧基黄酮含量为39.8%,5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮含量33.2%为,5,6,7,3′,4′- 五甲氧基黄酮含量为3.2%、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮含量为2.8%,7-羟基-5,3′, 4′-三甲氧基黄酮含量为5.0%。

实施例2

取九里香叶2公斤,85%乙醇回流提取3次,乙醇量分别为10、8、6倍,回流时间分别 为60、45、30分钟,滤过,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,加水稀释,过D4020大孔吸 附树脂吸附,80升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗,水洗至中性,85%乙醇洗脱至薄层层析检 测不到JA(5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮)为止,乙醇洗脱液过D941脱色树脂脱色,减压回 收乙醇,得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析,乙酸乙酯和乙醇的混合 溶液作为流动相进行梯度洗脱,收集黄酮部分,回收溶剂,得九里香叶总黄酮31克。取此九 里香叶总黄酮再次进行硅胶柱层析,乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮部分,回收溶剂,得精制九里香叶总黄酮26克。经HPLC检测,其中5,7,3′,4′- 四甲氧基黄酮含量为50.6.0%,5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮含量41.2%为,5,6,7,3′, 4′-五甲氧基黄酮含量为1.2%、5,6,7,3′,4′,5′-六甲氧基黄酮含量为1.8%,7-羟基-5, 3′,4′-三甲氧基黄酮含量为2.0%。

实施例3

取九里香叶1公斤,85%乙醇回流提取3次,乙醇量分别为10、8、6倍,回流时间分别 为60、45、30分钟,滤过,合并提取液,减压浓缩至无乙醇味,加水稀释,过AB-8大孔吸 附树脂吸附,85%乙醇洗脱至薄层层析检测不到JA(5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮)为止, 洗脱液减压回收乙醇,得九里香叶提取物。取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析,乙酸乙酯 和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱,收集黄酮部分,回收溶剂,得九里香叶总黄酮 37克。经HPLC检测,其中5,7,3′,4′-四甲氧基黄酮含量为24.8%,5,7,3′,4′,5′- 五甲氧基黄酮含量21.2%为,5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮含量为2.0%、5,6,7,3′,4′, 5′-六甲氧基黄酮含量为1.6%,7-羟基-5,3′,4′-三甲氧基黄酮含量为3.0%。

实施例4

取九里香叶总黄酮10克,加淀粉适量,制粒,装入胶囊,制成1000粒,得九里香叶总 黄酮胶囊。

实施例5

取九里香叶总黄酮10克,加预胶化淀粉、羧甲基淀粉钠适量,制粒,压片,制成1000 粒,得九里香叶总黄酮片。

实施例6

取九里香叶总黄酮10克,加吐温80适量,加10升加热溶解,高温灭菌,分装成100瓶, 得九里香叶总黄酮口服液。

实施例7

取九里香叶总黄酮10克,加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水,搅拌溶解,过滤,灭 菌,罐装,每支2ml,得九里香叶总黄酮注射液。

实验实施例

第一部分九里香叶总黄酮对肾上腺素所致高血糖小鼠的影响

1实验材料

1.1实验动物

健康昆明种小鼠,雌雄各半,体重16~20g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供, 质量合格证号:SCXK-(吉)2003-0001。九里香叶总黄酮,自制,批号:070905(实施例 1所得样品,以下简称TFMP1),071018(实施例2所得样品,以下简称TFMP2),071028(实 施例3所得样品,以下简称TFMP3)。

1.2药品与试剂

盐酸肾上腺素注射液  上海禾丰制药有限公司    批号:070303

二甲双胍            天津太平洋制药有限公司  批号:070416

1.3主要仪器

血糖仪          优克糖

优克糖血糖试纸  惠基生物科技股份有限公司

2实验方法

昆明种小鼠90只,雌雄各半,按体重随机分为9组:

各组动物按上面方案灌胃给药(容量为20ml/kg),每日1次,共10日,实验动物于给药 第9日禁食不禁水12h,第10日以优克糖血糖仪测定空腹血糖值(mmol/L)为药前值,然后 给药。末次药后1小时,除对照组外其他各组动物分别皮下注射0.1%肾上腺素0.25mg/kg, 注射后于30、60、90min断尾取血,用血糖仪测定血糖值(mmol/L)。

3统计学分析

数据以均数±标准差表示,统计分析采用组间比较t检验。

4实验结果

结果表明,与空白对照组比较,模型组小鼠注射肾上腺素后30~90min血糖均明显升高, 有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,二甲双胍组和TFMP1、TFMP2大剂量组及TFMP3小、 大剂量组注射肾上腺素后60min、90min血糖值均明显下降(P<0.05或P<0.01),提示TFMP1、 TFMP2及TFMP3均可明显对抗肾上腺素所致小鼠高血糖,结果见Tab.1。

Tab.1.Effect of TFMP on blood glucose in hyperglycemia  mice induced by adrenaline

#P<0.05,##P<0.01vs Control;*P<0.05,**P<0.01vs Model

第二部分TFMP的糖耐量实验

1实验材料

1.1实验动物

健康昆明种小鼠,雌雄各半,体重16~20g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供, 质量合格证号:SCXK-(吉)2003-0001。

1.2药品与试剂

10%葡萄糖注射液  吉林科伦康乃尔制药有限公司  批号:S070224LI

格列本脲          天津太平洋制药有限公司      批号:070205

1.3主要仪器

血糖仪          优克糖

优克糖血糖试纸  惠基生物科技股份有限公司

2实验方法

昆明种小鼠90只,雌雄各半,按体重随机分为9组:

各组动物按以上方案灌胃给药,每日1次,连续10日,实验动物于给药第9日禁食不禁 水12h,第10日以血糖仪测定空腹血糖值(mmol/L)为药前值,然后给药。末次药后1小时, 除对照组外其他各组经腹腔注射葡萄糖2g/kg,测定0.5、1、2小时的血糖值,观察各组药 物作用。

3统计学分析

数据以均数±标准差表示,统计分析采用组间比较t检验。

4实验结果

结果表明,与空白对照组比较,模型组小鼠注射葡萄糖后30~120min血糖均明显升高, 有显著性差异(P<0.01)。与模型组比较,格列本脲组注射葡萄糖后60、120min血糖值明显 下降(P<0.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3小、大剂量组注射葡萄糖后60min、120min血糖值 均有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05)。提示TFMP1、TFMP2及TFMP3对葡萄糖所致小鼠 高血糖无显著性作用,结果见Tab.2。

Tab.2.Effect of TFMP on blood glncose in hyperglycemia mice  induced by glucose

#P<0.05,##P<0.01vs Control;*P<0.05,**P<0.01vs Model

第三部分TFMP对大鼠实验性2型糖尿病的影响

1实验材料

1.1实验动物

健康Wistar大鼠,雄性,体重230~290g,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供, 质量合格证号:SCXK-(吉)2003-0001。

1.2药品与试剂

1.3主要仪器

2.实验方法

2.1药物配制

脂肪乳配方:猪油25%,胆固醇1%,丙硫氧嘧啶1%,吐温-8025%,1,2-丙二醇20 %。

脂肪乳制备:取猪油25g放入200ml烧杯中,加热至100℃,加入25ml吐温-80,制成 油相。另一烧杯中加入30ml蒸馏水和20ml1,2-丙二醇加热,制成水相。然后将水相加入油 相,充分混匀,即制成脂肪乳剂。

链脲佐菌素(STZ),临用时以0.1mol/L,PH4.2柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制成1% 的STZ溶液。

将TFMP用0.5%CMC-Na配成0.7%、0.35%的溶液,二甲双胍在研钵内用0.5%CMC-Na配 成0.7%的溶液。

2.2动物造模

将250只Wistar大鼠随机分为正常组和模型组,正常组大鼠给予蒸馏水10ml/kg,模型 组大鼠在正常饮食基础上按10ml/kg灌胃(ig)给脂肪乳剂,10日后,正常组和模型组随机 取12只大鼠尾静脉取血检测血清TC、TG、FFA含量。然后,各组动物禁食不禁水12小时,正 常组舌下iv0.1mol/L,PH4.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,模型组舌下iv STZ30mg/kg,药后 4小时ig给模型组大鼠25%葡萄糖溶液避免低血糖反应,72h后从造模大鼠中选取空腹血糖 值>11.1mmol/L的大鼠为2型糖尿病模型大鼠。

2.3分组及给药方法

将2型糖尿病模型大鼠按血糖和体重随机分为11组,每组15只,即:TFMP1大、中、小 剂量组、TFMP2大、中、小剂量组、TFMP3大、中、小剂量组、二甲双胍组及模型对照组。 具体给药方案为:

各组动物按照上述方案ig给药,连续4周。2型糖尿病大鼠ig给脂肪乳10ml/kg,每 3日给药1次。每周断尾取血,用血糖仪测定空腹血糖值一次,以实测值或变化百分率进行 组间比较。各组存活动物于第四周最后1次给药前禁食不禁水12h,测定空腹血糖值,ig给 药,药后1h腹腔注射3%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉,腹主动脉采血,分离血清,进行各种生 化指标和放免指标的测定。采集各鼠同一部位肝脏,测定肝糖原含量。采集各鼠胰腺,10% 甲醛固定。

2.4观测指标及测定方法

2.4.1一般状态观察

监测实验过程中空白组及糖尿病各组大鼠的一般状态、体重、摄食及摄水等变化,并记 录各组大鼠每日的摄食摄水量。

2.4.2血糖和肝糖元的测定

测血糖前夜,各组大鼠禁食不禁水12h,次日断尾取血,用血糖仪和优克糖试纸测定空 腹血糖值,每周1次。给药第28日采集各鼠同一部位肝脏,按照肝糖元试剂盒说明书测定肝 糖原含量。

2.4.3糖尿病相关的氧化因子的测定

腹主动脉采血约6ml,注入干净的试管内,4℃,2000rpm离心10min,分离血清,按相 应的试剂盒说明书要求严格操作,一部分血清用于测定血清中TC、TG、HDL、LDL、SOD、MDA 含量;另外一部分血清用放射免疫分析方法测定IL-1β、IL-6、TNF-α、INS、C肽含量,以 Homa Model方法计算ISI和胰岛素抵抗指数(Homa-IR)。

2.4.4胰岛细胞形态学观察

采集各鼠胰腺,10%甲醛固定,作免疫组化,进行胰岛细胞的形态学观察。

3.统计学分析

数据以均数±标准差表示,计量资料进行组间t检验。

4.实验结果

4.1高脂饮食对正常大鼠血脂的影响

与正常组比较,模型组大鼠连续ig脂肪乳剂10日后出现血脂代谢紊乱:TC、TG、FFA含 量均显著增高(P<0.01),结果见Tab.3。

Tab.3.Effect of highly fatted food on serum lipid in normal rats

#P<0.05,##P<0.01vs control

4.2TFMP对T2DM大鼠FBG及肝糖原的影响

在模型组大鼠出现血脂代谢紊乱的基础上舌下iv30mg/kg STZ后,模型对照组大鼠第0、 1、2、3、4周血糖值与正常对照组相比均显著升高(P<0.01),第4周肝糖原含量与正常对 照组相比明显降低(P<0.05),表明大鼠T2DM模型建立成功。与模型对照组比较,TFMP1、 TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组及二甲双胍组于药后第3、4周FBG均明显降低(P<0.05 或P<0.01),第4周肝糖原含量明显升高(P<0.05或P<0.01),提示TFMP1、TFMP2及TFMP3 可显著改善T2DM大鼠的高血糖症状,提高肝糖原含量,见Tab.4及Tab.5。

Tab.4.Effect of TFMP on blood glucose in T2DM rats

#P<0.05,##P<0.01vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

Tab.5.Effect of TFMP on liver glycogen content in T2DM rats

#P<0.05vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

4.3TFMP对T2DM大鼠血脂及脂代谢的影响

与正常组比较,模型对照组TG、TC、LDL-C含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),HDL-C 含量明显下降(P<0.01);与模型对照组比较,TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组的TC、 TG及LDL-C含量均显著下降,而HDL-C含量明显上升(P<0.05或P<0.01);TFMP1、TFMP2 及TFMP335mg/kg组的TC含量显著下降,HDL-C含量明显上升(P<0.05),表明TFMP可改善T2DM 大鼠的血脂代谢紊乱。结果见Tab.6。

Tab.6.Effect of TFMP on serum lipid in T2DM rats

#P<0.05,##P<0.01vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

4.4TFMP对T2DM大鼠胰岛素分泌功能及胰岛素抵抗的影响

与正常组相比,模型对照组血清中胰岛素和C-肽含量及胰岛素分泌指数ISI显著下降 (P<0.01),Homa-IR明显升高(P<0.01);与模型对照组比较,二甲双胍组和TFMP1、TFMP2及 TFMP370mg/kg剂量组的胰岛素和C-肽含量及ISI显著升高(P<0.05或P<0.01),Homa-IR明 显降低(P<0.05或P<0.01),TFMP1、TFMP2及TFMP335mg/kg剂量组的C-肽含量及ISI显著 升高(P<0.05),Homa-IR明显降低(P<0.05),说明TFMP能改善T2DM胰岛β细胞功能, 促进胰岛素分泌,增强组织对胰岛素的敏感性,改善IR。结果见Tab.7。

Tab.7.Effect of TFMP on Ins,C-peptide,Homa-IR and ISI in T2DM rats

##P<0.01vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

4.5TFMP对T2DM大鼠血清SOD活性及MDA含量的影响

与正常组相比,模型对照组SOD活性明显降低(P<0.01),MDA含量明显增加(P<0.01); 与模型对照组比较,TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组及二甲双胍组的SOD活性明 显提高(P<0.05或P<0.01),TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组及二甲双胍组的MDA含 量明显降低(P<0.05),结果见Tab.8。

Tab.8Effect of TFMP on SOD acfivity and MDA content in T2DM rats

##P<0.01vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

4.6TFMP对T2DM大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影响

与正常组相比,模型对照组IL-1β、IL-6及TNF-α含量均明显升高(P<0.05或P<0.01); 与模型对照组比较,二甲双胍组及TFMP1、TFMP2及TFMP335、70mg/kg剂量组的IL-1β含量 均明显降低(P<0.05或P<0.01);TFMP1、TFMP2及TFMP370mg/kg剂量组的IL-6含量明显 下降(P<0.05);TFMP1、TFMP2及TFMP3三个剂量组的TNF-α含量有下降趋势,但无显著性 差异(P>0.05)。结果见Tab.9。

Tab.9.Effect of TFMP on IL-1β、IL-6and TNF-αin T2DM rats

#P<0.05,##P<0.01vs normal;*P<0.05,**P<0.01vs model

4.7胰岛细胞形态学观察

与正常对照组比较,模型组胰岛数目减少,胰岛结构失去完整性,胰岛细胞分散,分布 不均匀,胰岛内β细胞数明显减少;与模型对照组比较,二甲双胍组及TFMP1、TFMP2、TFMP3 组的胰岛数目增多,胰岛结构趋向完整,胰岛内β细胞数增多,对胰岛的损伤有较好的改善 作用。

结论

1)TFMP对小鼠肾上腺素所致高血糖有明显的对抗作用,于药后60min开始起效持续到 90min。

2)TFMP对小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的对抗作用,但无显著性差异。

3)TFMP可以明显降低T2DM大鼠的血糖,并于给药后第3周开始血糖值降低最为显著; 并且能升高T2DM大鼠肝糖元的含量。

4)TFMP可以改善T2DM大鼠的脂代谢紊乱。

5)TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量,提高胰岛β细胞分泌指数, 降低胰岛素抵抗指数,改善IR。

6)TFMP可以降低T2DM大鼠的血清MDA含量,升高SOD活性。

7)TFMP可以降低T2DM大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量,减轻炎性反应。证明九 里香叶总黄酮对糖尿病及其并发症具有显著的预防与治疗作用。

附图说明

图1胰岛β细胞形态学免疫组化分析。

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1、(10)授权公告号 CN 101601760 B (45)授权公告日 2013.08.14 CN 101601760 B *CN101601760B* (21)申请号 200910117940.8 (22)申请日 2009.02.22 200810091362.0 2008.04.08 CN A61K 36/75(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (73)专利权人 长春瑞德医药科技有限公司 地址 130012 吉林省长春市高新开发区硅谷 大街 4000 号创业大厦 322 号 (72)发明人 金永日 睢大员 李绪文 于晓风 桂明玉。

2、 曲绍春 樊秋菊 . 九里香叶总黄酮降血糖作用的研 究 .吉林大学硕士学位论文 .2008,1-36. 樊秋菊 . 九里香叶总黄酮降血糖作用的研 究 .吉林大学硕士学位论文 .2008,1-36. (54) 发明名称 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的 应用 (57) 摘要 本发明公开了九里香叶总黄酮在制备治疗糖 尿病药物中的应用。从中药九里香叶中提取分离 的九里香叶总黄酮, 主要含有 5, 7, 3, 4 - 四 甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5-六甲氧基黄酮、 7-羟基-5, 。

3、3, 4-三甲氧 基黄酮。 动物实验结果表明, 九里香叶总黄酮能够 明显降低T2DM大鼠的血糖, 改善T2DM大鼠的脂代 谢紊乱, 升高 T2DM 大鼠血清中 C- 肽水平和胰岛 素含量, 提高胰岛 细胞分泌指数, 降低胰岛素 抵抗指数, 改善 IR, 降低 T2DM 大鼠的血清 MDA 含 量, 升高 SOD 活性, 降低 T2DM 大鼠的血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 含量。证明九里香叶总黄酮对糖尿 病具有显著的治疗作用。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 翟羽 权利要求书 1 页 说明书 16 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知。

4、识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书16页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101601760 B CN 101601760 B *CN101601760B* 1/1 页 2 1. 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。 2. 权利要求 1 所述的应用, 其特征在于其中九里香叶总黄酮至少含有 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮中的两种或两种以 上。 3. 权利要求 1 。

5、所述的应用, 其特征在于在九里香叶总黄酮中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的含量之和大于 50。 4. 权利要求 1 所述的应用, 其特征在于在九里香叶总黄酮中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮和 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮的含量之和大于 50。 权 利 要 求 书 CN 101601760 B 2 1/16 页 3 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用 。

6、0001 本发明涉及对糖尿病具有治疗作用的中药有效部位, 属于中医中药领域。 背景技术 0002 目前糖尿病发病率和病死率逐渐上升, 已成为继肿瘤、 心脑血管疾病之后, 危害人 类健康的第三大病种, 我国糖尿病的发病率与国外发达国家相比虽然并不算高, 但我国人 口众多, 病人的绝对人数却居世界首位。 因此, 寻找安全有效的药物用于防治糖尿病成为医 学研究的重要课题之一。目前用于治疗 2 型糖尿病的口服降糖药包括 : 磺酰脲类、 双胍类、 胰岛素增敏剂、 促胰岛素分泌药、 醛糖还原酶抑制剂等。而这些口服降糖药存在低血糖症、 胃肠道反应等副作用, 同时随着治疗时间的延长, 降糖效果呈降低趋势。 0。

7、003 九里香 Murraya paniculata(L.)Jack 为芸香科九里香属植物, 主要产自 我国云南、 贵州、 湖南、 广东、 广西、 福建、 台湾等地。到目前为止从九里香 Murraya paniculata(L.)Jack 叶中共分得 9 个黄酮类化合物, 分别是 3, 5, 6, 7, 8, 3, 4, 5 - 八 甲氧基黄酮(3, 5, 6, 7, 8, 3, 4, 5-octamethoxyflavone)、 3, 5, 6, 7, 3, 4, 5-七 甲氧基黄酮 (3, 5, 6, 7, 3, 4, 5 -heptamethoxyflavone)( 江苏新医学院, 中药。

8、大辞典, 上册, 上海人民出版社, 1977 : 44-45) ; 5, 7, 8, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮 (5, 7, 8, 3, 4, 5 -hexamethoxyflavone)、 3, 5, 7, 8, 3, 4, 5 - 七甲氧基黄酮 (3, 5, 7, 8, 3, 4, 5-heptamethoxyflavone)(植物学报1984, 26(2) : 184-186) ; 5, 7, 3, 4, 5-五 甲氧基黄酮(5, 7, 3, 4, 5-pentamethoxyflavone)(化学学报1984, 42, 1308-1311)以 及 5, 7, 3, 4 - 四甲。

9、氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六 甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮以及 3 - 羟基 -5, 7, 4 - 三甲氧基黄酮 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制备方法及应用 , 申请号 200710147357.2)。 发明内容 0004 本发明提供的是一种植物提取物的新的医药用途, 即九里香叶总黄酮在制备治疗 糖尿病药物中的应用。所述九里香叶总黄酮其特征在于其中至少含有 5, 7, 3, 4 - 四甲 氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基。

10、黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。而且 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五 甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的含 量之和大于 50或者 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮和 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮的 含量之和大于50。 本发明所述的药物可以是片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 口服液等口服剂型, 也 可以是注。

11、射剂等非口服剂型。 另外本发明所述的九里香叶总黄酮可以与其他药物包括化学 药、 中药以及天然药物组成复方药物用于糖尿病的治疗。 0005 本发明是通过如下创新性研究完成的。(1) 通过对九里香叶化学成分的提取分 离, 从九里香叶中分得了 6 种黄酮类化合物, 并通过 NMR 等波谱数据的分析鉴定了其结构, 它们分别是 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 说 明 书 CN 101601760 B 3 2/16 页 4 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3,。

12、 4 - 三甲氧基 黄酮以及 3 - 羟基 -5, 7, 4 - 三甲氧基黄酮 (2) 通过提取纯化工艺的研究, 完成了九里 香叶总黄酮的制备工艺, 所得九里香叶总黄酮以 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基 黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮为主要成分 (3) 建立了 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3。

13、, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的 HPLC 含量测定方法, 测定结果 表明九里香叶总黄酮中上述黄酮类化合物的含量之和在50至100之间(4)通过动物实 验发现了九里香叶总黄酮对糖尿病的治疗作用 (5) 对以九里香叶总黄酮为活性成分的药 物制剂进行了研究, 从而完成了本发明。具体如下。 0006 1、 九里香叶化学成分的提取分离及结构鉴定 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制 备方法及应用 , 申请号 200710147357.2)。 0007 2、 九里香叶总黄酮的制备工艺 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制备方法及应 用 , 申请号 20071。

14、0147357.2)。 0008 3、 九里香叶总黄酮中黄酮含量测定 0009 (1) 仪器、 试剂、 对照品 0010 Agilent1100Series 高效液相色谱仪 0011 ZORBAX Extend-C184.6250mm ODS, 5m 色谱柱 0012 VWD 可变波长自外检测器 0013 色谱甲醇、 二次蒸馏水 0014 (2) 色谱条件 0015 色谱柱用Zorbax Extend ODS柱, 4.6250mm, 5m ; 柱温为25; 流动相为甲醇 水 58 42 ; 流速为 1.2mL/min ; 检测波长为 337nm ; 进样量为 20l。 0016 (3) 对照品。

15、溶液的制备 0017 分别取 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4-五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5-六甲氧基黄酮和7-羟基-5, 3, 4-三甲 氧基黄酮适量, 精密称定, 加甲醇溶解, 制成每1毫升分别含0.4、 0.3、 0.03、 0.03、 0.04毫克 的溶液, 摇匀, 即得。 0018 (4) 供试品溶液的制备 0019 取九里香叶总黄酮 100mg, 精密称定, 加甲醇溶解, 超声提取 3 次, 每次加甲醇 15ml, 超声时间均为 20min, 合并提取液, 蒸干溶剂, 加甲醇溶解。

16、并定容至 100ml, 滤过, 取续 滤液作为供试品溶液。 0020 (4) 测定方法 0021 分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各 20l, 注入高效液相色谱仪, 记录峰面 积, 利用外标一点法进行含量计算。 具体实施方式 0022 实施例 1 0023 取九里香叶 2 公斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间 说 明 书 CN 101601760 B 4 3/16 页 5 分别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 AB-8 大孔吸 附树脂吸附, 50 升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗, 水洗至中性。

17、, 85乙醇洗脱至薄层层析检 测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 洗脱液减压回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗 脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮38克。 经HPLC检测, 其中5, 7, 3, 4-四 甲氧基黄酮含量为 39.8, 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮含量 33.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 3.2、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 2.8, 7- 羟 基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮。

18、含量为 5.0。 0024 实施例 2 0025 取九里香叶 2 公斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间 分别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 D4020 大孔 吸附树脂吸附, 80 升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗, 水洗至中性, 85乙醇洗脱至薄层层析 检测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 乙醇洗脱液过 D941 脱色树脂脱色, 减压 回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混 合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮。

19、部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮 31 克。取此 九里香叶总黄酮再次进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗 脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得精制九里香叶总黄酮 26 克。经 HPLC 检测, 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮含量为 50.6.0, 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮含量 41.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 1.2、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 1.8, 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮含量为 2.0。 0026 实施例 3 0027 取九里香叶 1 公。

20、斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间分 别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 AB-8 大孔吸附 树脂吸附, 85乙醇洗脱至薄层层析检测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 洗 脱液减压回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和 乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮 37 克。经 HPLC 检测, 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮含量为 24.8, 5, 7, 3, 4, 。

21、5 - 五 甲氧基黄酮含量 21.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 2.0、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 1.6, 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮含量为 3.0。 0028 实施例 4 0029 取九里香叶总黄酮 10 克, 加淀粉适量, 制粒, 装入胶囊, 制成 1000 粒, 得九里香叶 总黄酮胶囊。 0030 实施例 5 0031 取九里香叶总黄酮 10 克, 加预胶化淀粉、 羧甲基淀粉钠适量, 制粒, 压片, 制成 1000 粒, 得九里香叶总黄酮片。 0032 实施例 6 0033 取九里香叶总黄酮10克, 加吐。

22、温80适量, 加10升加热溶解, 高温灭菌, 分装成100 瓶, 得九里香叶总黄酮口服液。 0034 实施例 7 说 明 书 CN 101601760 B 5 4/16 页 6 0035 取九里香叶总黄酮 10 克, 加入 1000ml 丙二醇和 1000ml 注射用水, 搅拌溶解, 过 滤, 灭菌, 罐装, 每支 2ml, 得九里香叶总黄酮注射液。 0036 实验实施例 0037 第一部分九里香叶总黄酮对肾上腺素所致高血糖小鼠的影响 0038 1 实验材料 0039 1.1 实验动物 0040 健康昆明种小鼠, 雌雄各半, 体重 16 20g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心 提供, 质量。

23、合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。九里香叶总黄酮, 自制, 批号 : 070905( 实施例 1 所得样品, 以下简称 TFMP1), 071018( 实施例 2 所得样品, 以下简称 TFMP2), 071028( 实施 例 3 所得样品, 以下简称 TFMP3)。 0041 1.2 药品与试剂 0042 盐酸肾上腺素注射液 上海禾丰制药有限公司 批号 : 070303 0043 二甲双胍 天津太平洋制药有限公司 批号 : 070416 0044 1.3 主要仪器 0045 血糖仪 优克糖 0046 优克糖血糖试纸 惠基生物科技股份有限公司 0047 2 实验方法 004。

24、8 昆明种小鼠 90 只, 雌雄各半, 按体重随机分为 9 组 : 0049 0050 各组动物按上面方案灌胃给药 ( 容量为 20ml/kg), 每日 1 次, 共 10 日, 实验动物 于给药第 9 日禁食不禁水 12h, 第 10 日以优克糖血糖仪测定空腹血糖值 (mmol/L) 为药前 值, 然后给药。末次药后 1 小时, 除对照组外其他各组动物分别皮下注射 0.1肾上腺素 0.25mg/kg, 注射后于 30、 60、 90min 断尾取血, 用血糖仪测定血糖值 (mmol/L)。 0051 3 统计学分析 0052 数据以均数 标准差表示, 统计分析采用组间比较 t 检验。 005。

25、3 4 实验结果 0054 结果表明, 与空白对照组比较, 模型组小鼠注射肾上腺素后 30 90min 血糖均 明显升高, 有显著性差异 (P 0.01)。与模型组比较, 二甲双胍组和 TFMP1、 TFMP2 大剂量 说 明 书 CN 101601760 B 6 5/16 页 7 组及 TFMP3 小、 大剂量组注射肾上腺素后 60min、 90min 血糖值均明显下降 (P 0.05 或 P 0.01), 提示 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 均可明显对抗肾上腺素所致小鼠高血糖, 结果见 Tab.1。 0055 Tab.1.Effect of TFMP on blood gluc。

26、ose in hyperglycemia mice induced by adrenaline 0056 0057 #P 0.05,#P 0.01vs Control ; *P 0.05, *P 0.01vs Model 0058 第二部分 TFMP 的糖耐量实验 0059 1 实验材料 0060 1.1 实验动物 0061 健康昆明种小鼠, 雌雄各半, 体重 16 20g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心 提供, 质量合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。 0062 1.2 药品与试剂 0063 10葡萄糖注射液 吉林科伦康乃尔制药有限公司 批号 : S070224LI 0。

27、064 格列本脲 天津太平洋制药有限公司 批号 : 070205 0065 1.3 主要仪器 0066 血糖仪 优克糖 0067 优克糖血糖试纸 惠基生物科技股份有限公司 0068 2 实验方法 0069 昆明种小鼠 90 只, 雌雄各半, 按体重随机分为 9 组 : 0070 说 明 书 CN 101601760 B 7 6/16 页 8 0071 0072 各组动物按以上方案灌胃给药, 每日 1 次, 连续 10 日, 实验动物于给药第 9 日禁食 不禁水 12h, 第 10 日以血糖仪测定空腹血糖值 (mmol/L) 为药前值, 然后给药。末次药后 1 小时, 除对照组外其他各组经腹腔注。

28、射葡萄糖 2g/kg, 测定 0.5、 1、 2 小时的血糖值, 观察各 组药物作用。 0073 3 统计学分析 0074 数据以均数 标准差表示, 统计分析采用组间比较 t 检验。 0075 4 实验结果 0076 结果表明, 与空白对照组比较, 模型组小鼠注射葡萄糖后30120min血糖均明显 升高, 有显著性差异(P0.01)。 与模型组比较, 格列本脲组注射葡萄糖后60、 120min血糖 值明显下降 (P 0.05) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 小、 大剂量组注射葡萄糖后 60min、 120min 血糖值均有下降趋势, 但无统计学意义 (P 0.05)。提示 TF。

29、MP1、 TFMP2 及 TFMP3 对葡萄糖 所致小鼠高血糖无显著性作用, 结果见 Tab.2。 0077 Tab.2.Effect of TFMP on blood glncose in hyperglycemia mice induced by glucose 0078 说 明 书 CN 101601760 B 8 7/16 页 9 0079 #P 0.05,#P 0.01vs Control ; *P 0.05, *P 0.01vs Model 0080 第三部分 TFMP 对大鼠实验性 2 型糖尿病的影响 0081 1 实验材料 0082 1.1 实验动物 0083 健康Wistar。

30、大鼠, 雄性, 体重230290g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心提 供, 质量合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。 0084 1.2 药品与试剂 0085 说 明 书 CN 101601760 B 9 8/16 页 10 0086 1.3 主要仪器 0087 0088 0089 2. 实验方法 0090 2.1 药物配制 说 明 书 CN 101601760 B 10 9/16 页 11 0091 脂肪乳配方 : 猪油 25, 胆固醇 1, 丙硫氧嘧啶 1, 吐温 -8025, 1, 2- 丙二醇 20。 0092 脂肪乳制备 : 取猪油 25g 放入 200ml 烧杯。

31、中, 加热至 100, 加入 25ml 吐温 -80, 制 成油相。另一烧杯中加入 30ml 蒸馏水和 20ml1, 2- 丙二醇加热, 制成水相。然后将水相加 入油相, 充分混匀, 即制成脂肪乳剂。 0093 链脲佐菌素 (STZ), 临用时以 0.1mol/L, PH4.2 柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液新鲜配制 成 1的 STZ 溶液。 0094 将 TFMP 用 0.5 CMC-Na 配成 0.7、 0.35的溶液, 二甲双胍在研钵内用 0.5 CMC-Na 配成 0.7的溶液。 0095 2.2 动物造模 0096 将250只Wistar大鼠随机分为正常组和模型组, 正常组大鼠给予蒸馏水。

32、10ml/kg, 模型组大鼠在正常饮食基础上按 10ml/kg 灌胃 (ig) 给脂肪乳剂, 10 日后, 正常组和模型组 随机取 12 只大鼠尾静脉取血检测血清 TC、 TG、 FFA 含量。然后, 各组动物禁食不禁水 12 小 时, 正常组舌下 iv0.1mol/L, PH4.2 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液, 模型组舌下 iv STZ30mg/ kg, 药后 4 小时 ig 给模型组大鼠 25葡萄糖溶液避免低血糖反应, 72h 后从造模大鼠中选 取空腹血糖值 11.1mmol/L 的大鼠为 2 型糖尿病模型大鼠。 0097 2.3 分组及给药方法 0098 将2型糖尿病模型大鼠按血糖和体。

33、重随机分为11组, 每组15只, 即 : TFMP1大、 中、 小剂量组、 TFMP2 大、 中、 小剂量组、 TFMP3 大、 中、 小剂量组、 二甲双胍组及模型对照组。具体 给药方案为 : 0099 0100 0101 各组动物按照上述方案ig给药, 连续4周。 2型糖尿病大鼠ig给脂肪乳10ml/kg, 每 3 日给药 1 次。每周断尾取血, 用血糖仪测定空腹血糖值一次, 以实测值或变化百分率进 说 明 书 CN 101601760 B 11 10/16 页 12 行组间比较。各组存活动物于第四周最后 1 次给药前禁食不禁水 12h, 测定空腹血糖值, ig 给药, 药后1h腹腔注射3戊。

34、巴比妥钠30mg/kg麻醉, 腹主动脉采血, 分离血清, 进行各种生 化指标和放免指标的测定。采集各鼠同一部位肝脏, 测定肝糖原含量。采集各鼠胰腺, 10 甲醛固定。 0102 2.4 观测指标及测定方法 0103 2.4.1 一般状态观察 0104 监测实验过程中空白组及糖尿病各组大鼠的一般状态、 体重、 摄食及摄水等变化, 并记录各组大鼠每日的摄食摄水量。 0105 2.4.2 血糖和肝糖元的测定 0106 测血糖前夜, 各组大鼠禁食不禁水 12h, 次日断尾取血, 用血糖仪和优克糖试纸测 定空腹血糖值, 每周 1 次。给药第 28 日采集各鼠同一部位肝脏, 按照肝糖元试剂盒说明书 测定肝。

35、糖原含量。 0107 2.4.3 糖尿病相关的氧化因子的测定 0108 腹主动脉采血约 6ml, 注入干净的试管内, 4, 2000rpm 离心 10min, 分离血清, 按 相应的试剂盒说明书要求严格操作, 一部分血清用于测定血清中 TC、 TG、 HDL、 LDL、 SOD、 MDA 含量 ; 另外一部分血清用放射免疫分析方法测定 IL-1、 IL-6、 TNF-、 INS、 C 肽含量, 以 Homa Model 方法计算 ISI 和胰岛素抵抗指数 (Homa-IR)。 0109 2.4.4 胰岛细胞形态学观察 0110 采集各鼠胰腺, 10甲醛固定, 作免疫组化, 进行胰岛细胞的形态学。

36、观察。 0111 3. 统计学分析 0112 数据以均数 标准差表示, 计量资料进行组间 t 检验。 0113 4. 实验结果 0114 4.1 高脂饮食对正常大鼠血脂的影响 0115 与正常组比较, 模型组大鼠连续 ig 脂肪乳剂 10 日后出现血脂代谢紊乱 : TC、 TG、 FFA 含量均显著增高 (P 0.01), 结果见 Tab.3。 0116 Tab.3.Effect of highly fatted food on serum lipid in normal rats 0117 0118 #P 0.05,#P 0.01vs control 0119 4.2TFMP 对 T2DM 。

37、大鼠 FBG 及肝糖原的影响 0120 在模型组大鼠出现血脂代谢紊乱的基础上舌下 iv30mg/kg STZ 后, 模型对照组大 鼠第 0、 1、 2、 3、 4 周血糖值与正常对照组相比均显著升高 (P 0.01), 第 4 周肝糖原含量与 正常对照组相比明显降低 (P 0.05), 表明大鼠 T2DM 模型建立成功。与模型对照组比较, 说 明 书 CN 101601760 B 12 11/16 页 13 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组及二甲双胍组于药后第 3、 4 周 FBG 均明显降低 (P 0.05 或 P 0.01), 第 4 周肝糖原含量明显。

38、升高 (P 0.05 或 P 0.01), 提示 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 可显著改善 T2DM 大鼠的高血糖症状, 提高肝糖原含量, 见 Tab.4 及 Tab.5。 0121 Tab.4.Effect of TFMP on blood glucose in T2DM rats 0122 0123 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0124 Tab.5.Effect of TFMP on liver glycogen content in T2DM rats 0125 说 明 书 CN 101601760 。

39、B 13 12/16 页 14 0126 #P 0.05vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0127 4.3TFMP 对 T2DM 大鼠血脂及脂代谢的影响 0128 与正常组比较, 模型对照组TG、 TC、 LDL-C含量均显著升高(P0.05或P0.01), HDL-C 含量明显下降 (P 0.01) ; 与模型对照组比较, TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量 组的 TC、 TG 及 LDL-C 含量均显著下降, 而 HDL-C 含量明显上升 (P 0.05 或 P 0.01) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335m。

40、g/kg 组的 TC 含量显著下降, HDL-C 含量明显上升 (P 0.05), 表 明 TFMP 可改善 T2DM 大鼠的血脂代谢紊乱。结果见 Tab.6。 0129 Tab.6.Effect of TFMP on serum lipid in T2DM rats 0130 说 明 书 CN 101601760 B 14 13/16 页 15 0131 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0132 4.4TFMP 对 T2DM 大鼠胰岛素分泌功能及胰岛素抵抗的影响 0133 与正常组相比, 模型对照组血清中胰岛素和 C- 。

41、肽含量及胰岛素分泌指数 ISI 显 著下降 (P 0.01), Homa-IR 明显升高 (P 0.01) ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组和 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组的胰岛素和 C- 肽含量及 ISI 显著升高 (P 0.05 或 P 0.01), Homa-IR 明显降低 (P 0.05 或 P 0.01), TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335mg/kg 剂 量组的 C- 肽含量及 ISI 显著升高 (P 0.05), Homa-IR 明显降低 (P 0.05), 说明 TFMP 能 改善 T2DM 胰岛 细胞功能, 促进胰岛素分泌, 增强。

42、组织对胰岛素的敏感性, 改善 IR。结果 见 Tab.7。 0134 Tab.7.Effect of TFMP on Ins, C-peptide, Homa-IR and ISI in T2DM rats 0135 说 明 书 CN 101601760 B 15 14/16 页 16 0136 #P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0137 4.5TFMP 对 T2DM 大鼠血清 SOD 活性及 MDA 含量的影响 0138 与正常组相比, 模型对照组 SOD 活性明显降低 (P 0.01), MDA 含量明显增加 (P 0.01) ; 与模。

43、型对照组比较, TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组及二甲双胍组的 SOD 活性明显提高 (P 0.05 或 P 0.01), TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组及二甲 双胍组的 MDA 含量明显降低 (P 0.05), 结果见 Tab.8。 0139 Tab.8Effect of TFMP on SOD acfivity and MDA content in T2DM rats 0140 说 明 书 CN 101601760 B 16 15/16 页 17 0141 0142 #P 0.01vs normal ; *P 0.05,。

44、 *P 0.01vs model 0143 4.6TFMP 对 T2DM 大鼠血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 的影响 0144 与正常组相比, 模型对照组 IL-1、 IL-6 及 TNF- 含量均明显升高 (P 0.05 或 P 0.01) ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组及 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组的 IL-1 含量均明显降低 (P 0.05 或 P 0.01) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组的 IL-6 含量明显下降 (P 0.05) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 三个剂量组的 T。

45、NF- 含量有下降 趋势, 但无显著性差异 (P 0.05)。结果见 Tab.9。 0145 Tab.9.Effect of TFMP on IL-1、 IL-6and TNF-in T2DM rats 0146 0147 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0148 4.7 胰岛细胞形态学观察 说 明 书 CN 101601760 B 17 16/16 页 18 0149 与正常对照组比较, 模型组胰岛数目减少, 胰岛结构失去完整性, 胰岛细胞分散, 分布不均匀, 胰岛内 细胞数明显减少 ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组及。

46、 TFMP1、 TFMP2、 TFMP3 组的胰岛数目增多, 胰岛结构趋向完整, 胰岛内 细胞数增多, 对胰岛的损伤有较好 的改善作用。 0150 结论 0151 1)TFMP 对小鼠肾上腺素所致高血糖有明显的对抗作用, 于药后 60min 开始起效持 续到 90min。 0152 2)TFMP 对小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的对抗作用, 但无显著性差异。 0153 3)TFMP可以明显降低T2DM大鼠的血糖, 并于给药后第3周开始血糖值降低最为显 著 ; 并且能升高 T2DM 大鼠肝糖元的含量。 0154 4)TFMP 可以改善 T2DM 大鼠的脂代谢紊乱。 0155 5)TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量, 提高胰岛细胞分泌 指数, 降低胰岛素抵抗指数, 改善 IR。 0156 6)TFMP 可以降低 T2DM 大鼠的血清 MDA 含量, 升高 SOD 活性。 0157 7)TFMP 可以降低 T2DM 大鼠的血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 含量, 减轻炎性反应。证 明九里香叶总黄酮对糖尿病及其并发症具有显著的预防与治疗作用。 附图说明 0158 图 1 胰岛 细胞形态学免疫组化分析。 说 明 书 CN 101601760 B 18 1/1 页 19 图 1 说 明 书 附 图 CN 101601760 B 19 。

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