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1、(10)授权公告号 CN 101601760 B (45)授权公告日 2013.08.14 CN 101601760 B *CN101601760B* (21)申请号 200910117940.8 (22)申请日 2009.02.22 200810091362.0 2008.04.08 CN A61K 36/75(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61K 127/00(2006.01) (73)专利权人 长春瑞德医药科技有限公司 地址 130012 吉林省长春市高新开发区硅谷 大街 4000 号创业大厦 322 号 (72)发明人 金永日 睢大员 李绪文 于晓风 桂明玉。
2、 曲绍春 樊秋菊 . 九里香叶总黄酮降血糖作用的研 究 .吉林大学硕士学位论文 .2008,1-36. 樊秋菊 . 九里香叶总黄酮降血糖作用的研 究 .吉林大学硕士学位论文 .2008,1-36. (54) 发明名称 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的 应用 (57) 摘要 本发明公开了九里香叶总黄酮在制备治疗糖 尿病药物中的应用。从中药九里香叶中提取分离 的九里香叶总黄酮, 主要含有 5, 7, 3, 4 - 四 甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5-六甲氧基黄酮、 7-羟基-5, 。
3、3, 4-三甲氧 基黄酮。 动物实验结果表明, 九里香叶总黄酮能够 明显降低T2DM大鼠的血糖, 改善T2DM大鼠的脂代 谢紊乱, 升高 T2DM 大鼠血清中 C- 肽水平和胰岛 素含量, 提高胰岛 细胞分泌指数, 降低胰岛素 抵抗指数, 改善 IR, 降低 T2DM 大鼠的血清 MDA 含 量, 升高 SOD 活性, 降低 T2DM 大鼠的血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 含量。证明九里香叶总黄酮对糖尿 病具有显著的治疗作用。 (66)本国优先权数据 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 翟羽 权利要求书 1 页 说明书 16 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知。
4、识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书16页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101601760 B CN 101601760 B *CN101601760B* 1/1 页 2 1. 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用。 2. 权利要求 1 所述的应用, 其特征在于其中九里香叶总黄酮至少含有 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮中的两种或两种以 上。 3. 权利要求 1 。
5、所述的应用, 其特征在于在九里香叶总黄酮中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的含量之和大于 50。 4. 权利要求 1 所述的应用, 其特征在于在九里香叶总黄酮中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮和 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮的含量之和大于 50。 权 利 要 求 书 CN 101601760 B 2 1/16 页 3 九里香叶总黄酮在制备治疗糖尿病药物中的应用 。
6、0001 本发明涉及对糖尿病具有治疗作用的中药有效部位, 属于中医中药领域。 背景技术 0002 目前糖尿病发病率和病死率逐渐上升, 已成为继肿瘤、 心脑血管疾病之后, 危害人 类健康的第三大病种, 我国糖尿病的发病率与国外发达国家相比虽然并不算高, 但我国人 口众多, 病人的绝对人数却居世界首位。 因此, 寻找安全有效的药物用于防治糖尿病成为医 学研究的重要课题之一。目前用于治疗 2 型糖尿病的口服降糖药包括 : 磺酰脲类、 双胍类、 胰岛素增敏剂、 促胰岛素分泌药、 醛糖还原酶抑制剂等。而这些口服降糖药存在低血糖症、 胃肠道反应等副作用, 同时随着治疗时间的延长, 降糖效果呈降低趋势。 0。
7、003 九里香 Murraya paniculata(L.)Jack 为芸香科九里香属植物, 主要产自 我国云南、 贵州、 湖南、 广东、 广西、 福建、 台湾等地。到目前为止从九里香 Murraya paniculata(L.)Jack 叶中共分得 9 个黄酮类化合物, 分别是 3, 5, 6, 7, 8, 3, 4, 5 - 八 甲氧基黄酮(3, 5, 6, 7, 8, 3, 4, 5-octamethoxyflavone)、 3, 5, 6, 7, 3, 4, 5-七 甲氧基黄酮 (3, 5, 6, 7, 3, 4, 5 -heptamethoxyflavone)( 江苏新医学院, 中药。
8、大辞典, 上册, 上海人民出版社, 1977 : 44-45) ; 5, 7, 8, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮 (5, 7, 8, 3, 4, 5 -hexamethoxyflavone)、 3, 5, 7, 8, 3, 4, 5 - 七甲氧基黄酮 (3, 5, 7, 8, 3, 4, 5-heptamethoxyflavone)(植物学报1984, 26(2) : 184-186) ; 5, 7, 3, 4, 5-五 甲氧基黄酮(5, 7, 3, 4, 5-pentamethoxyflavone)(化学学报1984, 42, 1308-1311)以 及 5, 7, 3, 4 - 四甲。
9、氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六 甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮以及 3 - 羟基 -5, 7, 4 - 三甲氧基黄酮 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制备方法及应用 , 申请号 200710147357.2)。 发明内容 0004 本发明提供的是一种植物提取物的新的医药用途, 即九里香叶总黄酮在制备治疗 糖尿病药物中的应用。所述九里香叶总黄酮其特征在于其中至少含有 5, 7, 3, 4 - 四甲 氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基。
10、黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮中的两种或两种以上。而且 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五 甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的含 量之和大于 50或者 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮和 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮的 含量之和大于50。 本发明所述的药物可以是片剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 口服液等口服剂型, 也 可以是注。
11、射剂等非口服剂型。 另外本发明所述的九里香叶总黄酮可以与其他药物包括化学 药、 中药以及天然药物组成复方药物用于糖尿病的治疗。 0005 本发明是通过如下创新性研究完成的。(1) 通过对九里香叶化学成分的提取分 离, 从九里香叶中分得了 6 种黄酮类化合物, 并通过 NMR 等波谱数据的分析鉴定了其结构, 它们分别是 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 说 明 书 CN 101601760 B 3 2/16 页 4 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3,。
12、 4 - 三甲氧基 黄酮以及 3 - 羟基 -5, 7, 4 - 三甲氧基黄酮 (2) 通过提取纯化工艺的研究, 完成了九里 香叶总黄酮的制备工艺, 所得九里香叶总黄酮以 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基 黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮为主要成分 (3) 建立了 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基 黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3。
13、, 4, 5 - 六甲氧基黄酮、 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮的 HPLC 含量测定方法, 测定结果 表明九里香叶总黄酮中上述黄酮类化合物的含量之和在50至100之间(4)通过动物实 验发现了九里香叶总黄酮对糖尿病的治疗作用 (5) 对以九里香叶总黄酮为活性成分的药 物制剂进行了研究, 从而完成了本发明。具体如下。 0006 1、 九里香叶化学成分的提取分离及结构鉴定 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制 备方法及应用 , 申请号 200710147357.2)。 0007 2、 九里香叶总黄酮的制备工艺 ( 中国专利 千里香叶总黄酮及其制备方法及应 用 , 申请号 20071。
14、0147357.2)。 0008 3、 九里香叶总黄酮中黄酮含量测定 0009 (1) 仪器、 试剂、 对照品 0010 Agilent1100Series 高效液相色谱仪 0011 ZORBAX Extend-C184.6250mm ODS, 5m 色谱柱 0012 VWD 可变波长自外检测器 0013 色谱甲醇、 二次蒸馏水 0014 (2) 色谱条件 0015 色谱柱用Zorbax Extend ODS柱, 4.6250mm, 5m ; 柱温为25; 流动相为甲醇 水 58 42 ; 流速为 1.2mL/min ; 检测波长为 337nm ; 进样量为 20l。 0016 (3) 对照品。
15、溶液的制备 0017 分别取 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮、 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4-五甲氧基黄酮、 5, 6, 7, 3, 4, 5-六甲氧基黄酮和7-羟基-5, 3, 4-三甲 氧基黄酮适量, 精密称定, 加甲醇溶解, 制成每1毫升分别含0.4、 0.3、 0.03、 0.03、 0.04毫克 的溶液, 摇匀, 即得。 0018 (4) 供试品溶液的制备 0019 取九里香叶总黄酮 100mg, 精密称定, 加甲醇溶解, 超声提取 3 次, 每次加甲醇 15ml, 超声时间均为 20min, 合并提取液, 蒸干溶剂, 加甲醇溶解。
16、并定容至 100ml, 滤过, 取续 滤液作为供试品溶液。 0020 (4) 测定方法 0021 分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各 20l, 注入高效液相色谱仪, 记录峰面 积, 利用外标一点法进行含量计算。 具体实施方式 0022 实施例 1 0023 取九里香叶 2 公斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间 说 明 书 CN 101601760 B 4 3/16 页 5 分别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 AB-8 大孔吸 附树脂吸附, 50 升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗, 水洗至中性。
17、, 85乙醇洗脱至薄层层析检 测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 洗脱液减压回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗 脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮38克。 经HPLC检测, 其中5, 7, 3, 4-四 甲氧基黄酮含量为 39.8, 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮含量 33.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 3.2、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 2.8, 7- 羟 基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮。
18、含量为 5.0。 0024 实施例 2 0025 取九里香叶 2 公斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间 分别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 D4020 大孔 吸附树脂吸附, 80 升千分之一氢氧化钠水溶液冲洗, 水洗至中性, 85乙醇洗脱至薄层层析 检测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 乙醇洗脱液过 D941 脱色树脂脱色, 减压 回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混 合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮。
19、部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮 31 克。取此 九里香叶总黄酮再次进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗 脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得精制九里香叶总黄酮 26 克。经 HPLC 检测, 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮含量为 50.6.0, 5, 7, 3, 4, 5 - 五甲氧基黄酮含量 41.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 1.2、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 1.8, 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮含量为 2.0。 0026 实施例 3 0027 取九里香叶 1 公。
20、斤, 85乙醇回流提取 3 次, 乙醇量分别为 10、 8、 6 倍, 回流时间分 别为 60、 45、 30 分钟, 滤过, 合并提取液, 减压浓缩至无乙醇味, 加水稀释, 过 AB-8 大孔吸附 树脂吸附, 85乙醇洗脱至薄层层析检测不到 JA(5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮 ) 为止, 洗 脱液减压回收乙醇, 得九里香叶提取物。 取此九里香叶提取物进行硅胶柱层析, 乙酸乙酯和 乙醇的混合溶液作为流动相进行梯度洗脱, 收集黄酮部分, 回收溶剂, 得九里香叶总黄酮 37 克。经 HPLC 检测, 其中 5, 7, 3, 4 - 四甲氧基黄酮含量为 24.8, 5, 7, 3, 4, 。
21、5 - 五 甲氧基黄酮含量 21.2为, 5, 6, 7, 3, 4 - 五甲氧基黄酮含量为 2.0、 5, 6, 7, 3, 4, 5 - 六甲氧基黄酮含量为 1.6, 7- 羟基 -5, 3, 4 - 三甲氧基黄酮含量为 3.0。 0028 实施例 4 0029 取九里香叶总黄酮 10 克, 加淀粉适量, 制粒, 装入胶囊, 制成 1000 粒, 得九里香叶 总黄酮胶囊。 0030 实施例 5 0031 取九里香叶总黄酮 10 克, 加预胶化淀粉、 羧甲基淀粉钠适量, 制粒, 压片, 制成 1000 粒, 得九里香叶总黄酮片。 0032 实施例 6 0033 取九里香叶总黄酮10克, 加吐。
22、温80适量, 加10升加热溶解, 高温灭菌, 分装成100 瓶, 得九里香叶总黄酮口服液。 0034 实施例 7 说 明 书 CN 101601760 B 5 4/16 页 6 0035 取九里香叶总黄酮 10 克, 加入 1000ml 丙二醇和 1000ml 注射用水, 搅拌溶解, 过 滤, 灭菌, 罐装, 每支 2ml, 得九里香叶总黄酮注射液。 0036 实验实施例 0037 第一部分九里香叶总黄酮对肾上腺素所致高血糖小鼠的影响 0038 1 实验材料 0039 1.1 实验动物 0040 健康昆明种小鼠, 雌雄各半, 体重 16 20g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心 提供, 质量。
23、合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。九里香叶总黄酮, 自制, 批号 : 070905( 实施例 1 所得样品, 以下简称 TFMP1), 071018( 实施例 2 所得样品, 以下简称 TFMP2), 071028( 实施 例 3 所得样品, 以下简称 TFMP3)。 0041 1.2 药品与试剂 0042 盐酸肾上腺素注射液 上海禾丰制药有限公司 批号 : 070303 0043 二甲双胍 天津太平洋制药有限公司 批号 : 070416 0044 1.3 主要仪器 0045 血糖仪 优克糖 0046 优克糖血糖试纸 惠基生物科技股份有限公司 0047 2 实验方法 004。
24、8 昆明种小鼠 90 只, 雌雄各半, 按体重随机分为 9 组 : 0049 0050 各组动物按上面方案灌胃给药 ( 容量为 20ml/kg), 每日 1 次, 共 10 日, 实验动物 于给药第 9 日禁食不禁水 12h, 第 10 日以优克糖血糖仪测定空腹血糖值 (mmol/L) 为药前 值, 然后给药。末次药后 1 小时, 除对照组外其他各组动物分别皮下注射 0.1肾上腺素 0.25mg/kg, 注射后于 30、 60、 90min 断尾取血, 用血糖仪测定血糖值 (mmol/L)。 0051 3 统计学分析 0052 数据以均数 标准差表示, 统计分析采用组间比较 t 检验。 005。
25、3 4 实验结果 0054 结果表明, 与空白对照组比较, 模型组小鼠注射肾上腺素后 30 90min 血糖均 明显升高, 有显著性差异 (P 0.01)。与模型组比较, 二甲双胍组和 TFMP1、 TFMP2 大剂量 说 明 书 CN 101601760 B 6 5/16 页 7 组及 TFMP3 小、 大剂量组注射肾上腺素后 60min、 90min 血糖值均明显下降 (P 0.05 或 P 0.01), 提示 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 均可明显对抗肾上腺素所致小鼠高血糖, 结果见 Tab.1。 0055 Tab.1.Effect of TFMP on blood gluc。
26、ose in hyperglycemia mice induced by adrenaline 0056 0057 #P 0.05,#P 0.01vs Control ; *P 0.05, *P 0.01vs Model 0058 第二部分 TFMP 的糖耐量实验 0059 1 实验材料 0060 1.1 实验动物 0061 健康昆明种小鼠, 雌雄各半, 体重 16 20g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心 提供, 质量合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。 0062 1.2 药品与试剂 0063 10葡萄糖注射液 吉林科伦康乃尔制药有限公司 批号 : S070224LI 0。
27、064 格列本脲 天津太平洋制药有限公司 批号 : 070205 0065 1.3 主要仪器 0066 血糖仪 优克糖 0067 优克糖血糖试纸 惠基生物科技股份有限公司 0068 2 实验方法 0069 昆明种小鼠 90 只, 雌雄各半, 按体重随机分为 9 组 : 0070 说 明 书 CN 101601760 B 7 6/16 页 8 0071 0072 各组动物按以上方案灌胃给药, 每日 1 次, 连续 10 日, 实验动物于给药第 9 日禁食 不禁水 12h, 第 10 日以血糖仪测定空腹血糖值 (mmol/L) 为药前值, 然后给药。末次药后 1 小时, 除对照组外其他各组经腹腔注。
28、射葡萄糖 2g/kg, 测定 0.5、 1、 2 小时的血糖值, 观察各 组药物作用。 0073 3 统计学分析 0074 数据以均数 标准差表示, 统计分析采用组间比较 t 检验。 0075 4 实验结果 0076 结果表明, 与空白对照组比较, 模型组小鼠注射葡萄糖后30120min血糖均明显 升高, 有显著性差异(P0.01)。 与模型组比较, 格列本脲组注射葡萄糖后60、 120min血糖 值明显下降 (P 0.05) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 小、 大剂量组注射葡萄糖后 60min、 120min 血糖值均有下降趋势, 但无统计学意义 (P 0.05)。提示 TF。
29、MP1、 TFMP2 及 TFMP3 对葡萄糖 所致小鼠高血糖无显著性作用, 结果见 Tab.2。 0077 Tab.2.Effect of TFMP on blood glncose in hyperglycemia mice induced by glucose 0078 说 明 书 CN 101601760 B 8 7/16 页 9 0079 #P 0.05,#P 0.01vs Control ; *P 0.05, *P 0.01vs Model 0080 第三部分 TFMP 对大鼠实验性 2 型糖尿病的影响 0081 1 实验材料 0082 1.1 实验动物 0083 健康Wistar。
30、大鼠, 雄性, 体重230290g, 由吉林大学基础医学院动物实验中心提 供, 质量合格证号 : SCXK-( 吉 )2003-0001。 0084 1.2 药品与试剂 0085 说 明 书 CN 101601760 B 9 8/16 页 10 0086 1.3 主要仪器 0087 0088 0089 2. 实验方法 0090 2.1 药物配制 说 明 书 CN 101601760 B 10 9/16 页 11 0091 脂肪乳配方 : 猪油 25, 胆固醇 1, 丙硫氧嘧啶 1, 吐温 -8025, 1, 2- 丙二醇 20。 0092 脂肪乳制备 : 取猪油 25g 放入 200ml 烧杯。
31、中, 加热至 100, 加入 25ml 吐温 -80, 制 成油相。另一烧杯中加入 30ml 蒸馏水和 20ml1, 2- 丙二醇加热, 制成水相。然后将水相加 入油相, 充分混匀, 即制成脂肪乳剂。 0093 链脲佐菌素 (STZ), 临用时以 0.1mol/L, PH4.2 柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液新鲜配制 成 1的 STZ 溶液。 0094 将 TFMP 用 0.5 CMC-Na 配成 0.7、 0.35的溶液, 二甲双胍在研钵内用 0.5 CMC-Na 配成 0.7的溶液。 0095 2.2 动物造模 0096 将250只Wistar大鼠随机分为正常组和模型组, 正常组大鼠给予蒸馏水。
32、10ml/kg, 模型组大鼠在正常饮食基础上按 10ml/kg 灌胃 (ig) 给脂肪乳剂, 10 日后, 正常组和模型组 随机取 12 只大鼠尾静脉取血检测血清 TC、 TG、 FFA 含量。然后, 各组动物禁食不禁水 12 小 时, 正常组舌下 iv0.1mol/L, PH4.2 的柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液, 模型组舌下 iv STZ30mg/ kg, 药后 4 小时 ig 给模型组大鼠 25葡萄糖溶液避免低血糖反应, 72h 后从造模大鼠中选 取空腹血糖值 11.1mmol/L 的大鼠为 2 型糖尿病模型大鼠。 0097 2.3 分组及给药方法 0098 将2型糖尿病模型大鼠按血糖和体。
33、重随机分为11组, 每组15只, 即 : TFMP1大、 中、 小剂量组、 TFMP2 大、 中、 小剂量组、 TFMP3 大、 中、 小剂量组、 二甲双胍组及模型对照组。具体 给药方案为 : 0099 0100 0101 各组动物按照上述方案ig给药, 连续4周。 2型糖尿病大鼠ig给脂肪乳10ml/kg, 每 3 日给药 1 次。每周断尾取血, 用血糖仪测定空腹血糖值一次, 以实测值或变化百分率进 说 明 书 CN 101601760 B 11 10/16 页 12 行组间比较。各组存活动物于第四周最后 1 次给药前禁食不禁水 12h, 测定空腹血糖值, ig 给药, 药后1h腹腔注射3戊。
34、巴比妥钠30mg/kg麻醉, 腹主动脉采血, 分离血清, 进行各种生 化指标和放免指标的测定。采集各鼠同一部位肝脏, 测定肝糖原含量。采集各鼠胰腺, 10 甲醛固定。 0102 2.4 观测指标及测定方法 0103 2.4.1 一般状态观察 0104 监测实验过程中空白组及糖尿病各组大鼠的一般状态、 体重、 摄食及摄水等变化, 并记录各组大鼠每日的摄食摄水量。 0105 2.4.2 血糖和肝糖元的测定 0106 测血糖前夜, 各组大鼠禁食不禁水 12h, 次日断尾取血, 用血糖仪和优克糖试纸测 定空腹血糖值, 每周 1 次。给药第 28 日采集各鼠同一部位肝脏, 按照肝糖元试剂盒说明书 测定肝。
35、糖原含量。 0107 2.4.3 糖尿病相关的氧化因子的测定 0108 腹主动脉采血约 6ml, 注入干净的试管内, 4, 2000rpm 离心 10min, 分离血清, 按 相应的试剂盒说明书要求严格操作, 一部分血清用于测定血清中 TC、 TG、 HDL、 LDL、 SOD、 MDA 含量 ; 另外一部分血清用放射免疫分析方法测定 IL-1、 IL-6、 TNF-、 INS、 C 肽含量, 以 Homa Model 方法计算 ISI 和胰岛素抵抗指数 (Homa-IR)。 0109 2.4.4 胰岛细胞形态学观察 0110 采集各鼠胰腺, 10甲醛固定, 作免疫组化, 进行胰岛细胞的形态学。
36、观察。 0111 3. 统计学分析 0112 数据以均数 标准差表示, 计量资料进行组间 t 检验。 0113 4. 实验结果 0114 4.1 高脂饮食对正常大鼠血脂的影响 0115 与正常组比较, 模型组大鼠连续 ig 脂肪乳剂 10 日后出现血脂代谢紊乱 : TC、 TG、 FFA 含量均显著增高 (P 0.01), 结果见 Tab.3。 0116 Tab.3.Effect of highly fatted food on serum lipid in normal rats 0117 0118 #P 0.05,#P 0.01vs control 0119 4.2TFMP 对 T2DM 。
37、大鼠 FBG 及肝糖原的影响 0120 在模型组大鼠出现血脂代谢紊乱的基础上舌下 iv30mg/kg STZ 后, 模型对照组大 鼠第 0、 1、 2、 3、 4 周血糖值与正常对照组相比均显著升高 (P 0.01), 第 4 周肝糖原含量与 正常对照组相比明显降低 (P 0.05), 表明大鼠 T2DM 模型建立成功。与模型对照组比较, 说 明 书 CN 101601760 B 12 11/16 页 13 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组及二甲双胍组于药后第 3、 4 周 FBG 均明显降低 (P 0.05 或 P 0.01), 第 4 周肝糖原含量明显。
38、升高 (P 0.05 或 P 0.01), 提示 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 可显著改善 T2DM 大鼠的高血糖症状, 提高肝糖原含量, 见 Tab.4 及 Tab.5。 0121 Tab.4.Effect of TFMP on blood glucose in T2DM rats 0122 0123 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0124 Tab.5.Effect of TFMP on liver glycogen content in T2DM rats 0125 说 明 书 CN 101601760 。
39、B 13 12/16 页 14 0126 #P 0.05vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0127 4.3TFMP 对 T2DM 大鼠血脂及脂代谢的影响 0128 与正常组比较, 模型对照组TG、 TC、 LDL-C含量均显著升高(P0.05或P0.01), HDL-C 含量明显下降 (P 0.01) ; 与模型对照组比较, TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量 组的 TC、 TG 及 LDL-C 含量均显著下降, 而 HDL-C 含量明显上升 (P 0.05 或 P 0.01) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335m。
40、g/kg 组的 TC 含量显著下降, HDL-C 含量明显上升 (P 0.05), 表 明 TFMP 可改善 T2DM 大鼠的血脂代谢紊乱。结果见 Tab.6。 0129 Tab.6.Effect of TFMP on serum lipid in T2DM rats 0130 说 明 书 CN 101601760 B 14 13/16 页 15 0131 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0132 4.4TFMP 对 T2DM 大鼠胰岛素分泌功能及胰岛素抵抗的影响 0133 与正常组相比, 模型对照组血清中胰岛素和 C- 。
41、肽含量及胰岛素分泌指数 ISI 显 著下降 (P 0.01), Homa-IR 明显升高 (P 0.01) ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组和 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组的胰岛素和 C- 肽含量及 ISI 显著升高 (P 0.05 或 P 0.01), Homa-IR 明显降低 (P 0.05 或 P 0.01), TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335mg/kg 剂 量组的 C- 肽含量及 ISI 显著升高 (P 0.05), Homa-IR 明显降低 (P 0.05), 说明 TFMP 能 改善 T2DM 胰岛 细胞功能, 促进胰岛素分泌, 增强。
42、组织对胰岛素的敏感性, 改善 IR。结果 见 Tab.7。 0134 Tab.7.Effect of TFMP on Ins, C-peptide, Homa-IR and ISI in T2DM rats 0135 说 明 书 CN 101601760 B 15 14/16 页 16 0136 #P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0137 4.5TFMP 对 T2DM 大鼠血清 SOD 活性及 MDA 含量的影响 0138 与正常组相比, 模型对照组 SOD 活性明显降低 (P 0.01), MDA 含量明显增加 (P 0.01) ; 与模。
43、型对照组比较, TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组及二甲双胍组的 SOD 活性明显提高 (P 0.05 或 P 0.01), TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组及二甲 双胍组的 MDA 含量明显降低 (P 0.05), 结果见 Tab.8。 0139 Tab.8Effect of TFMP on SOD acfivity and MDA content in T2DM rats 0140 说 明 书 CN 101601760 B 16 15/16 页 17 0141 0142 #P 0.01vs normal ; *P 0.05,。
44、 *P 0.01vs model 0143 4.6TFMP 对 T2DM 大鼠血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 的影响 0144 与正常组相比, 模型对照组 IL-1、 IL-6 及 TNF- 含量均明显升高 (P 0.05 或 P 0.01) ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组及 TFMP1、 TFMP2 及 TFMP335、 70mg/kg 剂量组的 IL-1 含量均明显降低 (P 0.05 或 P 0.01) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP370mg/kg 剂量组的 IL-6 含量明显下降 (P 0.05) ; TFMP1、 TFMP2 及 TFMP3 三个剂量组的 T。
45、NF- 含量有下降 趋势, 但无显著性差异 (P 0.05)。结果见 Tab.9。 0145 Tab.9.Effect of TFMP on IL-1、 IL-6and TNF-in T2DM rats 0146 0147 #P 0.05,#P 0.01vs normal ; *P 0.05, *P 0.01vs model 0148 4.7 胰岛细胞形态学观察 说 明 书 CN 101601760 B 17 16/16 页 18 0149 与正常对照组比较, 模型组胰岛数目减少, 胰岛结构失去完整性, 胰岛细胞分散, 分布不均匀, 胰岛内 细胞数明显减少 ; 与模型对照组比较, 二甲双胍组及。
46、 TFMP1、 TFMP2、 TFMP3 组的胰岛数目增多, 胰岛结构趋向完整, 胰岛内 细胞数增多, 对胰岛的损伤有较好 的改善作用。 0150 结论 0151 1)TFMP 对小鼠肾上腺素所致高血糖有明显的对抗作用, 于药后 60min 开始起效持 续到 90min。 0152 2)TFMP 对小鼠葡萄糖所致高血糖有一定的对抗作用, 但无显著性差异。 0153 3)TFMP可以明显降低T2DM大鼠的血糖, 并于给药后第3周开始血糖值降低最为显 著 ; 并且能升高 T2DM 大鼠肝糖元的含量。 0154 4)TFMP 可以改善 T2DM 大鼠的脂代谢紊乱。 0155 5)TFMP可以升高T2DM大鼠血清中C-肽水平和胰岛素含量, 提高胰岛细胞分泌 指数, 降低胰岛素抵抗指数, 改善 IR。 0156 6)TFMP 可以降低 T2DM 大鼠的血清 MDA 含量, 升高 SOD 活性。 0157 7)TFMP 可以降低 T2DM 大鼠的血清 IL-1、 IL-6、 TNF- 含量, 减轻炎性反应。证 明九里香叶总黄酮对糖尿病及其并发症具有显著的预防与治疗作用。 附图说明 0158 图 1 胰岛 细胞形态学免疫组化分析。 说 明 书 CN 101601760 B 18 1/1 页 19 图 1 说 明 书 附 图 CN 101601760 B 19 。