相关申请的交叉引用
本申请要求2006年7月10号提交的美国临时申请号60/819,569 的优先权，其在此全部引作参考。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明部分地由美国政府支持完成，NIDA资助号DA021416。 本发明中美国政府有某些权利。
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发明领域
此处公开的本发明一般涉及抗可卡因疗法。
背景
可卡因滥用是抗药物治疗的棘手的社会和医疗问题。可卡因阻 断单胺类、多巴胺、去甲肾上腺素和五羟色胺(serotin)的再摄取，从 而延长并放大这些神经递质在中枢神经系统的作用(Benowitz NL (1993)Pharmacol Toxicol 72，3-12)。由于对神经递质系统和心肌钠通 道阻断的影响，可卡因毒性的特点为惊厥和心功能不全(如心肌梗 死、心律失常、血压升高、中风，或夹层动脉瘤，以及心肌耗氧量 增加)(Bauman JL and DiDomenico RJ(2002)J Cardiovasc Pharmacol Ther 7，195-202；Wilson LD and Shelat C(2003)J Toxicol Clin Toxicol 41，777-788；Knuepfer MM(2003)Pharmacol Ther 97，181-222)。可卡 因能容易地通过血脑屏障，并且对中枢和外周神经系统有广泛影 响，所以过量服用会导致猝死(参见Bauman JL and DiDomenico RJ (2002)J Cardiovasc Pharmacol Ther 7，195-202，用作综述)。
虽然人们很好地理解了可卡因作用机理，但此信息还未使可用 于滥用和过量情况的有效可卡因拮抗剂开发出来。可卡因的迅速和 多效性作用对于急性可卡因毒性的治疗而言是个复杂的问题(Carroll FI，Howell LL and Kuhar M.J(1999)J Med Chem 42，2721-2736)。就 可卡因而言，可用于治疗阿片类药物滥用的两种类型的疗法，拮抗 作用(如纳曲酮)和替代(如美沙酮)没有平行对照，尽管对后者 的尝试正在考虑中(例如J.Grabowski等(2004)Addictive Behaviors 29，1439-1464)。一种办法是通过使用或者内源性酯酶、可卡因特异 性抗体，或者催化抗体，防止或减少可卡因进入作用位点。
天然产生的可卡因被血清丁酰胆碱酯酶(BChE)在苯甲酰基酯处 水解为无毒芽子碱甲酯和苯甲酸。在肝脏中，羧酸酯酶hCE-2水解 甲酯产生苯甲酰芽子碱和甲醇(见例如图1)。可卡因血中的消除 半衰期为0.5至1.5小时(T.Inaba(1989)Canadian Journal of Physiology & Pharmacology 67，1154-1157)。已有过一些尝试使用自 然生成的BChE或基因工程BChE，以增加可卡因分解(参见例如 Carmona等(2000)Drug Metabolism & Disposition 28，367-371；Xie等 (1999)Molecular Pharmacology 55，83-91；Sun等(2002a)Molecular Pharmacology；Sun等(2002b)Pharmacology & Experimental Therapeutics 302，710-716；Duysen等(2002)Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics 302，751-758；Gao Y and Brimijoin S (2004)Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics 310，1046- 1052；Gao等(2005)Molecular Pharmacology 67，204-211)。其它研究 人员已用单克隆抗体Mab 15A10作为可卡因催化抗体(参见例如 Landry et al，1993；Mets等，1998；Baird等，2000；Larsen等，2004)，而 其它人正在探索使用可卡因疫苗(见例如Kosten等(2002)Vaccine 20， 1196-1204)。
表1：几种抗(-)可卡因的可卡因水解酶的动力学
酶 Kcat(min-1) Km(μM) 效率(kcat/Km) 参考文献 BChE 4.1 4.5 9.1x106 Sun等，2002a Ala328W/Y332A 154 18 8.5x106 Sun等，2002a Mab15A10 2.2 220 1x104 Larsen等，2004 AME 359 620 20 3.1x107 Gao等，2005 CocE 468 0.64 7.2x108 Turner等，2002
古柯植物周围土壤固有的细菌红球菌MB1，已进化出利用可卡 因作为其唯一碳源和氮源的能力。细菌表达与BChE作用相似的可 卡因脂酶(CocE)，水解可卡因的苯甲酰酯，得到芽子碱甲酯和苯 甲酸(见例如图1)(Bresler等(2000)Appl Environ Microbiol 66， 904-908；Turner et at.(2002)Biochemistry 41，12297-12307；Larsen等 (2002)Nature Struct Biol 9，17-21)。CocE基因已被分离和克隆 (Bresler等(2000)Appl Environ Microbiol 66，904-908)，CocE的晶体 结构已确定(Turner et at.(2002)Biochemistry 41，12297-12307；Larsen 等(2002)Nature Struct Biol 9，17-21)。CocE结构(见例如图2)显示 除了结合形成可卡因结合口袋的两个其它域外的典型的丝氨酸酯酶 折叠。活性位点中催化三联体内三个氨基酸(Asp、His或Ser)的任何 改变(综述见Dodson G and Wlodawer A(1998)Trends Biochem Sci 23，347-352)使抗可卡因酯酶活性失活。此外，与可卡因苯甲酸酯 部分接触的残基的突变也破坏可卡因水解，推测通过破坏过渡态中 氧阴离子的稳定(Turner等(2002)Biochemistry 41，12297-12307； Larsen等(2002)Nature Structural Biology 9，17-21)。纯化的酶(MW ～65kDa)非常有效地催化可卡因，米-曼(Michaelis-Menten)动力学kcal＝7.2s-1和Km＝640nM(Turner等(2002)Biochemistry 41，12297- 12307；Larsen等(2002)Nature Structural Biology 9，17-21)，大于内源 性脂酶近三个数量级，并最有可能迅速地起作用，足以使可卡因过 量服用的人解毒(Landry等(1993)Science 259，1899-1901；Mets等 (1998)National Academy of Sciences of the United States of America 95， 10176-10181)。此外，脂酶还代谢古柯乙烯(可卡因和醇的强药效代 谢物)，差不多与其代谢可卡因一样有效(kcat＝9.4s-1和Km＝1600 nM)(Turner等(2002)Biochemistry 41，12297-12307；Larsen等(2002) Nature Structural Biology 9，17-21)。
因此，理想的是提供稳定的抗可卡因疗法CocE。
发明概述
因此，本发明已已成功发现高效、耐热和持久的，可保护受试 者抗可卡因毒性和强迫性用药作用(reinforcing effects)的可卡因酯 酶突变体。
本发明一方面提供具有野生型CocE氨基酸序列(如SEQ ID NO： 1)但有至少一个氨基酸残基取代的分离的突变体可卡因脂酶(CocE) 多肽。所述突变体CocE多肽与野生型CocE比较，具有37℃下热 稳定性增加的脂酶活性。
各种实施方案包括具有野生型CocE氨基酸序列的至少两个、三 个、四个、五个或更多取代的突变体CocE多肽。本发明范围内突变 体CocE多肽的例子包括具有以下氨基酸序列的那些：SEQ ID NO：3 (L163V)；SEQ ID NO：7(V225I)；SEQ ID NO：8(I218L)；SEQ ID NO：9(A310D)；SEQ ID NO：10(A149S)；SEQ ID NO：11(S159A)； SEQ ID NO：12(S265A)；SEQ ID NO：13(S56G)；SEQ ID NO：14 (W220A)；SEQ ID NO：16(S140A)；SEQ ID NO：17(F189L)；SEQ ID NO：18(A193D)；SEQ ID NO：19(T254R)；SEQ ID NO：20 (N42V)；SEQ ID NO：21(V262L)；SEQ ID NO：22(L508G)；SEQ ID NO：23(Y152H)；SEQ ID NO：24(V160A)；SEQ ID NO：25 (T172R)；SEQ ID NO：26(Y532F)；SEQ ID NO：27(T74S)；SEQ ID NO：28(W285T)；SEQ ID NO：29(L146P)；SEQ ID NO：30 (D533S)；SEQ ID NO：31(A194R)；SEQ ID NO：32(G173Q)；SEQ ID NO：33(C477T)；SEQ ID NO：34(K531A)；SEQ ID NO：35 (R41I)；SEQ ID NO：36(L119A)；SEQ ID NO：37(K46A)；SEQ ID NO：38(F84Y)，T172R-G173Q(SEQ ID NO：39)；L169K(SEQ ID NO： 40)；F189A(SEQ ID NO：41)，N197K(SEQ ID NO：42)，R182K(SEQ ID NO：43)，F189K(SEQ ID NO：44)，V190K(SEQ ID NO：45)，Q191K (SEQ ID NO：46)和A194K(SEQ ID NO：47)，或其功能片段。另外的 典型突变体CocE多肽包括F189A/T172R、T172R/A193D、 T172R/G173Q-I175-G-G-A186、T172R/G173Q-T176-G-G-D185等 等。鉴于命名惯例与本文公开的多肽序列，本领域熟练技术人员能 确定上述命名为突变体CocE多肽的多肽序列。
本发明另一方面提供药物组合物，其成分包括本发明范围内的 突变体CocE多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明另一方面提供编码本文所述突变体CocE多肽的分离的核 酸。在各种实施方案中，所述核酸包括具有高严格性条件下，与编 码野生型CocE的核酸(例如SEQ ID NO：2)，或其互补序列杂交的序 列的那些。这样分离的核酸编码突变体CocE多肽，所述多肽与野生 型CocE相比，具有37℃时热稳定性增加的酶活性。所述分离的核 酸序列的各种实施方案与野生型CocE的核酸序列(如SEQ ID NO： 2)，具有至少约85％的序列一致性。例如，分离的核酸序列与野生 型CocE(如SEQ ID NO：2)有至少约86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％的序 列一致性。
在各实施方案中，与野生型CocE相比，突变体CocE多肽(或 本发明范围内核酸编码的多肽)熔点增加。在各实施方案中，突变 体CocE多肽(或本发明范围内核酸编码的多肽)比野生型CocE热 稳定性增加至少约2.0kcal/mol。例如，增加的热稳定性可以是至少 约2.1kcal/mol，至少约2.2kcal/mol，至少约2.3kcal/mol，至少约 2.4kcal/mol，至少约2.5kcal/mol，至少约2.6kcal/mol，至少约2.7 kcal/mol，至少约2.8kcal/mol，至少约2.9kcal/mol，至少约3.0 kcal/mol，至少约3.1kcal/mol，至少约3.2kcal/mol，至少约3.3 kcal/mol，至少约3.4kcal/mol，至少约3.5kcal/mol，至少约3.6 kcal/mol，至少约3.7kcal/mol，至少约3.8kcal/mol，至少约3.9 kcal/mol，至少约4.0kcal/mol，至少约4.1kcal/mol，至少约4.2 kcal/mol，至少约4.3kcal/mol，至少约4.4kcal/mol或至少约4.5 kcal/mol。
在各实施方案中，突变体CocE多肽(或本发明范围内核酸编码 的多肽)与野生型CocE相比，免疫原性降低。
在一些实施方案中，所述热稳定的突变体CocE多肽比野生型 CocE的酯酶活性低。例如，热稳定CocE突变体可有野生型CocE 酯酶活性的约10％，约20％，约30％，约40％，约50％，约60％， 约65％，约70％，约75％，约80％，约85％，约90％，约95％或约 99％。在其它实施方案中，所述突变体CocE多肽与野生型CocE多 肽有大约相同，或更高的催化效率。例如热稳定CocE突变体可有野 生型CocE酯酶活性的约100％，约110％，约120％，约130％，约 140％，约150％或更多。
在各实施方案中，突变体CocE多肽是聚乙二醇化的。在各实施 方案中，突变体CocE多肽是包封在红血细胞中的。例如聚乙二醇化 的突变体CocE多肽(或包括聚乙二醇化突变体CocE多肽的药物组 合物)可包封在RBC中。
在一些实施方案中，所述突变体CocE多肽被底物、产物和/或 抑制剂稳定。
本发明另一方面提供治疗可卡因诱导的疾病的方法。在这种方 法中，本发明范围内治疗有效量的突变体CocE多肽(或包括突变体 CocE多肽的药物组合物)施用于对其有需要的受试者。在各实施方 案中，所述可卡因诱导的疾病包括可卡因过量、可卡因毒性、可卡 因成瘾、可卡因依赖和/或其某些组合。
然而本发明另一方面提供鉴别热稳定突变体CocE多肽的高通量 筛选方法。在这种筛选方法中，细胞用编码突变体CocE多肽候选物 的核酸稳定转化。突变体CocE多肽是细胞中表达的。所表达的突变 体CocE多肽是分离的或展示的。分离的突变体CocE多肽的酯酶活 性在一个或多个温度测量，以确定分离的突变体CocE多肽的热稳定 性。这样的温度可从约30℃至50℃。筛选在预定温度具有酯酶活性 的突变体CocE多肽。
在所述筛选方法的一些实施方案中，测量分离的突变体多肽的 酯酶活性可通过将分离的突变体CocE多肽与(i)可卡因和pH指示剂 或(ii)可卡因硫代衍生物和硫醇指示剂接触完成。然后检测pH指示 剂或硫醇指示剂的任何变化。这样的变化与可卡因或可卡因衍生物 被突变体CocE多肽水解形成苯甲酸相关。
筛选方法的一些实施方案进一步包括进行几个循环的升高的温 度下以测量脂酶活性的筛选程序。例如，第一个循环可以采用约 30℃的测量酯酶活性的温度，而随后的循环周期可以采用约45℃的 测量酯酶活性的温度。
在筛选方法的一些实施方案中，突变体CocE多肽表达的温度是 野生型CocE基本上保留催化活性的温度。在筛选方法的其它实施方 案中，突变体CocE多肽的表达温度是野生型CocE多肽大体上分配 在包涵体中的温度。例如，表达温度可至少约35℃，至少约36℃， 至少约37℃，至少约38℃，，至少约39℃，或者至少约40℃。
其它目的和特征将是部分显而易见，部分下文指出。
附图简述
本领域技术人员会明白，下述的附图仅为说明目的。附图不以 任何方式限制本教导的范围。
图1是说明各种酶反应的可卡因代谢图。
图2是说明CocE结构的带状图。域1(DOM1)、域2 (DOM2)和域3(DOM3)与位于所述三个域交叉点的活性位点一 起表明。苯甲酸分子显示在活性位点中。
图3是描绘CocE的FPLC(Q-Sepharose)洗脱分布的线图，随时 间显示紫外吸收和氯化钠浓度。进一步的方法学信息参见实施例 1。
图4是表示人血浆中存在CocE时可卡因体外降解的线图和分布 图。进一步的方法学信息参见实施例2。
图5是30℃和37℃进行反应的野生型CocE、T172R突变体 CocE(SEQ ID NO：26)和S159A突变体CocE(SEQ ID NO：11)的米 氏酶动力学图。进一步的方法学信息参见实施例4。
图6是37℃孵育各时间点后，用变性(SDS+βMe)或非变性(自 然)条件，PAGE分离野生型和T172R突变体CocE后总蛋白染色 的一组照片。更多信息参见实施例4。
图7是描述确定野生型和T172R CocE熔点的圆二色性线图。全 光谱见A，近紫外光谱见B，每个突变体的估计熔点见C。更多信 息参见实施例4。
图8含有(A)可卡因的苯甲酰基硫代酯衍生物(硫代-1)和脱 甲酯基可卡因(硫代-2)水解后，释放的硫醇(R-SH)与Ellman试剂 反应的图；和(B)与苯甲酰基硫代酯衍生物(硫代-1)和Ellman 试剂孵育的对照BL21细胞和含CocE的BL21细胞的比色反应线 图。更多信息参见实施例15。
图9是增加可卡因剂量后施用一分钟时，1.0mg CocE(实心 圆)或PBS(溶剂，空心圆)对可卡因诱导致死率的作用的线图和 分布图(n＝6-7)。出现的数据表示为百分比及其标准误差。进一步的 方法学信息，参见实施例5。
图10是在180mg/kg可卡因的前一分钟施用时，增加剂量的 CocE(CE)或人BChE(BChE)或PBS对可卡因诱导致死率的作用的 柱状图(n＝6-7)。出现的数据表示为百分比及其标准误差均值。进 一步的方法学信息，参见实施例5。
图11是在180mg/kg可卡因的前一分钟施用时，CocE突变体 S117A和Y44F，或PMSF处理的CocE对可卡因诱导惊厥和致死率 的作用柱状图。进一步的方法学信息，参见实施例5。
图12是在560mg/kg WIN-35065-2，化合物的确定LD100，之 后一分钟施用时1.0mg CocE或PBS的作用的柱状图(n＝6-8)。进 一步的方法学信息，参见实施例5。
图13是体外CocE(125ng/ml)时间依赖性失活的线图和分布 图。指数衰减t1/2计算为13.2。进一步的方法学信息，参见实施例 6。
图14是100mg/kg可卡因之前和之后各时间施用时，1mg CocE的时间依赖性保护作用的柱状图(n＝6-8)。进一步的方法学信 息参见实施例6。
图15是给予酯酶后0或1分钟时，用0.8μM可卡因酯酶或酯 酶溶剂处理的人血浆中可卡因浓度的柱状图。进一步的方法学信息 参见实施例6。
图16是增加可卡因剂量(左图)之后一分钟施用时，0.32mg CocE(实心圆)、0.32mg T172R突变体CocE(实心三角形)或PBS(溶 剂，空心圆)对可卡因诱导致死率的作用的一系列线图和分布图(左 图)，以及可卡因施用后至死亡的分钟数(右图)。进一步的方法 学信息，参见实施例7。
图17是施用320mg/kg可卡因前1、10、30和60分钟施用时， 0.32mg/kg CocE(实心圆)或T172R突变体CocE(实心三角形)对可卡 因诱导致死率的作用的线图和分布图。进一步的方法学信息参见实 施例7。
图18是1mg hBChE(实心三角形)、0.32mg CocE(实心圆)或1 mg CocE(实心正方形)对可卡因诱导致死率的作用的一系列线图和 分布图。图18A是作为可卡因浓度的函数的致死率。图18B是作为 可卡因浓度的函数的可卡因施用后直至死亡的分钟数。进一步的方 法学信息见实施例8。
图19是聚乙二醇化CocE的MALDI-TOF质谱图。峰间质量差 异对应～5500Da；相当于单个PEG链的分子量。进一步的方法学信 息见实施例11。
图20是戊二醛固定的红血细胞SEM图。图20A是未处理的正 常RBC。图20B是装载L-ASNase的渗透破裂-重包封的RBC。图 20C是装载LMWP-ASNase的RBC。进一步的方法学信息参见实施 例12。
图21是RBC/LMP-ASNase或RBC血影/ASNase的作为时间(天) 函数的血中天冬酰胺酶活性的百分比分布图。进一步的方法学信息 参见实施例12。
图22是带有L5178Y淋巴瘤细胞的DBA/2小鼠存活的线图。第 5天给予酶或盐水，第5天时症状出现。进一步的方法学信息参见实 施例12。
图23是显示CocE及其突变体抗可卡因诱导毒性的保护作用的 线图和分布图。图中描绘表现作为施用野生型CocE(0.3mg)、 T172R(0.3mg)、T172R-G173Q(0.3mg)或L169K(1mg)的小鼠所注 射可卡因浓度的函数的可卡因诱导致死率的小鼠致死率百分比。可 卡因施用(mg/kg，腹腔注射)前1分钟，CocE或突变体(mg)静脉 注射给药。不同的符号代表CocE或突变体不存在或存在下，可卡因 诱导致死率的剂量响应曲线。每个数据点代表表现可卡因诱导致死 率的小鼠百分比(每个剂量条件n＝8)。
图24是表示CocE抗可卡因毒性保护作用时间过程的一系列线 图和分布图。腹腔给药可卡因180mg/kg之前不同时间点施用CocE 或突变体(0.1、0.3和1mg，静脉注射)。图24A描绘腹腔给药可 卡因180mg/kg前，表现作为野生型CocE(0.1mg)、T172R(0.1 mg)、L169K(1mg)或T172R-G173Q(0.1mg)给药时间的函数的可卡 因诱导致死率的小鼠百分比。图24B描绘腹腔给药可卡因180mg/kg 前，表现作为野生型CocE(0.3mg)、T172R(0.3mg)、L169K(0.3mg) 或T172R-G173Q(0.1mg)的给药时间的函数的可卡因诱导致死率的 小鼠百分比。图24C描绘腹腔给药可卡因180mg/kg前，表现作为 野生型CocE(1mg)、T172R(1mg)、L169K(1mg)或T172R-G173Q (1mg)给药时间的函数的可卡因诱导致死率的小鼠百分比。每个数据 点代表表现可卡因诱导致死率的小鼠百分比(每个剂量条件n＝ 8)。
图25是说明50％致死率的估计保护期的线图和分布图。图中描 绘了作为T172R-G173Q、L169K、T172R和野生型CocE剂量 (mg，静脉注射)函数的小鼠中CocE突变体的估计保护(50％致 死率)期(小时)。要求达到50％致死率的时间从图24确定。
图26是表明CocE、T172R-G173Q及其聚乙二醇化形式抗可卡 因诱导毒性保护作用的一系列线图和分布图。每种酶(0.3mg)在可卡 因给药(mg/kg，腹腔给药)前1分钟，静脉给药。不同符号代表酶存 在或不存在下，可卡因诱导致死率的剂量响应曲线。每个数据点代 表显示可卡因诱导致死率的小鼠百分比(每个剂量条件n＝8)。图 26A描绘了对于溶剂/PBS、CocE野生型(0.3.mg)和PEG-CocE野生 型(0.3mg)，作为可卡因剂量(mg/kg，腹腔给药)函数的致死率出现 百分比。图26B描绘了对于溶剂/PBS、T172R-G173Q(0.3.mg)和 PEG-CocE野生型(0.3mg)，作为可卡因剂量(mg/kg，腹腔给药)函数 的致死率出现百分比。
图27是显示可卡因酯酶和突变体：(A)野生型CocE、(B) T172R、(C)T272R/G173Q和L169K热稳定性的一系列线图和分布 图。进一步的方法学信息参见实施例17。
图28是显示酶37℃下预孵育0分钟或60分钟，通过尺寸排阻 色谱分离(A)野生型CocE、(B)T172R、(C)T172R/G173Q的 一系列色谱图。分子量标准BSA(66Kda)和AD(150Kda)包括在A 中。进一步的方法学信息参见实施例18。
图29是显示200nm至250nm之间观测到温度依赖性解链的野 生型CocE和4个突变体的一系列平滑CD谱图。进一步的方法学信 息参见实施例19。
图30是通过CCA算法去叠合为3个曲线的野生型CocE和4个 突变体的一系列谱图，表明CocE解链是至少2个步骤的过程，从初 始曲线(曲线1)到中间解折叠步骤(曲线2)，到完全变性蛋白 (曲线3)。进一步的方法学信息参见实施例19。
图31是显示在描述图30显示的3个去叠合CCA曲线中，每个 温度的贡献百分比的一系列线图和分布图。进一步的方法学信息参 见实施例19。
图32是显示(1)初始谱图融化物，(2)中间态的形成和解 链，以及(3)完全解链蛋白累积的解链和形成温度的线图和分布 图。进一步的方法学信息参见实施例19。
图33是显示可卡因(mM范围)防止37℃诱导形成高分子量 CocE聚集物(0.1mg/ml酶浓度)的凝胶图。进一步的方法学信息参 见实施例20。
图34是显示可卡因(uM量)稳定37℃诱导活性损失的线图和 分布图。进一步的方法学信息参见实施例20。
图35是苯甲酸(mM范围)防止37℃诱导形成高分子量CocE 聚集物(0.1mg/ml酶浓度)的凝胶图。进一步的方法学信息参见实 施例20。
图36是可卡因(uM量)稳定37℃诱导活性损失的线图和分布 图。进一步的方法学信息参见实施例20。
发明详述
其中公开的本发明的实施方案提供了抗可卡因疗法的催化降解 方法的组合物和方法。本文所述的技术是部分基于高效、热稳定性 和持久的，可保护受试者抗可卡因毒性和强迫性用药作用的可卡因 酯酶突变体的发现。这种突变体提供可卡因诱导疾病，如可卡因过 量和可卡因成瘾的治疗选择。
突变体CocE多肽
不管野生型CocE(见例如SEQ ID NO：1，检索号No. AF173165)代谢可卡因的效能(见例如实施例2；实施例4；实施 例5)，野生型CocE作为治疗剂在治疗可卡因过量中的应用，由于 生理温度下其热稳定性低可能会受到限制(见例如实施例4；实施 例6)。热不稳定性使野生型CocE的血浆半衰期短。CocE酶37℃ 在血浆中孵育后，或静脉注射到小鼠后观察到其活性明显衰减 (＞50％)。37℃时CocE的t1/2是大约15分钟，而4℃的t1/2大于6个 月。大鼠中初步研究显示，CocE略多于30分钟的相对短持续时间 的抗可卡因作用。
因此本发明一个方面提供纯化的突变体CocE多肽，其与野生型 CocE相比显示出热稳定性和血浆半衰期增加。本发明的突变体 CocE多肽由于其有效地水解可卡因的能力，同时还表现出热稳定性 和/或血浆半衰期增加，因而有重要的临床价值。
本发明提供其中野生型CocE的至少一个氨基酸残基被取代的突 变体CocE多肽，这里突变体CocE热稳定性增加，同时保持相对较 高的催化效率。在一些实施方案中，突变体CocE多肽基本上保持野 生型CocE多肽功能酯酶活性(即水解可卡因)。突变体CocE多肽 具有与天然CocE多肽有一个或多个氨基酸不同的肽序列。这样的突 变体的肽序列可以特征为天然CocE多肽的一个或多个氨基酸取 代、缺失或增加。氨基酸插入优选约1、2、3、4至5个毗连氨基 酸，缺失优选约1、2、3、4、5、6、7、8和9至10个毗连氨基 酸。在各实施方案中，突变体CocE多肽可以含有至少一个、两个、 三个、四个或者多个氨基酸取代、缺失或增加，由此产生的突变体 CocE多肽热稳定性增加。
本文使用的术语氨基酸，旨在包括自然产生的氨基酸以及非天 然产生的氨基酸，包括氨基酸类似物和衍生物。后者包括含有氨基 酸部分的分子。本领域熟练技术人员将认识到，本文参考的氨基酸 包括例如自然产生的蛋白产生L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的 氨基酸，如氨基酸类似物和衍生物；自然产生的非蛋白产生氨基酸 以及具有本领域已知为氨基酸特征的性质的化学合成化合物。对于 本文公开的所有氨基酸序列，人们理解相当的核苷酸和氨基酸可被 取代进入序列，而不影响序列的功能。这样的取代在本领域普通技 术人员的能力范围内。
本发明还提供具有以下取代的纯化突变体CocE多肽：L163V (SEQ ID NO：3)；V121D(SEQ ID NO：4)；S167A(SEQ ID NO：5)； Q123E(SEQ ID NO：6)；V225I(SEQ ID NO：7)；I218L(SEQ ID NO： 8)；A310D(SEQ ID NO：9)；A149S(SEQ ID NO：10)；S159A(SEQ ID NO：11)；S265A(SEQ ID NO：12)；S56G(SEQ ID NO：13)； W220A(SEQ ID NO：14)；T122A(SEQ ID NO：15)；S140A(SEQ ID NO：16)；F189L(SEQ ID NO：17)；A193D(SEQ ID NO：18)；T254R (SEQ ID NO：19)；N42V(SEQ ID NO：20)；V262L(SEQ ID NO： 21)；L508G(SEQ ID NO：22)；Y152H(SEQ ID NO：23)；V160A (SEQ ID NO：24)；T172R(SEQ ID NO：25)；Y532F(SEQ ID NO： 26)；T74S(SEQ ID NO：27)；W285T(SEQ ID NO：28)；L146P(SEQ ID NO：29)；D533S(SEQ ID NO：30)；A194R(SEQ ID NO：31)； G173Q(SEQ ID NO：32)；C477T(SEQ ID NO：33)；K531A(SEQ ID NO：34)；R41I(SEQ ID NO：35)；L119A(SEQ ID NO：36)；K46A (SEQ ID NO：37)；F84Y(SEQ ID NO：38)，T172R-G173Q(SEQ ID NO： 39)；L169K(SEQ ID NO：40)；F189A(SEQ ID NO：41)，N197K (SEQ ID NO：42)，R182K(SEQ ID NO：43)，F189K(SEQ ID NO： 44)，V190K(SEQ ID NO：45)，Q191K(SEQ ID NO：46)和A194K (SEQ ID NO：47)。例如，与野生型CocE相比，T172R突变体CocE 突变体多肽(SEQ ID NO：25)热稳定性增加，37℃ Vmax和Km增 加，熔点(Tm)增加，血浆半衰期增加，可卡因毒性导致的致死率降 低更多，抗可卡因作用持续更久(参见实施例4，实施例7)。
产生的突变体CocE多肽热稳定性增加至少约2kcal/mol。特定 多肽的热稳定性可通过本领域已知的各种方法评估，包括例如圆二 (CD)色谱或差示量热扫描。例如，产生的热稳定性增加可至少约 2.1，至少约2.2，至少约2.3，至少约2.4，至少约2.5，至少约 2.6，至少约2.7，至少约2.8，至少约2.9，至少约3.0，至少约 3.1，至少约3.2，至少约3.3，至少约3.4，至少约3.5，至少约 3.6，至少约3.7，至少约3.8，至少约3.9，至少约4.0，至少约 4.1，至少约4.2，至少约4.3，至少约4.4，或至少约4.5kcal/mol。 设想甚至更高的热稳定性增加。有人认为，能量降低约2.1至约 4.5kcal/mol可以延长室温下蛋白的半衰期约30至1000倍长。
一般来说，与野生型CocE比较，所述突变体CocE的具有热稳 定性增加的酯酶活性。在一些实施方案中，所述热稳定突变体CocE 多肽能具有比野生型CocE低的酯酶活性。例如，热稳定CocE突变 体可以有野生型CocE约10％，约20％，约30％，约40％，约 50％，约60％，约65％，约70％，约75％，约80％，约85 ％，约90％，约95％，或约99％的酯酶活性。在其它实施方案 中，突变体CocE多肽具有与野生型CocE多肽大约相同，或更高的 催化效率。例如，热稳定CocE突变体可以有野生型CocE约100 ％，约110％，约120％，约130％，约140％，约150％，或更 高的酯酶活性。
突变体CocE多肽的变体，如片段、类似物和衍生物也在本发明 范围内。与一个或多个特定基序和/或域或任意大小，例如5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39、40、50、75、100、125、150、200、250、300、 400、500、600、700、800、900、1000、1100、1150和1200个氨基 酸长度相应的CocE多肽片段在本文公开的本发明的范围内。CocE 多肽的分离肽基部分可通过筛选从编码这样肽的核酸相应片段重组 制备的肽获得。此外，片段可使用本领域已知的技术，如常规 Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学合成。例如，本文所述的CocE多 肽可以随意分为所需长度的没有片段重叠的片段，或优选分为所需 长度的重叠片段。
本文公开的本发明另一方面关于CocE多肽的重组形式。在一些 实施方案中，本发明分离的核酸分子包括编码上述CocE多肽的那些 多聚核苷酸。在其它实施方案中，本文公开的本发明的重组多肽由 与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少85％序列一致性(如85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％和99％)的核酸编码，这里表达的重组CocE多肽基 本保留与野生型CocE相同或更多的催化效率，并且与野生型CocE 相比热稳定性增加。
严格性条件下与SEQ ID NO：2的核酸或SEQ ID NO：2的互补 序列杂交的核酸也可用在本发明中。例如低严格性条件、中等严格 性条件或高严格性条件下，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2的互 补序列杂交，并且与野生型CocE相比，还编码与具有热稳定性增加 的酯酶活性的突变体CocE多肽的这种核酸，在本发明的范围内。 优选的核酸是具有全部或一部分SEQ ID NO：2的互补序列的核苷酸 序列的那些。本发明范围内天然CocE基因的其它变体是与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2互补序列具有至少65％(如65％、66％、 67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、 77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％和99％)序列一致性的多核苷酸。严格性条件下与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：2互补序列杂交，或者与SEQ ID NO：2或 SEQ ID NO：2互补序列具有至少65％序列一致性的核酸可通过本领 域已知的技术获得，例如通过天然CocE基因突变，或通过从表达这 样核酸的生物体分离(例如等位基因变体)。
编码突变体CocE融合蛋白的核酸也在本发明范围内。当引入合 适的宿主时，这样的核酸可通过制备表达突变体CocE融合蛋白的构 建物(如表达载体)制备。例如，这样的构建物可通过连接编码融 合在框架中的突变体CocE蛋白和编码另一蛋白的第二多核苷酸制 备，这样所述构建物在合适表达体系中表达得到融合蛋白。
本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架修饰，例 如以改善分子稳定性、杂交等等。本文公开的本发明实施方案中使 用的核酸分子可以是RNA或DNA的形式(例如cDNA、基因组 DNA和合成DNA)。DNA可以是双链或单链，如果单链的可以是 编码(正义)链或非编码(反义)链。编码突变体CocE的多肽的 编码序列可以与要求的核苷酸序列相同，或者也可以是由于遗传密 码的冗余或简并，编码与SEQ ID NOS：3-37多肽相同的多肽的不同 编码序列。
突变体CocE的设计
可设计CocE热稳定性突变，以或者通过降低ΔG(解折叠→折 叠)增加多肽的热力学稳定性，或通过增加解折叠过程的活化自由 能降低解折叠率。ΔG(解折叠→折叠)是解折叠和折叠状态之间自 由能的差异。对于热力学稳定的多肽，ΔG(解折叠→折叠)是负 值。一般来说，ΔG(解折叠→折叠)值越低，折叠状态越稳定。解 折叠过程的活化自由能是折叠状态和解折叠过渡态间的自由能差异 (Steipe，1999)。
热稳定性增加的突变体CocE多肽可以通过各种本领域已知的方 法设计和生成，包括例如合理设计，定向进化(如随机突变，CocE 宿主生物体的突变)，或其组合。定向进化可以通过突变或重组后 或者筛选所需性状，或者采用选择压力获取感兴趣的性状实现(见 例如Lehmann and Wyss，2001)。突变可以或者在感兴趣的特定基因 上，或者通过宿主生物体的突变和选择进行，这样基因工程的特性 被赋予感兴趣的蛋白。优选地，CocE突变体的热稳定性是通过三管 齐下(three prong)的方法人工改造的：(i)通过计算指导的定点突变的 合理设计(见例如实施例3；实施例4)，(ii)CocE基因的随机突变 和高通量筛选(见例如实施例4；实施例15)；和(iii)CocE宿主生 物体突变后再遗传选择(见例如实施例14)。
实现降低ΔG(解折叠→折叠)和/或增加解折叠过程活化自由能 的各种合理设计概念是本领域技术人员已知的(见例如Lehmann， 2001)。例如可以：通过引入另外的二硫键或通过X→Pro突变降低 解折叠状态的熵；通过Gly→Ala取代或通过稳定螺旋大偶极(helix macrodipole)增加螺旋倾向；通过引入另外的盐桥或甚至盐桥网， 或通过基于静电势计算的热稳定性突变，改善带电荷表面残基间的 静电相互作用。
基于适当分子动力学(MD)模拟的分子建模，可以合理引导 定点突变，以设计具有增加的热稳定性的突变体CocE多肽。经典 MD模拟通过采取原子力下许多小的连续时间步骤，使大体系的时 间演化研究成为可能，所述原子力由一组参数化的相互作用函数 (力场)确定，包括键合相互作用(键、角度和二面角)，非键合 范德华相互作用，以及静电相互作用为基础的或净原子电荷。由于 简单力场形式，MD模拟可以进行足够长的模拟时间，给出甚至涉 及超过十万个原子的非常大体系的有意义的总体均值性质。因此， 对于CocE和每个建议的突变体，MD模拟可能会产生模拟多肽在水 中的合理动态平均三维结构。
本文成功施用的一种方法重点是降低多肽的ΔG(解折叠→折 叠)值的热稳定突变的合理设计(见例如实施例3)。这种方法只 需要计算ΔG(解折叠→折叠)，不用对解折叠过渡态的结构和能量 进行更耗时的计算。因此，聚乙二醇化前为增加多肽的热稳定性， 可以使用合理设计程序(如RosettaDesign)中实施的方法，该合理 设计程序利用能量函数评价特定序列对特定折叠，以及Monte Carlo 搜索算法对采样序列空间的适合度。这种方法已知生成热稳定性增 加的其他酶，而催化效率并未降低(见例如Korkegian，2005)。例 如，计算中使用的折叠可对应现有CocE X-射线晶体结构的折叠。
合理设计程序预测可能有更低能量(例如ΔG(解折叠→折叠)值)， 并因此有更高热稳定性的一组修饰氨基酸序列。因此可以使用本文 所述的计算设计，预测可使多肽热稳定而没有催化效率损失的CocE 多肽核心的突变。这种方法最大限度地减少实验测试时间，并大大 增加实验成果的成功。在重复的过程中，预测的热稳定突变可通过 定点突变单独测试，然后结合测试(见例如实施例15)。
定向进化还可以用于生成热稳定CocE突变体。定向进化涵盖了 一系列的实验技术，该实验技术通过突变和重组产生加速的多样性 和适应性，随后筛选理想的性状或采用选择性压力以获得感兴趣的 性状(Lehmann & Wyss(2001)Current Opinion in Biotechnology 12， 371-375)。因此定向进化涉及产生多样性的过程和检测或富集所需性 状的有效筛选或选择方法。定向进化曾成功应用于热稳定蛋白的制 备，多样性的产生通过例如易错PCR技术、饱和突变、DNA重 排、化学诱变及其组合实现。易错PCR用设计随机产生单碱基对突 变的非校正聚合酶和压力条件扩增感兴趣的基因。每一轮后筛选最 佳突变体，用作下一轮突变中的母序列。此技术已被用于生成一些 热稳定蛋白变体，包括丙基内肽酶(Uchiyama ma.，等2000)，β葡糖 醛酸酶(Flores，H.and A.D.Ellington(2002)Journal of Molecular Biology 315，325-337)和家族10木聚糖酶(Andrews等(2004)J Biol Chem 279，54369-79)。在扩增产生更高数量突变的过程中，饱和突 变也扩增感兴趣的基因，但包含通用碱基。这项技术已用于产生嗜 冷酶的热稳定性(Miyazaki等(2000)Journal of Molecular Biology 297， 1015-1026)。DNA改组涉及一组同源序列间一个或多个的重组循 环，以获得特定酶的改善变体。此技术还可与易错PCR联用，易错 PCR得到的最好突变体通过DNA改组结合，以产生新的突变新亚 类。DNA改组已经实施以生成β-葡萄糖醛酸酶的热稳定变体 (Flores，H.and A.D.Elllington(2002)Journal of Molecular Biology 315， 325-337)。化学诱变涉及用将点突变引入序列的化学品，如羟胺、亚 硝胺或硫酸二甲酯处理质粒DNA。用羟胺进行的质粒处理已用于生 成多粘芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶(Lopez-Camacho等(1996) Biochemistry Journal 314，833-838)和萤火虫荧光素酶(White等(1996) Biochemistry Journal 319(Pt 2)，343-350)的热稳定突变体。
CocE宿主生物体突变也可用来产生热稳定CocE突变体。制备 热稳定CocE突变体的简单快速的方法可以通过利用此酶代谢作为其 宿主生物体唯一碳源的可卡因能力而实现。CocE基因最初通过将基 因片段亚克隆到红串红球菌CW25中，从红球菌MB1测序而来，红 串红球菌是无法代谢可卡因，但能够在可卡因酯酶副产物芽子碱甲 酯和苯甲酸酯上生长的细菌(Bresler等(2000)Applied & Environmental Microbiology 66，904-908)。之前证明代谢可卡因副产 物的另一生物体是荧光假单胞菌(MBER)，荧光假单胞菌能与另 一能通过酯酶代谢可卡因的细菌(食酸丛毛单胞菌MBLF)共生。
虽然高效率转化质粒有困难，但这些菌株可以相对容易地用克 隆到合适穿梭载体中的天然CocE基因转化，然后可进行传统的细菌 突变(见例如实施例14)。由于这些细菌通常只会于25-30℃在可 卡因水解产物上生长，所以选择能在37℃有效代谢可卡因的突变体 将预计选择高活性和37℃下稳定的CocE突变体。
细菌接触辐射或化学物质，以制备带有新表型的突变体在本领 域是众所周知的(见例如Maron，D.M.and Ames，BN(1983)Mutation Research 113，173-215)。辐射诱变可以涉及电离和非电离辐射；但 是广泛使用非电离辐射，260nm紫外线辐射作为致死物质是最有效 的。诱变是嘧啶二聚体诱导所致，增加复制过程中错配的可能性。 细胞暴露于预定杀死90-95％细胞群剂量的紫外线辐射，然后在存活 的中寻找突变体。化学诱变包括使用增加复制过程中复制错误的碱 基类似物，如5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤，或使用直接与DNA反应 的物质，如比碱基类似物更高频率诱导突变的羟胺或亚硝基胍。
生成突变体CocE多肽
本发明的实施方案进一步涉及突变体CocE多肽的制备方法。例 如，用指导编码突变体CocE多肽的核苷酸序列表达的核酸载体转染 的宿主细胞可在适当条件下培养，使多肽表达。可收集这些细胞， 裂解和分离蛋白。突变体CocE多肽可以用本领域已知纯化蛋白的技 术从宿主细胞分离，包括离子交换色谱、凝胶过滤层析、超滤、电 泳和用对这种蛋白特异性的抗体进行的免疫亲和纯化(见例如实施 例1)。
例如，突变体CocE多肽已在细胞中表达，可用任何免疫亲和层 析分离。更具体地说，抗CocE抗体可以固定在柱层析基质上，基质 可用于免疫亲和层析通过标准方法从细胞裂解物纯化突变体CocE多 肽(参见例如Sambrook and Russel(2006)Condensed Protocols from Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0879697717)。免疫亲和层析后，突变体CocE 多肽可通过其他标准技术进一步纯化，如高效液相色谱法。在另一 实施方案中，突变体CocE多肽作为含有有利其纯化的亲和标签(例 如Hisx6)的融合蛋白被表达(参见例如实施例1)。
突变体CocE多肽的聚乙二醇化
所述突变体CocE可以是聚乙二醇化的，以增加作用时间、热稳 定性，并降低免疫原型。聚乙二醇化可进一步增强本发明突变体 CocE的热稳定性，通过降低肾清除率、蛋白水解、巨噬细胞摄取和 免疫应答，增加血清半衰期。
聚乙二醇化是乙二醇重复单元(即聚乙二醇，或PEG)连接到 多肽，以降低多肽的免疫原性及其肾清除率的过程(一般参见 (Veronese，FM and Harris，JM(2002b)Advanced Drug Delivery Reviews 54，457-606，Veronese，FM and Harris，JM(2002c)Advanced Drug Delivery Reviews 55，1259-1345，评论PEG化技术)。每个乙二 醇单元可以结合两个或三个水分子，有效增加了肽的大小，并能保 护肽免受免疫应答，酶促降解，和/或快速肾清除。聚乙二醇也可以 抗温度和pH的变化，保持稳定。最终结果是治疗多肽能够在血液中 保持更长时间，并诱导更低的免疫应答(Harris，JM and Chess，RB (2003)Nature Reviews.Drug Discovery 2，214-221)。PEG具有一组独 特的性能，包括没有毒性、抗原性和免疫原性，大量依赖肾清除减 少，高度灵活性和水溶性。它给予与其连接的蛋白这些特征 (Veronese，FM and Harris，JM(2002b)Advanced Drug Delivery Reviews 54，457-606)。
PEG聚合物能够首先被促进共价结合蛋白氨基酸的功能性基团 激活。PEG的末端羟基可以被活性碳酸、活性酯、醛或三氟乙基磺 酸单甲氧基(tresylate)衍生物修饰。PEG可以连接赖氨酸或引入突 变体CocE的半胱氨酸残基。环氧乙烷的重复单元可以构建到许多有 不同长度，分枝或不分枝，并具有各种分子量的构型中。掺入的方 式可包括定点诱变或使用转谷氨酰胺酶的马来酰亚胺衍生物。
PEG是FDA批准用作药品溶剂或基质，所述药品包括注射、局 部、直肠和鼻制剂(Harris and Chess，2003)。聚乙二醇化的药物已批 准用于临床(见例如PEG-干扰素α-2a(Hamidi，M and Tajerzadeh，H (2003)Drug Delivery 10，9-20；PEG-干扰素α-2b(Reddy等(2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54，571-586)。
由于PEG优良的空间动态流动性，PEG聚合物对突变体CocE 表面的修饰保护包被酶免受蛋白水解酶的作用以及免疫系统的识 别，从而降低免疫原性，并延长聚乙二醇化突变体CocE的循环半衰 期。聚乙二醇化方法成功例子包括PEG修饰脂质体(即隐形脂质 体，之所以这样称呼是由于其逃避免疫检测和肾清除，从而显著延 长循环时间的能力(Lasic，DD(1997)Journal of Controlled Release 48， 203-222))，以及聚乙二醇化的天冬酰胺酶，其体内半衰期已由游离 天冬酰胺酶的26小时明显改善到15天(Avramis等(2002)Blood 99， 1986-1994)。另外，本领域公认聚乙二醇化可以明显提高酶热稳定性 (Kazan，D.and Erarslan，A.(1997)Applied Biochemistry & Biotechnology 62，1-13；Efremova等(1998)Biochemistry(Moscow)63， 441-447)，并减少补体系统的激活(Chang等(2005)Bioconjugate Chemistry 16，147-155)。因此，聚乙二醇化技术非常适合改进本发明 的突变体CocE的药理和药物作用(见例如实施例11)。突变体 CocE的聚乙二醇化也可与红细胞包封一起使用。
突变体COCE包封入RBC中
所述突变体CocE可以包封到红血细胞(RBC)中，以增加作用 的持续时间和热稳定性，并降低免疫原性。可卡因正如其迅速穿过 血脑屏障一样，也迅速穿过红细胞质膜，此摄取已在可卡因人静脉 内给药的研究中证实(Javaid等(1978)Journal of Chromatography 15， 105-113)。此外，RBC中可卡因浓度超过血浆中的浓度(Javaid等 (1978)Journal of Chromatography 15，105-113)。因此，RBC包封可用 来保护热稳定形式的CocE不被清除。
由于其作为药物载体的可能应用，红细胞已被广泛开发(Wang 等(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54，547-570)。作为人体最 大量的细胞，红细胞作为药物载体起作用有着无与伦比的优势。第 一，红细胞是完全生物相容和生物可降解的，尤其是自体细胞用于 携带药物时。另外，红细胞两面凹的盘型形状为其提供最高的表面 体积比(1.9x104cm/g)(Guyton，AG & Hall，JE(1996)Textbook of Medical Physiology，425-433)，可用于药物包封。RBC包封还防止内 源性因子使携带的药物失活，并保护生物体免受被包封药物的毒性 作用(Wang等(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54，547-570)。 此外，红细胞包封避免出现不想要的外部物体引发的免疫应答(即 抗原性和免疫原性)(Wang等(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54，547-570)。并且红细胞与其他合成载体相比，具有更长 的循环半衰期。例如，体循环中红细胞的正常寿命据报道为约120 天(Guyton，AG & Hall，JE(1996)Textbook of Medical Physiology，425- 433)。
突变体CocE在红细胞中的包封可以根据本领域已知的一些技 术，包括电穿孔、药物(如伯氨喹)诱导的内吞，以及渗透(见例如 Green，R.and Widder，KJ(1987)Methods In Enzymology，Vol.149)。 这些方法可以包括膨胀并破坏细胞膜，释放主要包括血红蛋白还有 细胞骨架的内容物，包埋药物，然后重新密封膜，得到杯形、球 型、粉红色或白色RBC(通常称为“RBC血影”)。
或者，膜穿透肽可用来包封红细胞中的突变体CocE(见例如实 施例12)。膜穿透肽或蛋白转导域(PTD)肽是包括TAT、LMWP 和其他精氨酸丰富的阳离子肽的小(通常由10-15个氨基酸残基组 成)肽家族(一般参见Dietz，GPH and Bahr，M(2004)Molecular Cell Neurosciences 27，85-131)。本领域已知，通过将PTD共价键连接到 几乎任何类型的分子种类，包括蛋白(MW＞150kDa；已检测超过 60个不同的蛋白(Dietz，GPH and Bahr，M(2004)Molecular Cell Neurosciences 27，85-131)和纳米载体(如脂质体)，PTD可以运送 连接的种类穿过所有器官类型包括大脑的细胞膜(Schwarze等(1999) Science 285，1569-1572)。PTD既无毒，也无免疫原性(Schwarze等 (1999)Science 285，1569-1572)，PTD介导的细胞内在化并没有引起 红细胞细胞膜的微扰或变化(Suzuki等(2002)Journal of Biological Chemistry 25，2437-2443)。PTD已成功地用于蛋白质载入红细胞，得 到具有不变的物理和化学属性的红细胞(参见例如Li等(2003) American Pharmaceutical Review 6，22-26)。因此，共轭到突变体 CocE的PTD肽能够促进红细胞包封。红细胞包封也可以使用聚乙 二醇化的突变体CocE进行。
稳定突变体CocE
本发明的另一个方面涉及使用底物、产物和/或可卡因的抑制 剂，使突变体CocE多肽稳定。本文公开的实施方案中有用的底物 和产物包括，例如但不仅限于可卡因；可卡因衍生物，例如(-)-可卡 因、(+)-可卡因、托派可卡因等；硫代可卡因衍生物，例如硫代-1， 硫代-2等；酰胺可卡因衍生物；维他命原-可卡因衍生物，如PABA 可卡因，烟酸可卡因等；苯甲酸；4-硝基苯基乙酸酯(4NPA)；4- 硝基酚(4NP)等。典型抑制剂包括但不限于底物类似物，如磷酸基氟 代可卡因、O-磷酸基可卡因、O-甲基磷酸基可卡因、S-甲基磷酸基 可卡因等；产物类似物，如芽子碱和芽子碱衍生物，例如硼酸芽子 碱甲酯类似物；苯基硼酸；苯甲酸衍生物，如4-叔丁基苯甲酸、1- 萘酸、2，3，4-三甲基苯甲酸甲酯等。其他化学品包括，例如但不仅限 于SDS、甘油、PEG等。
优选地，底物、产物和/或抑制剂稳定本文公开的多肽的热变 性。在一些实施方案中，底物、产物和/或抑制剂也防止凝胶电泳中 热诱导聚集。一般来说，使用底物、产物和/或抑制剂导致稳定性和/ 或抑制分别增加至少10％。例如增加可以是约15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％、95％、100％、120％、150％、200％、300％，或 甚至500％或更高。因此，底物、产物和/或抑制剂很适合稳定本文 公开的突变体CocE多肽(见例如实施例20)。
在一个实施方案中，小分子用来热稳定本文公开的突变体CocE 多肽。在优选实施方案中，这样的分子不占据该多肽的活性部位。
在一些实施方案中，本文公开的多肽可以与稳定分子共同加 入。在其他实施方案中，在制备过程中，该稳定分子可用于稳定所 述多肽。在其他实施方案中，所述稳定分子可以用来稳定突变体 CocE多肽，直至可以使用。
治疗方法
本发明另一方面涉及抗可卡因疗法的催化降解方法。通过将热 稳定的、酯酶活性的突变体CocE多肽施用于对其有需要的受试者， 提供可卡因诱导疾病的预防和治疗的疗法。本发明的可卡因酯酶变 体由于其比已知天然生成的CocE热稳定性增加和血浆半衰期更长， 所以有重要临床价值。正是这种热稳定性和血浆半衰期的增加，能 够对可卡因毒性危及生命的症状做出更快速得多的反应，使得本发 明CocE变体有别于其他的治疗选择。
需要治疗的决定通常会由符合可卡因诱导疾病的病史和体检进 行评估。可卡因诱导的疾病包括但不仅限于，可卡因过量、可卡因 毒性和可卡因依赖和/或成瘾。例如，可卡因毒性的诊断可以包括惊 厥、癫痫大发作、心脏骤停、心肌梗死，心律失常、血压升高、中 风、药物性精神病、夹层动脉瘤以及增加的心肌耗氧需求。作为另 一个例子，关于可卡因依赖和/或成瘾，戒断症状包括主观感觉轻微 到严重的烦躁不安、抑郁、焦虑或易怒。确定需要治疗的受试者包 括那些有诊断的可卡因诱导疾病，有可卡因诱导疾病迹象的那些， 以及已经接受治疗、正在接受治疗或将治疗可卡因诱导疾病的受试 者。所述受试者优选动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物和禽 鸟，更优选马、牛、猫、狗、羊、猪和鸡，最优选人。
本文所述突变体CocE多肽的有效量是通常可以减少可卡因毒性 或可卡因诱导疾病的严重程度的量。严重程度的降低包括例如症 状、生理指标、生化指标或代谢指标的停止(arrest)或减少。当用 于本发明的方法时，本文描述的治疗有效量的突变体CocE多肽可采 用纯化的形式，或存在这种形式的药学可接受的盐形式和带或不带 药学可接受的赋形剂。例如，本发明的所述突变体CocE多肽可以以 适用于任何医疗的合理效益/风险比，并以足以大大减少受试者血液 和/或组织中可卡因浓度的量施用。
突变体CocE多肽的毒性和疗效可通过在细胞培养物和/或实验 动物中，测定LD50(50％群体的致死剂量)和ED50(50％群体的治 疗有效剂量)的标准药学方法确定。毒性和治疗效果之间的剂量比 是可以表达为LD50/ED50比的治疗指数，优选大的治疗指数。
可与药学可接受的载体合用制得单剂量形式的突变体CocE多肽 的量将随治疗的宿主和特定给药模式而变化。本领域技术人员会理 解，每种剂量形式单个剂量中含有的药物单位含量本身并不需要构 成治疗有效量，因为通过施用若干单个剂量能达到所需治疗有效 量。药物可单次或经一段时间疗程施用。例如，药物可以每天、每 周、每两周或每月施用。对于一些疾病，治疗可能会从几个星期延 长到几个月，或甚至一年或更长时间。
任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素， 包括正在治疗的可卡因诱导疾病和可卡因诱导疾病的严重程度；使 用的突变体CocE多肽的活性；使用的具体组合物；患者的年龄、体 重、健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；突变体CocE多 肽的血浆半衰期；使用的突变体CocE多肽的排泄率；治疗期限；与 采用的突变体CocE多肽组合或巧合一起使用的药物；以及医学领域 众所周知的类似因素(参见例如Koda-Kimble等(2004)Applied Therapeutics：The Clinical Use of Drugs，Lippincott Williams & Wilkins， ISBN 0781748453；Winter(2003)Basic Clinical Pharmacokinetics，4th ed.，Lippincott Williams & Wilkins，ISBN 0781741475；Sharqel(2004) Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics，McGraw-Hill/Appleton & Lange，ISBN 0071375503)。熟练医生会理解，用于本文公开的本 发明实施方案的突变体CocE多肽的总每日使用将由主治医师在良好 医疗判断的范围内决定。
本文所述的突变体CocE多肽也可与其他治疗形式合用。因此， 除了本文所述的治疗方法，还可以向受试者提供其他已知对特定可 卡因诱导疾病有效的疗法。
本文所述的突变体CocE多肽可以通过任何常规方式，使用一种 或多种药学可接受的载体和/或赋形剂配制(参见例如Gennaro(2005) Remington the Science and Practice of Pharmacy 21st ed.Lippincott Williams & Wilkins，ISBN 0781746736)。这种制剂将含有治疗有效量 的突变体CocE多肽，优选纯化形式，和适合量的载体，以便提供适 合施用于受试者的形式。所述制剂应适合给药方式。本发明使用的 CocE多肽可以通过已知用一些途径施用于受试者的方法配置，所述 途径包括但不仅限于胃肠外、肺、口服、局部、皮内、肌肉内，腹 腔内、静脉内、皮下、鼻腔、硬膜外、眼、口腔和直肠。突变体 CocE多肽还可以与一个或多个本文公开的物质，和/或其他生物活 性或生物惰性物质合用。这种生物活性或惰性物质可以是液体的， 或与药物机械连接，或通过离子、共价的、范德华、疏水、亲水或 其他物理力连接所述药物。
本文所述的突变体CocE多肽可胃肠外施用，包括静脉注射、肌 肉注射、皮下和腹腔注射。通常用于小药物分子胃肠外给药的赋形 剂，包括增溶剂、渗透剂、缓冲剂和防腐剂，也可包括在生物分子 制剂中。当进行生物分子配置和给药时，包括抗聚集和抗吸收的物 质，如表面活性剂和白蛋白，可使稳定性增加更多，并降低活性生 物分子与界面相互作用的风险，该相互作用可能会导致解折叠、聚 集，和/或沉淀。突变体CocE多肽可冻干，增加保存期间的稳定 性，并在胃肠外给药前重新处理。
优选地，突变体CocE多肽是聚乙二醇化的，因此提供了增加的 稳定性和减少的免疫原型(见以上内容)。
大分子如突变体CocE多肽的肺部给药是相对容易的非侵害性循 环系统给药，实现全身分布(见例如Cryan(2004)AAPS J.7(1) article 4，E20-41，提供肺部给药技术的综述)。肺部给药的优点包括 非侵害性，吸收表面积大(～75m2)，薄(～0.1至0.5μm)的肺泡上皮可 迅速吸收，没有首过代谢，降低蛋白水解作用，迅速起效和高生物 利用度。可用于输送本文所述生物分子的各种吸入给药装置，如定 量吸入器、喷雾器和干粉吸入器，为本领域所知(如AErx(Aradigm， CA)；Respimat(Boehringer，Germany)；AeroDose(Aerogen Inc.， CA))。干粉吸入装置尤其优选基于蛋白药物的肺部给药(例如 Spinhaler(Fisons Pharmaceuticals，NY)；Rotohaler(GSK，NC)； Diskhaler(GSK，NC)；Spiros(Dura Pharmaceuticals，CA)；Nektar (Nektar Pharmaceuticals，CA))。
可以配制控释(或缓释)制剂，延长突变体CocE多肽活性，并 减少给药频率。控释制剂还可用于影响起效时间或其他特点，如药 物的血液水平，并因此影响副作用的出现。控释制剂可以被设计成 最初释放产生所需治疗效果量的突变体CocE多肽，并逐步和不断释 放其他量，以维持较长一段时间内治疗效果的水平。为保持体内接 近恒定水平的突变体CocE多肽，药物可以从剂型以取代正在代谢和 /或排出体外的药物量的速率释放。药物的控释可以被各种诱导物刺 激，如pH值改变，温度变化，酶、水或其他生理条件或分子。
控释系统可以包括，例如可以以类似用于输送胰岛素或化疗药 至特定器官或肿瘤的方式，用于给药的输液泵。本发明的药物可通 过本领域普通技术人员熟知的其他控释方式或给药装置给药，包括 例如羟丙甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系 统、储库、多层包衣、微粒、脂质体、微球等等，或任何上述的组 合以提供各种比例的理想释放分布。药物控释给药的其他方法对本 领域技术人员而言将是已知的，并在本发明的范围内。
突变体CocE多肽可包封，并以各种载体给药系统给药。基于载 体的生物分子药物给药系统可以：提供细胞内给药；调整生物分子/ 药物释放率；增加到达其作用部位的生物分子的比例；改善药物输 送到其作用部位；允许与其他药物或赋形剂共沉积；改善药物体内 稳定性；通过降低清除，延长药物在其作用部位的停留时间；减少 药物对非靶组织的非特异性给药；减少药物造成的刺激；减少高初 始剂量药物导致的毒性；改变药物的免疫原性；减少给药频率，改 善产品口感；和/或提高产品存放期。
本文所述突变体CocE多肽的载体给药系统的例子包括微球(见 例如Varde & Pack(2004)Expert Opin.Biol.4(1)35-51)，水凝胶(通 常见Sakiyama等(2001)FASEB J.15，1300-1302)，聚合物植入剂(通 常见Teng et al(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，3024-3029)，智 能聚合物载体(通常见Stayton等(2005)Orthod Craniofacial Res 8， 219-225；Wu等(2005)Nature Biotech(2005)23(9)，1137-1146)和脂质 体(见例如Galovic等(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15，441-448；Wagner等 (2002)J.Liposome Res.12，259-270)。优选地，突变体CocE多肽包 封在RBC中(见上文；实施例12)。
筛选方法
本发明另一方面涉及热稳定突变体CocE多肽的生成、识别和纯 化的筛选方法。一般来说，突变体CocE多肽可根据上述方法进行最 初设计。这种设计的多肽可随后筛选优选特征，如水解效率的保 持，增加的热稳定性，增加的血浆半衰期，和/或减少的抗原性。另 外，随机突变体CocE多肽可以筛选所期望的特性。
筛选热稳定突变体的检测方法包含了各种各样的技术。下面是 典型的通用流程总述。编码突变体CocE多肽(例如通过合理设计、 随机突变或宿主诱变产生)的核酸被转化到合适的表达宿主中(例 如大肠杆菌细胞，如大肠杆菌BL21 Gold(Stratagene))，根据标准 流程诱导突变体多肽的表达(如通过IPTG)。表达在生成最佳蛋白 表达的温度下(例如CocE为16℃，见例如实施例1)进行预先确 定的一段时间(例如无论何处从30分钟到24小时或更长)。或 者，表达是在升高的温度下进行(例如，升高的温度可以是至少约 35℃，至少约36℃，至少约37℃，至少约38℃，至少约39℃， 至少约40℃，或甚至更高)。优选地，突变体CocE多肽表达的升 高的温度是37℃。此温度附近，野生型CocE多肽几乎完全分配在 包涵体中。筛选含有所表达的突变体多肽的细胞，寻找存在的热稳 定CocE变体。
筛选存在的CocE热稳定性变体一般涉及或者直接测量培养细 胞，或细胞裂解物，或细胞破碎后分离突变体CocE多肽。细胞破碎 可包括渗透压冲击、化学裂解、超声处理和/或匀浆，突变体多肽的 分离可通过多种方法，包括或者直接吸附到基质或通过使用抗可卡 因抗体或融合蛋白特异性捕捉系统亲和吸附获得。吸附的适合基质 包括硝化纤维素纸、过滤器、未处理或亲和处理的微量滴定板、琼 脂糖或琼脂糖树脂，和/或亲和涂覆的尖端(affinity-coated tips)。
培养细胞或分离的突变体多肽的酯酶活性可随后在一个或多个 温度测量，以确定突变体的热稳定性。进行活性分析的温度决定热 稳定性检测的程度。因此，虽然最终的突变体将优选解链温度45℃ 或更高(正如例如圆二色谱确定的)，但通常情况下，45℃初筛将 无法找到活性酶。相反，可进行诱变和随后增加温度下筛选的几个 循环，以获得热稳定性突变体。因此，初筛可以在30℃进行，经过 进几轮循环的诱变，筛选可以逐步增加温度进行(例如34℃、 37℃、40℃、42.5℃、45℃等)，直到获得合适热稳定性的突变 体。增加的温度在所述过程中通过经验确定，并受特定温度下采样 数和所产生突变体的确定Tm影响。
虽然没有义务这样做，但不希望被理论约束，本文下面为被认 为是本文所述各种实施例突变体CocE多肽解链的机制解释。CD光 谱数据表明，可卡因酯酶和突变体的CD解链是不可逆的，因为冷 却到0度不会重新形成初始光谱(参见例如实施例19)。虽然热力 学参数无法确定，但CD谱可用于比较确定是否突变体更稳定或更 不稳定，是否它们有不同的二级结构或聚集性质。据认为，本文所 述CocE多肽通过中间步骤解链，即所述多肽经历2步解链过程。
酯酶活性检测可以用不同的方法进行，其中底物与特异性检测 系统有关联。用于确定酯酶活性的适当底物可包括可卡因，含氚(3H) 可卡因，可卡因底物衍生物如硫代可卡因衍生物(见例如图6)， 和/或报道有通常酯酶活性的底物，如4-硝基苯基乙酸酯。该检测系 统可与底物特异性直接偶联，例如：未修饰可卡因的断裂可通过监 测可卡因在240nm的吸收(见例如实施例4)，或通过监测酸性苯 甲酸产物蓄积导致的pH值变化(见例如实施例15)，或使用可卡 因适体(see e.g.，Stojanovic，M.N.，de Prada，P.& Landry，D.W.(2001) J Am Chem Soc 123，4928-4931；Stojanovic，M.N.& Landry，D.W. (2002)J Am Chem Soc 124，9678-9679)通过监测可卡因降解的荧光变 化(见实施例15)进行检测；含氚(3H)可卡因的裂解可通过酸化， 以及色谱分离检测含氘苯甲酸产物而测定(见实施例1和15)；可 卡因衍生物如硫代可卡因的裂解可通过加入Ellman试剂并测定 412nm吸光度变化(见例如实施例15)，或通过加入沉淀巯基的反 应重金属并可视化，检测活性巯基基团进行监测；4-硝基苯基乙酸 酯的裂解可监测420nm吸光度变化而检测(见例如Halgasova，N.等 (1994)Biochem J 298 Pt 3，751-755；O’Conner，C.J.& Manuel，R.D. (1993)J Dairy Sci.76，3674-3682)。
通过上述方法或类似高通量筛选分析鉴别的突变体CocE多肽， 可以使用本文所述的体外方法进一步评估(例如Kcat和Km值，37 度的稳定性，解链温度(Tm)，内毒素水平，降解血浆中可卡因的能 力)。具有热稳定酯酶活性和/或降低的免疫原性的突变体CocE多 肽，可使用本文所述的体内方法进一步评价(例如效价，作用期 限，重复给药的作用，和/或免疫学评价)。优选地，首先检测突变 体CocE多肽降低可卡因毒性的大小(见例如实施例5、7和8)， 那些至少降低约5-10倍毒性的突变体可以进一步对作用时间过程进 行评价(例如见实施例6)。候选突变体CocE多肽可以进一步通过 例如聚乙二醇化和/或包封在RBC中稳定，并通过上述方法再评 价。
已经详细描述了本发明，显而易见地，修改、变化或等同的实 施方案是可能的，并未偏离所附权利要求定义的本发明的范围。此 外，还应该理解，本公开中的所有实施例作为非限制性例子提供。
实施例
提供下列非限制性实施例，以进一步说明本文公开的各种实施 方案。本领域技术人员应理解，本发明人已经发现的现有方法之后 的所述实施例中公开的技术在本发明的实践中起到很好的作用，因 此可以被视为构成其实践模式的实施例。然而，本领域技术人员根 据本公开，明白公开的具体实施方案中可做许多变化，仍然获得了 相同或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1：CocE表达
建立CocE表达和纯化的方法，在此CocE作为带有羧基末端 Hisx6标记的融合蛋白在大肠杆菌中表达。可卡因酯酶基因亚克隆到 大肠杆菌表达载体pET-22b(+)中，含有C-末端组氨酸标记的高水平 可卡因酯酶，通过23度下加入IPTG诱导。所述重组蛋白累积到大 约总蛋白的10-15％。CocE在钴螯合柱(TalonTM Clontech)或镍螯合 琼脂糖柱(Pierce)，通过Hisx6标记富集。洗脱的蛋白通过SDS- PAGE和考马斯亮蓝染色，纯度大约95％，随后用离子交换层析柱 FPLC(Q-Sepharose)，使用氯化钠梯度溶解。单峰洗脱的所述蛋白由 SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色指示，纯度约为99％(见例如图 3)。
酶活性通过两种分析测定：放射配体活性分析，其中含氚可卡 因被水解，之后酸化后通过色谱法从含氚盐酸可卡因分离含氚苯甲 酸产物；以及如Turner等(2002)Biochemistry 41，12297-12307所述 类似条件下的分光光度分析。可卡因独特的吸收光谱(240nm的消 光系数为6.7L/mmol/cm)可观察酶裂解后其余的可卡因。可卡因的 最初线性衰变率，相当于速度，在SpectraMax 190读板仪 (Molecular Devices)，使用SOFTmax Pro软件(v1.13)测定。反应 通过加入150μL 2x酶溶液到150μL 2x可卡因溶液中引发。最终 CocE浓度范围为100ng/mL至20ng/mL。最终可卡因浓度如下： 250、126、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91和1.95μM。对于所有酶 的动力学，缓冲液是磷酸盐缓冲液，pH值7.4。初步速率适用于米 氏方程，kcat和Km为可调参数(GraphPad；PRISM，v4)。
正如使用可卡因光度法分析测定的，纯化的野生型CocE多肽水 解可卡因，Kcat大约500min-1以及Km大约2μM，与先前报道的 值一致(见例如Turner等2000)。
这样的表达方法可用于本文所述的突变体CocE多肽。
实施例2：先体外后体内COCE血浆活性
使用可卡因酯酶后可卡因水平的先体外后体内测定在人血浆(密 歇根大学医院血库)中进行。可卡因来自美国国立药物滥用研究所 (National Institute of Drug Abuse，Bethesda，MD，USA)。可卡因溶解 在无菌水中。试验开始前，等分(3ml)人血浆37℃水浴维持10分 钟，试验期间也维持在37℃。水浴平衡血浆后，可卡因加至终浓度 为300μM，涡旋30秒。除去血浆样品，并放在含有内标和饱和氟 化钠溶液的微量管里，以防止进一步的可卡因代谢。取出第一次血 浆样本(仅可卡因)后，立即加入0.05mg/ml CocE或溶剂CocE， 并涡旋。加入CocE后，收集1、2、4、6、8、10、15、30、45、60 和120分钟的血浆样本。使用高效液相色谱串联质谱法测量可卡因 的水平。
使用带四级泵和配置10μl进样环的自动进样器的Surveyor HPLC system(ThermoElectron Corp.，Franklin，MA)进行液相色谱。使 用带有相应保护柱(Waters Corp.，Milford，MA)的Phenomex C18 3μm 的30×4.6mm柱进行分离，流速为600μl/min。溶剂A为0.1％甲酸 溶液，溶剂B为含0.1％甲酸的乙腈(高纯度级；Burdick and Jackson，Muskegon，MI)。可卡因使用3分钟快速梯度(ballistic gradien)和内标，共洗脱2.3分钟。
对于质谱检测和定量，在正离子、选择反应监测模式中，使用 配备lonMax电喷雾电离源(ThermoElectron Corp.，Franklin，MA)的 Finnigan TSQ Quantum Ultra AM三重四级杆质谱仪。氮气为雾化 气，氩气为碰撞气。优化气体流速、喷雾电压和碰撞能量。用50 nM氘代可卡因(可卡因D3)为未处理血浆样本的内标，测定可卡因的 校准曲线。未知样本也掺加可卡因D3。所有样本重复评价三次。用 Xcalibur版本1.4的Quan Browser程序(ThermoElectron Corp.， Franklin，MA)软件分析标准曲线和未知样本。以标准浓度函数的可 卡因峰面积/内标面积比，加权因子1/x，使用线性回归，构建标准 曲线。标准曲线拟合值接受大于0.99的值，重复样本的RSD值为0- 10％。
结果表明，当CocE与可卡因在人血浆中简单混合时，CocE能 非常迅速地降解可卡因(见例如图4)。第一时间点显示加入可卡 因酯酶或酯酶溶剂前可卡因的浓度。酯酶处理前，可卡因水平相 似，但施用可卡因酯酶1分钟内，与溶剂处理的血浆样本相比，可 卡因水平降低至少100倍至大约2μM。酯酶处理的血浆样本中可卡 因水平继续下降，至2分钟时间点时跌至1uM以下。
所述酶的治疗效能通过单次静脉注射CocE后，产生毒性作用所 需的可卡因的增加剂量表示。大鼠和人血清中，野生型酶表现出对 先体外后体内可卡因降解的快速动力学。CocE的两种非活性突变体 未能保护大鼠免受可卡因的毒性作用，这证实了保护作用是由于水 解活性。此外，CocE没有改变WIN-35065-2的致死率，WIN- 35065-2是缺少CocE靶向的苯甲酰基酯部分的可卡因类似物。CocE 的体内和先体外后体内的表征支持所述酶作为合适的人解毒剂的作 用。
实施例3：预测的热稳定性突变体CocE
本文所述的突变体CocE的合理设计是根据分子动力学(MD) 模拟。CocE的计算模型使用公开的野生型CocE晶体结构构建(见 例如图2)。这样的模型可以用来确定增加蛋白理论解链温度，而 不破坏活性部位结构的某些氨基酸修饰。经典MD模拟能通过一组 参数化相互作用函数(力场)确定的原子力下，采用许多小的连续 时间步骤，研究大体系的时间演化，包括键相互作用(键，角度和 二面角)，非键合范德华相互作用，以及静电相互作用为基础的或 净原子电荷。由于所述简单力场形式，MD模拟可进行足够长的时 间，给出甚至是包括超过10万个原子的非常大体系的有意义的总体 平均性质。因此，对于CocE和每种提议的突变体，MD模拟将得到 水中模拟多肽的合理动态平均三维结构。
基于细菌可卡因酯酶(CocE)的X-射线晶体结构(PDB code 1JU3)(Larson等(2002)Nature 9，17)，建立与适合计算机建模其热动 力学稳定性的(-)-可卡因结合的CocE的完整3D模型。为增加CocE 的热稳定性，用RosettaDesign程序(Kuhlman and Baker(2000)PNAS 97，10383)实施计算方法，所述程序能够预测特定折叠内的热稳定性 突变，同时最小化可能结构性破坏活性位点结构或淬灭其柔性的骨 架中任何位移。RosettaDesign程序中实施的方法使用能量函数，评 价特定序列对特定折叠，以及Monte Carlo搜索算法对采样序列空间 的适合度。其他研究人员已成功地将类似方法用于提高酶的热稳定 性，而未减少催化效率(Korkegian等(2005)Science 308，857)。非标 准残基原子的部分原子电荷通过使用Amber7(或8)程序包(Case， 2002)的Antechamber模块实施的标准RESP流程计算。使用 RosettaDesign程序的计算建模允许预测计算具有低能量，因此热稳 定性增加的一组CocE突变(见例如表2)。对于本实施例，计算只 考虑与可卡因底物分子距离6-25的氨基酸残基的可能突变。
计算稳定CocE约2.1至约4.5kcal/mol的鉴定的单个突变CocE 多肽包括：L163V(SEQ ID NO：3)；V121D(SEQ ID NO：4)；S167A (SEQ ID NO：5)；Q123E(SEQ ID NO：6)；V225I(SEQ ID NO：7)； I218L(SEQ ID NO：8)；A310D(SEQ ID NO：9)；A149S(SEQ ID NO： 10)；S159A(SEQ ID NO：11)；S265A(SEQ ID NO：12)；S56G(SEQ ID NO：13)；W220A(SEQ ID NO：14)；T122A(SEQ ID NO：15)； S140A(SEQ ID NO：16)；F189L(SEQ ID NO：17)；A193D(SEQ ID NO：18)；T254R(SEQ ID NO：19)；N42V(SEQ ID NO：20)；V262L (SEQ ID NO：21)；L508G(SEQ ID NO：22)；Y152H(SEQ ID NO： 23)；V160A(SEQ ID NO：24)；T172R(SEQ ID NO：25)；Y532F (SEQ ID NO：26)；T74S(SEQ ID NO：27)；W285T(SEQ ID NO： 28)；L146P(SEQ ID NO：29)；D533S(SEQ ID NO：30)；A194R (SEQ ID NO：31)；G173Q(SEQ ID NO：32)；C477T(SEQ ID NO： 33)；K531A(SEQ ID NO：34)；R41I(SEQ ID NO：35)；L119A(SEQ ID NO：36)；K46A(SEQ ID NO：37)；和F84Y(SEQ ID NO：38)。
表2：使用RosettaDesign程序的一致性方法计算建模的总结
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 一致性突变 能量变化 (kcal/mol) 163 163 163 163 163 163 163 163 163 163 L163V -4.5 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 V121D -3.9 167 167 167 167 167 167 167 167 167 167 S167A -3.9 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 Q123E -3.8 225 310 310 225 225 225 225 310 225 218 V225I -3.6 218 225 218 218 218 218 218 225 218 225 I218L -3.5 310 218 225 310 310 310 310 218 310 152 A310D -3.4 149 149 152 149 149 149 149 149 149 310 A149S -3.3 159 159 140 159 159 159 159 159 159 149 S159A -3.3 189 265 149 265 265 265 265 265 189 265 S265A -3.3 265 140 265 56 56 56 56 220 265 159 S56G -3.2 56 220 159 220 220 220 220 122 56 220 W220A -3.2 220 122 220 122 122 122 122 140 220 56 T122A -3.1 122 189 122 140 140 140 140 189 122 122 S140A -3.1 140 193 189 189 189 189 189 193 140 140 F189L -3.1 254 42 193 193 193 193 193 42 254 189 A193D -3.1 262 262 42 254 254 254 254 254 42 193 T254R -3.1 508 508 262 42 42 42 42 262 262 262 N42V -3.0 152 152 508 262 262 262 262 508 508 508 V262L -3.0 160 160 198 508 508 508 508 152 152 198 L508G -2.9 74 198 160 152 152 152 152 160 160 254 Y152H -2.9 172 74 74 160 160 160 160 198 198 74 V160A -2.8 193 172 172 198 198 74 198 74 172 160 T172R -2.8 532 532 532 532 74 172 74 172 74 172 Y532F -2.7 146 146 56 74 172 532 172 532 193 532 T74S -2.7 285 285 285 172 532 146 532 146 532 285 W285T -2.6 533 290 146 285 146 285 146 285 285 290 L146P -2.6 173 254 533 146 285 533 285 533 146 146 194 533 173 533 533 173 533 173 533 533 D533S -2.5 477 56 194 173 194 194 173 194 173 173 A194R -2.4 531 173 200 194 200 290 194 200 194 194 G173Q -2.4 42 194 477 200 290 477 200 290 200 200 C477T -2.4 119 200 531 290 477 531 477 477 290 477 K531A -2.4 200 477 305 477 531 200 531 531 477 531 41 531 41 41 41 41 41 41 531 42 R41I -2.2 46 41 119 119 119 119 119 119 41 119 L119A -2.2 84 119 46 46 173 46 46 46 119 41 K46A -2.1 305 46 84 84 46 84 84 56 46 46 F84Y -2.1 478 57 158 478 84 478 305 84 84 57 57 84 307 57 478 57 478 307 478 84
87 478 478 142 57 87 57 478 57 158 142 87 57 263 87 142 87 57 142 478 263 142 142 307 142 263 142 142 263 142 307 263 263 78 263 307 263 263 307 263 78 307 78 257 307 78 307 78 78 78 257 78 257 531 48 257 78 257 257 257 290 257 290 49 78 49 257 49 49 49 291 201 49 201 257 305 201 201 201 201 49 49 201 305 45 291 290 412 305 307 176 291 291 412 49 176 291 291 412 291 45 305 412 291 201 45 49 176 291 176 54 176 176 176 305 54 176 45 45 305 406 45 254 45 291 406 45 413 176 45 50 54 45 413 176 50 54 54 413 54 406 54 54 54 406 305 54 406 50 413 50 406 50 406 406 50 406 406 50 50 50 50
实施例4：T172R和S159A突变体CocE的动力学参数
测试野生型CocE以及T172R和S159A突变体CocE多肽的催 化效率。
CocE定点突变(QuickChangeTM，Invitrogen)生成S159A(SEQ ID NO：11)突变CocE体多肽。除非另有说明，用于生成S159A的克 隆与表达技术与实施例1中相同。CocE基因在含有所需特定突变的 引物(Integrated DNA Technologies，Inc.)存在下，通过聚合酶链反应 (PCR)扩增。特定突变亚克隆回到表达质粒中，测定这些质粒的 核苷酸序列，证实所述突变的存在。
突变体T172R使用含有特定T172R突变的5′和3′引物，以及 另外的易于检测突变基因的Sac II限制酶切位点，使用重叠PCR制 得。引物对CocE 20-5’F-Nde I(5’GATATACATATGGTGGACGGGA ATTAC 3’)和T172R-3’R(5’CAGACCTCGACGTGATGAGCCCGCG GCCTATGAGAGCTGACCAGC 3’)以及CocE-1800-3’R(5’GTGGT GCTCGAGTCGCTTGATAATCG 3’)以及T172R-5’F(5’GCTGGTCA GCTCTCATAGGCCGCGGGCTCATCACGTCGAGGTCTG 3’)使用 高保真Pfu酶(Stratagene)，退火温度55℃，PCR扩增。合并得到的 PCR产物，重新扩增，产生编码T172R突变的全长CocE基因。该 基因用Nde I和Xho I消化；亚克隆到表达载体中，并全部测序，以 验证存在基因突变，而且没有另外的PCR拷贝错误突变。
含有所述突变的质粒转化到大肠杆菌BL21细胞中，用Ni-琼脂 糖纯化IPTG诱导的酶。随后测试表达蛋白的酶活性和37℃热稳定 性。酶活性采用实施例1中所述的分光光度分析测量。热稳定性也 通过两种野生型和突变体37℃下预孵育各种时间，由分光光度分析 检测。此外，野生型和T172R突变体的热不稳定性的性质在变性和 非变性条件下，由聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。简而言之，0.1mg/ml 突变体和野生型酶37℃下孵育各时间点，冷却至4℃，与含有β-~ 巯基乙醇的SDS上样染料混合，在10％SDS-PAGE凝胶(变性条 件)或天然10％聚丙烯酰胺凝胶(非变性条件)，4℃跑电泳。凝 胶用10％甲醇、7％乙酸固定30分钟，然后用Sypro-Ruby蛋白凝胶 染料(Molecular Probes，Invitrogen)染色3小时。蛋白染色用 AlphaImagerTM 3400(Alpha Innotech)在紫外光下显色。最后，野生型 和T172R突变体的确切解链温度使用Windows的JASCO V500/FP- 750分析程序驱动的JASCO-810分光旋光计，通过圆二色性确定。 CD光谱以毫度测量，并对PBS缓冲剂归一化。
分光光度法结果表明，与野生型CocE比较，T172R室温下 Vmax和Km增加，37℃下Vmax和Km大大增加(见例如表3，图 5)。事实上，37℃下T172R的Vmax和Km能与室温下野生型 CocE的Vmax和Km相比。S159A突变体CocE显示与野生型CocE 相比，37℃下Vmax和Km略有增加，但室温下Vmax和Km降 低。不考虑孵育温度，变性条件下的电泳(图6a)都显示约 65000Da的野生型和T172R的单个蛋白带，这表明蛋白降解未充分 说明热不稳定性的机制。37℃下，孵育前非变性凝胶(图6b)显示 野生型酶的单个蛋白带，但是37℃孵育后，最初的带消失时出现更 高分子量的种类。这些推定的蛋白聚集物也可观察T172R突变体， 但37℃孵育聚集的时间更长，在此过程中，37℃下T172R突变体 比野生型近似有8x的更长半衰期。圆二色性分析蛋白解链温度(图 7)表明，蛋白三级结构的温度敏感性变化出现在光谱的近紫外线范 围(260nm和320nm之间)。光谱此区域温度敏感性变化的曲线拟 合显示，野生型CocE解链温度为36.15℃，大约30℃开始有可检 测的变性。测定T172R突变体解链温度为41.43℃，大约28℃开始 有可检测的变性。因此氨基酸172的从酪氨酸到精氨酸的单个氨基 酸变化，热稳定性估计增加2.8kCa/mol，与野生型CocE相比确定解 链温度增加整整5度。
表3：T172R、S159A和wt CocE的动力学参数
S159A S159A(40分 钟37℃) T172R T172R(40分 钟37℃) wt CocE wt CocE(40 分钟37℃) Vmax 876.6 130.7 1466 1267 1264 94.06 Km 43.65 15.69 88.20 78.80 71.81 12.30
实施例5：体内野生型CocE防止可卡因致大鼠死亡
为确定CocE体内酯酶活性，建立急性可卡因毒性的啮齿动物模 型。用高剂量可卡因处理时，大鼠呼吸和运动停止后首次惊厥。最 低有毒剂量的可卡因腹腔给药时，将在处理的15分钟内致死。
测定野生型CocE抗可卡因诱导致死性的保护作用，并与人 BChE的保护作用比较。CocE的酯酶活性通过评估两种突变体酶的 活性确立，每种酶缺乏活性部位三种氨基酸的一种。此外，活性部 位内Ser17共价修饰的修饰野生型酶的活性，通过苯甲磺酰氟 (PMSF)测定。可卡因的酯酶降解通过验证酶是否抵御WIN35065- 2诱导的毒性，证明是CocE保护作用的机制(Madras等(1989)J Pharmacol Exp Ther 251，13-141)，WIN 35065-2是缺少酶水解建议 位点的酯桥的可卡因类似物。
雄性Sprague-Dawley大鼠(300g)(Harlan Sprague Dawley， Indianapolis，IN)每个笼子住三只动物。手术植入的颈静脉导管后， 所有大鼠单独饲养，直至实验终止。大鼠保持12小时光/暗循环， 上午7:30开灯，并提供食物和水，自由进食。大鼠用盐酸氯胺酮 (100mg/kg，腹腔给药)和甲苯噻嗪(10mg/kg，腹腔给药)麻醉 后，右侧颈静脉植入静脉导管(Micro-renethane tubing，15cm，MRE- 040，Braintree Scientific Inc.，Braintree，MA)。大约3厘米的导管插入 静脉，其余导管皮下穿过到背部，从肩胛骨间切口退出。外露导管 以1cm的一块不锈钢(直径0.28，Small Parts Inc.，Miami，FL)封 端。导管每天以0.5ml肝素盐水(50U/ml)冲洗，保持导管通畅。 手术后，大鼠恢复一周。每只大鼠被用于单个实验，所有实验组由 6-8只大鼠组成。
为确定阻断可卡因引起的惊厥和死亡的CocE的最低有效剂量， 施用180mg/kg可卡因(腹腔给药)后1分钟，静脉注射0.1、0.32 或1.0mg CocE或溶剂(磷酸盐缓冲液，PBS)。为确定CocE的催 化限度，施用1.0mg CocE(静脉注射)前1分钟，给予增加剂量的可 卡因(100、560、1000mg/kg，静脉给药)。施用180mg/kg可卡因 (腹腔给药)前1分钟，给予突变体和PMSF封闭的CocE(1mg，静 脉给药)。施用最低剂量WIN-35065-2(560mg/kg，腹腔给药)后1 分钟，还给予CocE(1.0mg，静脉注射)。施用可卡因(100mg/kg， 腹腔给药)之前和之后，给予CocE(1.0mg，静脉注射)，以确定酯酶 的体内半衰期。所有静脉注射后，进行肝素盐水冲洗(0.5ml)。处 理后，观察大鼠惊厥和死亡。记录惊厥发作次数，每次发作持续时 间和惊厥类型。死亡定义为观察到的运动和呼吸的停止。计算表现 出惊厥和死亡的每个实验组中的动物百分比。然后计算每个数据点 的百分标准误差均值。
结果表明，急性毒性的啮齿类动物模型中，可卡因剂量依赖性 诱导大鼠惊厥和死亡；100％的给予100mg/kg可卡因的动物中，给 药后不到15分钟观察到死亡(见例如图9)。给予可卡因后灌注 CocE(1.0mg)，可卡因毒性剂量效应曲线移位10倍(见例如图 9)，这样需要1000mg/kg可卡因克服CocE的保护性催化性能。此 治疗方案与人类毒性情况很相似，只有已摄入、吸入或注射可卡因 后，才给予过量解毒剂。
野生型CocE比人BChE表现出更好的催化效率。在180mg/kg 可卡因施用前1分钟给予，1mg CocE提供抗可卡因诱导致死的100 ％保护(见例如图10)，而10倍摩尔当量剂量的BChE(13mg)没 有提供保护，类似于低于CocE剂量(0.1毫克)10倍(见例如图 10)。
CocE的两种突变(Ser117Ala或Tyr44Phe)都缺乏体内活性， 因此没有保护作用(图11b)。此外，PMSF处理的酶也消除了 CocE抗可卡因的保护作用(图11b)。此外，非可水解可卡因类似 物WIN 35065-2的致死作用，用CocE治疗是无法克服的(图 12)。根据用所述酶的催化灭活制剂(PMSF处理的和CocE非活性 突变体)进行的体内保护研究，显然所述酶的保护作用是由于其水 解可卡因的能力。综合考虑，这些数据符合CocE酯酶活性的体外评 估，并证实了所述酶体外抗可卡因诱导致死的保护机制。
实施例6：野生型CocE的时间依赖性作用
检测可卡因给药前施用野生型CocE的作用。大鼠毒性模型正如 实施例5中描述的。可卡因施用前100、30、10、3和1分钟，以及 施用后1和6分钟，给予野生型CocE。用100％乙腈(3x体积)从人 血浆样本中提取化合物，培养大约15分钟，13,000转离心4.5分 钟，收集由此产生的上清。该提取物用Savant Speed Vac (ThermoElectron Corp.，Franklin，MA)浓缩，除去乙腈。提取的样品 在水中重构，并进一步稀释10-1000倍。
人血浆样本掺加300μm可卡因，并保持在37℃。加入可卡因 酯酶或酯酶溶剂前往一等份血浆中加样，加入酯酶后1分钟收集另 一等分。血浆等份与内标(可卡因-D3)和饱和氟化钠溶液立即混合， 防止进一步的可卡因代谢。提取组织，用高效液相色谱串联质谱法 定量可卡因和内标水平。
对于CocE体外时间依赖性失活，纯化的CocE酶(250ng/ml) 于37℃下无可卡因存在时，在分析缓冲液中孵育各种时间。37℃孵 育后，样本放置在冰上。为评估温度对CocE活性的作用，样本与所 示最终酶浓度125ng/ml的各种浓度(-)可卡因一起孵育。多板读数 仪(multiplate reader)于A240测量(-)-可卡因的衰变率。这些数据 使用KaleidagraphTM(Synergy软件)与单指数衰减拟合，得到tin为 13.2。
发现野生型CocE有时间依赖性保护作用；施用可卡因之前1分 钟用CocE(1mg)处理时100％大鼠存活，而施用可卡因之前30和1 分钟，用CocE处理时分别仅66％和32％大鼠存活(见例如图 14)。当施用可卡因前100分钟处理时，CocE的保护作用消除。此 时间依赖性效应很可能是由于酶在体内的热失活。大鼠血浆中，发 现CocE有非常短的半衰期(约10分钟，图13)，最有可能是由于 对pH值和温度变化的敏感性。此外，纯化的酶的初步体外数据表 明，CocE经历了温度依赖性失活，37℃下t1/2大约15分钟。
鉴于这些数据，可以近似认为可卡因之前30分钟施用的1mg剂 量的CocE，将衰变大约3个半衰期，施用可卡因时体循环中剩余 0.25mg野生型酶。
以往的研究已表明，大鼠中可卡因的致死血液浓度在50-128μM 间变化(Mets B and Virag L(1995)Anesth Analg 81，1033-1038；Mets 等(1999)Life Sci 65，1317-1328)，可卡因血浆水平峰值出现在腹腔 注射13分钟后(Sun等(2002)J Pharmacol Exp Ther 302，710-716)。 根据腹腔可卡因给药报道的动力学(Sun等(2002)J Pharmacol Exp Ther 302，710-716)，据估计100和320mg/kg可卡因产生的可卡因血 浓度峰值分别为35μM和113μM。致死浓度的可卡因量与人类的类 似(20-200μM)(Finkle BS and McCloskey KL(1978)J Forensic Sci 23， 173-189；Wetli and Wright(1979)J Am Med Assoc 241，2519-2522)。 1mg野生型CocE使得用这些剂量可卡因处理的大鼠存活(图9)， 可以有理由预测，该酶会保护人类抗可卡因毒性。此外，使用高效 液相色谱串联质谱，测量掺加300μm可卡因的人血浆中可卡因水 平，300μM的浓度超过报道的可卡因毒性水平，然后用CocE处理 (我们体内1.0mg剂量的摩尔当量)，不到一分钟内可卡因浓度降 至大约2μM(图10)。
抗大鼠中LD50剂量可卡因的保护作用需要10mg/kg BChE治疗 (Lynch等(1997)Toxicol Appl Pharmacol 145，363-371)，假设酶在人 体内分布类似，70公斤的人将需要700mg剂量的外源性BChE，以 抵御过量服用。此外，没有任何证据表明，在可卡因之后施用， BChE可起逆转可卡因毒性的作用，逆转可卡因毒性作用是可卡因解 毒剂的必要特征。
因此表明，300克大鼠体内1mg剂量的野生型CocE足以抵御超 过LD100剂量的可卡因毒性(图9)。此外，更重要的是，前面给 出的两种酶在施用LD100剂量的可卡因后长达6分钟，提供了抗毒 性的保护作用(图14)。CocE在不到一分钟内代谢血浆中可卡因浓 度150倍(图15)。
基于这些数据，预计毒性可卡因摄入后，将250mg CocE施用 于70公斤的人会挽救此人免于死亡。上述情况表明，野生型CocE 是有效的抗可卡因分子，但生理条件限制下这种酶的活性时间短， 限制了其治疗价值。这样的结果指出了延长野生型CocE热稳定性的 重要性。
实施例7：体内T172R突变体CocE防止卡因致大鼠死亡
表征野生型CocE和T172R突变体CocE的水解活性，并通过评 估其防止可卡因诱导大鼠死亡的能力得以在体内确认。
动物治疗如实施例5中所描述的。增加剂量的可卡因施用于(腹 腔给药)大鼠，一分钟后静脉给药野生型CocE(0.32mg)、突变体 CocE T172R(0.32mg)或溶剂。所有静脉注射后肝素冲洗 (0.5ml)。治疗后，观察大鼠死亡。记录1g/kg可卡因剂量直至死 亡的时间。腹腔给药320mg/kg可卡因前的不同时间(1、10、30和 60分钟)施用野生型和T172R CocE(0.32mg)，然后检测大鼠的死 亡。
结果表明，静脉注射CocE，特别是突变体CocE具有逆转或防 止可卡因致死作用的能力。给予可卡因后一分钟施用野生型CocE， 防止杀死对照大鼠可卡因剂量的致死性，100％致死并未出现，直到 可卡因剂量为1g/kg(见例如图16)。T172R突变体CocE处理的大 鼠能耐受更高的剂量，1g/kg可卡因导致仅约70％的致死率。 T172R突变体CocE的预防性作用比野生型CocE更持久(见例如图 17)。
实施例8：小鼠体内重复CocE给药
对CocE对小鼠毒性的影响，尤其是对重复剂量进行了另外的研 究。
除了所述的以外，动物毒性模型与前述相类似。使用雄性NIH Swiss小鼠。小鼠被放置在露出其尾巴的小限制室里，进行尾静脉注 射。红外加热灯，250w灯泡置于离尾部4英寸处，并停留几分钟。 然后用酒精擦拭清洁尾巴，用30G 1/2精密度的滑动(glide)针(Fisher Scientific)插入侧静脉输注。为验证针是否在静脉中，少量药物是否 注入，如果在正确位置溶液应该容易输入，而没有注射部位泛白的 任何错误皮下位置的迹象。对于静脉插管，雄性NIH Swiss小鼠氯 胺酮100mg/kg和甲苯噻嗪10mg/kg联合腹腔注射给药麻醉。当小鼠 对爪子压力不再有反应时，剃光颈部，用Betadine和酒精擦拭交替 备用。在干净的条件下，作右侧横向颈部切口，分离颈外静脉。导 管借助解剖显微镜插入静脉至右心房，用尼龙，4-0缝合线和组织粘 合剂，3M Vetbond(3M Animal Care Products，St.Paul，MN)固定在静 脉。该导管是内径0.010英寸，外径0.030英寸的短的聚乙烯(Tygon) 管型材料(Small Parts，Inc.，Miami Lakes，FL)。在动物背部中间作小 切口，皮下插入套针，从腹部切口出来。然后导管从套针穿过，从 动物背部取出，用尼龙缝合材料和组织粘合剂固定在背部。直径 0.011英寸的短钢丝(Small Parts，Inc.，Miami Lakes，FL)插入导管末 端。用4-0 Vicryl缝合材料缝合腹部切口，小鼠置于加热灯下复苏。 大约一小时后，小鼠回到原来的笼子。
第一次0.32mgCocE和320mg/kg可卡因联合给药存活的小鼠， 初始给药后14天再次进行此联合给药。此第二次给药中所有小鼠存 活。第一次联合给药后21天进行第三次给药，所有小鼠也存活。重 复给药的效果表明，此次准备中对CocE没有强免疫应答，也许是因 为其迅速清除。
结果表明，0.32和1.0mg/kg可卡因使可卡因致死的效能明显右 移(见例如图18)。CocE使死亡潜伏期明显延长：腹腔注射 180mg/kg可卡因后，小鼠通常在约3分钟内死亡。给予一次 1.0mg/kg可卡因和1.0mg CocE后，平均在28分钟时出现死亡。考 察数据，分析hBChE阻断可卡因毒性的能力。剂量为1mg时， hBChE使杀死小鼠必须的可卡因剂量略有增加(见例如图18)。这 种酶明显效果低于CocE。虽然施用hBChE后杀死小鼠需要更大剂 量的可卡因，但这种酶没有改变死亡时间。
实施例9：体内半衰期和生物分布测试
在BALB/c小鼠中检测突变体CocE多肽的体内半衰期和生物分 布。简而言之，使用既定的氯胺-T碘化法，用125I标记突变体CocE 的酪氨酸残基(Hunter，WM and Greenwood，FC(1962)Nature 194， 495-496)。BALB/c小鼠尾静脉注射0.1ml或0.5μCi 125I标记的突变 体CocE或突变体CocE-PEG缀合物。每个实验组由24只小鼠组 成。药物注射后第15、30、90分钟、3、12、24、48和72小时时间 间隔时，断颈处死三只小鼠。收集血液样本以及肝、肺、心、肾和 脾的组织样本，称重，使用伽玛计数器(gamma counter)测量放射 性。血样也离心，收集上清，并计数估计血浆相关的放射性标记。 峰与内标的比率用作实验参数。通过血浆放射活性数据拟合于双指 数方程，使用KINFT(Kaltenbach，ML and Vistelle，R(1994) Anticancer Research 14，2375-2377)非线性最小二乘计算机程序，计 算PK参数(Gibaldi，M.and Perrier，D.(1982)Pharmacokinetics)：
A(t)＝Ate-k1t+A2e-k2t
此处A(t)＝％ID/mL血浆，ID＝注射剂量。k2将用来计算一级 消除时间t1/2。如Gibaldi and Perrier，1982所述，从A1、A2、k1、k2和小鼠体重(kg)，计算血药浓度-时间曲线的曲线下面积(AUC)，稳 态分布容积(Vss)，总血浆清除率(CI)，平均保留时间(MRT)。 器官渗透表面积(PS)乘积计算公式为：
PS＝[Vd-Vo]CP(60min)/AUC(0-60min)
此处CP(60min)为注射后60分钟时末期血浆浓度(dpm/μL)，Vd是 从每分钟每克组织的分解与Cp(60min)的比率确定的组织分布容积，Vo是器官血浆体积。样本的器官传送由下述公式确定：
％ID/g＝PSxAUC(0-60min)
这里％ID/g是克组织吸收的注射剂量百分比。
实施例10：免疫学
CocE可用于不完全福氏佐剂(IFA)，以免疫小鼠(见表4)。 通过标准流程建立对CocE抗体特异性的直接ELISA。用CocE(1 ug/ml)包被96孔微量滴度板，使用硼酸盐缓冲盐水(1.5M NaCl，0.5 M H3BO3，1.0M NaOH)重新悬浮可卡因酯酶(50uL/孔)。包被板4℃ 过夜。翌日早上除去包被缓冲液，37℃下用含2％正常山羊血清的 PBS封闭板1小时，并洗3次。各组小鼠的血清在孔中用50μL PBS 连续稀释至范围为102至101，一式两份。板盖盖，37℃孵育30分 钟。随后板洗涤3次，50μL/孔的山羊抗小鼠IgG过氧化物酶标记的 抗体1∶400稀释。然后板洗涤3次，每孔加入100μL过氧化物酶底 物溶液(OPD溶解于柠檬酸磷酸缓冲液中)。孵育5-10分钟后(根据 阳性对照的显色)，反应用3M H2SO4终止(50μL/孔)。490nm读 板，通过增加超过背景吸收的最高稀释确定滴度。用不完全福氏佐 剂(IPA)中乳化的可卡因酯酶(100μg/100μL)腹腔(IP)注射，免疫 Balb/c小鼠，作为阳性对照。阳性1组中，从2周免疫小鼠分离血 清。阳性2组中，初次免疫2周后腹腔注射(100μg/100μL)加强 小鼠免疫，再过一周后收集血清(初次后三周)。
高滴度来自分别用105和106CocE免疫的两个阳性对照组。可 卡因攻击过程中静脉注射给予CocE的动物抗体滴度确证可检测，但 与CocE加IFA免疫的阳性对照动物相比，滴度相对低。从用 CocE/IFA免疫一次的动物收集的血清显示出105的高滴度，而给予 另外加强免疫的小鼠血清滴度更高，为106(3小鼠/组)。从这些动物 收集的血清将用作所有后续滴度试验的阳性对照。
表4：免疫小鼠的CocE滴度
组 流程 滴度(log10稀释+/-SE 阳性1(n＝3)2周 免疫(IFA/IP) 5 阳性2(n＝3)3周 免疫/加强(IFA/IP) 6 攻击和处理(3x) 与可卡因一起给予CocE 3.33+/-0.333 攻击和处理(4x) 与可卡因一起给予CocE 3.5+/-0.5
实施例11：CocE聚乙二醇化
每个酶分子与一个至两个PEG聚合物缀合通常足以产生想要的 保护作用(Avramis等(2002)Blood 99，1986-1994)。因为每个野生型 CocE分子据报道含有8个赖氨酸残基，活性部位没有一个，但接近 活性部位仅有2个(Turner等(2002)Biochemistry 41，12297-12307)， 靶向赖氨酸进行聚乙二醇化不可能使酶失活。突变体CocE与各种单 甲氧基-PEG(m-PEG)聚合物(分子量3-12KDa)混合；所有都含有 激活的N末端功能羟基丁二酰基(succiniyl)酯基团(mPEG-NHS；来 自Shear Water Inc.，Birmingham，AL)。分子量5.5kDa的PEG将是首 次尝试，因为发明人和其他研究者的成果(见例如Veronese，FM and Harris，JM(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54，453-456； Avramis等(2002)Blood 99，1986-1994)表明，此分子量带来有益的 保护。测试1∶2至1∶10的不同摩尔比[NH2]∶[mPEG](前者是基于突 变体CocE的赖氨酸残基的总摩尔数计算)，以获得最佳条件。4℃ 下温和搅拌，进行缀合约40分钟。然后4℃下反应产物超滤 (MWCO 10,000)纯化。通过使用先前的既定方法测量可卡因水解初 始速率，确定聚乙二醇化突变体CecE产物的活性(Turner等(2002) Biochemistry 41，12297-12307)。此外用MALDi-TOF质谱分光光度 法分析这些产物的聚乙二醇化程度及其分子量。聚乙二醇产物-40℃ 保存，临用前解冻。
突变体CocE-PEG缀合物的标准表征，包括确定最佳pH值、温 度、离子强度以及动力学参数(如Km、Vm)，在PBS中进行。此 外，聚乙二醇化产物的热稳定性及其抗蛋白降解的稳定性，在有人 血浆或血液存在的情况下检测。突变体CocE-PEG产物的体内功能 性检测如上所述进行。突变体CocE-PEG缀合物的体内半衰期和生 物分布与游离CocE比较，如上所述进行(见实施例9)。
对从聚乙二醇化试验得到的数据进行统计分析。使用Windows 和GraphPad软件的GraphPad(San Diego，CA)Prism，对具有两个变 量的数据集进行具有Dennett′s效果测验的随机区组两因素方差分析 (Random block two-way ANOVA)。对有两个条件的试验进行配对 t检验。
也可进行突变体CocE与高分子量分枝PEG(如高达60KDa)的 缀合(见例如Reddy等(2002)Advanced Drug Delivery Reviews 54， 571-586)。
此外，位点特异性PEG化也是可行的另一种减少功能和结构异 质性的方法。去除活性部位附近的半胱氨酸残基，或在蛋白表面掺 入半胱氨酸残基，可以作为更好的聚乙二醇化底物(通过马来酰亚 胺偶联)。类似地，PEG与CocE的胺偶联，可通过例如精氨酸残 基保守取代突变体CocE的任何残基而被采用(野生型CocE中总共 9个赖氨酸，其中7个是表面赖氨酸)。
初步研究结果表明，使用上述方法，野生型(WT)CocE与一端 含有激活的琥珀酰亚胺基功能基团的单甲氧基-PEG(m-PEG)聚合物 (MW：5.5KDa)成功相连。PEG化反应后重新获得高初始CocE活性 (＞70％)。MALDI-TOF质谱显示PEG-CocE产物的四个主要峰， 表明存在含有不同数量PEG链(分别为1至4条)的缀合物的异质 混合物(见例如图19)。有人在文献中建议每个蛋白分子仅1-2条 PEG链的缀合将能够产生PEG诱导的保护作用(Veronese，FM and Harris，JM(2002b)Advanced Drug Delivery Reviews 54，457-606； Avramis et al(2002)Blood 99，1986-1994)。就此而言，这里采用的聚 乙二醇化的方法显然满足这样的要求。
实施例12：RBC包封
CocE的RBC包封可经由连接的PTD肽完成。由于其使蛋白跨 细胞膜的效能(Park等(2005)FASEB Journal，in press)和无毒性 (Chang等(2001)AAPS Journal 3，Article#17，#18和#19)，LMWP被 选作PTD肽，运送突变体CocE进入RBC。为确保被包封的突变体 CocE永久包埋入RBC，一旦突变体CocE-LMWP缀合物进入 RBC，CocE和LMWP间的连接可自动并迅速降解。接头如二硫(S-S) 键，其由于增加的胞质谷胱甘肽和还原酶活性的存在，会在RBC中 迅速降解(Trouet等(1982)Proceeding of the National Academy of Science 79，626-629)，确保CocE留在RBC中。
根据之前研发的改良方法(Liang等(2000)AAPS Pharmaceutical Science 2，Article 7)，为生成与S-S键连接的突变体CocE-LMWP缀 合物，LMWP的N端胺基(这是LMWP的唯一-NH2基团)首先被 SPDP激活，随后激活的LMWP与突变体CocE在二硫苏糖醇(DTT) 存在下混合，以便与突变体CocE游离半胱氨酸残基之一(野生型中 有四个)形成S-S键(Turner等(2002)Biochemistry 41，12297- 12307)。CocE保存在DTT中时，是稳定的(Turner等(2002) Biochemistry 41，12297-12307)，这意味着使用这些游离半胱氨酸基 团进行缀合，可能不会损害此酶的催化活性(已经完成的野生型 CocE中每个半胱氨酸向丝氨酸的突变没有导致活性减小)。最后的 LWMP-CocE产物随后通过肝素柱纯化，并冻干保存。
包封是通过将RBC与突变体CocE-LMWP孵育30-60分钟完成 的。由于PTD介导的细胞进入是不依赖于温度的(Schwarze等(1999) Science 285，1569-1572)，包封在4℃下进行以最大限度地保留RBC 的功能。突变体CocE包封到RBC中的方法和程度，用FITC标记 的突变体CocE，通过共聚焦显微镜和流式细胞仪分析监测。突变体 CocE-包埋的红细胞的形态学也通过SEM检验。
基本表征——包括评估RBC(如氧转移活性)和突变体CocE (如可卡因水解活性，动力学性质如Km、Vm等)的功能，突变体 CocE从RBC渗漏(即在缓冲液中孵育装载突变体CocE的RBC， 然后测量上清液的酶活性)，以及包封的突变体CocE抗蛋白降解的 稳定性——在缓冲液或血浆中进行。从RBC包封的突变体CocE得 到的结果与从游离酶获得的结果进行比较。包封突变体CocE的 RBC的体内功能检测如上所述进行。
人RBC(来自American Red Cross，Detroit，MI)用于体外研 究。但是，对于包括功能测试和药代动力学研究的体内动物研究， 来自相同动物种的自体RBC用来避免细胞不相容性和可能的细胞毒 性作用。
包封突变体CocE的RBC的循环半衰期(t1/2)是根据上述同样的 方法，通过将125I标记的突变体CocE(即将其装入RBC前)注射 小鼠确定的。每一个实验组由24只小鼠组成。在3、6、12、24小 时和3、6、10和15天时间间隔时处死小鼠(3只)。收集血液和组 织样本，称重，测放射性。PK参数包括消除t1/2以及组织分布，如 上所述，通过使用KINFT程序计算。从RBC包封突变体CocE得到 的动力学结果与从游离突变体CocE得到的结果相比较。
对从RBC包封试验得到的结果进行统计分析。使用Windows 和GraphPad软件的GraphPad(San Diego，CA)Prism，对具有两个变 量的数据集进行具有Dennett′s效果测验的随机区组两因素方差分析 (Random block two-way ANOVA)。对有两个条件的试验进行配 对t检验。
为检查是否以前建议的可以满足后两个要求，使用L-天冬酰胺 酶作为模型酶，进行PTD介导的RBC包封的初步研究。LMWVP 是Dr.Yang的实验室以前研发出来的(Chang等(2001)AAPS Journal 3，Article#17，#1，and#19)，具有已证实的潜在穿透膜活性的PTD肽 (Park等(2005)FASEB Journal，印刷中)，使用与上述类似的方法与天 冬酰胺酶连接。4℃下该LMWP-ASNase缀合物随后与RBC一起孵 育(从DBA/2小鼠收集)2小时。相比之下，含有包封的ASNase 的RBC血影也根据先前既定的方法制备(Updike等(1976)Science 193，681-683)。初步结果表明，LMWP介导的方法的装载效率，如 果不比常规基于渗透的细胞破裂技术好，则至少也与之相当。但 是，PTD介导方法的主要优势是只需单个处理步骤；与都需要装载 和洗涤方法多个步骤的其他进入细胞的方法不同。
图20显示正常RBC、装载ASNase的RBC血影，以及装载 LMWP-ASNase的RBC样本的扫描电镜(SEM)图。正如所见的，当 从渗透破裂/重包封方法得到的装载ASNase的RBC(即RBC血 影)形状和形态学呈现明显变化时，装载LMWP-ASNase的RBC的 形状和形态学(即两面凹的圆盘)与正常RBC实际是无法区别的。 这些研究结果与许多其他研究者的那些报道一致，其他研究者报道 PTD介导的细胞包封不会导致细胞膜的明显微扰或改变(Dietz，GPH and Bahr，M(2004)Molecular Cell Neurosciences 27，85-131；Schwarze 等(1999)Science 285，1569-1572；Suzuki等(2002)Journal of Biological Chemistry 25，2437-2443)。
为了进一步评估这两种RBC包封体系，进行了初步清除 (preliminary clearance)研究。在静脉注射(1)装载ASNase的RBC 血影，和(2)装载LMWP-ASNase的RBC后，评估ASNase活性 在血浆中的半衰期。每个动物组由4只DBA-2小鼠组成，每只小鼠 给予8个单位的装载ASNase活性。血液样本在不同时间间隔从尾静 脉取回，ASNase活性在全血中的量通过制备氨的直接奈士勒比色法 测量(Ho等(1970)Journal of Biological Chemistry 245，3708-15)。结 果表明，与RBC血影的半衰期(t1/2为5.9天)相比，LMWP-ASNase 包封RBC的循环半衰期(t1/2为9.2天)增加差不多两倍(见例如图 21)。目前不知道包封RBC和正常的未经处理红细胞半衰期间的区 别。但是，比RBC血影t1/2增加2倍的这些结果证实了这种方法的 优点，正如文献中报道的，即使是利用RBC血影包封的方法，体内 ASNase活性已从游离ASNase的26小时延长至RBC血影包封 ASNase的29天(Kravtzoff等(1996)European Journal of Clinical Pharmacology 49，465-470)：已增加10倍。因此，通过本文所述包封 方法的此t1/2的另2倍增加尤其有效。
为确认RBC包封ASNase仍可保留其原有生物功能，用带有肿 瘤的小鼠检测RBC血影-ASNase和RBC-ASNase的抗肿瘤作用。培 养L5178Y小鼠淋巴瘤细胞，每只DBA/2小鼠腹腔注射7x105个癌 细胞。植入肿瘤后五天，选择类似体重的小鼠，分为三组：(1)对 照组仅给予生理盐水；(2)装载ASNase的RBC血影；和(3)装 载LMWP-ASNase的RBC。每个组由5小鼠组成，每个实验小鼠给 予0.1mL包封药物的RBC(或血影)。结果表明，未治疗对照、 ASNase-RBC-血影治疗，以及LMWP-ASNase-红细胞治疗组的平均 存活时间分别为10.0、12.6和14.4天(见例如图22)。应当指出的 是，考虑到每只小鼠给予仅0.1mL RBC悬浮液(相等于小鼠总血量 的仅5％)进行抗肿瘤治疗的事实，虽然三组之间存活时间相差只 有大约2天，但RBC包封ASNase治疗的作用仍然相当显著。总的 来说，ASNase模型酶的这些结果表明，RBC包封的酶在治疗上仍然 是有活性的。应该指出，可卡因比天冬酰胺酶底物更能渗透跨过 RBC膜。
因此，治疗可卡因相关疾病中使用RBC包封的CocE是有效的 办法，因为可卡因容易穿过RBC膜(实际上在RBC中稍微浓缩) (Javaid等(1978)Journal of Chromatography 15，105-113)，PTD介导 的包封不会改变RBC的物理和/或化学性质，并且RBC包封的酶起 作用就好似游离酶一般。
实施例13：去除内毒素
CocE突变体的内毒素污染可有几个方面。理想地，去内毒素污 染使浓度降至少于10EU/mg蛋白的水平。去污染的方法包括选择性 离子交换柱色谱条件，尺寸排阻，聚乙烯亚胺(PEI)和疏水柱层析， 超滤和去污剂提取。内毒素检测系统(PYROGENT 5000， Cambrex)是用来确定制剂的内毒素含量。该分析是基于来自鲎变形 细胞溶解物(LAL)的抗LPS因子。分析的敏感性为0.01和100 EU/ml，在所需水平内。分光法分析设计在96孔微量滴定板中进 行。可以检测通过下列过程分级分离的内毒素和CocE和/或突变体 CocE的内毒素水平和可卡因酯酶活性。利用可卡因在240nm的固 有吸收，使用分光光度法分析测量可卡因酯酶活性。经水解，吸收 光谱显示240nm峰明显降低(Turner等(2002)Biochemistry 41， 12297-12307)。
阴离子交换色谱：现有条件涉及在pH8.0使用快速高效液相色 谱(FPLC)ona Q-琼脂糖凝胶柱，去内毒素污染。可以优化缓冲条 件(pH)，最大限度地吸附CocE和/或突变体CocE并分离内毒 素。洗脱组分通过测量CocE或突变体CocE活性进行评价(可卡因 水解的光谱分析，在240nm吸收)。使用PYROGENT 5000(见上) 评价内毒素水平。
尺寸排阻色谱法和超滤：内毒素可以以单体形式(MW～1-2x104) 或胶束形式(MW～4x105至1x106)存在，这取决于缓冲条件。洗涤 剂如胆盐的存在，有利于单体形式，而二价阳离子(如Ca2+)利于 胶束形式(Hirayama，C and Sakata，M(2002)Journal of Chromatography B Analytical Technology Biomedical Life Science 781，419-432)。内毒 素的此性质用于将胶束(即在二价阳离子如Mg2+或Ca2+存在下)， 通过凝胶过滤色谱，使用Sephadex 75或Sephadex 200(Pharmacia) 柱树脂与CocE和/或突变体CocE分离。胶束内毒素不应保留在柱 上，应通过空隙，而CocE和/或突变体CocE应作为对应于65kDa 蛋白的单分散性蛋白洗脱。同样，将估计使胶束形式的内毒素从 CocE和/或突变体CocE分离的超滤单位的容量。超滤单位现在可用 于截留分子量3x105到1x106，在保留胶束内毒素的所需范围内， 但不会保留CocE本身。
聚乙烯亚胺色谱：Mitzner等(1993)and Morimoto等(1985)曾使 用PEI-固定化的纤维素珠或纤维素纤维，分别从BSA制剂分离内毒 素。PEI-层析柱是非常弱的阴离子交换剂，其可能实际上利用内毒 素的一些疏水性质，从而优先吸附内毒素。各种PE1-硅珠制品来自 Sigma，取决于珠子大小。虽然硅珠更经典地是与HPLC应用有关， 我们将填充低压工作柱，并会选择200um目大小。
Triton X-114萃取：Triton X-114相分离已成功地用于从白蛋白 和过氧化氢酶分离内毒素(Aida，Y and Pabst，MJ(1990)J Immunological Methods 132，191-195)。Adia和Pabst报道，单个 Triton X-114提取步骤后，内毒素浓度减少了1000倍。CocE和突变 体CocE样本与同体积Triton 114一起孵育，先在冰上孵育，然后37 ℃孵育15分钟。离心去除含有内毒素的Triton X-114相。如同前面 所指出的，已经证明CocE是相当热不稳定的，但存在底物可卡因时 可能会有点保护。如果CocE与Triton X-114在37℃孵育导致明显 CocE失活，则提取过程中包括过量底物将使酶稳定。
实施例14：CocE宿主生物体的诱变
存在一些菌株，其在可卡因酯酶副产物上显示出温度敏感性生 长，包括一些假单胞菌株，通过添加合适质粒载体内编码的CocE基 因，这些生物体能够适应在可卡因上的温度敏感性生长。例如， CocE基因最初通过将基因片段亚克隆到红串红球菌CW25中，从红 球菌MB1测序，红串红球菌CW25是不能代谢可卡因，但能在可卡 因酯酶副产物芽子碱甲酯和苯甲酸酯上生长的细菌(Bresler等(2000) Applied & Environmental Microbiology 66，904-908)。CocE基因已亚 克隆到穿梭载体pJAK-14和pMMB67EH中(见例如实施例1)。这 些质粒能够在任何革兰阴性菌，包括假单胞菌中表达，另外 pMMB67EH质粒使高水平的表达成为可能，并且使用辅助质粒 pRK2013通过细菌接合使转化变得容易。两种质粒中任一个转化到 表现出在可卡因酯酶副产物上温度敏感性生长的细菌(例如假单胞 菌株)中，使含有可卡因作为唯一碳源的平板上的温度敏感增长成 为可能。原始红球菌MB1和含CocE质粒的假单胞菌株的诱变采用 260nm紫外光辐射进行。逐步增加照射剂量，这样90-95％的细胞被 杀死。其余的细胞26℃下在营养培养基中恢复1小时，如前所述在 可卡因存在下富集(Britt，等(1992)Journal of Bacteriology 174，2087- 2094)。37℃时富集，筛选CocE的热稳定变体。最后，细胞置于含 有10nM可卡因的最小琼脂培养基平板(minimal media agar plate) 上，37℃孵育。单菌落生长，并在37℃测试CocE活性。CocE基 因的PCR扩增在发现37℃下生成活性和可溶性CocE的突变体上进 行，扩增产物亚克隆到PET-22B(+)质粒中，进一步表征。作为 CocE突变的前奏，可能有必要诱变天然假单胞菌株，以预筛当在可 卡因水解产物上生长时37℃下没有温度敏感性的，然后克隆到 CocE后37℃下对可卡因表现出温度敏感性的。
实施例15：鉴别热稳定CocE突变体的高通量筛选方法
实施一些鉴别热稳定CocE变体的高通量筛选方法。由于野生型 酶已知温度超过30℃是热不稳定的，转化到大肠杆菌BL21细胞中 后，菌落传代培养，在16℃诱导蛋白表达。然后在温度30℃及以 上，测试酯酶活性。经过几轮升高温度下的诱变和测试，得到热稳 定的突变体。如上所述，然后制备每个单独突变体CocE，纯化，并 测试37℃的活性和热稳定性(见实施例1和4)。
通过复制平板的硝酸纤维素滤膜印记，从琼脂平板直接筛选含 有突变体多肽的菌落，然后裂解细菌和固定蛋白质。不同温度下酶 活性的确定，通过监测(-)可卡因的酸性副产物苯甲酸的蓄积完成。 潮湿硝酸纤维素印记置于干燥滤纸上，该干燥滤纸事先用pH7.4无 缓冲剂的可卡因和通过酸化由无色变有色的的pH指示剂如甲基红的 混合物饱和。活性酶通过颜色变化鉴别，适当地收集菌落。采用基 于通过形成苯甲酸酸化的该检测方法，检测在苯甲酰基酯基团水解 可卡因的催化抗体的细胞表达，苯甲酰基酯基团是CocE断裂的相同 位点。或者，硝酸纤维素印记是通过接触可卡因硫醇衍生物，并随 后通过沉淀重金属(如基于汞)指示剂体系检测巯基基团实现的。
还通过传代到液体培养基，使用可卡因硫醇衍生物直接测试可 卡因酯酶活性，并使用比色硫醇指示剂Ellman试剂检测，筛选含有 突变体多肽的菌落(见例如图6)。Ellman试剂与游离巯基基团迅 速形成二硫键，并释放在412nm有吸收的有色硫醇盐。在IPTG存 在下16℃孵育过夜诱导蛋白表达(20μl)的培养物，与1mM苯甲酰 基硫酯可卡因衍生物和500uMEllman试剂在pH7.4磷酸钠缓冲液中 混合，至终体积200ul。结果(见例如图6)表明，含有野生型 CocE酶的细胞比单独的细胞能够在更高得多水平上断裂苯甲酰基硫 酯。
最后通过传代到液体培养基中，筛选含有突变体多肽的菌落， 随后裂解，并使用亲和介质分离突变体多肽。例如，裂解的细胞通 过允许收集和随后洗脱6xHIS标记蛋白的镍-琼脂糖过滤板洗涤(例 如Ni-NTA Superflow 96-Bio-robot试剂盒(Qiagen)。或者，细胞在允 许结合6xHIS融合蛋白，并且随后去除污染物的镍涂层的微量滴定 板内裂解(例如，固定器镍螯合板(Nunc)或NEN镍螯合急骤板 (Perkin Elmer))。同样地，裂解的细胞与镍涂层微珠(如Ni-NTA磁 性琼脂糖珠(Qiagen))一起孵育，随后去除污染的蛋白。然后使用前 面提到的任何分析法测试分离的酯酶蛋白活性，例如分光光度活性 分析(实施例1和4)，含氚可卡因活性测定(实施例1)，苯甲 酸pH指示活性分析，可卡因巯基衍生物检测体系，使用可卡因适体 (Stojanovic，M.N.，de Prada，P.& Landry，D.W.(2001)J Am Chem Soc 123，4928-31；Stojanovic，M.N.& Landry，D.W.(2002)J Am Chem Soc 124，9678-9)，通过监测可卡因降解时荧光的变化，或通过使用 通用酯酶底物如4-硝基苯基乙酸酯，并如前所述监测420nm的比色 变化(Halgasova，N.等(1994)Biochem J 298 Pt 3，751-5；O’Conner，C.J. & Manuel，R.D.(1993)J Dairy Sci.76：3674-3682)。
实施例16：N197K突变体多肽的初步分析
N197K突变体多肽(SEQ ID NO：42)的初步分析表明，第0天 37℃下1小时后有良好稳定性。Vmax和Km值见表5。第3天再次 检查发现类似稳定性。Vmax和Km值见表6。第3天Km值较高， 是因为重新使用旧的可卡因。37℃孵育样本的凝胶过滤显示形成聚 集体。
表5：N197K最初检验(第0天)
N197K(0) N197K(60) 等式1 最佳适配值 VMAX 2928 2187 KM 34.77 24.24
表6：N197K重复检验(第3天)
N197K(0) N197K(60) 等式2 最佳适配值 VMAX 3357 3085 KM 102.2 113.5
实施例17：热稳定突变体CocE多肽的鉴定
热稳定突变体CocE多肽通过确定突变体CocE多肽的t1/2鉴 别。简而言之，酶37℃预孵育不同时间。室温(25℃)测定活 性。t1/2大于12分钟(野生型CocE的t1/2)的突变体酶被认为是热 稳定的(见例如图27和表7)。正如组合突变体CocE多肽 T172R/G173Q所示，在各实施方案中，更低稳定性或无稳定性的两 种单突变的组合可产生热稳定组合。
表7：热稳定突变体CocE多肽
实施例18：热稳定可卡因酯酶突变体聚集的防御
热稳定CocE突变体聚集的防御施用尺寸排阻色谱法评价。简而 言之，酶在37℃预孵育0分钟或60分钟，并用尺寸排阻色谱法分 离。野生型CocE、T172R和T172R/G173Q的结果如图28。
实施例19：低紫外光谱
低紫外CD光谱数据使用Aviv Spectropolarimeter Mode 400，借 助Norma Greenfield，UMDNJ，采用5-比色皿座和0.2mg/ml蛋白浓 度获得。得到的原始数据值扣除对照PBS，平滑处理，并使用A. Perczel，K.Park，and G.D.Fasman所述的CCA算法去叠合[Analysis of the circular dichroism spectrum of proteins using the convex constraint algorithm：a practical guide.Analyrical Biochemistry 203，83-93 (1992).]。该算法找到重构数据集所需曲线的最低数量，并以温度的 函数表达每个曲线对数据集的贡献百分比。
下面是CocE WT和4种突变体的低紫外CCA去叠合分析，使 用5-比色皿座在单个CD光谱解链物中获得。试验进行8个小时， 从0至80℃。
在测试波长(200-250nm)之间观察温度依赖性解链，每个突变体 平滑处理的光谱见图29。通过CCA算法去叠合表明，每个光谱通 过一组三条曲线得以最好地描述，见图30。这表明CocE的解链是 至少两个步骤的过程，从初始曲线(曲线1)发展到中间态解折叠 步骤(曲线2)，以及最终完全变性蛋白(曲线3)。在描述这三 条曲线中每个温度的贡献％见图31。剂量反应分析用于接近初始光 谱解链的温度(1)，中间态形成和解链的温度(2)，以及完全解 链蛋白积聚的温度(3)。收集这些数字，并在图32作图，见表 8。
表8：每步的熔点
最热稳定的突变体T172R-G173Q(在其他分析中确定)显示， 初始曲线1的最高解链温度(40℃与野生型的37℃)，曲线2中间 体消失(46℃与野生型的50℃)和出现完全解链曲线3的最低温度 (56℃与野生型的59℃)。
总之，似乎所有的突变体都进行2步解链过程。
实施例20：使用产物和抑制剂稳定
可卡因酯酶(CocE)裂解可卡因生产苯甲酸和芽子碱甲酯。简 而言之，可卡因的替代底物和抑制剂，以及能够热稳定酶的化合 物，一般通过在活性酯键取代酰胺和巯基类似物，或除去键(对于 抑制剂)，用苯甲酰基类似物取代苯甲酸离去基团，和/或除去或改 变该分子芽子碱部分的甲基酯基团进行研究。正如下面所讨论，已 确定野生型CocE的一些底物、产物和抑制剂稳定热变性，以及防 止凝胶电泳中热致聚集。
可卡因是可卡因酯酶(CocE)的天然底物。可卡因裂解通过 240nm处吸收的下降进行监测。可卡因(mM范围)防止37℃诱导形 成高分子量CocE聚集物(0.1mg/ml酶浓度)(见例如图33)。可 卡因(uM量)稳定37℃诱导的活性损失(见例如图34)，虽然由 于更高浓度底物抑制，此稳定的机制是复杂的。
苯甲酸是CocE的天然产物，以及CocE裂解4-硝基苯基乙酸酯 的弱抑制剂(Ki 310uM)。苯甲酸防止37℃诱导形成高分子量CocE 聚集物(0.1mg/ml酶浓度)(见例如图35)。苯甲酸(uM量)稳 定37℃诱导的活性损失(见例如图36)，虽然由于更高浓度底物 抑制，此稳定机制是复杂的。
CocE催化裂解4-硝基苯基乙酸酯(4NPA)为4-硝基酚(4NP) 和醋酸酯。裂解反应通过观察400nm处产物的形成，进行监测。 4NP和4NPA(mM范围)防止37℃诱导的高分子量CocE聚集物形 成(0.1mg/ml酶浓度)。
苯基硼酸是CocE的强抑制剂(Ki 250nM)。苯基硼酸稳定37℃ 诱导CocE聚集，密度测定法EC50值为0.2UM。
使用上述的，筛选分析发展为筛选可能类似地稳定酶但不必占 据活性位点的小分子。确定为稳定性分子的分子用来稳定本文公开 的蛋白，直至可以使用。
序列表
<110>Columbia University
Zhan，Chang-Guo
Landry，Donald
Sunahara，Roger
MacDonald，Joanne
Narasimhan，Diwa
Woods，James
Holden Ko，Mei_Chuan
Deng，Shi-Xian
<120>ANTI-COCAINE COMPOSITI0NS AND TREATMENT
<130>88800730-0003
<140>PCTUS0715762
<141>2007-08-03
<150>60/819,569
<151>2006-07-10
<160>47
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>574
<212>PRT
<213>红球菌(Rhodococcus sp.)MB1
<400>1
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<212>DNA
<213>红球菌(Rhodococcus sp.)MB1
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ggaatgcgga ccggaagttc ggcattgccg cgacctaccc gattcaagaa gccaccacga 960
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<211>574
<212>PRT
<213>人工
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<223>突变CocE多肽
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