发明背景
发明领域
本发明涉及一种方法，该方法使用PGE2作为佐剂以提高宿主体内的免 疫应答，从而协助制造抗体。
相关领域
使用单克隆抗体(mAbs)作为治疗试剂已成为治疗多种疾病的有效手 段。此外，单克隆抗体也是更好地了解多种疾病的免疫病理学的有力工具。 一种生成单克隆抗体的标准方法包括将骨髓瘤细胞与从被免疫的Balb/c小 鼠中获取的淋巴结细胞或脾细胞进行融合。由于其容易获得，Balb/c小鼠被 选作产生单克隆抗体的宿主。更重要地，由外源性T-依赖性抗原敏化的 Balb/c小鼠的免疫应答的特点在于，它们的源自T细胞的细胞因子的产生会 向类Th2表现型极化(polarization)。此类Th2应答伴随有高水平的抗原特异 性抗体的产生，这与抗原特异性B细胞克隆的频率增加以及用于获得单克 隆抗体的B细胞融合后的杂合体数量的增长相关。
然而，许多免疫原不能在小鼠体内触发适当的抗体应答。这意味着仅 仅有极少数的B细胞产生针对免疫原的抗体，因而使得在生成杂交瘤之后 分离这些细胞系十分困难。由于免疫原不能够引发适当的T细胞辅助以在可 测量的水平上扩增对免疫原有特异性的B细胞克隆，导致低抗体应答。此 外，在重复注射后导致的毒性问题也使针对某些免疫原的单克隆抗体的生 成变得困难。
为了增加能产生针对免疫原的抗体的B细胞的数量，通常会使用佐剂， 它们能够使针对免疫原的抗体应答加强。佐剂是一些化合物，当与免疫原 一起施用时，它们能够提高免疫系统的应答，产生更高的抗体滴度(titer)和 延长的宿主应答。常用的佐剂包括不完全福氏佐剂，它由油包水乳剂组成； 福氏完全佐剂，它包含不完全福氏佐剂的成分以及结核分枝杆菌和明矾。 然而，由于其严重的副作用，管理部门并不鼓励某些佐剂的使用。此外， 虽然这些佐剂能够提高加强对外来免疫原的体液应答，它们也会使一些蛋 白免疫原变性。这会影响能够产生生物反应性抗体的重要的免疫表位的加 工和呈递。因此，需要提供能够克服上述一种或多种问题的新佐剂。
发明概述
一方面，本发明提供PGE2作为一种新的佐剂，用于提高宿主的免疫应 答。在一种实施方案中，本发明提供PGE2作为提高动物体内B细胞应答的 佐剂。
另一方面，本发明提供一种在宿主体内提高针对给定免疫原的免疫应 答的方法。在一种实施方案中，该方法包含将目标免疫原以及有效辅助量 的PGE2施于宿主。本发明的方法提高的免疫应答可以是B细胞应答，增加 的抗体滴度能够作为该方法的典型表现。
另一方面，本发明提供一种改进的方法，用于产生针对免疫原的抗体， 该方法包括施用免疫原以及有效辅助量的PGE2，从而提高对该免疫原的免 疫应答，并筛选对该免疫原有特异反应性的抗体或产生抗体的细胞。本发 明的方法提供了更高效的生成抗体的途径。因此，另一方面，本发明提供 了使用本发明的改进的方法产生的抗体。使用本发明的方法产生的抗体可 用于治疗、诊断和/或研究目的。
发明详述
本文引用的所有出版物或专利完整地作为参考引入，用于展示本发明 当时的技术发展水平和/或提供本发明的描述和可实施性。
本发明提供PGE2作为新的佐剂，它能够有效地用于提高宿主的免疫应 答。被提高的免疫应答可以是B细胞应答。在一种实施方案中，本发明提 供PGE2作为佐剂，用来提高小鼠体内针对给定免疫原的抗体滴度。
PGE2是一种由多种类型的细胞产生的花生四烯酸(arachidonic acid， AA)代谢物。它能够广泛地调节内分泌系统、心血管系统、肠胃系统、神 经系统、生殖系统和免疫系统中的生理活动，并维持局部内稳态。PGE2 的合成分为三个步骤。首先，在磷脂酶A2的作用下，膜磷脂释放出花生四 烯酸。然后，花生四烯酸被环加氧酶1和2(Cox-1和Cox-2)转化成PGG2， 然后被转化为PGH2。最终，PGH2被终止PGE合酶异构化为PGE2。
在免疫系统中，PGE2主要由APC(例如单核细胞、巨噬细胞和树突细 胞的)产生。PGE2对Th1相关的免疫应答有抑制性。它能够抑制Th1克隆 产生IL-2和IFN-γ，但不抑制Th2克隆产生IL-4和IL-5。在初始()T细胞 的分化阶段，PGE经由cAMP积累抑制Th1和IL-12R表达的分化。PGE2抑制 APC经LPS诱导产生IL-12，但促进IL-10的产生。在B细胞中，PGE2促进经 IL-4和LPS刺激的B细胞体外产生IgE。现在发现，PGE2在Th2应答的产生 中具有关键性的作用。
本文使用的术语“免疫原”指任何能够潜在地引发受试者的免疫应答 的分子。由于一些免疫原在没有与佐剂一起施用的时候无法引发免疫应答， 术语“免疫原”包含那些仅当与佐剂一起施用时才能引发免疫应答的分子。
本文使用的术语“佐剂”指能够提高免疫原的免疫刺激特性的物质。 佐剂具有影响抗体滴度、应答持续时间、同种型、亲和力(avidity)以及其他 免疫特性的能力。对许多本身免疫原性弱的免疫原来说，使用佐剂是优选 或者必要的。佐剂可以通过多种不同的机制发生作用。由于毒性和过敏作 用，或因其极端高昂的生产成本，目前已知和/或已使用的佐剂是有限的。
本文使用的关于免疫原的免疫应答的术语“提高”或“被提高的”指 增加、加强或诱发对免疫原的免疫应答。在本发明中，PGE2作为佐剂不仅 能够提高对强免疫原的免疫应答，也能提高对弱/微量(difficult/nominal)的 免疫原的应答。
本文使用的术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体。总体而言， 抗体是显示出与特定免疫原有结合特异性的蛋白或多肽。完整的抗体是异 四聚体的糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。典型地，每 条轻链由一个共价二硫键与重链连接，而重链之间二硫键连接的数量则因 不同的免疫球蛋白同种型而不同。每条重链和轻链也有有规律地间隔的链 内二硫键桥。每条重链的一端有一个可变区(VH)，随后是若干个恒定区。 每条轻链的一端有一个可变区(VL)，另一端有一个恒定区；轻链的恒定 区与重链的第一恒定区对齐，而轻链的可变区与重链的可变区对齐。脊椎 动物的抗体轻链可以根据其恒定区的氨基酸序列明确地分为两种，分别称 为kappa(κ)和lambda(λ)。免疫球蛋白可以根据其重链恒定区的氨基酸 序列分为五大类，分别称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG可以再 分为IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4这些同种型。
本文使用的术语“单克隆抗体”指单一分子构成的抗体分子制备物。 单克隆抗体对特定表位具有单一的结合特异性和亲和性。单克隆抗体包括 鼠单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体。
本发明也提供一种能够提高宿主对给定免疫原的免疫应答的方法。在 一种实施方案中，该方法包括将目标免疫原和有效辅助量的PGE2施于宿 主。本发明的方法提高的免疫应答可以是B细胞应答，增加的抗体滴度能 够作为该方法的典型表现。
本文使用的术语“有效辅助量”指在与免疫原同时或按顺序施用时， 产生比单独施用免疫原更好的效果，或引发对该免疫原的免疫应答的佐剂 用量。预期本领域的技术人员能容易地确定用于辅助某些免疫原的PGE2 的适当用量。典型地，该用量依赖于免疫原的性质、免疫原的用量、宿主 的物种类型和生理状况，以及施用的途径。例如，本文描述的PGE2的有效 辅助量可以从约0.1nmol到约10nmol不等，例如但不限于0.01、0.02、0.03、 0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30nmol，或其 中任意范围或数值，例如但不限于0.01-10nmol、0.05-5nmol、0.1-2nmol、 0.5-0.9nmol、0.1-1.0、0.01-0.05、0.05-0.1、0.1-0.5、0.6-1.0、1-5，5-10、10-20、 20-30nmol，或其中的任意范围或数值。
PGE2可以与免疫原同时或按顺序施用。当PGE2与免疫原同时施用时， 免疫原和PGE2都可以构成同一组合物的一部分。作为选择，与免疫原分别 施用PGE2也可以发挥PGE2的辅助作用。当分别施用时，优选的方法是在 适当的载体中提供PGE2，所述载体例如盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。PGE2 可以与免疫原同时施用，或者作为选择，也可以在施用免疫原之前或之后 施用。施用免疫原和PGE2的时间间隔取决于免疫原。
免疫原根据免疫原的免疫接种程序表(schedule)施用。例如，可以一次 性施用足够引发有效免疫应答的用量的免疫原。作为选择，也可以先施用 免疫原，然后继以一次或多次的加强。当需要多次施用免疫原时，PGE2 可以仅在第一次施用时与免疫原一起施用，或在计划中的每次施用时一起 施用。施用可以通过任何适当的途径完成，例如腹膜内、静脉内、皮下、 肌肉内、皮内或足垫注射。
进一步地，本发明提供一种改进的针对免疫原产生抗体的方法，该方 法包括施用目标免疫原和有效辅助量的PGE2，从而提高针对免疫原的免疫 应答，并筛选与该免疫原有特异反应性的抗体或产生抗体的细胞。
引文：本文引用的所有出版物或专利均完整地作为参考引入，用于展 示本发明当时的技术发展水平和/或提供本发明的描述和可实施性。出版物 指任何科学或专利出版物，或任何其他可以任何媒介形式获得的信息，包 括所有记录、电子或印刷的格式。以下参考文献完整地作为参考引入： Ausubel等，ed.，Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学实验手 册》)，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2006)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆指南》)，第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual(《抗体 技术实验指南》)，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等，eds.，Current Protocols in Immunology(《免疫学实验手册》)，John Wiley & Sons，Inc.，NY (1994-2006)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science(《蛋白质科学 手册》)，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2006)。
总体而言，用于制备和表征抗体的方法是本领域中众所周知的(例如 前述Ausubel、Harlow和Lane，以及Colligan的著作中提及的)。然而，某 些免疫原的免疫性是隐蔽的(cryptic)，当施于宿主时通常无法引发令人满意 的抗体应答。本发明提供一种改进的产生抗体的方法，其中可以通过标准 方法来提高针对免疫原的抗体应答。
为了依照本发明制备多克隆抗体，将免疫原和有效辅助量的PGE2施于 宿主。从宿主中收集抗血清。多种动物物种可用于生产抗血清。典型地， 用于生产抗-抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。多克隆 抗体的产生可以通过在免疫后的多个时间点对被免疫的动物的血液取样来 监测。也可进行一次或多次加强注射。在达到适当的滴度前，重复进行加 强和滴定。参见例如前述完整地作为参考引入的Colligan著作第二章。
为了依照本发明制备单克隆抗体，将免疫原和有效辅助量的PGE2施于 宿主。典型地，可使用啮齿动物，如小鼠和大鼠。在免疫化之后，筛选有 产生抗体潜力的体细胞，尤其是B淋巴细胞(B细胞)，用于产生单克隆抗 体的方法。这些细胞可以从活检的脾、扁桃腺或淋巴结中，或从外周血样 本中获取。
来自免疫化的动物的产生抗体的B淋巴细胞接下来与永生骨髓瘤细胞 系的细胞融合。优选地，适用于产生杂交瘤的融合操作的骨髓瘤细胞系是 不产生抗体的，具有高融合效率和导致无法在只支持所需的融合细胞(杂 交瘤)的特定的选择性培养基中生长的酶缺陷。例如，当被免疫的动物是 小鼠时，可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、SP210-Ag14、 FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul。
用于产生制造抗体的脾或淋巴节细胞和骨髓瘤细胞的杂交细胞的方法 是本领域中众所周知的。尽管比例可能是约20∶1到约1∶1不等，但一般地， 体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例在一种或多种能够促进细胞膜融合的介 体(agent，化学的或电的)的参与下混合。使用仙台病毒融合的方法已被 Kohler和Milstein阐述过(1975；1976)，而使用聚乙二醇(PEG)(例如 37％(v/v)PEG)的方法已被Gefter等阐述(1977)。使用电诱发的融合方 法也是恰当的(Goding 71-74页，1986).
杂交瘤细胞群在选择培养基中培养，并从中挑选出特定的杂交瘤细胞。 典型地，杂交瘤细胞的选择通过以下方法完成：首先在酶标板中用单克隆 稀释液培养细胞，然后检测单个的克隆上清液(约二至三周后)是否达到 要求的反应性。测定方法可以是放射性免疫法、酶免疫法、细胞毒素法、 噬菌斑测定、斑点免疫结合法以及类似方法。
产生抗体的细胞也可以从被目标抗原免疫的人或其他合适的动物的外 周血，或者优选地，脾或淋巴结中获得。任何其他合适的宿主细胞也可以 被用于表达编码本发明的抗体、其特定片段或变异体的外源或内源的核酸。 融合的细胞(杂交瘤细胞)或重组细胞可以通过使用选择性培养条件或其 他合适的已知方法来分离，并通过有限稀释或细胞分选，或其他已知方法 来克隆。产生具有所需特异性的抗体的细胞可以通过适当的测试方法(例 如ELISA)来筛选。
可使用本领域已知的产生或分离所需特异性抗体的其他适当的方法， 例如前述Colligan、Harlow和Lane，Ausubel的著作中提及的，在此均作为 参考完全引入。
也可使用改造(engineering)或人源化非人或人抗体的方法，这些方法在 本领域中众所周知。一般地，人源化的或改造的抗体有一个或多个源自非 人来源(例如但不限于，小鼠、大鼠、兔、非人灵长类或其他哺乳动物) 的氨基酸残基。这些人类氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，典 型情况下它们取自一种已知的人类序列的“输入”可变区、恒定区或其他 域。已知的人类免疫球蛋白序列在本领域中众所周知，且任何已知序列均 可。参见例如但不限于Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白的序列)，U.S.Dept.Health(1983)和 PCT publication WO 05/33029和US 10/872,932，2004年6月21日提交，在 此作为参考完整地引入。
这些输入的序列可以用于降低免疫原性，或减少、提高或改变结合、 亲和性(affinity)、开速率(on-rate)、关速率(off-rate)、亲和力(avidity)、特异 性、半衰期或任何其他适当的在本领域中已知的特性。一般地，非人类或 人类CDR序列的部分或全部被保留，而可变和恒定区的非人类序列被人类 或其他氨基酸替代。抗体也可以任选地人源化，以保留其对抗原的高亲和 性和其他有利的生物学特性。为达到此目标，人源化的抗体可以任选地通 过这样的流程来制备：使用父序列和人源化序列的三维模型来分析父序列 和多种概念性的人源化产物。三维免疫球蛋白模型容易获取并且为本领域 技术人员所熟悉。现已有能够用于描绘和展示选定的候选免疫球蛋白序列 可能的三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查可以分析残基在候 选免疫球蛋白序列中可能的作用，也就是说，分析对候选免疫球蛋白与其 抗原的结合产生影响的残基。这样，可从一致和输入序列选择FR残基并将 其组合以达到要求的抗体特性，比如对单个或多个目标抗原的提高了的亲 和性。一般来说，CDR残基直接并最实质性地与对抗原结合的影响有关。 本发明中对抗体的人源化或改造可以通过任何已知方法来完成，例如但不 限于在Winter(Jones等，Nature 321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323 (1988)；Verhoeyen等.，Science 239：1534(1988))，Sims等，J.Immunol.151： 2296(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901(1987)，Carter等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)，美 国专利编号：5723323，5976862，5824514，5817483，5814476，5763192， 5723323，5,766886，5714352，6204023，6180370，5693762，5530101，5585089， 5225539；4816567，PCT/：US98/16280，US96/18978，US91/09630， US91/05939，US94/01234，GB89/01334，GB91/01134，GB92/01755； WO90/14443，WO90/14424，WO90/14430，EP 229246，以及前述Colligan、 Ausubel、Harlow和Lane的著作中提及的，在此连同其中引用的文献作为参 考引入。
抗体也可以任选性地通过免疫能够产生全系列(a repertoire of)人类 抗体的转基因动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类以及类似生 物)来获得，其方法在本文已有描述和/或在本领域中已知。产生所需 抗体的细胞可以使用适当的方法，例如本文描述的方法，从这些动物 中分离并无限增殖化。
使用已知的方法(例如，但不限于：US.Pat.No.：5,770,428、5,569,825、 5,545,806、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,661,016和5,789,650，授予 Lonberg等；Jakobovits等WO 98/50433、Jakobovits等WO 98/24893、Lonberg 等WO 98/24884、Lonberg等WO 97/13852、Lonberg等WO 94/2558、 Kucherlapate等WO 96/34096、Kucherlapate等EP 0463 151B1、Kucherlapate 等EP 0710 719 A1、Surani等US.Pat.No.5,545,807、Bruggemann等WO 90/04036、Bruggemann等EP 0438474B1、Lonberg等EP 0814 259 A2、 Lonberg等GB 2 272 440 A、Lonberg等Nature 368：856-859(1994)、Taylor等 Int.Immunol.6(4)579-591(1994)、Green等Nature Genetics 7：13-21(1994)、 Mendez等Nature Genetics 15：146-156(1997)、Taylor等Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)、Tuaillon等Proc Natl Acad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)、Lonberg等Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)以及 Fishwald等Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，在此均完整地作为参考引 入)，转基因小鼠可以产生能够与人类抗原结合的全系列的人类抗体。一 般而言，这些小鼠包含至少一个转基因，该转基因包含至少一个经过功能 性重组的人类免疫球蛋白位点或能够功能性重组的位点的DNA。为了消除 动物产生内源基因编码的抗体的能力，可以使这些小鼠的内源性免疫球蛋 白位点被破坏或缺失。
因此，本发明的方法提供一种更有效的产生抗体的方法。相应地，本 发明也提供使用本发明中改进的方法产生的抗体。使用本发明产生的抗体 可以用于治疗、诊断和/或研究目的。
以上对本发明作了概述，通过参考以下实施例，可以更好地理解本发 明，这些实施例仅作举例说明，并无限定性。
实施例1：作为佐剂，PGE2明显提高抗体滴度
为了产生针对卵清蛋白(OVA)的抗体，将25ug OVA在佐剂中乳化， 用来免疫Balb/c小鼠。为了检测PGE2的效果，在进行免疫3小时前，为小鼠 腹膜内注射(i.p.)1nmol的PGE2，并在免疫后24小时和48小时重复注射。 作为对照组，在进行免疫3小时前，为小鼠腹膜内注射(i.p.)等量的PBS。 在第14天(腹膜内注射)和第28天(皮下注射)，使用25ug OVA对小鼠 进行加强。在第27天和第35天进行抗-OVA浓度滴定。如表1所示，使用PGE2 处理的Balb/c小鼠的抗-OVA滴度得到了明显提高。
表1：使用和未使用PGE2处理的Balb/c小鼠的抗-OVA滴度(滴 度以几何平均数表示)
免疫 第27天平均滴度 第35天平均滴度 OVA/PBS ～1∶1600 ～1∶20,480 OVA/PGE2 ～1∶128,000 ～1∶809,500
为了评估PGE2在产生针对困难目标的抗体时的效果，使用了一种已知 难以引发抗体应答的微量免疫原(AgX)。简单地说，使用25ug OVA或 AgX按照上述的时间表进行免疫，并在2次腹膜内注射后于第27天进行浓度 滴定。如表2所示，PGE2的添加提高了在仅仅两次免疫原注射后的抗-OVA 滴度。因此，PGE2提高了Balb/c小鼠的免疫应答，可以用于缩短免疫时间。
更重要地，PGE2也将2次注射后的抗-AgX滴度增加2-3倍。考虑到该免 疫原本身很难产生抗体，这是一个非常明显的增加。因此，PGE2不仅可以 用于提高Balb/c小鼠对强免疫原的免疫应答，也可以用于提高其对弱/微量 免疫原的应答。
表2：使用PGE2和未使用PGE2时，Balb/c小鼠对强免疫原和微 量免疫原的滴度(滴度以几何平均数表示)
免疫 第27天平均滴度 OVA/PBS ～1∶51,200 OVA/PGE2 ～1∶145,000 AgX/PBS ～1∶9,050 AgX/P GE2 ～1∶25,600
综上所述，通过使用高效且只引发很低的副作用或不引发副作用的 PGE2作为新型佐剂，本发明成功地弥补了当前已知和/或已使用的佐剂的 不足。
可以预见，本发明也可使用与前面说明和实施例中特别描述的方案不 同的方案实施。依据前面的讲述，对本发明也可以进行大量修改和变化， 这些修改和变化因而也包含于本发明的范围之内。
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