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1、(10)申请公布号 CN 103446137 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103446137 A *CN103446137A* (21)申请号 201310440069.1 (22)申请日 2013.09.23 A61K 31/424(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 南京广康协生物医药技术有限公司 地址 210019 江苏省南京市建邺区奥体大街 69 号新城科技大厦 01 幢 5 层 (72)发明人 江春平 王慧 (74)专利代理机构 江苏银创律师事务所 32242 代理人 何震花 (54) 发明名称 Lycojaponicum。
2、in A 在治疗黄热病毒感染药 物中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 Lycojaponicumin A 在 制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用。 Lycojaponicumin A 能够有效地抑制黄热病毒的 增殖， 但是对细胞毒性很小， 可进一步开发为治疗 这些病毒感染引起的疾病的药物， 具有广泛的应 用前景。本发明涉及的 Lycojaponicumin A 在制 备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首次公 开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对 于黄热病毒抑制活性强得意想不到， 不存在由其 他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质 性特点， 同时用于黄热病毒感染的防。
3、治显然具有 显著的进步。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103446137 A CN 103446137 A *CN103446137A* 1/1 页 2 1. 一种 Lycojaponicumin A 在治疗黄热病毒感染药物中的应用， 所述化合物 Lycojaponicumin A 结构如式 （） 所示 ： 式 （） 。 权 利 要 求 书 CN 103446137 A 2 1/5 页 3 Lycojaponicumin A 在治疗黄热病毒感染药物中。
4、的应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药领域， 更具体涉及一种 Lycojaponicumin A 在制备治疗或预 防黄热病毒感染药物中的应用。 背景技术 0002 黄热病毒 （yellow fever virus， YFV） 属于黄热毒科黄病毒属的成员。黄热病毒 能够引起黄热病， 该病为急性传染病。 国际上已将黄热病定为检疫传染病， 中国也将其定为 甲类传染病。1648 年， 美洲的 YUCATAN 半岛首次证实黄热病的流行。17 19 世纪， 此病通 过交通运输被带到欧洲及北美， 在差不多两个世纪内， 黄热病成为美、 非、 欧三大洲一些地 方最严重的瘟疫之一， 造成大量人群死亡。20。
5、 世纪以来， 本病在北美及欧洲未再发生， 但在 中、 南美、 非洲的一些国家和地区仍不时流行。据 WHO （1983） 报告， 1979 1982 年期间， 黄 热病在非洲发生 50 例， 南美洲发生 695 例， 估计实际病例数为上述报告数的 35 480 倍。 埃及伊蚊是主要传播媒介。 迄今为止， 中国尚无病例的报道， 但是这并不能使我们放松对该 病毒的警惕， 因为中国的气候、 地理环境复杂， 蚊虫种类繁多， 具备传播条件， 同时随着国际 交流的日益频繁， YFV 传入中国境内的可能性非常大。 0003 因此， 我们应该高度重视对黄热病毒的研究， 加强对其的科研力度， 做好相关知识 和药物。
6、的储备。 0004 本发明涉及的化合物 Lycojaponicumin A 是一个 2012 年发表 （Wang,X.J.et al.,2012.Lycojaponicumins A-C,Three Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Lycopodium japonicum.Organic Letters14(10),2614-2617.） 的新骨架化合物， 该化 合物拥有全新的骨架类型， 对于本发明涉及的 Lycojaponicumin A 在制备治疗黄热病毒感 染药物中的用途属于首次公开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对。
7、于黄热病毒 抑制活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质性特 点， 同时用于黄热病毒感染的防治显然具有显著的进步。 发明内容 0005 本发明的目的是在于提供了一种Lycojaponicumin A在制备治疗或预防黄热病毒 感染药物中的应用， Lycojaponicumin A 在 10.0uM 浓度下对 YFV 的抑郁率为 96.58%。而 Lycojaponicumin A在浓度为100uM条件下， Vero细胞的存活率为91.8%。 Lycojaponicumin A 能够有效地抑制黄热病毒的增殖， 但是对细胞毒性很小， 可进一步开发为治疗这些病毒感 染。
8、引起的疾病的药物， 具有广泛的应用前景。 0006 所述化合物 Lycojaponicumin A 结构如式 （） 所示 ： 0007 说 明 书 CN 103446137 A 3 2/5 页 4 0008 本发明涉及的Lycojaponicumin A在制备治疗黄热病毒感染药物中的用途属于首 次公开， 由于骨架类型属于全新的骨架类型， 而且其对于黄热病毒抑制活性强得意想不到， 不存在由其他化合物给出任何启示的可能， 具备突出的实质性特点， 同时用于黄热病毒感 染的防治显然具有显著的进步。 0009 为了实现上述目的， 本发明采用以下技术方案 ： 0010 A.Lycojaponicumin 。
9、A 对 Vero 细胞的毒性实验 ： 0011 Vero 细胞是 YFV 的易感细胞。因此， 本实验首先检测 Lycojaponicumin A 对 Vero 细胞的细胞毒性， 以不同浓度的 Lycojaponicumin A 作用于 Vero 细胞， 来了解在细胞存活 率为90%以上的Lycojaponicumin A的最大使用浓度， 为后续的Lycojaponicumin A对YFV 的抑制作用实验提供参考数据。 0012 B.Lycojaponicumin A 对 YFV 的抑制实验 ： 0013 以不同浓度的 Lycojaponicumin A 作用于已经感染了 YFV 的 Vero 。
10、细胞， 来获得 Lycojaponicumin A 对病毒的抑制效率。本实验中的 Lycojaponicumin A 的使用浓度均在 使 Vero 细胞在 90% 以上存活率的浓度的范围内， 因此， 可以排除 Lycojaponicumin A 的浓 度过高而对实验数据的分析产生影响。 0014 一种 Lycojaponicumin A 在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用， 其步骤 是 ： 0015 A.Lycojaponicumin A 对 Vero 细胞的毒性实验 ： 0016 Vero细胞 （非洲绿猴肾细胞） 是YFV的易感细胞。 实验中的Vero细胞购买于中国科 学院上海生科院细。
11、胞资料中心 ； MTT 试剂盒购于碧云天生物技术研究所 ； 胎牛血清 （Fetal Bovine Serum， FBS） 购买于美国GIBCO公司 ； 细胞培养板购买于德国Greiner bioone公司 ； DMEM 培养基和 MEM 培养基购买于美国 GIBCO 公司。 0017 实验步骤如下 ： 0018 1 ： 接种 Vero 细胞 ： 用含 10% （v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基配成单个细胞悬液， 以 每孔 1000-10000 个细胞接种到 96 孔细胞培养板， 每孔接种体积 100ul ； 0019 2 ： 培养 Vero 细胞 ： 在 37， 5%（v/v） CO2培。
12、养条件下， 培养 2 天 ； 0020 3 ： 加入Lycojaponicumin A ： 吸弃每个孔中的DMEM培养基， 向各个孔中加入100ul 用含 10%（v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基稀释成相应浓度 （0uM， 0.4uM， 1.2uM， 3.7uM， 11uM， 说 明 书 CN 103446137 A 4 3/5 页 5 33uM， 100uM， 300uM） 的 Lycojaponicumin A， 对照孔加不加含 10%（v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基 100ul ； 0021 4 ： 呈色 ： 培养 48 小时后， 每孔加 MTT 溶液 10ul， 在 37。
13、， 5%（v/v） CO2培养条件下 继续孵育 4 小时， 然后加入 Formazan 溶解液， 在 37， 5%（v/v） CO2培养条件下继续孵育 4 小时， 直至在普通光学显微镜下观察发现 Formazan 全部溶解 ； 0022 1、 ： 测量与计算 ： 在 570nm 测定吸收值， Sarcaboside A 不同浓度下的细胞存活率 为该浓度下细胞吸光值比上 Sarcaboside A 的浓度为 0uM 时的吸光值， 再乘以 100%。 0023 表 1 不同浓度的 Lycojaponicumin A 对 Vero 细胞的毒性 0024 0025 0026 B.Lycojaponic。
14、umin A 对 YFV 的抑制实验 ： 0027 以 Vero 细胞为培养病毒 YFV 的细胞， MOI 为 0.1， 实验步骤如下 ： 0028 在 24 孔细胞培养板中接入 Vero 细胞， 24 小时后细胞长至单层 （细胞覆盖孔底的 面积约为 80% 90%） ， 吸出培养基， 接入病毒样品 200ul， 37吸附 2 小时。吸附完成后， 吸弃各孔中的病毒液， 用 DMEM 培养基洗去未吸附的病毒。加入用含 10%（v/v） 胎牛血清 的 DMEM 培养基稀释的指定浓度 （0uM， 0.04uM， 0.12uM， 0.37uM， 1.1uM， 3.3uM， 10.0uM）的 Lycoj。
15、aponicumin A， 于 37、 5%（v/v） CO2的培养箱中培养 42 小时， 收集各个孔中的上清， 做病毒噬斑实验。 0029 病毒噬斑实验 ： 在 24 孔板中接入 Vero 细胞， 24 小时后细胞长至单层 （细胞覆盖孔 底的面积约为 80% 90%） ， 吸弃各孔中的培养基， 接入用含 3% （v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养 基10倍系列稀释的病毒样品200ul， 37吸附2小时。 吸附完成后将各个孔的上清板吸弃， 用 10%（v/v） FBS 的 DMEM 培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的 45预热的半固定培养 基 A 成分 ： 3%（v/v） FBS， 2MEM。
16、 培养基， 青霉素 （美国 AMRESCO） 和链霉素 （美国 AMRESCO） 终浓度分别为 100U/ml， 0.1mg/ml ； B 成分 ： 1% （w/v） 的琼脂糖 （法国 Biowest） 。A 成分 ： B 成 分 =1:1（v/v） ， 于 37、 5%（v/v） CO2的培养箱中培养 48 72 小时。待噬斑形成后用结 晶紫 （美国 AMRESCO） 染色 （2%（w/v） 结晶紫溶于 10%（v/v） 甲醛） ， 2 小时后用流水冲去结 晶紫和琼脂糖， 在显微镜下对每孔产生的细胞噬斑， 根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴 度 （PFU/ml， PFU ： plaque fo。
17、rmation unit 噬斑形成单位） 。PFU= 病毒稀释度 P/V，（P ： 空 说 明 书 CN 103446137 A 5 4/5 页 6 蚀斑数目 ； V ： 接种量） 。在 2 次不同的时间进行实验 ( 表 2)。 0030 表 2 不同浓度的 Lycojaponicumin A 对 YFV 滴度降低及抑制作用 0031 0032 0033 本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果 ： 0034 本发明通过对 YFV 的抑制实验证实了 Lycojaponicumin A 对 YFV 具有很好的抑制 作用， 从本质上证明了 Lycojaponicumin A 在治疗 YFV 感染。
18、疾病中具有广泛的应用背景。 0035 研制抗黄热病毒引起的疾病的药物， 以便对疾病进行有效的预防和治疗， 具有巨 大的社会效益和研究价值。 具体实施方式 0036 本发明所涉及化合物 Lycojaponicumin A 的制备方法参见文献 （Wang,X.J.et al.,2012.Lycojaponicumins A-C,Three Alkaloids with an Unprecedented Skeleton from Lycopodium japonicum.Organic Letters14(10),2614-2617.） 。 0037 以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明， 但。
19、本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制， 而是由权利要求加以限定。 0038 实施例 1 ： 本发明所涉及化合物 Lycojaponicumin A 片剂的制备 ： 0039 取 20 克化合物 Lycojaponicumin A， 加入制备片剂的常规辅料 180 克， 混匀， 常规 压片机制成 1000 片。 0040 实施例 2 ： 本发明所涉及化合物 Lycojaponicumin A 胶囊剂的制备 ： 0041 取20克化合物Lycojaponicumin A， 加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉180克， 混 匀， 装胶囊制成 1000 片。 0042 下面通过药效学实验来进一步说明。
20、其药物活性。 0043 实验例 1 ： 0044 一种 Lycojaponicumin A 在制备治疗或预防黄热病毒感染药物中的应用， 其步骤 是 ： 0045 A.Lycojaponicumin A 对 Vero 细胞的毒性实验 0046 Vero 细胞 （非洲绿猴肾细胞） 是 YFV 的易感细胞。 0047 实验步骤如下 ： 说 明 书 CN 103446137 A 6 5/5 页 7 0048 1 ： 接种 Vero 细胞 ： 用含 10% （v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基配成单个细胞悬液， 以 每孔 1000-10000 个细胞接种到 96 孔细胞培养板， 每孔接种体积 100。
21、ul ； 0049 2 ： 培养 Vero 细胞 ： 在 37， 5%（v/v） CO2培养条件下， 培养 2 天 ； 0050 3 ： 加入Lycojaponicumin A ： 吸弃每个孔中的DMEM培养基， 向各个孔中加入100ul 用含 10%（v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基稀释成相应浓度 （0uM， 0.4uM， 1.2uM， 3.7uM， 11uM， 33uM， 100uM， 300uM） 的 Lycojaponicumin A， 对照孔加不加含 10%（v/v） 胎牛血清的 DMEM 培养基 100ul ； 0051 4 ： 呈色 ： 培养 48 小时后， 每孔加 MTT。
22、 溶液 10ul， 在 37， 5%（v/v） CO2培养条件下 继续孵育 4 小时， 然后加入 Formazan 溶解液， 在 37， 5%（v/v） CO2培养条件下继续孵育 4 小时， 直至在普通光学显微镜下观察发现 Formazan 全部溶解 ； 0052 5 ： 测量 ： 在 570nm 测定吸收值。 0053 6 ： 实验结果见表 1。 0054 B.Lycojaponicumin A 对 YFV 的抑制作用 ： 0055 以 Vero 细胞为培养病毒 YFV 的细胞， MOI 为 0.1， 实验步骤如下 ： 0056 1. 在 24 孔细胞培养板中接入 Vero 细胞， 24 小。
23、时后细胞长至单层 （细胞覆盖孔底 的面积约为 80% 90%） ， 吸出培养基， 接入病毒样品 200ul， 37吸附 2 小时。吸附完成 后， 吸弃各孔中的病毒液， 用 DMEM 培养基洗去未吸附的病毒。加入用含 10%（v/v） 胎牛血 清的 DMEM 培养基稀释的指定浓度 （0uM， 0.04uM， 0.12uM， 0.37uM， 1.1uM， 3.3uM， 10.0uM） 的 Lycojaponicumin A， 于 37、 5%（v/v） CO2的培养箱中培养 42 小时， 收集各个孔中的上清， 做病毒噬斑实验。 0057 2.病毒噬斑实验 ： 在24孔板中接入Vero细胞， 24小。
24、时后细胞长至单层 （细胞覆盖 孔底的面积约为 80% 90%） ， 吸弃各孔中的培养基， 接入用含 3% （v/v） 胎牛血清的 DMEM 培 养基 10 倍系列稀释的病毒样品 200ul， 37吸附 2 小时。吸附完成后将各个孔的上清板吸 弃， 用 10%（v/v） FBS 的 DMEM 培养基洗去未吸附的病毒。加入新鲜的 45预热的半固定培 养基 A 成分 ： 3% （v/v） FBS， 2MEM 培养基， 青霉素和链霉素终浓度分别为 100U/ml， 0.1mg/ ml ； B 成分 ： 1%（w/v） 的琼脂糖 （法国 Biowest） 。A 成分 ： B 成分 =1:1（v/v） ，。
25、 于 37、 5% （v/v） CO2的培养箱中培养 48 72 小时。待噬斑形成后用结晶紫 （美国 AMRESCO） 染色 （2% （w/v） 结晶紫溶于10% （v/v） 甲醛） ， 2小时后用流水冲去结晶紫和琼脂糖， 在显微镜下对每孔 产生的细胞噬斑， 根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度 （PFU/ml， PFU ： plaque formation unit 噬斑形成单位） 。PFU= 病毒稀释度 P/V，（P ： 空蚀斑数目 ； V ： 接种量） 。 0058 3. 实验结果见表 2。 0059 结 论 ： Lycojaponicumin A 对 YFV 具 有 很 强 的 抑 制 作 用， 而 且 安 全， 因 此 Lycojaponicumin A 在治疗 YFV 感染疾病中具有广泛的应用背景。 说 明 书 CN 103446137 A 7 。