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1、(10)申请公布号 CN 103432114 A (43)申请公布日 2013.12.11 CN 103432114 A *CN103432114A* (21)申请号 201310364356.9 (22)申请日 2013.08.20 A61K 31/353(2006.01) A61P 17/00(2006.01) A61K 8/49(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (71)申请人 云南农业大学 地址 650201 云南省昆明市云南农业大学 (72)发明人 盛军 郝淑美 黄艳苹 刘易凡 王宣军 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 53。
2、108 代理人 马晓青 (54) 发明名称 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表 皮修复和再生药物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 激活表皮生长因子受体 （EGFR） 丝氨酸、 苏 氨酸和酪氨酸磷酸化的效果， 该效果与表皮生长 因子 （EGF） 类似， 即EGCG可以作为植物来源的EGF 应用于促进表皮修复和再生。 提供EGCG在制备促 进表皮修复和再生的药物和化妆品中的应用。本 发明还提供用 EGCG 表没食子酸儿茶素没食子酸 酯作为类表皮生长因子， 作为表皮生长因子受体 活化剂， 以及作为表皮生长因子受体信号通路促 进剂。 (51)Int.C。
3、l. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103432114 A CN 103432114 A *CN103432114A* 1/1 页 2 1. 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中的应用。 2. 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生化妆品中的应用。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通 过促进表皮生长因子受体丝氨酸、 苏氨酸和酪氨酸磷酸化来活化表皮生长因子受体信号通 路。
4、。 4. 如权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通 过使细胞表面的表皮生长因子受体 1046 位、 671 位丝氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和 再生。 5. 如权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通 过使细胞表面的表皮生长因子受体 669 位苏氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。 6. 如权利要求 1 或 2 所述的应用， 其特征在于所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通 过使细胞表面的表皮生长因子受体 1068 位、 1086 位、 998 位、 1148 位、 845 位、 992 位、 1045 位酪氨酸。
5、磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。 7. 用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为类表皮生长因子。 8. 用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体活化剂。 9. 用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体信号通路促进剂。 权 利 要 求 书 CN 103432114 A 2 1/5 页 3 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生 药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于天然药物化学和药物开发应用领域， 具体地， 涉及表没食子酸儿茶素 没食子酸酯及其制剂在活化 EGFR、 促进表皮修复和再生中的应用。 技术背景 0002 茶叶是世界上最受欢迎的饮料之一， 具有抗氧化、 抗衰。
6、老、 抗菌抗病毒、 抗肿瘤、 降 低某些疾病发病率等多种功效。茶的成分很复杂， 到目前为止茶叶中已分离鉴定的化合物 有 500 余种， 其中有机化合物有 450 余种， 无机物营养素也有几十种。茶叶的水提取物中， 儿茶素占 25 40， 表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 占儿茶素的 60。EGCG 被认 为是茶叶鲜叶和绿茶中的主要活性成份。国内外对茶叶功效的研究也集中对 EGCG 的研究 上。经过多年研究， 人们发现 EGCG 对细胞、 动物具有明显的生物效应， 尤其是对肿瘤细胞和 荷瘤小鼠具有明确的抗肿瘤效应。 0003 表 皮 生 长 因 子 受 体 (epidermal grow。
7、th factor receptor,EGFR) 是 一 种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白， 是鸟类成红细胞白血病病毒 (avianerythroblastic leukemiaviral,v-erb-b) 致癌基因同源体， 为 HER/ErbB 家族的四 个成员之一， 故又名 HER1 或 ErbB-1。EGFR 被配体激活后启动胞内信号传导， 经过细胞质中 衔接蛋白、 酶的级联反应， 调节转录因子激活基因的转录， 指导细胞迁移、 黏附、 增殖、 分化、 凋亡， 且与肿瘤的形成和恶化密切相关。 0004 研究表明， EGFR 能显著加速伤口表皮的再生 ； EGFR( 酪氨酸激酶 。
8、) 抑制剂可抑制 血管内皮生长因子、 双调蛋白、 角蛋白 6 和肝素结合的类 EGF 因子 (HB-EGF) 等有促进伤口 愈合作用的因子的转录。几种外源性 EGFR 配体如转移生长因子 （transforming growth factor(TGF-) 能够促进伤口愈合。EGFR 能促进鼠科动物皮肤癌的血管生成。在伤口愈 合过程的早期阶段， EGFR 是一种重要的调节因子。EGFR 在伤口的整个愈合过程中是非常必 要的， EGFR 是通过调节水肿、 炎症、 细胞增殖和血管生成等促进伤口愈合的。 0005 表皮生长因子 EGF 是 EGFR 的主要配体， EGF 促进 EGFR 磷酸化， 从而。
9、启动该信号通 路， 促进细胞增殖。 EGF大量存在于人体上皮细胞内， 它可刺激上皮细胞和内皮细胞生长， 使 新的表皮细胞不断长成， 将死皮层推动并逐渐脱落， 保持肌肤细嫩光滑。 同时促进皮肤各种 细胞的新陈代谢， 增强细胞吸收营养物质。促使胶原及胶原酶合成， 分泌胶原物质、 透明质 酸和糖蛋白， 调节胶原纤维， 具有滋润皮肤、 增强皮肤弹性， 减少皮肤皱纹和防止皮肤衰老 的作用。在美容界有 “美丽因子” 之称。EGF 的美容功效主要包括 ：（1） 护肤、 修复 ；（2） 抗 皱、 防衰老 ；（3） 美白、 祛斑 ；（4） 防粉刺、 去疤痕 ；（5） 细致柔肤缩小毛孔等。 0006 迄今， 现有。
10、技术中没有涉及表没食子酸儿茶素没食子酸酯及其制剂在活化 EGFR、 促进表皮修复和再生中的应用的报道。 发明内容 说 明 书 CN 103432114 A 3 2/5 页 4 0007 本发明的目的在于提供表没食子酸儿茶素没食子酸酯 EGCG 活化细胞表面的表皮 生长因子受体EGFR、 作为类表皮生长因子EGF的应用， 即EGCG通过活化EGFR的信号调节细 胞、 机体的生命活动。本发明还提供了 EGCG 以 EGFR 为作用靶点的具体应用对象和应用领 域。 0008 为了实现本发明的上述目的， 本发明提供了如下的技术方案 ： 0009 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生药物中。
11、的应用。 0010 表没食子酸儿茶素没食子酸酯在制备促进表皮修复和再生化妆品中的应用。 0011 如所述的应用， 所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过促进表皮生长因子受体 丝氨酸、 苏氨酸和酪氨酸磷酸化来活化表皮生长因子受体信号通路。 0012 如所述的应用， 所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长 因子受体 1046 位、 671 位丝氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。 0013 如所述的应用， 所述的表没食子酸儿茶素没食子酸酯通过使细胞表面的表皮生长 因子受体 669 位苏氨酸磷酸化增强从而促进表皮修复和再生。 0014 如所述的应用， 所述的表没食子酸儿茶素没食子酸。
12、酯通过使细胞表面的表皮生长 因子受体 1068 位、 1086 位、 998 位、 1148 位、 845 位、 992 位、 1045 位酪氨酸磷酸化增强从而 促进表皮修复和再生。 0015 本发明还提供用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为类表皮生长因子。 0016 用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体活化剂。 0017 用表没食子酸儿茶素没食子酸酯作为表皮生长因子受体信号通路促进剂。 附图说明 ： 0018 图 1 为 EGCG 对 EGFR 磷酸化的影响， Ser ： 丝氨酸 ； Thr ： 苏氨酸 ； Tyr ： 酪氨酸 ； 0019 图 2 为 EGCG 的结构式。 具体实施。
13、方式 ： 0020 下面结合附图， 用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容， 但并不以 此来限定本发明。 0021 实施例 1 ： 0022 表没食子酸儿茶素没食子酸酯 EGCG 对 A431 细胞膜表面表皮生长因子受体 EGFR 的作用 ： 0023 A431是能够传代培养的人表皮癌细胞系。 使用含10胎牛血清 （Hyclone） 、 1青 链霉素的 RPMI1640 培养基培养。培养到最佳状态 （死细胞少， 可以明显的看出细胞呈明显 的梭形） 分 40 板， 每板细胞接种 500 万。 0024 24小时后， 将传代的A431细胞吸去培养液， 用PBS洗后， 用无血清培养基饥饿处理。
14、 （至少达到 16 小时以上） ， 吸走培养液， PBS 洗后， 用 pH6.5 的酸性培养基处理 30min， 每个处 理 10 板细胞， 四个处理， 对照加入等体积的无血清培养基 pH6.5 的酸性培养基 10mL, 实验 组分别是在 pH6.5 的酸性培养基加入终浓度为 0-200ug/ml 表没食子酸儿茶素没食子酸酯 EGCG,20ng/ml 的表皮生长因子 EGF,0-200ug/ml+20ng/ml EGCG+EGF,30min 后， 用通用蛋白 裂解液和 PMSF（100 ： 1） 裂解细胞 . 然后 1350 转分离心 8 分钟收集细胞， 收集细胞全蛋 说 明 书 CN 103。
15、432114 A 4 3/5 页 5 白， 测定蛋白浓度。 0025 使用 40的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 分离细胞裂解 液， 每个处理的裂解液上样量 60ug 蛋白质。50 伏恒压电泳 30 分钟。120 伏恒压电泳 1h， 将 电泳分离完毕的蛋白通过外加电场转移到硝酸纤维素膜上。200 毫安恒流转移 120 分钟。 在室温用 5牛血清白蛋白封闭蛋白转移完毕的硝酸纤维素膜 30 分钟， 分别使用不同位点 磷酸化的抗体 （1:1000） 杂交过夜， 然后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜 3 次， 每次10分钟。 洗涤结束后， 用过氧化物酶标记的兔抗体 （1:。
16、5000） 与硝酸纤维素膜室温杂交 60 分钟。反应结束后用磷酸盐缓冲的生理盐水洗涤硝酸纤维素膜 3 次， 每次 10 分钟。洗 涤结束后， 参照说明书用 ECL 化学发光试剂盒处理 （GE HealthCare） 。在暗室用 X 光底片曝 光。结果如图 1 所示。EGCG 的结构式如图 2 所示。 0026 实验结果图 1 证实表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 能使细胞表面的表皮生 长因子受体 （EGFR） 1046 位、 671 位丝氨酸磷酸化增强 ； EGCG 使细胞表面的 EGFR669 位苏氨 酸磷酸化增强 ； EGCG 使细胞表面的 EGFR1068 位、 1086 位、 。
17、998 位、 1148 位、 845 位、 992 位、 1045 位酪氨酸， 从而活化 EGFR， 促进表皮修复和再生。 0027 制剂实施例 1 ： 0028 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） ， 按常规加注射用水， 精滤， 灌封灭 菌制成注射液。 0029 制剂实施例 2 ： 0030 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） ， 将其溶于无菌注射用水中， 搅拌 使溶， 用无菌抽滤漏斗过滤， 再无菌精滤， 分装于 2 安瓿中， 低温冷冻干燥后无菌熔封得粉 针剂。 0031 制剂实施例 3 ： 0032 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） ， 与赋形剂。
18、重量比为 9:1 的比例加 入赋形剂， 制成粉剂。 0033 制剂实施例 4 ： 0034 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 按其与赋形剂重量比为 1:5-1:10 的比例加入赋形剂， 制粒压片。 0035 制剂实施例 5 ： 0036 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 按常规口服液制法制成口服液。 0037 制剂实施例 6 ： 0038 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 按其与赋形剂重量比为 5:1 的比 例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂或冲剂。 0039 制剂实施例 7 ： 0040 从市售得表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） ， 按其。
19、与赋形剂重量比为 3:1 的比 例加入赋形剂， 制成胶囊或颗粒剂或冲剂。 0041 制剂实施例 8 ： 0042 含有表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 的美白霜配方 （W%） ： 0043 说 明 书 CN 103432114 A 5 4/5 页 6 0044 0045 按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。 0046 制剂实施例 9 ： 0047 含有表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 的乳剂配方 （W%） ： 0048 0049 按常规制作化妆品的方法制得本发明上述配方的化妆品。 说 明 书 CN 103432114 A 6 5/5 页 7 0050 制剂实施例 。
20、10 ： 0051 配方 ： 0052 A 油相 w（质量百分比） 0053 蜂蜡 2%， 硬脂酸 5%， 十八醇 3%， 羊毛脂 2%， 司盘 803%， 土温 803%， 0054 石蜡油 3%。 0055 B 水相 w（质量百分比） 0056 甘油 5%， 表没食子酸儿茶素没食子酸酯 （EGCG） 5%， 三乙醇胺 0.3%， 蒸馏水 75%。 0057 C 香精适量， 尼泊金丙酯 0.2% 0058 方法 ： 0059 将油相置于恒温水浴锅内搅拌加热至 90完全熔化成均相后， 缓慢加入水相， 继 续搅拌 30min ； 缓慢降温至 45时加入香精、 尼泊金丙酯， 继续搅拌 ； 待温度降至 35左右 时， 停止搅拌， 静置， 冷却， 得到乳膏状产品。 0060 前述的说明应当理解为仅仅是说明本发明。 各种选择和修正可由本领域熟练人员 不背离本发明而设计。从而， 本发明意图包括所有落入以下权利要求范围内的这种选择和 修正以及变化。 说 明 书 CN 103432114 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103432114 A 8 。